TWI409457B - 表面增強共振拉曼散射光譜奈米粒子探針及其使用方法 - Google Patents

表面增強共振拉曼散射光譜奈米粒子探針及其使用方法 Download PDF

Info

Publication number
TWI409457B
TWI409457B TW098120031A TW98120031A TWI409457B TW I409457 B TWI409457 B TW I409457B TW 098120031 A TW098120031 A TW 098120031A TW 98120031 A TW98120031 A TW 98120031A TW I409457 B TWI409457 B TW I409457B
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
group
dye
probe
signal
enhanced resonance
Prior art date
Application number
TW098120031A
Other languages
English (en)
Other versions
TW201003070A (en
Inventor
Philip-Leslie Drake
Hsiang Yuan Huang
Original Assignee
Ind Tech Res Inst
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ind Tech Res Inst filed Critical Ind Tech Res Inst
Publication of TW201003070A publication Critical patent/TW201003070A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI409457B publication Critical patent/TWI409457B/zh

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/65—Raman scattering
    • G01N21/658—Raman scattering enhancement Raman, e.g. surface plasmons
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54346—Nanoparticles

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)

Description

表面增強共振拉曼散射光譜奈米粒子探針及其使用方法
本發明關於表面增強共振拉曼探針及其於生物檢定之偵測方法的應用；更具體地關於表面增強共振拉曼探針的訊號理想值，經由該探針化學修飾而達成。
表面增強拉曼光譜(SERS)及表面增強共振拉曼光譜(SERRS)已被應用為分析工具多年(K.T.Carron,B.J.Kennedy,Anal.Chem. ,1995,67,3353-3356.；S.Xu,X.Ji,W.Xu,B.Zhao,X.Dou,Y.Bai,Y.Ozaki,J.Biomed.Opt. ,2005,10(3),031112,1-12.)。SERS活性粒子成功地作為化學分析(P.D.Enlow,M.Buncick,R.J.Warmack,T.Vo-Dinh,Anal.Chem.,1986,58,1119-1123.)、免疫分析(J.D.Driskell,K.M.Kwarta,R.J.Lipert,M.D.Porter,Anal.Chem. ,2005,77,19,6147-6154.；S.Xu,X.Ji,W.Xu,X.Li,L.Wang,Y.Bai,B.Zhao,Y.Ozaki,Analyst ,2004,129,63-68.；D.S.Grubisha,R.J.Lipert,H.Y.Park,J.Driskell,M.D.Porter,Anal.Chem. ,2003,75,5936-5943.)、及DNA分析(K.Faulds,L.Stewart,W.E.Smith,D.Graham,Talanta ,2005,67,667-671.；K.Faulds,W.E.Smith,D.Graham,Analyst ,2005,130,1125-1131.)的標記或探針，SERS的訊號波峰強度與目標種類的濃度相關。
SERS首先由Fleischmann等人(M.Fleischmann,P.J.Hendra,A.J.McQuillan,Chem.Phys.Lett. ,1974,26,163.)於1974年在其紀錄水溶液中吸附於粗糙銀電極的吡啶所產生的強烈拉曼訊號而發現。之後，多篇刊物結論出這些強烈訊號無法由傳統的拉曼理論說明，並推測一增強機制發生在金屬表面，增加了每一被吸收吡啶分子的散射強度(M.G.Albrecht,J.A.Creighton,J.Am.Chem.Soc. ,1977,99,5215.；D.L.Jeanmaire,R.P.Van Duyne,J.Electroanal.Chem. ,1977,84,1.)。自此以後，其他刊物報導此表面增強效應，並提出數種理論說明。關於此歷史及理論發展可由回顧文章詳細了解(A.Campion,P.Kambhampati,Chem.Soc.Rev. ,1998,27,241-250.；M.Moskovits,Rev.Mod.Phys. ,1985,57,783-826.；A.Otto,I.Mrozek,H.Grabhorn,W.Akemann,J.Phys.Condens.Matter ,1992,4,1143-1212.)。
表面增強共振拉曼光譜(SERRS)結合SERS及共振增強效應與染料分子(J.R.Lombardi,R.L.Birke,T.Lu,J.Xu,J.Chem.Phys.,1986,84,4174-4180.；K.Nakamoto,Coordination Chemistry Reviews,2002,226,153-165.)。在SERRS試驗中，染料的吸收與金屬奈米粒子(NP)的表面電漿共振(SPR)及使用的激光雷射重疊。共振與表面增強的結合效應，使SERRS成為可使用光譜中靈敏性最高的一種。
SERS及SERRS皆已被使用於單一分子偵測(Z.Zhou,G.Wang,Z.Xu,Appl.Phys.Lett. ,2006,88,034104.；S.Nie,S.R.Emory,Science ,1997,275,21,1102-1106.)。SERRS試驗中觀察到最大的增強因素被歸類為兩種，化學性增強及電磁性增強。化學性增強被認為是因為電價由分子轉移至金屬表面或相反方向轉移所造成(P.Kambhampati,C.M.Child,M.C.Foster,A.Campion,J.Chem.Phys. ,1998,108,5013-5026.)。電磁性增強相信是因為局部的SPR與金屬NP所造成。SPR效應大幅增強NP表面的電磁場(M.J.Weaver,S.Zou,H.Y.H.Chan,Anal.Chem. ,2000,72,38A-47A.)。尚有其他因素可有效增強拉曼截面積，例如發色基(chromophore)的共振效應，或者有特異陽離子或陰離子的存在時(T.W.Koo,S.Chan,L.Sun,X.Su,J.Zhang,A.A.Berlin,Appl.Spectrosc. ,2004,58,1401-1407.)。
其他文獻顯示SERS增強效應極大至1012 倍，SERRS的應用可導致單一分子的靈敏性(Zhouet al .,Appl.Phy s.Lett. ,88,034104,2006.)。
與螢光探針不同，拉曼探針具有數種結構要件，例如一中心奈米粒子核、一交聯基、及一發色基(chromophore)。奈米粒子的組成物及尺寸、交聯組成物及長度、及發色基種類及數量密度的改變，皆可能影響該探針產生的拉曼訊號。
金屬奈米結構造成表面電漿共振。發光基提供拉曼訊號的化學性增強。奈米粒子與發光基之間的能量流動及共振耦合，造成SERRS效應。如果發光基距離奈米結構太遠，兩者不產生耦合，則拉曼訊號會減弱。發光基及奈米粒子間的化學鍵結亦扮演重要角色(A.Otto,J.Raman Spectrosc. ,22：743,1991.)。
SERRS實現單一分子靈敏性的能力證明，引導此領域內大量研究。例如以下的美國專利公開案及專利案提供此技術應用的例子：US專利申請案公開號2007/0155021、US專利申請案公開號2005/0221510、US專利號5,445,972、及US專利號7,192,778。這些SERRS申請案及專利多數關於矽表面塗佈金屬層的應用及拉曼裝置的操作及結構的變異。大多數是關於SERRS活性粒子，而關於表面的部分，如US專利申請案公開號2007/015021所揭露。這些揭露係基於SERS活性粒子具有陽離子塗佈。這些揭露宣稱之前公開的方法使粒子具有陰離子性質，並宣稱此塗佈層改變為陽離子後，可改善訊號強度及可再現性。這些先前文獻使用”表面尋找基”(surface seeking group)為改善拉曼訊號的方法之一。
US專利5,445,972揭露連結於特異性連接成員的拉曼活性標籤，用於配體結合分析之使用。然而，此專利未確認金屬奈米粒子作為拉曼標籤要件之一的用途，其似乎包括拉曼活性染色分子的使用，但並未包含拉曼活性粒子。此技術係修飾拉曼染料於標準銀表面或銀奈米粒子，以獲得全SERS訊號。在這些更早的技術中，銀奈米粒子及銀塗佈表面用於產生來自拉曼活性標籤的拉曼訊號。
US專利7,192,778及6,861,263揭露二氧化矽層塗佈的金屬奈米粒子之使用。此技術包括將拉曼活性分子保留於二氧化矽層中。該玻璃層具有多種功能。例如，該玻璃層使拉曼活性分子保留在該奈米粒子表面；使該奈米粒子溶液穩定存在於多種不同溶劑中；及當其他種類連結於整個粒子結構時，該玻璃層作用如一修飾點。這些專利皆揭露”三明治”結構的使用，其中拉曼活性分子位於兩金屬奈米粒子的接面上。
US專利申請案公開號2005/0130163揭露一類似技術但確定拉曼活性粒子由一個以上金屬奈米粒子分散於聚合物殼中所組成，其中該聚合物材料可為任何一般聚合物及玻璃結構。
US專利申請案公開號2006/0246460揭露一偵測DNA的系統，使用兩種拉曼活性分子。一開始兩種拉曼分子皆在奈米粒子表面，兩者皆提供整個拉曼訊號。在連結目標DNA後，奈米粒子表面上的一拉曼分子被移除，整個拉曼訊號便發生變化。
US專利6,219,137揭露核殼結構，確定其分析法提供拉曼訊號，即該奈米粒子核殼結構本身不具有拉曼訊號。該奈米粒子核殼結構僅當目標分析物連結至金屬SERS表面時才具有拉曼訊號。也只有之後才獲得拉曼光譜。
本發明關於SERRS活性粒子的使用，特別是提供新穎SERRS活性粒子及最佳化SERRS活性粒子之方法，藉由修飾奈米粒子(如金屬奈米粒子)及訊號分子間的交聯基，以及提供偵測分析物之方法，經由使該修飾後的SERRS活性粒子直接或間接地藉由一辨識種類連結至該分析物。該SERRS活性粒子造成的SERRS訊號與該分析物濃度有關，因此可定量該分析物。本發明提供在SERRS應用上增強奈米粒子探針的拉曼訊號強度之方法，例如在化學分析或生物檢定中，當該探針作為標籤時，因而改善該探針的偵測限制。本發明之拉曼強度的增加係使用一交聯基而達成，該交聯基用於連接訊號分子(例如染料)至奈米粒子表面(例如Au或Ag奈米粒子)。
本發明之SERRS活性粒子為塗佈訊號分子的粒子(例如奈米粒子)，其中該訊號分子以交聯基修飾。
本發明之具體實施詳細說明如下，然而以下的實施例僅用於進一步揭露本發明之技術內容，不應藉以限制本案的發明範疇。
本發明具體提供一種表面增強共振拉曼光譜之探針，包括一奈米粒子，一交聯基、及一訊號分子，其中該交聯基使該訊號分子連結至該奈米粒子；以及該交聯基化學連接於該奈米粒子與該訊號分子。
本發明更具體提供一種以表面增強共振拉曼光譜偵測目標物之方法，包括提供一表面；提供一樣本，該樣本包括欲偵測的目標物；提供上述表面增強共振拉曼光譜之探針，該探針更包括一特異連接於目標物的物質；使該目標物連接於該表面；使該探針與該表面接觸；提供一光束至該表面；及測量散射光之訊號。
沒有任何一篇報導揭露或提議拉曼染料及奈米粒子間的交聯基之合成及使用以及其在訊號強度及再現性上的高度助益的效應。本發明首次解釋一清楚的增強作用，得自訊號分子與表面尋找基(surface seeking group)間的交聯基之添加。本發明使用一完整結構的拉曼標籤，包含一拉曼活性訊號分子塗佈的中心金屬奈米粒子。本發明不需要SiO2 層，因為拉曼活性訊號分子經一化學鍵連結至該奈米粒子。本發明中，該金屬奈米粒子具有拉曼訊號分子永久連結至其表面，使該奈米粒子具有內在的拉曼訊號。即使在沒有目標物存在下，本發明之探針粒子仍然具有拉曼訊號，表示本發明之探針可用於偵測本質上非拉曼活性的分析物。
本發明提供顯示強拉曼訊號的探針，該探針可作為標籤經傳統技術偵測微量的目標分子。使用本發明之組成物及方法，偵測目標物的限制為至少小如飛莫耳程度(femto-molar level)。
1.訊號分子
本發明之訊號分子可為任何習知的訊號分子，包括已知的染料。染料可為任何該技術領域中已知者，例如偶氮(azo)染料、蒽醌(anthraquinone)為主的染料(例如苯甲三唑偶氮染料(benzatriazole azo dye))、類黃酮(flavonoid)染料、多酚染料、螢光素(fluorescein)衍生物、夫倫(fluorone)染料、若丹明(rhodamine)染料、苯丙類(phenylpropanoid)染料、氰染料、聚甲炔(polymethine)染料、吖啶(acridine)染料、啡啶(phenanthridine)染料、紫質(porphyrin)染料、三芳基染料(triaryl dye)、噁嗪(oxazin)染料、噁唑(oxazone)染料、及苯噁嗪(phenoxazin)染料。特定例包括類黃酮(flavonoid)、螢光素(fluorescein)、若丹明(rhodamine)、香豆素(coumarin)、吖啶(acridine)及其衍生物、含紫質(porphyrin)衍生物，但不限於此。而且，任何列於http：//stainsfile.info/StainsFile/dyes/dyes.htm的已知染料，皆可用作為本發明之訊號分子。
2.交聯基
本發明之交聯基可包括，例如奈米粒子與訊號分子間預定長度之分子基。該交聯基本身可分為兩部分。第一部分為一有機或無機基，例如共價，連結於該訊號分子。第二部分連結於該有機或無機基，為表面-尋找基(surface-seeking group)。
有機或無機基的例子，包括二價有機基，如烷基、烯基、炔基、醚、酯、醯胺、芳基、異芳基、或前述之組合，但不限於此。
這些有機或無機基可選擇性被取代，例如被鹵素、氰基、羧基等取代。
該表面-尋找基可為含硫的基，例如硫醇基；二硫基；或亞硫酸基；或含硫醇基、二硫基、亞硫酸基的聚合物。硫醇化合物為較佳的硫化合物。該硫醇化合物表示含氫硫基(-SH)的有機化合物(R-SH，R為烴基，例如烷基)的一般名稱。
在具體實施例中，該交聯基可為一系列的胺基酸。例如在一具體實施例中，該交聯基可包括一半胱胺酸殘基在C端，其後向N端方向，為一個或一個以上甘胺酸殘基。
一具體實施例中，該交聯基可為約4至約40個原子長，以提供足夠的暴露。該交聯分子可為，例如芳基乙炔、乙二醇、含2-10單體單位的寡聚物、二胺、二酸、胺基酸、前述之類似物、及前述之組合。另一實施例中，該交聯基可為多核苷酸、寡核苷酸、或寡糖。
本發明允許選擇適當的交聯基長度，使其可增加SERRS訊號最大至22倍，相較於無交聯基所得的SERRS訊號。
該交聯基可進行至少兩個功能。第一，該交聯基導入一”表面尋找基”，該表面尋找基改善金屬奈米粒子及訊號分子間交互作用的強度。第二，該交聯基具有該訊號分子，位於對應該金屬奈米粒子表面的理想位置，提供增強的SERRS散射。這兩個功能的組合形成一SERRS散射訊號，可容許先前從未達到的整體SERRS活性粒子的偵測限制。
本發明結合該訊號分子及該交聯基。該訊號分子，例如發光基(chromophore)，共軛連接於交聯基，例如半胱胺酸。例示的交聯基例如半胱胺酸之硫醇基，使發光基(chromophore)共軛連接於金屬奈米粒子。固相的合成製造發光基(chromophore)與不同長度胺基酸交聯基於硫醇基及選擇的活性區域之間。經由進行這些非常微小的結構改變至該交聯基的大改變，可見於結果的SERRS光譜中。這些拉曼訊號的改變非熟知該技術領域之人士可預期的。例如，在延長該交聯基時，可預期發光基(chromophore)位於離該金屬表面更遠的位置，因此顯示拉曼訊號的降低。此降低的拉曼訊號無法觀察得到，事實上，當該交聯區域增加額外的甘胺酸基時，相較於不含有額外甘胺酸基的交聯基之訊號，該拉曼訊號顯示訊號強度增加10倍以上。
本發明揭露一交聯基的系統性修飾，使拉曼活性發光基(chromophore)耦合至SERS活性表面，為一增強SERRS訊號的有效方法，使增強的SERRS訊號達到先前無法達成的靈敏度之程度。單一交聯基單元的添加，例如甘胺酸，在整體SERRS反應的強度上具有明顯的影響。
3.粒子
本發明之SERRS活性粒子為訊號分子塗佈的粒子，其中該訊號分子以本發明之交聯基修飾。
例如，本發明之粒子可為奈米粒子。”奈米粒子”為微小的粒子，其尺寸為奈米。本發明之具體實施例中，該奈米粒子的直徑小於約200nm，介於約20nm至約200nm，或介於約40nm至約100nm。
本發明之具體實施例中，該奈米粒子為金屬奈米粒子。該金屬奈米粒子可為無反應性金屬或金屬混合物，例如Au、Cu、Ag。本發明之奈米粒子也可為習知的粒子，例如有機或無機粒子，具有金屬塗佈者。例如根據本發明內容，可使用Au奈米粒子(以下簡稱AuNP)或Au塗佈的奈米粒子。
本發明之具體實施例中，該奈米粒子可包括金屬或金屬合金，例如金、銀、銅、鎳、鈷、鐵、鈀、鉑、及鋁。
根據本發明，奈米粒子被多方定義為少於約1千萬個原子的材料、或直徑小於約1,000 nm的材料。在本發明之具體實施例中，奈米粒子可為具有小於約100 nm的直徑者。奈米粒子一般可為球狀、三角狀、棒狀、立方狀、14面體狀、及其他形狀，及/或前述之混合。奈米粒子可包括單一材料或多重材料。例如奈米粒子可包括金屬，例如Au、Ag、Pt、Ni、Co、Ti、Al、Si、Ge、Cu、Cr、W、Fe、Pd、及/或Ir；金屬氧化物，例如任一前述的金屬氧化物；半導體，例如第III-V族及第II-VI族半導體，例如CdSe、CdS、CdTe、及/或GaAs；有機材料，例如聚苯乙烯、HMP-PEGA聚丙烯醯胺、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、PEG(聚乙二醇)、及/或PLGA(聚(乳酸-甘醇酸))；生物材料，例如DNA、蛋白質、碳水化合物及糖、及/或任何前述之組成物。
4.分析物/目標物
可由SERRS偵測的目標物通常為蛋白質，包括蛋白質複合物、多元體(multimer)及其衍生物、核酸、碳水化合物及其他分子物質。
本發明揭露的探針，可顯示強烈的拉曼訊號，可作為標籤經由習知技術(例如免疫分析法)偵測微量的目標分子。該偵測限制的目標物至少小如飛莫耳(femto-molar)的程度。
本發明之分析物可為直接由樣本中發現的分子，例如宿主的體液作為樣本。該樣本可直接被檢查，或預先處理使該分析物更容易被偵測。而且，對於有興趣的分析物可經由偵測證明該分析物的試劑而確認，例如互補於該分析物的特異性連接對的一員，只有當該有興趣的分析物存在於樣本中時，才會偵測該分析物的存在。因此，證明該分析物的試劑成為分析對象，在分析法中偵測。體液可為，例如尿液、血液、血漿、血清、唾液、精液、糞便、痰、腦脊髓液、眼淚、黏液、或類似物。
以拉曼光譜為主的偵測方法可取代目前的螢光系統，本發明之組成物及方法所提供的靈敏度提高，可偵測低濃度的生物標記(biomarker)，包括血液樣本中的生物標記。該低濃度的生物標記可包括甲種胎兒蛋白(alpha fetoprotein；AFP)、γ-胺基丁酸(GABA)、肌鈣蛋白(troponin)及澱粉狀蛋白-β-衍生的可擴散配體(ADDL)。AFP是一種醣蛋白，正常由胎兒在發育中產生，也會在某些成人癌症中產生。AFP可用於偵測嬰兒發育缺陷以及作為成人睪丸癌及肝細胞腫瘤的標記。血液中AFP的正常濃度為0.2 nM/dm3 。肌鈣蛋白(troponin)是一種在肌肉細胞中發現的蛋白複合物。血漿中肌鈣蛋白(troponin)的存在可作為心肌梗塞(心臟病發作)的標誌。肌鈣蛋白(troponin)的正常濃度為0.02 nM/dm3 。
本發明的其他具體實施例可應用於偵測非常低濃度的生物標誌。例如抑制素(inhibin)是一種可能作為卵巢癌生物標誌的蛋白質，其正常的濃度為1.5 pM/dm3 。澱粉狀蛋白-β-衍生的可擴散配體(ADDL)為阿茲海默症的可能的生物標記，其正常濃度只有0.2 fM/dm3 。以目前技術及系統無法偵測ADDL。為了完全使用這些生物標記以及其他目前正在研發的生物標記，必須要發展可解除次飛莫耳(sub femto-molar)及阿莫耳(atto-molar)偵測限制的新穎免疫分析偵測方法。
本發明之探針可用於生物檢定及化學分析，取代習知的螢光標誌。取代以適當發光波長在螢光顯微鏡下觀看生物檢定結果之方法，本發明方法的結果在桌上型拉曼裝置上以圖像、數字、或代表文字等方式顯示。特定波長下的波峰高度或波峰區域與該目標種類的濃度相關。真實目標物形成的拉曼訊號可能太弱，而無法成像，但是，本發明的拉曼探針所形成的訊號為1010 -1018 倍以上(S.Nie,S.R.Emory,Science,1997,275,21,1102-1106.)。本發明之標籤可用於標識生物種類，例如抗體、蛋白質及DNA。這些生物種類使該探針具有所需的選擇性，拉曼訊號可偵測該生物種類的存在。因此，本發明之探針及使用該探針的方法可應用於多種不同微量分析的應用及生物檢定。
本發明之具體實施例中，本發明方法之生物檢定是三明治分析法，其中，該目標物先連結於辨識種類，然後該具有第二辨識種類的拉曼探針與先前形成的連結物形成三明治結構。
實施例
本發明由以下實施例例示。此例示的實施例僅用於說明本發明，不意圖限制本發明之範疇。
[實施例1.奈米粒子的合成]
此試驗使用EZRaman-L系統光譜儀(Enwave Optronics)，使用670 nm雷射，22 mW輸出功率，0.30 NA聚焦鏡。使用5(6)羧酸-x-若丹明(rhodamine)-N-琥珀醯亞胺酯(5(6)Carboxy-x-rhodamine-N-succinimidyl，Fluka)，固相合成(SPS)樹脂TentaGel S AM(Advanced ChemTech)。
金奈米粒子根據檸檬酸鹽還原法合成(P.C.Lee,D.Meisel,J.Phys.Chem. ,1982,86,3391-3395.；K．C.Grabar,R.G.Freeman,M.B.Hommer,M.J.Natan,Anal.Chem. ,1995,67,735-743.；K.R.Brown,D.G.Walter,M.J.Natan,Chem.Mater. ,2000,12,306-313.)。首先製造小的金奈米粒子，將其作為種粒(seed particle)，再生長成最後較大的金奈米粒子。
小的金奈米粒子種粒以檸檬酸鹽還原法合成。將檸檬酸三鈉(50 mg)溶於蒸餾水(5 ml)，形成1%溶液。將此溶液加入於蒸餾水(50 mL)中四氯氫金酸(20 mg)的沸騰溶液中。所得溶液變色形成深紅/紫色。迴流30分鐘後，移除加熱。
紀錄該溶液從300nm-900nm的UV-Vis光譜，顯示特徵的表面電漿共振的峰在波長517nm。TEM影像分析得知該奈米粒子直徑為12.2±0.8 nm。代表的TEM影像如第2圖所示。插圖顯示單一金奈米粒子的特寫，呈現晶格結構。
較大的金奈米粒子由檸檬酸鹽還原法，以種粒生長。將四氯氫金酸溶液(0.5 mL,11mM溶液)加入蒸餾水(32 mL)中，在一固定冷凝器中迴流。此溶液(0.3 mL)中加入上述之小金奈米粒子合成的種粒溶液，之後快速地加入四氯氫金酸溶液(0.17 mL的1%溶液)。30秒後此溶液轉為藍色，1分鐘後轉為紅色。10分鐘後移除加熱，攪拌此溶液至冷卻。
紀錄該溶液從300nm-900nm的UV-Vis光譜，顯示特徵的表面電漿共振的峰在波長535nm。TEM影像分析得知該奈米粒子直徑為49.8±1.2 nm。代表的TEM影像如第3圖所示。插圖顯示單一金奈米粒子的特寫。
[實施例2.具有Fmoc-Cys(Trt)的TentaGel S AM樹脂的製造(1a)]
首先移除Fmoc保護基，活化固相合成(SPS)樹脂(SJ5075 Advanced Chemtech)(T.w.Greene，P.G.M.Wuts：Protective Groups in Organic Synthesis,3rd Edition,Wily Interscience,U.S.A.,1999.)。將該樹脂(2g)懸浮於20%哌啶(piperidine)80%DMF的溶液(20 mL)中，攪動約30分鐘。移除此溶液，以新鮮哌啶/DMF溶液清洗該樹脂3次。觀察UV-Vis光譜，監測Fmoc基的釋放。
一旦活化後，根據標準的苯併三唑-1-基-氧三吡咯啶-磷六氟磷酸鹽(PyBOP)條件，Fmoc-Cys(Trt)-OH胺基耦合於該樹脂。Fmoc-Cys(Trt)-OH(0.36 g)及PyBOP(0.30 g)溶於DMF(20 mL)，並加入DIPEA(200 μL)。然後加入活化的樹脂(2g)，室溫下溫和地攪動整個溶液24小時。之後，該樹脂以新鮮DMF清洗3次，然後乙醇清洗3次，抽氣下乾燥至恆重。
此反應是否成功，隨後以Fmoc分析確認。如同預期，在胺基酸耦合反應中無明顯顏色改變。計算Fmoc-Cys(Trt)的含量為0.13 mmolg-1 。
[實施例3.具有Fmoc-Gly-Cys(Trt)的TentaGel S AM樹脂的製造(2a)]
首先移除Fmoc保護基，活化上述形成的具有Fmoc-Cys(Trt)的TentaGel S AM樹脂。將該樹脂(2g)懸浮於20%哌啶80%DMF的溶液(20 mL)中，攪動約30分鐘。移除此溶液，以新鮮哌啶/DMF溶液清洗該樹脂3次。觀察UV-Vis光譜，監測Fmoc基的釋放。
一旦活化後，根據標準的PyBOP條件，Fmoc-Gly-OH胺基耦合於該樹脂。Fmoc-Gly-OH(0.1 g)及PyBOP(0.15 g)溶於DMF(20 mL)，加入DIPEA(150 μL)。然後加入活化的樹脂(2g)，室溫下溫和地攪動整個溶液24小時。之後，該樹脂以新鮮DMF清洗3次，然後乙醇清洗3次，抽氣下乾燥至恆重。
此反應是否成功，隨後以Fmoc分析確認。如同預期，在胺基酸耦合反應中無明顯顏色改變。計算Fmoc-Gly-Cys(Trt)的含量為0.12 mmolg-1 。
[實施例4.具有Fmoc-Gly-Gly-Cys(Trt)的TentaGel S AM樹脂的製造(3a)]
首先移除Fmoc保護基，活化上述形成的具有Fmoc-Gly-Cys(Trt)的TentaGel S AM樹脂。將該樹脂(1g)懸浮於20%哌啶80%DMF的溶液(20 mL)中，振動約30分鐘。移除此溶液，以新鮮哌啶/DMF溶液清洗該樹脂3次。觀察UV-Vis光譜，監測Fmoc基的釋放。
一旦活化後，根據標準的PyBOP條件，Fmoc-Gly-OH胺基耦合於該樹脂。Fmoc-Gly-OH(0.05 g)及PyBOP(0.08 g)溶於DMF(10 mL)中，加入DIPEA(75 μL)。然後加入活化的樹脂(1g)，室溫下溫和地攪動整個溶液24小時。之後，該樹脂以新鮮DMF清洗3次，然後乙醇清洗3次，抽氣下乾燥至恆重。此反應是否成功，隨後以Fmoc分析確認。
如同預期，在胺基酸耦合反應中無明顯顏色改變。Fmoc-Gly-Gly-Cys(Trt)的添加計算為0.10 mmolg-1 。
[實施例5.羧基-x-若丹明(rhodamine)-N-琥珀醯亞胺酯(Carboxy-x-rhodamine-N-succinimidyl ester)的耦合(1b、2b、3b)]
此合成作用使用標準條件及碳酸氫鹽緩衝液進行。緩衝液的製造，以0.5M NaCl及0.1M Na2 CO3 混合液滴定0.5M NaCl及0.1M NaHCO3 混合液(總體積20 ml)，形成pH 8.3的溶液。簡單地說，上述製造的樹脂經移除Fmoc保護基而活化。將該樹脂(1g)懸浮於20%哌啶80%DMF的溶液(0.5 mL)中，攪動約30分鐘。移除此溶液，以新鮮哌啶/DMF溶液清洗該樹脂3次。觀察UV-Vis光譜，監測Fmoc基的釋放。
然後該樹脂以乙醇充分清洗，直到未發現哌啶為止。之後該樹脂進一步以蒸餾水清洗3次。該樹脂然後懸浮於碳酸氫鹽緩衝溶液(0.3 mL)。使羧基-x-若丹明(rhodamine)-N-琥珀醯亞胺酯(7.5 mg)溶於DMF(100 μL)。取此溶液25 μL加入每一樹脂/碳酸氫鹽混合物中。最終混合物在黑暗環境中攪動過夜。乙醇清洗該樹脂數次，直到洗液中無顏色呈現。
如同預期，跟隨該羧基-x-若丹明(rhodamine)的耦合反應，該樹脂由開始的黃棕色轉變為粉紅/紅色。
[實施例6.硫醇脫保護作用及Trt分析]
Cys硫醇基的Trt保護基以10% TFA/DCM清洗去除。Trt+ 陽離子的強UV-Vis吸光度用來評估該樹脂上的Cys量。具有羧基-x-若丹明(rhodamine)標籤(1mg)的樹脂仔細地以乙醇、丙酮及DCM清洗，除去任何未連接的染料。該樹脂然後懸浮於10% TFA/90% DCM溶液(1 mL)20分鐘。之後移除該溶液，儲存於密封容器中。重複此步驟，直到TFA/DCM溶液暴露於該樹脂時不再轉變為黃色為止。合併收集所有TFA/DCM洗液，以新鮮TFA/DCM稀釋至5 ml。然後紀錄該溶液的UV-Vis光譜。
三苯甲基(trityl)陽離子在可見光譜λ=410 nm處具有強吸光度，消光係數為37555 mol-1 dm3 cm-1 。該三樹脂經三苯甲基的分析，其中Cys皆為0.10 mmol/g，與起始的Fmoc量一致。硫醇基的存在可進一步由陽性愛爾曼測試(positive Ellman test)確認(J.P.Badyal,A.M.Cameron,N.R.Cameron,D.M.Coe,R.Cox,B.G.Davis,L.J.Oates,G.Oye,P.G.Steel,Tetrahedron Lett.,2001,42,8531-8533.)。
[實施例7.產物的回復]
羧基-x-若丹明(rhodamine)-Cys(SH)(1c)、羧基-x-若丹明(rhodamine)-Gly-Cys(SH)(2c)及羧基-x-若丹明(rhodamine)-Gly-Gly-Cys(SH)(3c)三種產物，經90% TFA/DCM清洗，自SPS樹脂移除。該樹脂(1mg)懸浮於90% TFA/DCM(1 mL)，攪動30分鐘。之後移除溶液，儲存於密閉容器中。重複此步驟3次，最後以100%TFA清洗。然後集合該TFA萃取物，在50℃減壓下旋轉蒸發，移除溶劑，留下粉紅色/紫色殘餘物。
將此殘餘物溶於蒸餾水(200 μL)中，形成預期的粉紅色/紫色溶液。不具染料標籤的控制產物以相同方法回復，但獲得無色殘餘物。
每一耦合反應的前後，使用標準Kaiser試劑，測試樹脂中的胺基。終產物濃度的評估，來自最終水溶液的UV-Vis光譜，假設該修飾的羧基-x-若丹明(rhodamine)與起始的羧基-x-若丹明(rhodamine)標籤有相同的消光係數(ε580 =8085.5 mol-1 dm3 cm-1 )。前述產物在可見光譜λ=580 nm處具有強吸光度，與羧基-x-若丹明(rhodamine)起始材料相同。硫醇基的存在由陽性愛爾曼測試(positive Ellman test)確認。該三種產物的結構如第1圖所示。
奈米粒子的合成是以由小的種粒生長，形成較大的粒子。與起始的種粒相比，這些較大粒子呈現一加強的SERS增強因子。種粒及該較大的終粒子的TEM圖分別如第2、3圖。影像分析顯示平均粒徑分別為12.2±0.8 nm及49.8±1.2 nm。在生長過程中，Au表面電漿共振的最大波峰由517nm平移至539nm，奈米粒子溶液的顏色也從深紅色變為更紫的顏色。最終的奈米粒子溶液非常穩定，經過數天後僅出現少量沉澱。由UV-Vis光譜觀察，該溶液容易懸浮且沒有任何減少。
[實施例8. SERRS訊號的收集]
SERRS訊號由EZRaman-L系統(Enwave Optronics)紀錄，使用670 nm雷射，22mw輸出，0.30 NA聚焦鏡。將該產物(2 μL)與該大的金奈米粒子(100μL)及蒸餾水(398 μL)於1.5 mL樣本安瓶中混合。該樣本安瓶簡單以超音波混合，放置在光譜儀的樣本固定器。該樣本固定器(Enwave Optronics)使該樣本安瓶與發光雷射為一理想排列，因此雷射的焦點位於該1.5 mL安瓶的中心，距離該安瓶底部2mm。收集SERRS光譜的積分時間通常不一，但是最常設定為l0秒。
將2 μL的三種產物溶液加入100 μL該大的金奈米粒子溶液中，以蒸餾水稀釋該混合液至0.5mL，紀錄該三種產物的SERRS光譜。該最終溶液置於樣本安瓶中，放在該樣本固定器。該固定器固定該樣本，其雷射焦點落在該溶液的中心。該雷射發出105μm直徑波導，通過準直透鏡形成寬度0.25 cm的光束。該光束然後通過焦距0.7 cm的透鏡，形成直徑100μm的聚焦點。
如上述設定之後，該雷射有效地發光，並收集該樣本中6.9 nL體積的訊號。該SERRS訊號強度與兩因素有關，拉曼活性染料(1c、2c或3c，如第1圖)的濃度及訊號積分時間。
為了補償上述兩種變異，SERRS以散射係數(Sc )的函數繪製。Sc 單位為mol-1 dm3 s-1 ，定義為拉曼訊號強度(I)除以拉曼染料的濃度(C)(mol dm-3 )及積分時間(t)(秒)，即Sc =I/(C x t)。如第4圖所示，該修飾後的拉曼染料2c的光譜非常近似未修飾的羧基-x-若丹明(rhodamine)。兩樣樣本中與C-C芳族伸縮有關的波峰都強勢出現在1346 cm-1 、1503 cm-1 及1647 cm-1 處。此與其他報導的若丹明(rhodamine)芳族系統值相同(N.Hayazawa,Y.Inouye,Z.Sekkat,S.Kawata,Chemical Physics Letters ,2001,335,369-374.)。
修飾的染料2c顯示在1203 cm-1 and 1291 cm-1 有增強的峰強度。這是因為胜肽鍵的C-N拉伸，且與提出的結構相符(B.C.Smith,Infrared Spectral Interpretation：A Systematic Approach,CRC Press,1999,page 130.；H.Okabayashi,K.Taga,T.Yoshida,K.Ohshima,H.Etori,T.Uehara,E.Nishio,Appl.Spectrosc. ,1991,45,4,626-631.)。如第4圖所示，令人感興趣的特徵為所有帶(band)的強度都增加，特別是1503 cm-1 的C-C芳族拉伸。產物2c的此帶的消光係數(Sc )是標準的羧基-x-若丹明(rhodamine)染料的約22倍，分別為11 mol-1 dm3 s-1 及0.5 mol-1 dm3 s-1 。
習知的SERS理論預測訊號強度與拉曼染料在金奈米粒子表面的覆蓋成正比。在染料結構中添加表面尋找基，例如硫醇，造成增強的訊號。該硫醇基具有一強化學鍵連結至金表面，導致連結的染料分子與未連結的染料分子間的平衡平移，造成表面密度增加。此與實驗觀察結果相符。
然而，此理論不能解釋該三種修飾的染料1c、2c及3c之間的訊號強度的差異。前述三種染料的拉曼光譜如第5圖所示。該光譜稍微平移以便觀察。從此光譜中可看出，產物2c在1503 cm-1 具有最強訊號。產物1c具有最弱訊號，雖然這個弱的訊號仍然是未修飾染料的訊號2倍。產物1c在1503 cm-1 峰的Sc 值為1 mol-1 dm3 s-1 ，未修飾的染料在1503 cm-1 峰的Sc 值為0.5 mol-1 dm3 s-1 。產物3c的Sc 值為7 mol-1 dm3 s-1 ，為該未修飾染料的約14倍。
當產物1c、2c及3c皆具有相同的表面尋找基連接於金奈米粒子表面，以及添加甘胺酸單元造成的化學結構上的差異，化學上的增強對拉曼訊號的影響應該大致相同。對表面增強的影響，三產物應該相同。如果交聯基(胜肽鍵)被認為是限制彈性的堅硬支持，那麼拉曼活性發光基(chomophore)與金奈米粒子表面有一段距離，該距離依1c、2c、3c增加。與該表面增加的距離，因電磁場強度衰減，導致拉曼訊號降低。但是，該交聯基不必然為堅硬的支持物。當該胜肽鍵中加入額外的甘胺酸單元時，該鍵變得更有彈性，使該若丹明(rhodamine)發光基(chomophore)的移動性增加。此增加的移動性相信可使該發光基(chomophore)位在相對該金奈米粒子的不同位置。
整體的SERRS增強與數個不同機制有關，發光基(chomophore)相對於SERS表面的位置為因素之一(C.J.McHugh，F.T.Docherty,D.Graham,W.E.Smith,Analyst ,2002,127,838-841.)。當額外的甘胺酸單元位於該交聯基，對SERRS增強有2個競爭機制，一為因為與金奈米粒子表面距離增加造成的訊號強度減弱，另一為因為該發光基(chomophore)再定位造成的訊號強度增強。此系統中，理想的交聯基為Cys-Gly構成的二胜肽2c。含有第二個甘胺酸單元的3c使整體拉曼訊號強度降低。
[實施例9. atto680探針的製造]
使用金奈米粒子及670nm的發光雷射，紀錄三個修飾的atto680染料的SERRS光譜。該染料以小胜肽Cys、Cys-Gly及Cys-Gly-Gly交聯基修飾。Cys硫醇基作用如Au表面的耦合點，Gly-NH2 基用於連結染料。Cys-Gly的交聯呈現最大的訊號。atto680染料的577 cm-1 拉曼峰的訊號強度是未修飾染料的27倍以上。使用的Au奈米粒子粒徑為49.8±1.2 nm，由檸檬酸鹽還原法合成。拉曼染料-AuNP探針亦使用於免疫分析法，偵測1飛莫耳(femto mole)的鼠免疫球蛋白(IgG)。
桌上型拉曼光譜儀為EZRaman-L系統(Enwave Optronics)，使用670 nm雷射，22mW輸出，0.30 NA聚焦鏡。Atto680-N-琥珀醯亞胺酯購自Fluka，固相合成(SPS)樹脂TentaGel S AM購自Advanced ChemTech。
奈米粒子、小的AuNP種粒、及大的AuNP如實施例1製造。具有Fmoc-Cys(Trt)的TentaGel S AM樹脂(1a)、具有Fmoc-Gly-Cys(Trt)的TentaGel S AM樹脂(2a)及具有Fmoc-Gly-Gly-Cys(Trt)的TentaGel S AM樹脂(3a)分別如實施例2、3、4製造。
Atto680-N-琥珀醯亞胺酯(1d、2d及3d)的耦合使用標準條件及碳酸氫鹽緩衝液進行。緩衝液每天新鮮製造，以0.5M NaCl及0.1M Na2 CO3 混合液滴定0.5M NaCl及0.1M NaHCO3 混合液(總體積20 ml)，形成pH 8.3的溶液。簡單地說，上述製造的樹脂經移除Fmoc保護基而活化。然後該樹脂以乙醇充分地清洗，直到未發現微量的哌啶為止。之後再以蒸餾水清洗該樹脂3次。然後將該樹脂懸浮於碳酸氫鹽緩衝溶液(0.3 mL)中。將atto680-N-琥珀醯亞胺酯(1 mg)溶於DMSO(500μ L)，將部份此溶液加入每個該樹脂/碳酸氫鹽混合物中，獲得染料的終濃度2mg ml-1 。黑暗環境中振動該最終混合物過夜。以乙醇清洗該樹脂數次，直到洗液呈現無顏色。如同預期，伴隨atto680的耦合，該樹脂由開始的黃棕色轉變為綠色。
[實施例10.硫醇基脫保護作用及Trt分析]
Cys硫醇基上的Trt保護基以10% TFA/DCM清洗去除。Trt+ 陽離子的強UV-Vis吸光度用來評估該樹脂上的Cys量。完整具有染料的該樹脂(1mg)仔細地以乙醇、丙酮及DCM清洗，除去任何未連接的染料。該樹脂然後懸浮於10% TFA 90% DCM溶液(1 mL)20分鐘。之後移除該溶液，儲存於密封容器中。重複此步驟，直到TFA/DCM溶液暴露於該樹脂時不再轉為黃色為止。合併收集所有該TFA/DCM洗液，以新鮮TFA/DCM稀釋至5 ml。然後紀錄該溶液的UV-Vis光譜。三苯甲基陽離子在可見光譜λ=410 nm處吸光度強，消光係數為37555 mol-1 dm3 cm-1 。經由三苯甲基分析，三樹脂上的Cys值皆為0.10-0.12 mmolg-1 ，與起始的Fmoc量一致。硫醇基的存在可進一步由陽性愛爾曼測試(positive Ellman test)確認(J.P.Badyal,A.M.Cameron,N.R.Cameron,D.M.Coe,R.Cox,B.G.Davis,L.J.Oates,G.Oye,P.G.Steel,Tetrahedron Lett.,2001,42,8531-8533.)。
[實施例11.產物的回復]
atto-Cys(SH)(1e)、atto-Gly-Cys(SH)(2e)及atto-Gly-Gly-Cys(SH)(3e)三種產物，經90% TFA/DCM清洗，自SPS樹脂移除。該樹脂(1mg)懸浮於90% TFA/DCM(1 mL)，振動30分鐘。之後移除溶液，儲存於密閉容器中。重複此步驟3次，最後以100%TFA清洗。然後收集該TFA萃取物，50℃減壓下旋轉蒸發，移除溶劑，留下藍色殘餘物之atto為主的染料。將此殘餘物溶於蒸餾水(500 μL)中。不具染料標籤的控制產物以相同方法回復，但獲得無色殘餘物。
[實施例12. SERRS光譜]
將0.5mL該產物溶液加入200μ L該大AuNP溶液，紀錄該產物的SERRS光譜。一開始該溶液具有強的螢光訊號遮蔽SERRS光譜。該溶液放置48小時，使AuNP沉澱。之後將此液體倒出，使奈米粒子再懸浮於1.2 ml的水。之後將該溶液在12000rpm離心10分鐘，再將該溶液倒掉，將該奈米粒子再懸浮於1.2 ml的水。此清洗過程重複5次。將最終溶液放入樣本安瓶中，該樣本安瓶位於SERRS裝置的樣本固定器。
[實施例13.免疫分析]
用於SERRS偵測之2e修飾的AuNP，以來自山羊的抗鼠IgG Fab 塗佈。簡而言之，AuNP溶液(500 μl)與5 μl的EDC水溶液(7 mg ml-1 )及5μ1的抗鼠IgG(90μg ml-1 )混合過夜。合成第二AuNP標籤，由4-巰基苯甲酸(MBA)塗佈AuNP。合成的大AuNP與溶於5 ml氨水(1 moldm-3 )的MBA(50 mg)混合，如前述，塗佈來自山羊的抗鼠IgG Fab 。為了捕捉抗體，首先將以金塗佈的玻片，以同質二雙功能(homobifunctional)交聯基-3,3' -二硫醇基雙[磺酸基琥珀醯亞胺基丙酯](DTSSP)活化。該以金塗佈的玻片經超音波振動5分鐘後，將溶於蒸餾水(100 μl)的DTSSP(0.6 mg)滴在該金表面上超過1 cm2 的面積，每一玻片上有三處如此處理。24小時後，將該玻片以去離子水清洗，在相同位置上滴入含有來自兔的抗鼠IgG Fc (90 μgml-1 )之硼酸緩衝液(50 mM)的溶液28 μl。將此玻片儲存在4℃下24小時。經塗布後，該基底以去離子水濕潤、乾燥、最後暴露於100 μl的SuperBlock緩衝液30分鐘。40 μgml-1 及20 μgml-1 不同濃度的鼠IgG(100 μl)分別滴在上述三個1 cm-2 面積的其中兩處，第三處為空白試驗，不暴露於鼠IgG。此三處之後暴露於100 ul的以抗鼠IgG塗佈的AuNP標籤，經去離子水清洗後乾燥。紀錄該表面的SERRS光譜。使用MBA-AuNP標籤重複上述相同步驟。
atto680染料胺基酸序列的合成如預期進行。在每一耦合反應前與後，使用標準Kaiser試劑測試該樹脂的胺基。終產物的濃度由該最終水溶液的UV-vis光譜評估，假設該修飾後的染料與起始的染料標籤具有相同的消光係數(atto680的ε680 =157143 mol-1 dm3 cm-1 )。該產物在可見光譜λ=680 nm具有強吸光度，與起始材料相同。硫醇基的存在由陽性愛爾曼測試(positive Ellman test)確認。此三產物的結構如第6圖所示。該奈米粒子的合成是基於小種粒的生長，形成較大的粒子。此較大粒子顯示一增加的SERS增強因子，相較於起始的種粒。該種粒與較大的最終粒子之TEM影像分別如第2、3圖所示。影像分析中得知平均粒徑分別為12.2±0.8 nm及49.8±1.2 nm。在生長階段，金表面電漿共振的最大波峰由517nm平移到539nm，奈米粒子溶液的顏色由深紅色轉變為較紫的顏色。最終的奈米粒子溶液非常穩定，經過數天後僅出現少許沉澱。在UV-Vis光譜觀察下，此溶液可輕易地懸浮，沒有減少。
使用桌上型系統紀錄樣本的SERRS光譜。將終溶液(1.2ml)放在樣本固定器上。該固定器固定樣本，使雷射焦點落在該溶液的中心。該雷射發出105 μm直徑波導，通過準直透鏡，使光束寬度呈0.25 cm。然後使該光束通過焦距0．7 cm的透鏡，使聚焦點直徑為100 μm。以此述之設定，該雷射有效發光，收集該樣本中6.9 nL體積所產生的訊號。SERRS訊號強度與兩因素有關，一為拉曼活性染料的濃度，另一為訊號加工的積分時間。為了抵銷此二變異，SERRS光譜以散射係數(Sc )的函數關係繪製。Sc 單位為mol-1 dm3 s-1 ，定義為拉曼訊號強度(I)除以拉曼染料濃度(C)(mol dm-3 )及積分時間(t)(秒)，即Sc =I/(C x t)。如第7圖所示，修飾後的拉曼染料2e的光譜與未修飾的atto680染料非常相似。Atto680結構為所有人私有，非公眾知悉，但是相信其為苯併苯噁嗪(benzophenoxazin)為主的染料(N.Marme,J.P.Knemeyer,Anal.Bioanal.Chem.,2007,388,1075-1085.)。Atto680的拉曼光譜與苯併苯噁嗪(benzophenoxazin)染料Nile Blue的SERRS光譜相似(D.A.Watson,L.O.Brown,D.F.Gaskill,M.Naivar,S.W.Graves,S.K.Doorn.,J.P.Nolan,Cytometry Part A,2008,73A,119-128.)。與C-C結構變形模式、C-O-C、C-N-C模式相關的峰分別位於577 cm-1 ,1160 cm-1 及1230 cm-1 。修飾後的染料2e顯示在1203 cm-1 及1291 cm-1 的波峰強度增加，是因為胜肽鍵的C-N伸拉，此與提案的結構相符(B.C.Smith,Infrared Spectral Interpretation：A Systematic Approach,CRC Press,1999,page 130.；H.Okabayashi,K.Taga,T.Yoshida,K.Ohshima,H.Etori,T.Uehara,E.Nishio,Appl.Spectrosc. ,1991,45,4,626-631.)。如第7圖所示，令人感興趣的特徵在於，所有帶(band)的強度增加，特別是在577 cm-1 的C-C結構變形模式。此帶的散射係數(Sc )，產物2e為標準atto680染料的27倍以上，分別為45 nmol-1 dm3 s-1 及1.7 nmol-1 dm3 s-1 值。傳統的SERS理論預測該訊號強度與金奈米粒子表面的拉曼染料的覆蓋成正比。在該染料結構上加上一表面-尋找基，例如硫醇基，導致一增強的訊號。該硫醇基具有一強的化學鍵連接於該金表面，使表面密度增加。然而，單純此理論無法用於解釋三個修飾後的染料1e、2e及3e之間訊號強度的差異。這些染料的拉曼光譜如第8圖所示。
如第8圖所示，該光譜輕微地平移以便觀察。由其可知，產物2e在577 cm-1 具有最強訊號，產物1e具有最弱訊號，但是此最弱訊號仍然是未修飾染料的5倍。產物1e與未修飾染料在577 cm-1 的Sc 值分別為8.3 nmol-1 dm3 s-1 及1.7 nmol-1 dm3 s-1 。產物3e在該處具有Sc 值為18.5 nmol-1 dm3 s-1 ，為未修飾染料的約11倍。因為產物1e、2e及3e皆具有相同的表面尋找基連接於AuNP表面，且只有在添加甘胺酸單元的化學結構上差異，由此化學性增強造成的拉曼訊號應該大約相等，且由該AuNP表面增強造成的影響對此三產物應該相同。如果該交聯基(胜肽鍵)被認為是限制彈性的堅硬支持物，則拉曼活性的發光基(chromophore)應與AuNP表面有一段距離，該距離依1e、2e、3e增加。當光場(optical field)強度衰減時，距離該表面的增加距離會使拉曼訊號降低。然而，該交聯基並非堅硬的支持物。當在該胜肽鏈中加入額外的甘胺酸單元，該鏈變得更柔軟，使atto680發光基(chromophore)的移動性增加。此增加的移動性使該發光基(chromophore)可位於相對AuNP表面的不同位置。
整體的SERRS增強已知與數個不同機制有關，發光基(chromophore)於SERS表面的位置為其中一因素(G.McAnally,C.McLaughlin,R.Brown,D.C.Robson,K Faulds,D.R.Tackley,W.Ewen Smith,D.Graham,Analyst,2002,127,838-841.)。當額外的甘胺酸單元位於交聯基時，對SERRS增強有兩個競爭機制，一為因為距離AuNP表面的距離增加造成的訊號強度降低，另一為因為發光基(chromophore)的再定位造成的訊號強度增加。此系統中，理想的交聯基為2e的二胜肽，由Cys-Gly所構成。含有第二個甘胺酸單元的3e的拉曼訊號強度整體下降。
發光基(chromophore)與表面尋找基(例如硫醇基)的修飾已列於文件，SERS表面的距離依賴性也被大量調查，但是，就吾等所知，間隔物基(spacer group)及表面尋找配體(surface seeking ligand)皆共價耦合於染料及奈米粒子表面的組合，並未被任何文獻揭露。本發明顯示交聯基耦合拉曼活性發光基(chromophore)於SERS活性表面之系統修飾，可為理想化SERRS訊號的有效方法，本發明亦顯示增加單一甘胺酸單元可對整體SERRS反應的強度上有深切的影響。經由選擇適當的交聯基可將使用atto680-AuNP探針所形成的SERRS訊號增加高至27倍。Kennedy等人觀察到由C8間隔物(spacer)至C18間隔物(spacer)的SERS訊號降低3倍(B.J.Kennedy,S.Spaeth,M.Dickey,K.T.Carron,J.Phy.Chem.B,1999,103,3640-3646.)。
為了顯示前述染料修飾奈米粒子作為生物檢定中非常靈敏的標籤之使用性，採用該奈米粒子進行鼠IgG的標準免疫分析。使捕捉的抗體(來自兔的抗鼠IgG Fc )耦合至金表面，以來自山羊的抗鼠IgG Fab 修飾該拉曼活性奈米粒子標籤。免疫分析結果如第9、10、11圖所示。由第11圖所示，具有修飾後atto680染料的奈米標籤(2e)仍然可用於偵測飛莫耳(femto-molar)程度的目標抗體的存在，但是MBA修飾的奈米粒子標籤在飛莫耳(femto-molar)程度上顯示無訊號。MBA在1071 cm-1 拉曼峰的Sc 值為0.18 μmol-1 dm3 s-1 ，此值過低而無法在此述的目標濃度提供訊號。此處確認由該交聯基提供的SERRS訊號增強，可基於奈米粒子標籤而降低拉曼的偵測限制，提供較標準標籤優良的表現。
實施例1-8中，採用染料分子羧基-x-若丹明(rhodamine)。羧基-x-若丹明(rhodamine)以相同的小胜肽鏈修飾，該小胜肽鏈由半胱胺酸(Cys)及甘胺酸(Gly)間隔物所構成(P.Drake,H.Y.Huang,Y.J.Lin,Journal of Analytical Chemistry,Accepted 2009.)。Cys側鏈的硫醇基用於使該染料連接於金奈米粒子(AuNP)表面，該胺基酸鏈的胺基端用於連接該染料分子。兩種染料的比較如表1所示。
[表1]兩種染料分子以小胜肽交聯基修飾的SERRS訊號強度
[表中的訊號強度係相對於未修飾染料，atto680的訊號強度為577cm-1 拉曼峰，羧基-x-若丹明(rhodamine)的訊號強度為1503cm-1 拉曼峰]如表1所示，交聯基的增加皆增強二染料分子的SERS訊號。而且，即使兩染料的UV-Vis吸光度最大值不同(att680的λmax =680 nm,羧基-x-若丹明(rhodamine)的λmax =568 nm)，兩染料的增強比例卻非常相似，平均為4：25：3：1。因此，不論哪一染料，交聯基增強SERRS訊號。
因此可知，改變交聯基的長度提供一最終理想的訊號增強。每一系統可在此狀態下最佳化，產生增強最多的訊號。
雖然本發明已以較佳實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟悉此項技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
第1圖顯示三種修飾後的羧基-X-若丹明(rhodamine)染料的結構。
第2圖為小種粒的Au奈米粒子的TEM圖。插圖顯示單一奈米粒子，影像寬度為5nm。
第3圖為大Au奈米粒子的TEM圖。插圖顯示單一奈米粒子，影像寬度為50nm。
第4圖為重疊的拉曼光譜，顯示2c與未修飾的羧基-X-若丹明(rhodamine)間的差異。
第5圖為重疊的拉曼光譜，顯示1c、2c及3c的訊號強度的差異。該光譜未由零開始顯示以便於觀察。
第6圖顯示三種修飾後的atto680染料的結構。
第7圖為重疊的拉曼光譜，顯示2e與未修飾的atto680的差異。
第8圖為重疊的拉曼光譜，顯示1e、2e及3e訊號強度的差異。該光譜未由零開始顯示以便於觀察。
第9圖顯示使用2e修飾的AuNPs作為標籤進行免疫分析後取自玻片表面的SERRS訊號。
第10圖顯示使用MBA修飾的AuNPs作為標籤進行免疫分析後取自玻片表面的SERRS訊號。
第11圖顯示使用2e修飾的AuNP標籤進行免疫分析之結果。

Claims (15)

  1. 一種表面增強共振拉曼光譜之探針，包括一金屬奈米粒子，一交聯基、及一具有拉曼活性之訊號分子，其中該交聯基選自由Cys、Gly-Cys及Gly-Gly-Cys所組成的群，該交聯基連結該訊號分子至該奈米粒子；以及該交聯基化學連接於該奈米粒子與該訊號分子。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之表面增強共振拉曼光譜之探針，其中該訊號分子為一染料，選自由以下組成的群：偶氮(azo)染料、蒽醌(anthraquinone)染料、類黃酮(flavonoid)染料、多酚(polyphenol)染料、夫倫(fluorone)染料、若丹明(rhodamine)染料、苯丙類(phenylpropanoid)染料、聚甲炔(polymethine)染料、啡啶(phenanthridine)染料、紫質(porphyrin)染料及三芳基染料(triaryl dye)。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之表面增強共振拉曼光譜之探針，其中該訊號分子為若丹明(rhodamine)。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之表面增強共振拉曼光譜之探針，其中該訊號分子為苯甲三唑偶氮染料(benzatriazole azo dye)。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之表面增強共振拉曼光譜之探針，其中該訊號分子為atto680染料。
  6. 如申請專利範圍第1項所述之表面增強共振拉曼光譜之探針，其中該訊號分子為三芳基染料(triaryl dye)。
  7. 如申請專利範圍第1項所述之表面增強共振拉曼光 譜之探針，其中該奈米粒子選自金及銀奈米粒子。
  8. 如申請專利範圍第1項所述之表面增強共振拉曼光譜之探針，其中該奈米粒子由檸檬酸鹽與四氯金酸鹽反應製造。
  9. 如申請專利範圍第1項所述之表面增強共振拉曼光譜之探針，其中該交聯基的長度為可變動。
  10. 如申請專利範圍第1項所述之表面增強共振拉曼光譜之探針，其中該交聯基包括一二價有機基及一表面尋找基。
  11. 如申請專利範圍第10項所述之表面增強共振拉曼光譜之探針，其中該表面尋找基為硫醇基。
  12. 一種以表面增強共振拉曼光譜偵測目標物之方法，包括：提供一拉曼散射表面；提供一樣本，該樣本包括欲偵測的目標物，該目標物表面具有一第一分子；使該目標物連接於該拉曼散射表面；提供申請專利範圍第1項之表面增強共振拉曼光譜之探針，該探針的表面更包括一特異連接於目標物之第一分子的第二分子；使該目標物之第一分子與該探針之第二分子特異性連接而使該探針固定於該拉曼散射表面；提供一光束至該拉曼散射表面；及測量該拉曼散射表面的散射光之訊號。
  13. 如申請專利範圍第12項所述之以表面增強共振拉 曼光譜偵測目標物之方法，其中該表面包括一金屬。
  14. 如申請專利範圍第13項所述之以表面增強共振拉曼光譜偵測目標物之方法，其中該金屬選自以下組成之群中的至少一種：Ag、Au及Cu。
  15. 如申請專利範圍第12項所述之以表面增強共振拉曼光譜偵測目標物之方法，更包括使一個或一個以上的探針與該拉曼散射表面接觸，該方法更包括：重複如申請專利範圍第12項之方法複數次，其中每一探針的交聯基長度不同，確認提供理想訊號的交聯基長度。
TW098120031A 2008-06-16 2009-06-16 表面增強共振拉曼散射光譜奈米粒子探針及其使用方法 TWI409457B (zh)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US6171108P 2008-06-16 2008-06-16

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW201003070A TW201003070A (en) 2010-01-16
TWI409457B true TWI409457B (zh) 2013-09-21

Family

ID=42826513

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW098120031A TWI409457B (zh) 2008-06-16 2009-06-16 表面增強共振拉曼散射光譜奈米粒子探針及其使用方法

Country Status (2)

Country Link
US (1) US7989213B2 (zh)
TW (1) TWI409457B (zh)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9512468B2 (en) 2012-11-06 2016-12-06 Industrial Technology Research Institute Detection method uses magnetic and detectable nanoparticles with oligonucleotides attached thereto
CN102914646B (zh) * 2012-11-16 2014-08-20 湖南大学 基于表面等离子体耦合效应的均相多组分免疫分析方法
CA2900686A1 (en) * 2013-02-20 2014-08-28 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Wide field raman imaging apparatus and associated methods
US10912947B2 (en) 2014-03-04 2021-02-09 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Systems and methods for treatment of disease via application of mechanical force by controlled rotation of nanoparticles inside cells
CN104164698B (zh) * 2014-07-25 2016-08-24 中国科学院理化技术研究所 提高单晶氧化锌纳米棒表面增强拉曼散射信号的方法
US10919089B2 (en) 2015-07-01 2021-02-16 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Anisotropic particles, methods and uses thereof
TWI686599B (zh) * 2018-05-24 2020-03-01 國立清華大學 塵蟎抗原檢測系統及方法
CN109406489A (zh) * 2018-11-08 2019-03-01 安徽中科赛飞尔科技有限公司 一种表面增强拉曼散射基底材料及其制备方法和应用
CN109811089A (zh) * 2019-01-02 2019-05-28 南京邮电大学 一种流感病毒基因片段sers检测试剂盒及其制备方法
CN111500682B (zh) * 2020-04-29 2022-11-01 东南大学 基于表面增强拉曼散射光谱技术的dna杂化检测方法
CN114685311B (zh) * 2020-12-29 2024-06-04 华中师范大学 一种偶氮芳香化合物及其应用和一种用于增强拉曼散射信号的试剂
CN113237865B (zh) * 2021-05-10 2023-04-21 江苏师范大学 一种呼出气冷凝液及血清中甲醛的检测方法
CN113916856B (zh) * 2021-10-09 2022-10-04 江南大学 一种荧光-拉曼双模式的纳米传感器及其制备方法与其在硫醇检测中的应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007032241A1 (ja) * 2005-09-12 2007-03-22 Japan Science And Technology Agency 微粒子－タンパク質複合体およびその作製方法、半導体装置、蛍光標識方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007032241A1 (ja) * 2005-09-12 2007-03-22 Japan Science And Technology Agency 微粒子－タンパク質複合体およびその作製方法、半導体装置、蛍光標識方法

Also Published As

Publication number Publication date
TW201003070A (en) 2010-01-16
US20100255599A1 (en) 2010-10-07
US7989213B2 (en) 2011-08-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TWI409457B (zh) 表面增強共振拉曼散射光譜奈米粒子探針及其使用方法
Luan et al. Ultrabright fluorescent nanoscale labels for the femtomolar detection of analytes with standard bioassays
Wang et al. Mixed monolayers on gold nanoparticle labels for multiplexed surface-enhanced Raman scattering based immunoassays
CA2490413C (en) Nanoparticle polyanion conjugates and methods of use thereof in detecting analytes
CN101305280B (zh) 诊断纳米传感器及其在医学中的用途
JP4787938B2 (ja) 銀ナノ粒子を用いた検体検出用センサ
JP6945445B2 (ja) プラズモン特異的結合パートナーアッセイにおけるシグナル増幅
JP7485834B2 (ja) 溶液ベースのプラズモン特異的結合パートナーアッセイにおけるシグナル増幅
KR20230011477A (ko) 용액-기반 플라스몬 특이적-결합 파트너 검정 및 금속성 나노구조체
Pekdemir et al. Ultrasensitive and selective homogeneous sandwich immunoassay detection by Surface Enhanced Raman Scattering (SERS)
KR101470730B1 (ko) 파장-의존성 플라즈몬 공명산란을 이용한 나노바이오칩 키트 및 이를 이용한 생체분자의 검출방법
Xia et al. The simultaneous detection of the squamous cell carcinoma antigen and cancer antigen 125 in the cervical cancer serum using nano-Ag polydopamine nanospheres in an SERS-based lateral flow immunoassay
Ilyas et al. SERS immuno-and apta-assays in biosensing/bio-detection: Performance comparison, clinical applications, challenges
JP5110254B2 (ja) 蛍光測定法と、蛍光測定のための測定用チップ及びその製造方法
Ryu et al. Use of peptide for selective and sensitive detection of an Anthrax biomarker via peptide recognition and surface‐enhanced Raman scattering
Majdinasab et al. Label-free SERS for rapid identification of interleukin 6 based on intrinsic SERS fingerprint of antibody‑gold nanoparticles conjugate
EP1811302A1 (en) Diagnostic nanosensor and its use in medicine
Cordina et al. Rapid and sensitive glycan targeting by lectin-SERS assay
Park et al. Ultrasensitive immunoassays based on surface-enhanced Raman scattering by immunogold labels
Lei et al. A highly sensitive and quantitative detection method for bisphenol A (BPA) by competitive immunoassay based on surface-enhanced Raman spectroscopy
US20220308047A1 (en) Probes comprising metal nanoparticles, magnetic nanoparticles and target-specific fluorophores or binding sites
BR102016004353A2 (pt) Desenvolvimento de sistema de diagnóstico de flavivirus utilizando nanobastões de ouro
Wang Tissue-and cell-based breast cancer diagnostics with iSERS microscopy
Alughare Gold Nanorods Functionalized with DNA Oligonucleotide Probes for Biosensing and Plasmon-Enhanced Fluorescence Detection
Nagamura et al. Enhancement effects of metal nanostructures and metal nanofilms on various emissions by interactions of photons with materials or molecules