CN113237865B - 一种呼出气冷凝液及血清中甲醛的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种呼出气冷凝液及血清中甲醛的检测方法，该方法取一定体积的呼出气冷凝液或血清，加入吸收试剂，混匀后加入衍生化试剂进行反应，得到衍生化溶液；取衍生化溶液与SERS基底混合后，进行拉曼光谱检测。本发明的优点是检测时间短，简单易操作，表面增强拉曼散射可以实现现场实时监测，无需复杂前处理，具有指纹峰特性，灵明度高。甲醛的线性范围为10‑3–5μg/mL，且该方法具有广阔的实际应用价值。

Description

一种呼出气冷凝液及血清中甲醛的检测方法
技术领域
本发明涉及一种呼出气凝液及血清中甲醛的检测方法，具体涉及一种高稳定性SERS基底用于定量检测呼出气冷凝液及血清中的甲醛，属于纳米材料检测技术领域。
背景技术
据了解，由于肺癌起病隐匿，早期症状并不明显，大多数患者就诊时已处于肺癌中后期，这导致我国肺癌的发病率和死亡率急剧上升。因而对肺癌的早期诊断和筛查对于降低肺癌患者的死亡率意义重大。迄今为止，临床上用于肺癌诊断的主要手段有病理学、影像学等，但是这些检测方法具有创伤性、灵敏度低、费用昂贵等缺点，使得早期诊断和筛查面临较大的困难，因此寻找一种无创伤、灵敏度高且成本低廉的检测方法显得尤为迫切。
近年来，随着科技的发展，一种新兴的肺癌早期诊断方法即人体呼出气和血清中醛类物质分析研究受到越来越多的关注。人体中代谢产生的甲醛已被确立为肺癌的生物标志物，目前检测呼出气及血清中醛类物质的主要手段有气相-质谱联用法、选择离子流管质谱法、固相微萃取，但由于呼出气及血清中中醛类物质含量低，且呼出气及血清体系复杂，在利用上述方法检测时往往存在前处理复杂、操作繁琐、耗时长等问题，因此亟需开发一种低成本、操作简单、灵敏度高的手段。表面增强拉曼散射(SERS)是一种将待测物吸附到粗糙的纳米金属表面，可使待测物信号提高106-1015倍的技术。它以独具的指纹峰、特异性强、灵敏度高、水干扰小、取样量小、原位无损检测等优势广泛地应用于食品安全、环境监测、生物医学等领域。目前存在的将SERS应用于甲醛检测的方法主要分为两类，直接法和间接法，直接法如Wen等人[2]多用的是多孔材料，可以克服气体分子难以吸附在固体基质上的限制，以对氨基苯硫酚(4-ATP)为桥梁，利用酰胺反应检测醛，但实验操作繁琐，且基底制备成本高；间接法如Liu等人[3]利用的是醛的还原性质，通过tollen反应将银离子还原成银原子，从而增强基底SERS活性，间接地检测到甲醛分子，这种方法方便快捷，但同时也存在专一性差等缺点。
发明内容
本发明的目的在于：针对上述现有技术存在的不足，提出一种呼出气冷凝液及血清中甲醛的检测方法，该方法采用高稳定性SERS基底实现对醛类物质的高灵敏度、高选择性定量分析。
为了达到以上目的，本发明的技术方案如下：
一种呼出气冷凝液及血清中甲醛的检测方法，包括以下步骤：
步骤1、取一定体积的呼出气冷凝液或血清，加入吸收试剂，混匀后加入衍生化试剂进行反应，得到衍生化溶液；
步骤2、采用酸性衍生方法检测不同浓度甲醛的SERS信号，以获得对应的SERS信号图，以甲醛浓度对数为横坐标，SERS信号值为纵坐标绘制甲醛标准曲线；
步骤3、取步骤1的衍生化溶液与SERS基底混合后，进行拉曼光谱检测，将检测所得SERS信号值代入甲醛标准曲线以获得甲醛含量的实际值；
步骤4、取一组等体积的呼出气冷凝液或血清，分别加入不同浓度的甲醛后，采用酸性衍生方法检测其SERS信号，并将该检测结果与标准曲线进行对比，计算其回收率和相对标准偏差。
本发明通过一种简便的策略，制备了高稳定性的AgTNPs@Fe复合基底，实现了Fe对银纳米三角的包裹。相比于单纯的AgTNPs，该复合基底有更强的抗干扰能力，有利于将其应用于在复杂样品环境中检测，同时Fe的包覆增加了基底表面的粗糙度，使其信号进一步的增强。另外，由于甲醛拉曼截面小不易直接检出，基于此本发明首先采用酸性衍生化方法得到甲醛衍生化产物，再观察其衍生物的特征峰以实现醛类物质的定性定量，并将该方法进一步应用到人体呼出气冷凝液及血清的检测当中。
本发明进一步细化的技术方案如下：
所述步骤2中采用酸性衍生方法检测不同浓度甲醛的SERS信号的具体方法如下：
取一组等体积的吸收试剂，分别吸收不同浓度的甲醛溶液，再加入衍生化试剂进行反应得到衍生化溶液，衍生化溶液分别与SERS基底混合后进行拉曼光谱检测；
所述步骤4中采用酸性衍生方法检测加标呼出气冷凝液或血清SERS信号的具体方法如下：
取一组等体积的呼出气冷凝液或血清，分别加入不同浓度的甲醛并混匀，然后加入到吸收试剂中，随后再加入衍生化试剂进行反应得到衍生化溶液，取衍生化溶液与SERS基底混合，进行拉曼光谱检测。
进一步的，所述SERS基底为AgTNPs@Fe复合材料。
本发明的AgTNPs@Fe复合材料不但具有更高的SERS活性，更为重要的是具有更高的稳定性，尤其是对于卤素离子的耐受力大大增加，从而更加有利于在实际样品中的应用。本发明利用SERS基底结合酸性衍生的方法成功实现了灵敏检测，同时受益于该基底的稳定性，探测了基底对呼出气冷凝液和血清中甲醛检测的可行性，取得了良好的结果。
再进一步的，所述AgTNPs@Fe复合材料为外层包裹Fe的AgTNPs溶液，在AgTNPs表面包裹一层Fe，Fe提高了AgTNPs溶液的稳定性以及抗干扰能力。
更进一步的，所述AgTNPs@Fe复合材料的制备方法如下：
(1)参照文献[1]制备AgTNPs溶液，低温、避光保存备用；
(2)制备AgTNPs@Fe复合材料—在AgTNPs溶液中加入1.5μM Fe2+溶液，95℃水浴加热5分钟，得到AgTNPs@Fe复合材料，离心浓缩20倍后待用。
本发明还提供了一种合成AgTNPs@Fe基底的方法，无需复杂的操作步骤，制备方法简单、快速、成本低。该方法制备的基底在AgTNPs表面原位包覆Fe，克服了AgTNPs本身不稳定、抗干扰能力差的缺点。既提高了AgTNPs的抗卤素离子干扰能力，可应用于复杂体系中的检测，又提高它的SERS活性。
又进一步的，所述吸收试剂为200μg/mL的酚试剂；所述衍生化试剂为质量浓度为1％的硫酸铁铵溶液，该溶液的溶剂采用质量浓度为0.01mol/L的HCl。
进一步的，所述步骤2中采用酸性衍生方法检测不同浓度甲醛的SERS信号的具体方法如下：
取一组体积为5mL、浓度为200μg/mL的酚试剂，分别吸收不同浓度的甲醛溶液，再加入750μL衍生化试剂反应30min得到衍生化溶液，然后取5μL衍生化溶液与250μL浓缩20倍的SERS基底混合，采用BWS415-785S拉曼仪检测，激发波长为785nm；
所述步骤4中采用酸性衍生方法检测加标呼出气冷凝液或血清SERS信号的具体方法如下：
取一组等体积的呼出气冷凝液或血清，分别加入不同浓度的甲醛并混匀，然后加入到体积为5mL、浓度为200μg/mL的酚试剂中，随后再加入750μL衍生化试剂反应30min得到衍生化溶液，取5μL衍生化溶液加入到250μL浓缩20倍的SERS基底中，混匀，进行拉曼光谱检测，平行实验三次，将所得结果与标准结果对比，算其回收率和相对标准偏差(RSD)。
本发明采用酸性化学衍生化方法，通过拉曼光谱仪追踪甲醛衍生物的特征峰，从而实现其定性定量检测。本发明的检测原理如下：AgTNPs得益于其高活性尖端、各向异性的形貌，有望作为一种高活性的SERS基底。然而，AgTNPs极易受外界环境干扰，更易氧化刻蚀，导致其SERS信号不稳定，从而限制了其检测时的可靠性和准确性。因而本发明提出一种引入Fe2+改善其稳定性的方法，当在银纳米三角溶液中加入Fe2+时，银纳米表面残留的Ag+能迅速将Fe2+氧化成Fe3+，Fe3+极易水解为Fe(OH)3，进而实现了对AgTNPs的原位包覆，在后续对其进行加热处理，使AgTNPs表面包裹的Fe(OH)3更加紧实，进一步提高AgTNPs@Fe的稳定性，以此作为SERS基底。并且高稳定性的SERS基底与酸性化学衍生方法结合，实现对甲醛的定性定量分析。
本发明提供了一种定量检测甲醛的方法，该方法检测时间短，简单易操作，表面增强拉曼散射可以实现现场实时监测，无需复杂前处理，具有指纹峰特性，灵明度高。甲醛的线性范围为10-3–5μg/mL，且该方法具有广阔的实际应用价值。
附图说明
下面结合附图对本发明作进一步的描述。
图1a为加入20μM Fe2+前后AgTNPs的紫外可见光谱图；图1b为AgTNPs表面包裹Fe的x射线光电子能谱图；图1c为AgTNPs的TEM表征图；图1d为加入Fe2+的AgTNPs的TEM表征图。
图2为加入不同浓度Fe2+对AgTNPs的SERS活性的影响效果图。
图3为不同浓度4-ATP的SERS光谱图。
图4为4-ATP在1077cm-1特征峰处信号强度与浓度对数的线性关系图。
图5为10-5M 4-ATP在AgTNPs、AgTNPs@Fe复合基底上的SERS光谱图以及10M 4-ATP的拉曼光谱图。
图6a为分别加入不同浓度Cl-(200μM、500μM、1mM、2mM、5mM、10mM)，加热前后AgTNPs@Fe复合基底的相对变化程度对比图；图6b为分别加入不同浓度Cl-(10μM、20μM、50μM、100μM、200μM、500μM、1mM、2mM、5mM)，AgTNPs和AgTNPs@Fe复合基底的相对变化程度对比图；图6c为分别加入不同浓度Br-(0.2μM、0.5μM、1μM、2μM、5μM、10μM、20μM、50μM、100μM)，AgTNPs和AgTNPs@Fe复合基底的相对变化程度对比图；图6d为分别加入不同浓度I-(0.1μM、0.2μM、0.5μM、1μM、2μM、5μM、10μM、20μM、50μM)，AgTNPs和AgTNPs@Fe复合基底的相对变化程度对比图。
图7为不同浓度甲醛SERS光谱图。
图8为甲醛在1275cm-1特征峰处信号强度与浓度对数的线性关系图。
具体实施方式
下面结合实施例及说明书附图对本发明进行详细说明，本发明中所涉及的“溶液”如无特殊说明均为各物质溶于去离子水形成的水溶液。
实施例1一种AgTNPs@Fe复合基底的制备
(1)参照文献[1]合成AgTNPs溶液，4℃避光保存待用。
(2)AgTNPs@Fe复合材料的制备：在银纳米三角溶液中加入1.5μM Fe2+溶液，在95℃水浴加热5分钟，得AgTNPs@Fe复合材料。离心浓缩20倍后待用。
(3)实验可行性研究：AgTNPs得益于其高活性尖端、各向异性的形貌，有望用于SERS检测中。但AgTNPs更易受外界干扰，易氧化刻蚀。因而本实施例提出一种引入Fe2+改善其稳定性的方法，如图1a所示，当加入20μM Fe2+溶液时，银纳米三角的LSPR峰值红移了60nm左右，这就导致LSPR峰值红移的原因可能是纳米粒子发生聚集或外层包裹了一层物质导致粒径增大，而纳米粒子的聚集往往会伴随吸收峰变宽或者峰值下降，而在加入Fe2+前后峰形无明显变化，所以推测出加入Fe2+可能会导致银纳米三角被包裹。为了验证这一想法，将加入Fe2+前后的银纳米三角用TEM进行形貌表征，如图1c和图1d所示，加入Fe2+后银纳米三角表面包裹了一层壳状物质，为了验证壳状物质中Fe元素的存在及其价态，将AgTNPs@Fe样品进行了XPS测试，结果如图1b所示，710.3eV和724.0eV两处的峰可归属于Fe3+的Fe 2p1/2和Fe2p3/2，从而得出银纳米三角表面的Fe呈三价状态，基于以上表征，推断出当在AgTNPs溶液中加入Fe2+时，AgTNPs表面残留的Ag+会将Fe2+氧化为Fe3+，而Fe3+极易水解，从而实现对AgTNPs原位包覆。
为了考察加入不同浓度Fe2+对AgTNPs@Fe复合材料SERS活性的影响，将AgTNPs与不同浓度的Fe2+进行孵育，并且分别将其浓缩20倍，并加入5μM信号分子对氨基苯硫酚(4-ATP)进行表征，用BWS415-785S拉曼仪检测，激发波长为785nm，以便于对其SERS活性进行考察。如图2所示，加入高浓度Fe2+溶液(8μM、15μM、50μM)时，SERS活性较差，这可能是因为外层包裹的Fe壳太厚，无法激发AgTNPs产生局域表面等离子体共振，从而没有SERS增强效果，而低浓度Fe2+(1μM、1.5μM、2μM、4μM)加入后，SERS效果较好且比单纯AgTNPs的信号还要强，这就可以推断出是因为在银纳米三角表面半包裹或包裹一层很薄的Fe壳，在一定程度上增加了其表面粗糙度，因而SERS“热点”也会增多。因此以加入1.5μMFe2+的AgTNPs作为SERS基底，即可获得高活性的AgTNPs@Fe。
对加热前后AgTNPs@Fe溶液的抗干扰能力是否有提升进行考察。在加热前后的AgTNPs@Fe溶液中分别加入不同浓度的Cl-，浓缩10-20倍后通过1μM 4-ATP表征，通过拉曼光谱仪检测，以SERS信号的相对变化值∣△I/I0∣为纵坐标，LogCCl -为横坐标建立直角坐标系，如图6a所示，加入200μM、500μM Cl-对加热前后AgTNPs@Fe溶液SERS信号影响不大，而在加入高浓度Cl-(1mM、2mM、5mM、10mM)时，未加热的AgTNPs@Fe SERS变化值较大，抗干扰能力较差，这是由于加热使AgTNPs外层包裹的Fe(OH)3更加紧实，从而提高了AgTNPs@Fe的稳定性和抗干扰能力。
(4)SERS灵敏度考察：将最优Fe2+浓度下且95℃加热5min后所得的AgTNPs@Fe复合基底浓缩20倍，接下来选取常见的信号分子4-ATP来评估AgTNPs@Fe复合材料的SERS灵敏度，即加入不同浓度信号分子4-ATP进行表征，用拉曼光谱仪检测。如图3所示，4-ATP在1077cm-1处特征峰归因于C-S拉伸振动和C-C拉伸振动，1179cm-1归因于C-H面内弯曲振动，1490cm-1处可归因于C-H面内弯曲振动和C-C拉伸运动，1595cm-1归因于C-C拉伸振动。此外，4-ATP在1077cm-1处SERS峰强与浓度对数呈线性关系。由图4可以看出，在0.05–50μM浓度范围内，其线性方程为I1077＝4261LogC4-ATP+9807，线性相关系数R2为0.97。上述结果表明本实施例制备的AgTNPs@Fe复合材料具有较高的灵敏度。
(5)基底增强因子的计算：计算增强因子是表面增强拉曼散射的一个重要表征性能的指数，其计算公式如下：EF＝(ISERS/CSERS)/(IRaman/CRaman)，公式中ISERS、IRaman分别表示为1077cm-1峰值下SERS强度和4-ATP溶液的对应强度(如图4所示)，CSERS、CRaman分别表示为SERS和正常测量中4-ATP的浓度。将图5中的各项数值分别计算得出AgTNPs和AgTNPs@Fe复合材料的增强因子，EF分别为3.5×105、1.5×106。
(6)抗干扰能力考察：人体血清中含有高浓度的卤素离子(Cl-、Br-、I-)，而卤素离子对AgTNPs有强作用，因而对AgTNPs@Fe的抗卤素离子干扰能力进行了评估：分别加入不同浓度的卤素离子于AgTNPs溶液和AgTNPs@Fe复合基底溶液中，浓缩10-20倍，1μM信号分子4-ATP表征后，用拉曼光谱仪检测。以Cl-为例，分别加入10μM-5mM Cl-于AgTNPs和AgTNPs@Fe复合材料溶液中，离心浓缩20倍，用1μM 4-ATP表征，由于两种材料加入相同浓度的4-ATP响应不同，以∣△I/I0∣为纵坐标，LogCCl -为横坐标建立直角坐标系，考察两种材料对Cl-的抗干扰能力，由图6a可见，在10μM-5mM Cl-浓度范围内，制备的AgTNPs@Fe复合材料抗干扰能力明显强于单纯的AgTNPs，同理可得，图6b和图6c分别证明，在0.2μM-100μMBr-，以及0.1μM-50μM I-浓度范围内，AgTNPs@Fe复合材料有较强的抗干扰能力。
实施例2 AgTNPs@Fe复合基底用于呼出气冷凝液及血清中甲醛的加标检测
(1)酸性衍生方法检测甲醛：采用酸性衍生方法检测不同浓度甲醛的SERS信号，以获得对应的SERS信号图。具体为：5mL浓度为200μg/mL酚试剂吸收不同浓度的甲醛溶液，加入750μL 1％的硫酸铁铵溶液(采用0.01mol/L HCl为溶剂)，反应30分钟后，取5μL衍生化溶液与250μL AgTNPs@Fe复合基底混合，用BWS415-785S拉曼仪检测，激发波长为785nm。
(2)标准曲线的绘制：图7为不同浓度甲醛的SERS光谱图，从图中可以观察到SERS信号随着分析物浓度的增加而单调增加。在875cm-1、1275cm-1、1401cm-1和1511cm-1处观察到四个稳定的特征峰。875cm-1处特征峰归因于C-H环外平面的振动和弯曲振动，1275cm-1和1401cm-1处特征峰分别归因于＝C-N和＝N-N拉伸振动。1511cm-1处特征峰归因于苯环骨架的振动。并且在1275cm-1特征峰处的强度与浓度对数呈线性关系，因此以甲醛浓度对数为横坐标，1275cm-1特征峰处的SERS信号值为纵坐标绘制甲醛标准曲线。如图8所示，在甲醛10-3-5μg/mL浓度范围内，其线性方程为I1275＝9618LogC甲醛+26475，线性相关系数R2为0.93。
(3)取一定体积的呼出气冷凝液或血清，加入5mL浓度为200μg/mL酚试剂，混匀后加入750μL 1％的硫酸铁铵溶液(采用0.01mol/L HCl为溶剂)，反应30min，得到衍生化溶液。取5μL衍生化溶液与250μL AgTNPs@Fe SERS基底混合，进行拉曼光谱检测，将检测所得SERS信号值代入甲醛标准曲线以获得甲醛含量的实际值。
(4)呼出气冷凝液和血清中甲醛的加标检测：为了验证实验方法的实用性，采用加标算回收率的方法，在呼出气冷凝液中和血清中加入不同浓度的甲醛。如表1所示，分别选取了甲醛的三种浓度并保证被选取浓度都在甲醛的标曲浓度范围内，将所得强度值分别代入标曲内算其实际值，用实际值/标准值得到回收率，由表1可得，其回收率均在90-120％范围内，且相对标准偏差RSD值都较小，由此证明该实验方法可以检测出呼出气冷凝液和血清中的甲醛且重复性高，有潜在的应用前景。
表1呼出气冷凝液和血清中甲醛的加标检测
Figure GDA0003155774420000101
Figure GDA0003155774420000111
参考文献
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除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。

Claims (3)

1.在一种呼出气冷凝液及血清中甲醛的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、取一定体积的呼出气冷凝液或血清，加入吸收试剂，混匀后加入衍生化试剂进行反应，得到衍生化溶液；
步骤2、采用酸性衍生方法检测不同浓度甲醛的SERS信号，以获得对应的SERS信号图，以甲醛浓度对数为横坐标，SERS信号值为纵坐标绘制甲醛标准曲线；采用酸性衍生方法检测不同浓度甲醛的SERS信号的具体方法如下：
取一组等体积的吸收试剂，分别吸收不同浓度的甲醛溶液，再加入衍生化试剂进行反应得到衍生化溶液，衍生化溶液分别与SERS基底混合后进行拉曼光谱检测；
所述SERS基底为AgTNPs@Fe复合材料；所述AgTNPs@Fe复合材料为外层包裹Fe的AgTNPs溶液；所述AgTNPs@Fe复合材料的制备方法如下：
（1）制备AgTNPs溶液，低温、避光保存备用；
（2）制备AgTNPs@Fe复合材料—在AgTNPs溶液中加入1.5 μM Fe2+溶液，95℃水浴加热5分钟，得到AgTNPs@Fe复合材料，离心浓缩20倍后待用；
步骤3、取步骤1的衍生化溶液与SERS基底混合后，进行拉曼光谱检测，将检测所得SERS信号值代入甲醛标准曲线以获得甲醛含量的实际值；
步骤4、取一组等体积的呼出气冷凝液或血清，分别加入不同浓度的甲醛后，采用酸性衍生方法检测其SERS信号，并将该检测结果与标准曲线进行对比，计算其回收率和相对标准偏差；
采用酸性衍生方法检测加标呼出气冷凝液或血清SERS信号的具体方法如下：
取一组等体积的呼出气冷凝液或血清，分别加入不同浓度的甲醛并混匀，然后加入到吸收试剂中，随后再加入衍生化试剂进行反应得到衍生化溶液，取衍生化溶液与SERS基底混合，进行拉曼光谱检测。
2.根据权利要求1所述一种呼出气冷凝液及血清中甲醛的检测方法，其特征在于，所述吸收试剂为200μg/mL的酚试剂；所述衍生化试剂为质量浓度为1%的硫酸铁铵溶液，该溶液的溶剂采用质量浓度为0.01mol/L的HCl。
3.根据权利要求1所述一种呼出气冷凝液及血清中甲醛的检测方法，其特征在于，所述步骤2中采用酸性衍生方法检测不同浓度甲醛的SERS信号的具体方法如下：
取一组体积为5mL、浓度为200μg/mL的酚试剂，分别吸收不同浓度的甲醛溶液，再加入750 μL衍生化试剂反应30min得到衍生化溶液，然后取5 μL衍生化溶液与250 μL 浓缩20倍的SERS基底混合，采用BWS415-785S拉曼仪检测；
所述步骤4中采用酸性衍生方法检测加标呼出气冷凝液或血清SERS信号的具体方法如下：
取一组等体积的呼出气冷凝液或血清，分别加入不同浓度的甲醛并混匀，然后加入到体积为5mL、浓度为200μg/mL的酚试剂中，随后再加入750 μL衍生化试剂反应30min得到衍生化溶液，取5 μL衍生化溶液加入到250 μL 浓缩20倍的SERS基底中，混匀，进行拉曼光谱检测，平行实验三次，将所得结果与标准结果对比，算其回收率和相对标准偏差。
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