WO2007032241A1 - 微粒子－タンパク質複合体およびその作製方法、半導体装置、蛍光標識方法 - Google Patents

微粒子－タンパク質複合体およびその作製方法、半導体装置、蛍光標識方法 Download PDF

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listeria
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Definitions

  • Microparticle-protein complex and method for producing the same, semiconductor device, fluorescent labeling method
  • the present invention relates to a microparticle-protein complex and a method for producing the same.
  • FIG. 1 is a view showing the characteristics of ferritin (apoferritin) and listeria ferritin (listeria apoferritin).
  • Ferritin is a globule-like protein with a diameter of about 12 nm (in the case of Uma) which is abundant in liver, spleen and heart in mammals, and 24 subunit subunits 3 consisting of 175 amino acid residues are collected 1 Form one protein molecule! The molecular weight of one protein molecule is 480 kDa.
  • Ferritin has a core 1 which has a diameter of at most 7 nm and which also has an iron-iron strength inside a shell 2 which also has a protein strength in vivo. The one from which the core 1 of ferritin's acid iron is missing is called apoferritin.
  • Listeria ferritin is a Dps-like protein derived from Listeria monocytogenes, is composed of 12 monomer subunits 9, and is spherical with a diameter of about 9 nm. Like apoferritin, Listeria ferritin also has a cavity inside the outer shell 7 capable of storing the iron / iron core 6, and the cavity diameter is about 4 nm. In addition, those in which the Core 6 which is a ferric oxide also loses the Listeria ferritin potency are called Listeria apoferritin.
  • Apoferritin can form a core which also has various metal forces instead of the core which also has an acid and iron strength. For this reason, complexes of apoferritin and microparticles having various metal powers such as cobalt (Co), manganese (Mn), nickel (Ni), etc. have been produced up to now. Use of Listeria apoferritin also for the formation of microparticles consisting of various metals Can.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2003-113198
  • An object of the present invention is to produce fine particles which are made of a compound semiconductor and capable of emitting light.
  • microparticle-protein complex of the present invention is composed of a plurality of monomer subunits.
  • the fine particle-protein complex can be used not only for the preparation of a semiconductor device utilizing the quantum effect of the fine particle consisting of a semiconductor but also for the method of labeling a biological substance by utilizing the generation of fluorescence. Can.
  • ferritin family proteins such as apoferritin and listeria apoferritin and recombinants thereof are preferably used.
  • Examples of the material of the fine particles include CdS and ZnS which are compound semiconductors of type II VI.
  • the diameter of the microparticles is about 7 nm or less when apoferritin is used, and about 4 nm or less when listeria apoferritin is used.
  • the method for producing a microparticle-protein complex of the present invention comprises the step (a) of forming an ammonium complex of a metal in an aqueous solution, and a solution of protein having a cavity formed therein and thioacetic acid. Of the metal in the aqueous solution of the metal And (b) forming fine particles of an object.
  • ammonium complex prevents the formation of metal sulfate outside the protein, and the thioacetic acid is also released gradually by the S 2 -ion. It is believed that metal sulfates with good crystallinity can be formed in proteins.
  • proteins ferritin family proteins such as apoferritin and listeria apoferritin are preferably used, and as metals, Cd or Zn is preferably used.
  • a semiconductor storage device using a particle is realized by using the particle-protein complex produced by the above-described method, or a biological substance or the like is labeled using fluorescence emitted from the particle. It is possible to
  • microparticle-protein complex produced by the method of the present invention can be used in various fields such as production of semiconductor devices and labeling of biological substances and the like. Brief description of the drawings
  • FIG. 1 shows the characteristics of ferritin (apoferritin) and listeria ferritin.
  • FIG. 2 (a) is a flowchart showing a method of producing a compound semiconductor apoferritin complex according to the first embodiment of the present invention
  • FIG. 2 (b) is a diagram showing final concentrations of each reagent. is there.
  • Fig. 3 is a transmission electron microscope (TEM) photograph showing apoferritin in the reaction solution when using thiourea as a source of thiourea
  • Fig. 3 (b) is a photo of thioacetic acid as a source of iodophor. It is a TEM photograph which shows the apoferritin in the reaction liquid at the time of using.
  • TEM transmission electron microscope
  • FIG. 4 is a TEM photograph showing the CdS apoferritin complex when the ammonia concentration in the reaction solution is changed.
  • FIG. 5 is a diagram showing a fluorescence spectrum of a CdS apoferritin complex.
  • FIG. 6 (a) to (c) of FIG. 6 show the results of measurement of the particle diameter of CdS fine particles formed in apoferritin under each condition.
  • FIG. 7 shows the S 2 ⁇ ion concentration and pH in the reaction solution when using thiourea
  • FIG. 7 (b) shows the reaction solution when using thioacetic acid Indicates the concentration of S 2-in the medium and the pH
  • FIG. 8 is a view for explaining a reaction mechanism in the method for producing a CdS apoferritin complex according to the first embodiment.
  • FIG. 9 (a) is a flow chart showing a method for producing a compound semiconductor-apoferritin complex according to the second embodiment of the present invention
  • FIG. 9 (b) is a drawing showing the final concentration of each reagent. is there.
  • FIG. 10 is a transmission electron microscope (TEM) photograph showing apoferritin in the reaction solution when using thiourea as a thio source
  • FIG. 10 (b) is a thioacetate as a source. It is a TEM photograph which shows the apoferritin in the reaction liquid when using for V ,.
  • TEM transmission electron microscope
  • FIG. 11 is a diagram showing a fluorescence spectrum of a ZnS apoferritin complex.
  • FIG. 12 (a) is a flowchart showing a method of producing a compound semiconductor listeria apoferritin complex according to the third embodiment of the present invention
  • FIG. 12 (b) shows final concentrations of respective reagents. It is a figure
  • (c) is a figure showing the final concentration of each reagent in the preparation method of compound semiconductor listeria apoferritin complex concerning the modification of a 3rd embodiment.
  • FIG. 13 is a diagram showing the core formation rate when the conditions of the method for forming CdS Listeria apoferritin complex are changed.
  • FIG. 14 (a) is a flow chart showing a method of producing a compound semiconductor-listeria apoferritin complex according to the fourth embodiment of the present invention, and (b) shows the final concentration of each reagent. It is a figure and (c) is a figure showing the final concentration of each reagent in the preparation method of compound semiconductor listeria apoferritin complex concerning the modification of a 4th embodiment.
  • FIG. 15 shows the amount of protein remaining in the supernatant of the reaction solution when using commercially available apoferritin (without deletion) and Fer8 apoferritin.
  • FIG. 16 is a diagram showing a fluorescence spectrum of CdS-Fer8 apoferritin complex when the ammonia concentration in the reaction solution is 7.5 mM, 37.5 mM and 75 mM.
  • FIG. 17 is a diagram comparing the proportion of core formation in apoferritin between the cases where apoferritin was used and the case where Fer8 apoferritin was used.
  • FIG. 18 is a cross-sectional view showing a semiconductor device according to a sixth embodiment of the present invention.
  • FIGS. 19A to 19F illustrate a method of manufacturing a semiconductor device according to a sixth embodiment. Is a cross-sectional view of FIG.
  • FIGS. 20 (a) to 20 (g) are diagrams for explaining the first fluorescent labeling method of the seventh embodiment of the present invention.
  • FIGS. 21A and 21B are diagrams for explaining a second fluorescent labeling method according to the seventh embodiment.
  • 22 (a) to 22 (c) are diagrams schematically showing a fluorescent labeling method for a substrate according to an eighth embodiment of the present invention.
  • FIG. 23 is a flowchart showing a method of producing a compound semiconductor apoferritin complex according to a ninth embodiment of the present invention.
  • FIG. 24 (a) is a diagram showing the diameter of CdS fine particles produced using the method according to the ninth embodiment, and (b) is a diagram showing the diameter formed by the method according to the first embodiment. It is a TEM photograph of a CdS apoferritin complex, and (c) is a TEM photograph of a CdS apoferritin complex formed by the method of the present embodiment.
  • FIG. 2 (a) is a flow chart showing a method for producing a compound semiconductor apoferritin complex according to the first embodiment of the present invention
  • FIG. 2 (b) is a drawing showing the final concentration of each reagent.
  • an ammonium acetate solution and a cadmium acetate solution are mixed. Specifically, 300 mL of pure water is mixed with 1 M ammonium acetate, 1 M ammonia water, and 100 mM cadmium acetate solution. The final concentration of ammonia acetate is 40 mM, the final concentration of ammonia is 7.5 mM, 37.5 mM, 75 mM, and the final concentration of cadmium acetate is ImM, and each reagent is mixed. Thereafter, the apoferritin solution is added to the reaction solution.
  • an appropriate concentration of apoferritin solution is added to the reaction solution to a final concentration of, for example, 0.3 mg ZmL.
  • concentration of the reagent used in the method of the present embodiment is not limited to the one exemplified here!
  • step S2 the reaction solution prepared in step S1 is allowed to stand at room temperature for 10 minutes. This forms an ammonium complex of cadmium.
  • step S3 thioacetic acid (CH2OS) is added to the reaction solution.
  • CH2OS thioacetic acid
  • the apoferritin used in the present embodiment is apoferritin derived from the spleen of kuma. Furthermore, this apoferritin is composed of two types of monomer subunits, L subunit and H subunit. There is.
  • step S4 the reaction solution is left at room temperature for 12 hours or more to form a CdS-apoferritin complex.
  • the pH at this time should be 4.0 or more and 9.0 or less.
  • the final concentration of each reagent is not limited to the above-mentioned value.
  • An example of the concentration range of each reagent is as shown in FIG. 2 (b).
  • the concentration of ammonium acetate is not limited to 40 mM.
  • the reaction time in step S4 may be about 24 hours.
  • FIG. 3 (a) is a transmission electron microscope (TEM) photograph showing apoferritin in the reaction solution when using thiourea as a thio source
  • FIG. 3 (b) is a thioacetate as a source. It is a TEM photograph which shows the apoferritin in the reaction liquid at the time of using.
  • FIG. 4 is a TEM photograph showing the CdS-apoferritin complex when the concentration of ammonia in the reaction solution is changed.
  • FIG. 5 is a diagram showing a fluorescence spectrum of a CdS-apoferritin complex.
  • the fluorescence spectrum of the CdS-apoferritin complex when excited with light of wavelength 350 nm in a reaction solution in which the concentration of the CdS-apoferritin complex is 0.5 mg ZmL is shown.
  • the peak around the wavelength of 440 nm to 450 nm is considered to be fluorescence by apoferritin.
  • ammonia concentrations of 37.5 mM and 75 mM fluorescence was observed at around 560 nm, 610 nm and 640 nm, which is considered to be due to CdS fine particles.
  • FIGS. 6 (a) to 6 (c) show the results of measurement of the particle diameter of CdS microparticles formed in apoferritin under each condition. This is the result of analyzing a TEM image using particle size analysis software.
  • CdS microparticles of different particle sizes can be formed by adjusting the ammonia concentration in the reaction solution. Furthermore, according to the method of the present embodiment, it is also important to be able to form fine particles having a uniform particle size as compared with the case of forming fine particles by other methods.
  • the CdS-apoferritin complex produced by the method of the present embodiment is composed of a large number (24) of monomer subunits 3, and is internally voided. It comprises an outer shell 2 in which a (holding portion) is formed, and a core (fine particle) 1 which is made of CdS formed in the cavity of the outer shell 2 and emits fluorescence when excited.
  • FIG. 7 (a) is a diagram showing the S 2 ⁇ ion concentration and pH in the reaction solution when using thiourea
  • FIG. 7 (b) is the reaction solution when using thioacetic acid.
  • FIG. 6 is a graph showing the concentration of S 2 ⁇ and pH of FIG. 8 is a view for explaining a reaction mechanism in the method for producing a CdS-apoferritin complex of the present embodiment. In addition, in FIG. 7, it measures using the reaction liquid which does not contain Cd ion.
  • step SI shown in FIG. 2 (a) a solution containing ammonium ions and acetate ions such as acetic acid to which ammonium ions have been added instead of ammonium acetate solution is used.
  • S-Apoferritin complexes can be formed.
  • step S2 and step S4 shown in FIG. 2 (a) the reaction solution was left at room temperature, but it is possible to form a complex CdS-apoferritin complex even at a temperature other than room temperature. It is.
  • thioacetate is most preferable as a source of sulfur, but ammonium sulfate ((NH 2) S)
  • Erytin complexes can be formed. If the reaction time is extended, although CdS-apoferritin complex is formed to some extent by using thiourea, the number of complex formation is small and it is not practical.
  • apoferritin derived from umula spleen is used, but apoferritin derived from other organs (heart, liver, etc.) may be used, or apoferritin from another organism may be used. Even when used, the CdS-apoferritin complex can be formed in the same manner as in this embodiment.
  • the CdS-apoferritin complex of the present embodiment can be used in various fields such as a semiconductor memory device using fine particles of CdS and a marker using characteristics that emit fluorescence. It is.
  • FIG. 9 (a) is a flow chart showing a method for producing a compound semiconductor-apoferritin complex according to a second embodiment of the present invention
  • FIG. 9 (b) is a drawing showing the final concentration of each reagent.
  • ZnS zinc sulfate
  • an ammonium acetate solution and a zinc acetate solution are mixed. Specifically, 300 mL of pure water is mixed with 1 M ammonia acetate, 1 M ammonia water, and 100 mM zinc acetate solution. The reagents are mixed such that the final concentration of ammonium acetate is 40 mM, the final concentration of ammonia is 7.5-75 mM, and the final concentration of zinc acetate is 1 mM. Thereafter, the apoferritin solution is added to the reaction solution. Specifically, apoferritin solution of appropriate concentration is adjusted to a final concentration of, for example, 0.3 mg ZmL! The concentrations of the reagents used in the method of the present embodiment are not limited to those exemplified here.
  • step S12 the reaction solution prepared in step S11 is left at room temperature for 10 minutes. From this point, an ammonium complex of zinc is formed.
  • step S13 thioacetic acid is added to the reaction solution. Specifically, thioacetic acid is added to the reaction solution to a final concentration of 10 mM.
  • the apoferritin used in the present embodiment is apoferritin derived from umula spleen.
  • step S14 the reaction solution is left at room temperature for 12 hours or more to form a ZnS-apoferritin complex.
  • the pH at this time should be 4.0 or more and 9.0 or less.
  • ZnS formed in apoferritin is partially zinc other than ZnS such as ZnS.
  • reaction time in step S14 may be about 24 hours.
  • each reagent is not limited to the above-mentioned value.
  • An example of the concentration range of each reagent is as shown in FIG. 9 (b).
  • the final concentration of apoferritin in the reaction solution is 0.3 mg / mL. It is possible to form a ZnS-apoferritin complex even if it is out of the range above 1 mg ZmL.
  • the concentration of ammonium acetate is not limited to 40 mM.
  • FIG. 10 (a) is a transmission electron microscope (TEM) photograph showing apoferritin in the reaction solution when thiourea is used as a thio source
  • FIG. 10 (b) is a photo of thioacetic acid as a source. It is a TEM photograph which shows apoferritin in the reaction liquid at the time of having
  • a core formed of zinc sulfate containing ZnS in apoferritin can be formed.
  • thiourea was used as a source of thioacetate instead of thioacetic acid
  • apoferritin hardly formed a core composed of zinc sulfide.
  • ammonia concentration in the reaction solution was changed to 1.
  • OmM to 100 mM
  • a ZnS-apoferritin complex could be formed (not shown).
  • FIG. 11 is a diagram showing a fluorescence spectrum of a ZnS-apoferritin complex.
  • a fluorescence spectrum when ZnS fine particles are excited with light of wavelength 325 nm in a reaction solution containing a ZnS-apoferritin complex is shown.
  • the peak in the region of 400 nm or less in wavelength is considered to be fluorescence independent of ZnS particles from the comparison with the blank sample of 150 mM NaCl solution.
  • the concentration of ammonia was in the range of 7.5 mM to: LO OmM, and in the wavelength range of 400 nm to 500 nm, the fluorescence considered to be due to the ZnS fine particles was observed.
  • the ZnS-apoferritin complex produced by the method of the present embodiment is composed of a large number (24) of monomer subunits 13 as shown in FIG. 10 (b), and a cavity is formed therein.
  • the ZnS-apoferritin complex according to the present embodiment can be used in various fields such as a semiconductor memory device using fine particles of ZnS and a marker using the property of emitting fluorescence.
  • step SI 2 and step S 14 shown in FIG. 9 (a) the reaction solution was left at room temperature, and 1S was left at room temperature even if it was an ammonium complex or ZnS-apoferritin complex even at a temperature other than room temperature. form It is possible to
  • thioacetic acid is most preferable as a source of sulfur, but ammonium sulfate ((NH 2) S)
  • Erytin complexes can be formed.
  • apoferritin from other organs such as heart and liver
  • apoferritin from another organism may be used. Even in this case, it is possible to form a ZnS apoferritin complex under the same conditions as in this embodiment.
  • FIG. 12 (a) is a flow chart showing a method for producing a compound semiconductor listeria apoferritin complex according to the third embodiment of the present invention
  • FIG. 12 (b) is a drawing showing the final concentration of each reagent. .
  • a method for forming CdS microparticles in listeria apoferritin is described.
  • an ammonium acetate solution and a cadmium acetate solution are mixed. Specifically, 300 mL of pure water is mixed with 1 M ammonia acetate, 1 M ammonia water, and 100 mM cadmium acetate solution. Each reagent is mixed so that the final concentration of ammonium acetate is 40 mM, the final concentration of ammonia is 7.5-75 mM, and the final concentration of cadmium acetate is ImM. Thereafter, the Listeria apoferritin solution is added to the reaction solution. Specifically, an appropriate concentration of Listeria apoferritin solution is added to the reaction solution to a final concentration of, for example, 0.3 mg ZmL.
  • concentrations of the reagents used in the method of the present embodiment are not limited to those exemplified here.
  • step S22 the reaction solution prepared in step S21 is left at room temperature for 10 minutes. This forms an ammonium complex of cadmium.
  • step S23 thioacetic acid is added to the reaction solution. Specifically, thioacetic acid is added to the reaction solution to a final concentration of 5: LOmM. In addition, it is used in this embodiment.
  • Listeria apoferritin is a Dps-like protein derived from Listeria monocytogenes and a mutant protein thereof.
  • step S24 the reaction solution is left at room temperature for 12 hours or more to form a CdS apoferritin complex.
  • the pH at this time should be 4.0 or more and 9.0 or less.
  • each reagent is not limited to the values described above.
  • An example of the concentration range of each reagent is as shown in FIG. 12 (b).
  • the concentration of ammonium acetate is not limited to 40 mM.
  • the CdS Listeria apoferritin complex prepared by the above method is composed of 12 monomer subunits of Listeria poferritin, and is composed of an outer shell having a cavity formed therein and CdS formed in the cavity. It is equipped with particles. The diameter of the microparticles is about 5 nm or less.
  • FIG. 12C is a view showing the preparation conditions of a compound semiconductor listeria apoferritin complex according to a modification of the third embodiment.
  • an ammonium acetate solution, a cadmium acetate solution, ammonia water, and so on have concentrations as shown in FIG. 12 (c).
  • the reaction temperature is 0 to 15 ° C. In particular, about 4 ° C. is preferable.
  • step S23 thioacetic acid is added to the reaction solution so as to have the concentration shown in FIG. 12 (a).
  • concentrations of cadmium acetate and thioacetic acid be higher than those of the method of the third embodiment.
  • step S24 the reaction solution is left at 0 ° C. to 15 ° C. for 12 hours or more to form a CdS-listeria apoferritin complex.
  • FIG. 13 is a diagram showing the core formation rate when the conditions of the method of forming the CdS-listeria apoferritin complex are changed. From the results, it can be seen that the core formation rate can be improved by reacting at 4 ° C. than when reacting at 25 ° C., and at low temperatures, the one having a higher cadmium acetate concentration (that is, cadmium concentration) in the reaction solution is the core. It can be seen that the formation rate can be improved. In particular, when the concentration of cadmium is 3 mM, the core formation rate is almost 100%. When the cadmium concentration is raised at 25 ° C, the CdS precipitation outside the Listeria apoferritin is increased, and no improvement in the core formation rate is observed. Therefore, CdS precipitation can be achieved by increasing the cadmium concentration while keeping the temperature low. It is presumed that the rate of formation of microparticles within the Listeria apoferritin will increase.
  • CdS fine particles can be produced more reliably. Therefore, the cost can be reduced at the time of fine particle production.
  • FIG. 14 (a) is a flow chart showing a method of producing a compound semiconductor-listeria apoferritin complex according to the fourth embodiment of the present invention
  • FIG. 14 (b) is a drawing showing the final concentration of each reagent. is there.
  • a method of forming fine particles of zinc sulfate (ZnS) in a listeria apoferritin will be described.
  • an ammonium acetate solution and a zinc acetate solution are mixed. Specifically, 300 mL of pure water is mixed with 1 M ammonia acetate, 1 M ammonia water, and 50 mM zinc acetate solution. Each reagent is mixed so that the final concentration of ammonium acetate is 40 mM, the final concentration of ammonia is 10 mM, and the final concentration of zinc acetate is ImM. Thereafter, the Listeria apoferritin solution is added to the reaction solution. Specifically, an appropriate concentration of Listeria apoferritin solution is added to the reaction solution to a final concentration of, for example, 0.3 mg / mL. In addition, the concentration of the reagent used by the method of this embodiment is not limited to what was illustrated here! /.
  • step S32 the reaction solution prepared in step S31 is allowed to stand at room temperature for 10 minutes. From this point, an ammonium complex of zinc is formed.
  • step S33 thioacetic acid is added to the reaction solution. Specifically, thioacetic acid Is added to the reaction solution to a final concentration of 10 mM.
  • step S34 the reaction solution is left at room temperature for 12 hours or more to form a ZnS listeria apoferritin complex.
  • the pH at this time should be 4.0 or more and 9.0 or less.
  • each reagent is not limited to the values described above.
  • An example of the concentration range of each reagent is as shown in FIG. 14 (b).
  • the concentration of ammonium acetate is not limited to 40 mM.
  • the ZnS listeria apoferritin complex produced by the above method is composed of 12 monomer subunits of listeria poferritin, and is composed of an outer shell in which a cavity is formed inside, and ZnS formed in the cavity. It is equipped with particles. The diameter of the microparticles is about 5 nm or less.
  • FIG. 14 (c) is a view showing the preparation conditions of a compound semiconductor-listeria apoferritin complex according to a modification of the third embodiment.
  • step S31 shown in FIG. 14 (a) ammonium acetate solution, zinc acetate solution, and Listeria apoferritin solution are made to have the concentrations shown in FIG. 14 (c). Mix.
  • the reaction temperature is 0 ° C. or more and 15 ° C. or less. In particular, about 4 ° C. is preferable.
  • the concentration of the zinc acetate solution is preferably higher than that of the third embodiment.
  • step S33 thioacetic acid is added to the reaction solution so as to have the concentration shown in FIG. 14 (c).
  • concentration of thioacetic acid is preferably higher than that of the method of the fourth embodiment.
  • step S34 the reaction solution is left at 0 to 15 ° C for 12 hours or more to form a ZnS listeria apoferritin complex.
  • the formation rate of ZnS fine particles in the Listeria apoferritin can be increased to nearly 100%.
  • the precipitation of ZnS becomes slow and the listeria It is thought that precipitation outside poferritin can be suppressed. Therefore, it is presumed that the rate of formation of microparticles within the Listeria apoferritin is increased.
  • ZnS fine particles can be produced more reliably than the method according to the fourth embodiment. Therefore, the cost reduction at the time of fine particle preparation can also be achieved.
  • a method of forming a microparticle-protein complex which also has a compound semiconductor activity by using recombinant apoferritin produced using a genetic engineering technique will be described.
  • the commercially available apoferritin used in the methods of the first and second embodiments is a hybrid of two monomer subunits of H subunit and L subunit.
  • the amino acid sequence of the L subunit is as shown in SEQ ID NO: 1.
  • Naturally occurring apoferritin is said to be processed and deleted in the body by 8 residues from the N-terminus. Some of the eight residues are projected to the outer surface of apoferritin, and loss of this part is thought to change the surface charge of apoferritin.
  • a recombinant apoferritin capable of reducing L subunits by removing seven residues except for methionine located at the beginning of the amino acid sequence out of eight residues at the N-terminus is used as a particulate protein complex Perform body formation.
  • L subunit is prepared by deleting the 2nd to 8th amino acids (from the N terminus) of kuma L-apoferritin using genetic engineering technology. Specifically, a DNA encoding an L subunit from which amino acids 2 to 8 were deleted was introduced into an expression vector, which was used to transform E. coli to delete the N-terminal amino acid. We obtain recombinant apoferritin, which is also effective only in the L subunit. This recombinant apoferritin is hereinafter referred to as "Fer8 apoferritin". The amino acid sequence of this Fer8 apoferritin is set forth in SEQ ID NO: 2.
  • FIG. 15 is a diagram showing the amount of protein remaining in the supernatant of the reaction solution when commercially available apoferritin (C-Apoferritin) and Fer8 apoferritin were used. This measurement result is obtained by measuring the protein in the obtained supernatant by centrifuging the reaction solution at 12000 rpm for about 10 minutes after forming the fine particle-apoferritin complex.
  • FIG. 16 is a diagram showing a fluorescence spectrum of the CdS-Fer8 apoferritin complex when the ammonia concentration in the reaction solution is 7.5 mM, 37.5 mM and 75 mM.
  • "! -C-apoferritinj” shows the fluorescence spectrum of only commercially available apoferritin derived from umbilical spleen
  • "Fer8” shows the fluorescence spectrum of only Fer8 apoferritin. It shall be. It can be seen from FIG. 16 that the CdS-Fer8 apoferritin complex receives excitation light and emits fluorescence in the vicinity of 500 to 600 nm.
  • FIG. 17 is a diagram comparing the ratio of core formation in apoferritin between the case where commercially available apoferritin is used and the case where Fer8 apoferritin is used.
  • the Cd concentration in the reaction solution was 1 mM
  • the S 2 ⁇ concentration was ImM
  • the ammonia concentration was 75 mM.
  • Fer8 apoferritin has a large supply secured by genetic recombination technology.
  • Listeria apoferritin even with Listeria apoferritin, there is a possibility that the core formation rate can be improved by removing a part of the N-terminus.
  • Such listeria apoferritin can also be produced in large quantities using genetic engineering techniques using E. coli.
  • FIG. 18 is a cross-sectional view showing a semiconductor device according to the sixth embodiment of the present invention.
  • the semiconductor device shown in the same figure is a non-volatile memory cell using quantum dots that are also compound semiconductors.
  • the semiconductor device 120 of this embodiment includes a semiconductor substrate 101 made of a semiconductor of a first conductivity type such as Si, and an isolation for surrounding an active region on the semiconductor substrate 101. Edge film 102 and a tunnel such as SiO provided on the active region of the semiconductor substrate 101
  • Insulating film 103 fine particles 104 made of a composite semiconductor spaced apart from each other on tunnel insulating film 103, and SiO provided on tunnel insulating film 103 to embed fine particles 104 in.
  • Insulating film 105 having a force of 2 or the like, control gate (gate electrode) 106 having a conductivity of A1 or the like provided on insulating film 105, and a region of semiconductor substrate 101 located on both sides of control gate 106.
  • Source region 107a which is provided and contains impurities of the second conductivity type.
  • drain region 107b impurity diffusion layer
  • interlayer insulating film 108 provided on the entire surface of the substrate, contact hole 109 formed in interlayer insulating film 108, and a source region through a plug filling contact hole 109.
  • A1 wiring ll la and 11 lb are connected to the 107a and the drain region 107b, respectively.
  • the thickness of the tunnel insulating film 103 is, for example, about 1.5 nm to 4 nm, and the thickness of the insulating film 105 is, for example, about 17 nm.
  • the fine particles 104 are spherical with a diameter of about 7 nm.
  • the distance between the centers of the particles 104 is about 12 nm, and they are two-dimensionally arranged on the tunnel insulating film 103.
  • Examples of the material of the particles 104 include CdS and ZnS.
  • source region 107a and drain region 107b contain high concentration n-type impurities, and semiconductor substrate 101 contains p-type impurities.
  • the semiconductor device of the present embodiment is considered to exhibit two drain current-gate voltage characteristics depending on whether or not electric charge is held by the particles 104. That is, the semiconductor device of the present embodiment is considered to exhibit different drain current-gate voltage characteristics in the state in which the electrons are injected into the particles 104 and the state in which the electrons are extracted from the particles 104. Therefore, the semiconductor device of this embodiment can function as a non-volatile memory cell by operating as follows.
  • the diameter of the fine particles 104 is about 7 nm, but fine particles having a diameter smaller than this may be used. Microparticles smaller than 7 nm in diameter can be prepared by changing the ammonia concentration in the reaction solution when forming the CdS apoferritin complex as described in the first embodiment. Method for manufacturing a semiconductor device
  • 19 (a) to 19 (f) are cross-sectional views for explaining the method of manufacturing the semiconductor device of the present embodiment.
  • metal ions and sulfide ions are added to cage proteins such as apoferritin 132 or listeria apoferritin. 135 is introduced through the three-fold symmetric channel 130 to form fine particles of CdS or ZnS force.
  • the thickness of 1. 5 nm or more 4nm following by Netsusani ⁇ on the semiconductor substrate 101 including the l ⁇ 5 X 10 16 cm_ 3 about p-type impurity After forming the SiO film 103a
  • the element isolation insulating film 102 is formed by the LOCOS method.
  • the element isolation insulating film 102 may be formed by STI (Shllow Trench Isolation).
  • STI Shllow Trench Isolation
  • the surface of the insulating film 102 for element separation and the SiO film 103 a is modified with an amino group using a methoxysilane compound such as 3- (2-aminoethylamino) propyl-trimethoxysilane (APTMS).
  • the apoferritin complex 137 is two-dimensionally arranged.
  • a method of disposing the fine particle apoferritin complex 137 on the substrate for example, the method described in JP-A-11-45990 or the like is used.
  • apoferritin 132 (outer shell portion) and 3- (2) are irradiated by irradiating the substrate with ultraviolet light (UV) at an intensity of 110 W for 10 minutes in the presence of ozone.
  • UV ultraviolet light
  • ATMS -aminoeth yl amino) propyl-trimethoxysilane
  • the substrate is irradiated with UV at wavelengths of 2537 nm and 184.9 nm at an intensity of 110 W for 40 minutes in an atmosphere containing ozone.
  • This step is performed at 115 ° C. to remove moisture.
  • organic substances such as apoferritin 132 can also be removed by oxygen plasma treatment at room temperature, heat treatment at 400 ° C. in a nitrogen atmosphere, or the like.
  • SiO is used as a target at room temperature
  • the pressure is 4. 7-5. 3 X 10 Pa
  • the RF power is 200 W
  • the argon flow rate is 16 sccm (mL / min at 0 ° C, 101.3 kPa)
  • the oxygen flow rate is 4 sccm for 4 minutes and 30 seconds.
  • the formation of 2 a may be performed by the CVD method!
  • an A1 film is deposited on the substrate. Subsequently, patterning of the SiO film 103a, the insulating film 105 and the A1 film is performed using a photoresist mask Prl.
  • a tunnel insulating film 103, an insulating film 105 to be an inter-electrode insulating film, and a control gate 106 made of Al are formed. Thereafter, n-type impurity ions are implanted using the photoresist mask and control gate 106 as a mask to form a source region 107a and a drain region 107b.
  • the formation of the interlayer insulating film 108, the opening of the contact hole 109 to the interlayer insulating film 108, and the tantalum into the contact hole 109 are carried out by a known method.
  • the semiconductor device of the present embodiment can be manufactured by the above method. As shown here, the compound semiconductor / protein complex produced by the first to fourth methods can be used to realize a semiconductor memory device utilizing the properties of quantum dots.
  • 20 (a) to 20 (g) are diagrams for explaining the first fluorescent labeling method of the present embodiment.
  • a method for fluorescently labeling a target substance using a compound semiconductor-protein complex is described.
  • apoferritin DNA having a sequence encoding cysteine (denoted as “Cys” in the figure) at the beginning (5 ′ side) in the plasmid.
  • Cys cysteine
  • the prepared plasmid is introduced into E. coli as a host to transform E. coli.
  • the transformed E. coli was cultured, and mutant apoferritin produced in the cell (apoferritin having Cys introduced at the N-terminus) was Extract and refine. Thereafter, microparticles made of CdS or ZnS are formed in the purified mutant apoferritin according to the method of the first or second embodiment. Thereby, a complex of microparticles and apoferritin to which Cys is added at the N-terminus can be formed.
  • the amino acid residue exposed on the surface of the substance to be labeled is substituted with Cys.
  • the target substance is not limited to a protein, and may be anything as long as it can introduce an SH group.
  • high molecular compounds such as DNA and polymers can also be used as target substances.
  • a solution containing protein A and a solution containing a microparticle-mutated apoferritin complex are mixed.
  • Cys of protein A and Cys of the microparticle-mutant apoferritin complex form an S—S bond (disulfide bond), and protein A and microparticle mutant apoferritin complex are bound.
  • Microparticles The microparticles in the mutant apoferritin complex fluoresce, for example, to excitation light at a wavelength of 350 nm, so that this fluorescence can be used to detect protein A.
  • the target protein can be fluorescently labeled.
  • an S—S bond may be formed between the SH group added to the target substance and the Cys of the microparticle-mutated apoferritin complex. As shown in FIG. 20 (g), this SS bond can be easily cleaved by the addition of a reducing agent.
  • any protein can be fluorescently labeled, and the fluorescence wavelength of the labeled protein can be changed by using a microparticle-mutated apoferritin complex having different diameters of microparticles. You can also.
  • the compound semiconductor protein complex of the present invention can be used as a marker for a biological substance or the like.
  • the compound semiconductor / protein complex of the present invention can be used for a fluorescent labeling method using avidin / biotin binding or an antigen-antibody reaction.
  • listeria apoferritin is used instead of apoferritin. I'm sorry.
  • proteins but also high molecular compounds such as DNA, antigens, viruses, polymers, etc., those that retain SH groups or those that can be modified with SH groups are fluorescent. It can be labeled.
  • FIG. 21 (a), (b) is a figure for demonstrating the 2nd fluorescence labeling method of this embodiment.
  • a fine particle-apoferritin complex is produced by the method according to the first and second embodiments. Then, a solution containing the microparticle-apoferritin complex is mixed with a solution containing an object to be labeled (an antibody, a protein containing an antigen, a target biological substance such as a cell). Then, when a coupling agent such as DEC (1- (Di (methylamino) propyl) -3-ethylcarboimide) is added to the reaction solution, the carboxyl group present on the outer surface of apoferritin and the amino group of the object to be labeled are added. A condensation reaction occurs with the end to form an amide bond as shown in FIG.
  • a coupling agent such as DEC (1- (Di (methylamino) propyl) -3-ethylcarboimide
  • microparticles in the microparticle-apoferritin complex fluoresce, for example, to excitation light with a wavelength of 350 nm, so that the object to be labeled can be easily observed.
  • microparticles in apoferritin after binding the apoferritin and the target to be labeled with the target to be labeled in the apoferritin solution and the coupling agent.
  • target substances include proteins, cells, etc., as well as DNA, polymers, carbon nanohorns, etc., those having an amino group, or substances capable of chemically modifying an amino group. It can be used.
  • Ti-recognizing peptide that recognizes and binds to titanium (Ti) and the like has been published in the literature or the like! (Kenichi Sano et al., Small, No. 8-9, p 826-832 (2005)).
  • This Ti-recognizing peptide consists of 6 amino acid residues of Arg-Lys-Leu-Pro-Asp-Ala, and has the property of binding to Ti, Si, etc. Book In the fluorescent labeling method of the embodiment, the particulate apoferritin complex is placed at a desired position on a substrate using a Ti recognition peptide. The procedure is described below.
  • FIGS. 22 (a) to 22 (c) are diagrams schematically showing a fluorescent labeling method for a substrate according to an eighth embodiment of the present invention.
  • a Ti recognition peptide 150 is added on the outer surface of apoferritin.
  • the Ti-recognition peptide 150 may be bound on the outer surface of apoferritin using a coupling agent etc.
  • the directionality of introducing the Ti-recognition peptide 150 at the N-terminus of apoferritin using genetic engineering techniques The face power is also preferable.
  • a DNA in which DNA encoding Ti recognition peptide 150 is added upstream (5 'side) of DNA encoding apoferritin is inserted into an expression vector, and this is introduced into E. coli or the like. In this E.
  • a large amount of recombinant apoferritin is produced in which a Ti-recognizing peptide 150 is added to the N-terminal side.
  • recombinant apoferritin is extracted from the cells and purified.
  • Recombinant apoferritin can be purified in the form of aggregated monomeric subunits. Since the N-terminus of the monomeric subunit protrudes on the outer surface of apoferritin, the Ti-recognizing peptide added on the N-terminal side also protrudes on the outer surface of recombinant apoferritin.
  • SEQ ID NO: 3 shows the amino acid sequence of the monomeric subunit of recombinant apoferritin.
  • fine particles of CdS or ZnS are formed in recombinant apoferritin. This step is performed by the same method as the first and second embodiments.
  • the microparticle-recombinant apoferritin complex is placed on the substrate.
  • a Ti film is formed in advance on a region of the substrate where the fine particle-recombinant apoferritin complex is to be disposed.
  • this substrate is placed in an aqueous solution containing a particulate-recombinant apoferritin complex, the particulate-recombinant apoferritin complex is bound only to the portion of the substrate on which the Ti film is formed. Since CdS or ZnS emits fluorescence when excited by ultraviolet light or the like, as shown in FIG.
  • fluorescence is observed only in the portion of the substrate where the fine particle-recombinant apoferritin complex is disposed.
  • the particulate recombinant apoferritin complex can be disposed on the substrate according to the pattern of the Ti film, various fluorescent patterns can be drawn on the substrate. it can.
  • a particulate-recombinant apoferritin complex having fine particles of different particle sizes in different regions of the substrate it becomes possible to generate different fluorescence for each region.
  • a blue fluorescent pattern and nano fluorescent characters can be created by arranging the ZnS recombinant apoferritin complex emitting blue and the CdS recombinant apoferritin complex emitting red respectively on different regions of the substrate.
  • fine particles that can also be compound semiconductors can be disposed at arbitrary positions on the substrate, it is possible to fabricate semiconductor devices and optical devices that are more complex than conventional.
  • an example is shown here in which an example is used in which a Ti-recognition peptide is attached to the N-terminal end of apoferritin derived from Uma liver, apoferritin derived from other organs, or apoferritin derived from other organisms. It can be arranged in any region on the substrate by using a Ti recognition peptide added at the N-terminus.
  • FIG. 23 is a flowchart showing a method of producing a compound semiconductor apoferritin complex according to a ninth embodiment of the present invention. In the present embodiment, a method of forming fine particles of CdS in apoferritin will be described.
  • step S51 shown in FIG. 23 after the CdS apophyritin complex is formed by the method according to the first embodiment, the CdS apoferritin complex is purified using a column or the like.
  • step S52 the purified CdS-apoferritin complex is covered again in the reaction solution having the composition shown in FIG. 2 (b).
  • the CdS apoferritin complex is used in place of apoferritin, and its concentration is preferably 0.3 mg ZmL to 1 O mg / mL, which is the same as the apoferritin concentration.
  • step S53 the reaction solution is left at room temperature for 12 hours or more.
  • step S54 cadmium acetate is added to the reaction solution so that the final concentration is ImM, and in step S55, the reaction solution is left at room temperature for 10 minutes.
  • step S56 thioacetic acid can be added to the reaction solution to a final concentration of ImM. Thereafter, in step S57, the reaction solution is left at room temperature for 12 hours or more.
  • step S58 the steps from step S54 to step S57 are repeated.
  • the microparticles in apoferritin can be further grown.
  • FIG. 24 (a) is a view showing the diameter of CdS microparticles produced using 7.5 mM ammonia water in the method of the present embodiment
  • FIG. 24 (b) is a view showing the method of the first embodiment. It is a TEM photograph of formed CdS-apoferritin complex
  • (c) is a TEM photograph of CdS-apoferritin complex formed by the method of this embodiment.
  • “Condition 1” shown in FIG. 24 (a) represents the fine particles formed by the method according to the first embodiment, and “Condition 2” is CdS of ImM cadmium and ImM thioacetic acid. “Condition 3” represents ImM Cadmium and ImM Thioacetic acid twice after purification of CdS-Apoferritin complex. “Condition 4" represents microparticles formed by adding ImM cadmium and ImM thioacetic acid three times after purification of the CdS-apoferritin complex. Express
  • the standing time of the reaction solution in step S55 is not limited to 10 minutes. Further, the concentration of cadmium acetate added in step S54 is not limited to ImM, and the concentration of thioacetic acid added in step S56 is not limited to ImM.
  • a ZnS-apoferritin complex a CdS- listeria apoferritin complex, or a ZnS- listeria apoferritin complex can also be formed using the same method as in this embodiment.
  • the ZnS-apoferritin complex is formed by the method of the second embodiment and then purified, and the ZnS-apoferritin complex is reacted Add to the solution. Thereafter, ImM zinc acetate and ImM thioacetate are sequentially added to the reaction solution. Thereafter, ZnS fine particles can be grown by alternately adding zinc acetate and thioacetic acid.
  • Steps S51 to S58 may be performed using a CdS-apoferritin complex produced by a method other than the first embodiment.
  • the composite semiconductor-protein complex produced by the method of the present invention can be used for various applications such as semiconductor devices using quantum dots and fluorescent labels for biological materials. it can.

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Abstract

　まず、酢酸アンモニウム溶液とＣｄまたはＺｎなどの金属酢酸塩溶液とを混合し、金属のアンモニウム錯体を形成させる。次に、アポフェリチン溶液とチオ酢酸を反応液に添加する。１２時間以上放置することにより、ＣｄＳまたはＺｎＳを含む微粒子とアポフェリチンとの複合体を形成させる。

Description

微粒子一タンパク質複合体およびその作製方法、半導体装置、蛍光標識 方法
技術分野
[0001] 本発明は、微粒子—タンパク質複合体およびその製造方法に関するものである。
背景技術
[0002] 現在、ナノメーターサイズの構造体の構築を目指すナノテクノロジーが世界中で注 目を浴びている。ナノテクノロジーの一つとして、球殻状あるいは棒状のタンパク質を 铸型として金属ナノ粒子を形成する試みがなされて!/、る。この 、わゆるバイオナノプ 口セスに用いられるタンパク質として、アポフェリチンやリステリアフェリチン、 DNA bind ing proteinなど力め 。
[0003] 図 1は、フェリチン（アポフェリチン）およびリステリアフェリチン（リステリアアポフェリチ ン)の特性を示す図である。フェリチンは、ほ乳類では肝臓、脾臓、心臓に多く含まれ る直径約 12nm (ゥマの場合）の球殻状タンパク質で、 175個のアミノ酸カゝらなるモノ マーサブユニット 3が 24個集まって 1つのタンパク質分子を形成して!/、る。 1個のタン パク質分子の分子量は 480kDaである。フェリチンは、生体内においてはタンパク質 力もなる外殻 2の内部に直径が最大で 7nmの酸ィ匕鉄力もなるコア 1を有して 、る。フ エリチン力 酸ィ匕鉄のコア 1が抜けたものはアポフェリチンと呼ばれる。
[0004] 一方、リステリアフェリチンは、リステリア菌由来の Dps様タンパク質であり、 12個の モノマーサブユニット 9で構成され、直径約 9nmの球殻状をしている。リステリアフェリ チンもアポフェリチンと同様に、外殻 7の内部に酸ィ匕鉄力 なるコア 6を格納できる空 洞が形成されており、その空洞径は約 4nmである。なお、リステリアフェリチン力も酸 化鉄力 なるコア 6が抜けたものは、リステリアアポフェリチンと呼ばれる。
[0005] アポフェリチンには、酸ィ匕鉄力もなるコアの代わりに種々の金属力もなるコアを形成 させることができる。このため、コバルト（Co)、マンガン（Mn)、ニッケル (Ni)など、種 々の金属力もなる微粒子とアポフェリチンとの複合体が現在までに作製されている。リ ステリアアポフェリチンについても、種々の金属からなる微粒子の形成に利用すること ができる。
特許文献 1 :特開 2003— 113198号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0006] 上記の従来技術では金属あるいは金属酸ィ匕物からなる微粒子を作製することがで きるが、 2種類以上の化合物力 なる化合物半導体の微粒子を作製することができな かった。そこで、アポフェリチン内の空洞に半導体力 なる微粒子を保持させる研究 が進められている。化合物半導体からなる微粒子の場合、励起させた場合に発光す ることが結晶性が良いことのひとつの目安となっている。半導体装置の材料としては 結晶性の良好な半導体微粒子が求められている力 バイオナノプロセスを用いた場 合、化合物半導体からなり、発光が可能な微粒子を作製することができな力つた。
[0007] 本発明は、化合物半導体からなり、発光が可能な微粒子を作製することを目的とす る。
課題を解決するための手段
[0008] 本発明の微粒子—タンパク質複合体は、複数のモノマーサブユニットから構成され
、内部に空洞が形成された外殻と、前記外殻内に形成され、化合物半導体からなり、 励起された場合に蛍光を発する微粒子とを備えて!/ヽる。
[0009] このため、微粒子 タンパク質複合体は、半導体からなる微粒子の量子効果を利 用した半導体装置の作製に用いられる他、蛍光を生じることを利用して生体物質の 標識方法などに用いられることができる。
[0010] 空洞が形成されたタンパク質としてはアポフェリチンやリステリアアポフェリチンなど のフェリチンファミリータンパク質やその組み換え体が好ましく用いられる。
[0011] 微粒子の材料としては、 II VI型の化合物半導体である CdSあるいは ZnSなどが 挙げられる。微粒子の直径は、アポフェリチンを用いた場合は約 7nm以下で、リステ リアアポフェリチンを用いた場合は約 4nm以下である。
[0012] 本発明の微粒子—タンパク質複合体の作製方法は、水溶液中で金属のアンモ-ゥ ム錯体を形成させる工程 (a)と、内部に空洞が形成されたタンパク質の溶液とチォ酢 酸とを前記水溶液中で混合して、前記タンパク質の前記空洞内に前記金属の硫ィ匕 物からなる微粒子を形成させる工程 (b)とを備えている。
[0013] これにより、アンモ-ゥム錯体を形成させることでタンパク質の外部で金属硫ィ匕物が 形成されるのを防ぐとともに、チォ酢酸力も S2—イオンが徐々に放出されることにより、 タンパク質内に結晶性の良い金属硫ィ匕物を形成することができると考えられる。タン パク質としてはアポフェリチンやリステリアアポフェリチンなどのフェリチンファミリータン パク質が好ましく用いられ、金属としては Cdあるいは Znが好ましく用いられる。
[0014] なお、上述の方法で作製された微粒子—タンパク質複合体を用いれば、微粒子を 用 、た半導体記憶装置を実現したり、微粒子から発せられる蛍光を利用した生体物 質等の標識を行ったりすることが可能となる。
発明の効果
[0015] 以上のように、本発明の方法によって作製される微粒子—タンパク質複合体は、半 導体装置の製造や生体物質等の標識など、種々の分野に用いることができる。 図面の簡単な説明
[0016] [図 1]図 1は、フェリチン（アポフェリチン）およびリステリアフェリチンの特性を示す図で ある。
[図 2]図 2 (a)は、本発明の第 1の実施形態に係る化合物半導体 アポフェリチン複 合体の作製方法を示すフローチャートであり、（b)は、各試薬の最終濃度を示す図で ある。
[図 3]図 3 (a)は、ィォゥ源としてチォ尿素を用いた場合の反応液中のアポフェリチン を示す透過電子顕微鏡 (TEM)写真であり、（b)は、ィォゥ源としてチォ酢酸を用い た場合の反応液中のアポフェリチンを示す TEM写真である。
[図 4]図 4は、反応液中のアンモニア濃度を変化させた場合の CdS アポフェリチン 複合体を示す TEM写真である。
[図 5]図 5は、 CdS アポフェリチン複合体の蛍光スペクトルを示す図である。
[図 6]図 6 (a)〜（c)は、各条件においてアポフェリチン中に形成された CdS微粒子の 粒子径を測定した結果を示す図である。
[図 7]図 7 (a)は、チォ尿素を用いた場合の反応液中の S2—イオン濃度と pHとを示す 図であり、（b)は、チォ酢酸を用いた場合の反応液中の S2—イオン濃度と pHとを示す 図である。
[図 8]図 8は、第 1の実施形態に係る CdS アポフェリチン複合体の作製方法におけ る反応機構を説明するための図である。
圆 9]図 9 (a)は、本発明の第 2の実施形態に係る化合物半導体—アポフェリチン複 合体の作製方法を示すフローチャートであり、（b)は、各試薬の最終濃度を示す図で ある。
[図 10]図 10 (a)は、ィォゥ源としてチォ尿素を用いた場合の反応液中のアポフェリチ ンを示す透過電子顕微鏡 (TEM)写真であり、（b)は、ィォゥ源としてチォ酢酸を用 V、た場合の反応液中のアポフェリチンを示す TEM写真である。
[図 11]図 11は、 ZnS アポフェリチン複合体の蛍光スペクトルを示す図である。
[図 12]図 12 (a)は、本発明の第 3の実施形態に係る化合物半導体 リステリアアポフ エリチン複合体の作製方法を示すフローチャートであり、（b)は、各試薬の最終濃度 を示す図であり、（c)は、第 3の実施形態の変形例に係る化合物半導体 リステリア アポフェリチン複合体の作製方法での各試薬の最終濃度を示す図である。
[図 13]図 13は、 CdS リステリアアポフェリチン複合体の形成方法の条件を変えた場 合のコア形成率を示す図である。
圆 14]図 14 (a)は、本発明の第 4の実施形態に係る化合物半導体—リステリアアポフ エリチン複合体の作製方法を示すフローチャートであり、（b)は、各試薬の最終濃度 を示す図であり、（c)は、第 4の実施形態の変形例に係る化合物半導体 リステリア アポフェリチン複合体の作製方法での各試薬の最終濃度を示す図である。
[図 15]図 15は、市販のアポフェリチン (欠失なし）および Fer8アポフェリチンを用 、た 場合で、反応液の上清中に残存するタンパク質量を示す図である。
[図 16]図 16は、反応液中のアンモニア濃度を 7. 5mM、 37. 5mM、 75mMとした場 合の CdS— Fer8アポフェリチン複合体の蛍光スペクトルを示す図である。
[図 17]図 17は、巿販のアポフェリチンを用いた場合と Fer8アポフェリチンを用いた場 合とでアポフェリチン内にコアが形成される割合を比較した図である。
[図 18]図 18は、本発明の第 6の実施形態に係る半導体装置を示す断面図である。 圆 19]図 19 (a)〜 (f)は、第 6の実施形態に係る半導体装置の製造方法を説明する ための断面図である。
[図 20]図 20 (a)〜 (g)は、本発明の第 7の実施形態の第 1の蛍光標識方法を説明す るための図である。
圆 21]図 21 (a)、（b)は、第 7の実施形態の第 2の蛍光標識方法を説明するための図 である。
[図 22]図 22 (a)〜 (c)は、本発明の第 8の実施形態に係る基板に対する蛍光標識方 法の概略を示す図である。
[図 23]図 23は、本発明の第 9の実施形態に係る化合物半導体 アポフェリチン複合 体の作成方法を示すフローチャートである。
圆 24]図 24 (a)は、第 9の実施形態に係る方法を用いて作製された CdS微粒子の直 径を示す図であり、（b)は、第 1の実施形態の方法で形成させた CdS アポフェリチ ン複合体の TEM写真であり、（c)は、本実施形態の方法で形成させた CdS アポフ エリチン複合体の TEM写真である。
符号の説明
1、 6、 11 コア
2、 7、 12 外殻
3、 9、 13 モノマーサブユニット
101 半導体基板
102 素子分離用絶縁膜
103 トンネル絶縁膜
103a, 105a SiO膜
2
104 微粒子
105 絶縁膜
106 コントロールゲート
107a ソース領域
107b ドレイン領域
108 層間絶縁膜
109 コンタクトホール 110 タングステンプラグ
111a, 111b Al配線
120 半導体装置
130 チャネル
132 アポフェリチン
135 硫化物イオン (金属イオン）
137 微粒子 アポフェリチン複合体
発明を実施するための最良の形態
[0018] 以下、本発明の実施形態を図面に基づいて詳細に説明する。
[0019] (第 1の実施形態）
図 2 (a)は、本発明の第 1の実施形態に係る化合物半導体 アポフェリチン複合体 の作製方法を示すフローチャートであり、（b)は、各試薬の最終濃度を示す図である
。本実施形態では、硫ィ匕カドミウム (CdS)からなる微粒子をアポフェリチン内に形成 させる方法を説明する。
[0020] まず、図 2 (a)に示すステップ SIでは、酢酸アンモ -ゥム溶液と酢酸カドミウム溶液 とを混合する。具体的には、 300mLの純水に、 1Mの酢酸アンモ-ゥム、 1Mのアン モ-ァ水、 lOOmMの酢酸カドミウム溶液を混合する。酢酸アンモ-ゥムの最終濃度 力 S40mM、アンモニアの最終濃度がそれぞれ 7. 5mM、 37. 5mM、 75mM、酢酸 カドミウムの最終濃度が ImMとなるように各試薬を混合する。その後、反応液にアポ フェリチン溶液を添加する。具体的には、適当な濃度のアポフェリチン溶液を最終濃 度が例えば 0. 3mgZmLになるように反応液に加える。なお、本実施形態の方法で 用いられる試薬の濃度は、ここで例示したものに限られな!/、。
[0021] 次に、ステップ S2では、ステップ S1で調整された反応液を室温で 10分間放置する 。これにより、カドミウムのアンモ-ゥム錯体が形成される。
[0022] 次いで、ステップ S3では、反応液にチォ酢酸 (C H OS)を添加する。具体的には
2 4
、チォ酢酸を最終濃度が ImMとなるように反応液に加える。なお、本実施形態で用 いられるアポフェリチンはゥマ脾臓由来のアポフェリチンである。また、このアポフェリ チンは、 Lサブユニットと Hサブユニットの 2種類のモノマーサブユニットで構成されて いる。
[0023] その後、ステップ S4では、反応液を室温で 12時間以上放置して CdS—アポフェリ チン複合体を形成させる。この際の pHは 4. 0以上 9. 0以下程度とする。
[0024] なお、各試薬の最終濃度は上述の値に限られない。各試薬の濃度範囲の例は、図 2 (b)の通りである。ただし、反応液中のアポフェリチンの最終濃度が 0. 3mg/mL 以上 lmgZmL以下の範囲外であっても CdS—アポフェリチン複合体を形成すること は可能である。また、酢酸アンモ-ゥムの濃度も 40mMに限られない。また、ステップ S4での反応時間は 24時間程度であってもよい。
[0025] 図 3 (a)は、ィォゥ源としてチォ尿素を用いた場合の反応液中のアポフェリチンを示 す透過電子顕微鏡 (TEM)写真であり、（b)は、ィォゥ源としてチォ酢酸を用いた場 合の反応液中のアポフェリチンを示す TEM写真である。また、図 4は、反応液中のァ ンモユア濃度を変化させた場合の CdS—アポフェリチン複合体を示す TEM写真で ある。
[0026] 図 3 (b)に示すように、本実施形態の方法によれば、アポフェリチン中に CdS力 な るコアを形成できることが分かる（図中の黒い丸)。これに対し、チォ酢酸に代えてィ ォゥ源としてチォ尿素を用いた場合には、アポフェリチン中にほとんど CdSからなるコ ァが形成されなかった。この違いにっ 、ての考察は後述する。
[0027] また、図 4に示す結果から、反応液中のアンモニア濃度を 7. 5mM〜75mMに変 ィ匕させると微粒子の粒径が異なる CdS—アポフェリチン複合体が形成できることが分 かった。
[0028] 図 5は、 CdS—アポフェリチン複合体の蛍光スペクトルを示す図である。ここでは、 C dS—アポフェリチン複合体の濃度を 0. 5mgZmLとした反応液中で、波長 350nm の光で励起した際の CdS—アポフェリチン複合体の蛍光スペクトルを示す。同図に ぉ 、て、波長 440nm〜450nm付近のピークはアポフェリチンによる蛍光であると考 えられる。また、特にアンモニア濃度が 37. 5mMと 75mMの場合〖こ波長 560nm、 6 10nm、 640nm付近に CdS微粒子によるものと見られる蛍光が見られた。なお、励 起光を浴びた反応液を目視した場合、アポフェリチンのみを含む反応液では青色に なり、アンモニア濃度が増加するに従って反応液は赤に近い色に変わった。 [0029] ここで、発明者らは、アンモニア濃度が互いに異なる反応液中で形成された CdS— アポフェリチン複合体の蛍光波長のピークが異なる理由について調べた。図 6 (a)〜 (c)は、各条件においてアポフェリチン中に形成された CdS微粒子の粒子径を測定 した結果を示す図である。これは、 TEM像を粒径分析ソフトを用いて分析した結果 である。
[0030] この結果、図 6 (a)に示すように、アンモニア濃度が 7. 5mMの場合には CdS微粒 子の平均径が 4. 7nmで標準偏差 σが 0. 7nmであることが分かった。また、図 6 (b) に示すように、アンモニア濃度が 37. 5mMの場合には CdS微粒子の平均径が 5. 1 nm、標準偏差 σが 0. 8nmであることが分かった。また、図 6 (c)に示すように、アン モ-ァ濃度が 75mMの場合には CdS微粒子の平均径が 7. lnm、標準偏差 σが 0. 8nmであることが分力つた。これらの結果から、反応液中のアンモニア濃度を調節す ることで、異なる粒径の CdS微粒子を形成できることが分力つた。さらに、本実施形態 の方法によれば、他の方法で微粒子を形成する場合に比べて、粒径の均一な微粒 子を形成できることも分力つた。
[0031] すなわち、本実施形態の方法により作製された CdS—アポフェリチン複合体は、図 3 (b)に示すように、多数（24個）のモノマーサブユニット 3により構成され、内部に空 洞 (保持部）が形成された外殻 2と、外殻 2の空洞内に形成された CdSからなり、励起 された場合に蛍光を発するコア (微粒子） 1とを備えている。
[0032] 次に、本実施形態の方法によって CdS—アポフェリチン複合体を形成することがで きた理由についての仮説を説明する。
[0033] 図 7 (a)は、チォ尿素を用いた場合の反応液中の S2—イオン濃度と pHとを示す図で あり、（b)は、チォ酢酸を用いた場合の反応液中の S2—イオン濃度と pHとを示す図で ある。図 8は、本実施形態の CdS—アポフェリチン複合体の作製方法における反応 機構を説明するための図である。なお、図 7では、 Cdイオンを含まない反応液を用い て測定している。
[0034] 図 7 (a)に示すように、チォ尿素をィォゥ源として用いた場合、 V、ずれの濃度にぉ ヽ ても反応液中に S2—イオンは見られず、反応液の pHはチォ尿素の濃度に影響され ない。これに対し、図 7 (b)に示すように、チォ酢酸をィォゥ源として用いた場合、チォ 酢酸の添加後から S2—イオン濃度はゆっくり上昇し、 5時間後に大きくなつた後、 22時 間後には低下する。反応液の pHはチォ酢酸の濃度に応じて変化する。また、 S2—ィ オン濃度はチォ酢酸濃度が 10〜20mMのときに最も大きくなつている。チォ尿素を 用いた場合には CdS—アポフェリチン複合体はほとんど形成されないことから、 S2ーィ オンの存在が CdS—アポフェリチン複合体の形成に必要であると考えられる。
[0035] また、アンモ-ゥムイオンを反応液にカ卩えな 、場合には、 CdS粒子がアポフェリチン の外部で形成されてしまうことから、カドミウムがアンモ-ゥムイオンと錯体を形成して 安定ィ匕されることが CdS—アポフェリチン複合体を形成させる上で好ましいと考えら れる。すなわち、本実施形態の方法で CdS—アポフェリチン複合体を形成できるの は、図 8に示すように、チォ尿素に比べて不安定なチォ酢酸が水溶液中でゆっくり分 解して S2—イオンを供給することと、アンモ-ゥムイオンの添カ卩によりテトラアンミンカド ミゥムイオンが形成されてアポフェリチンの外部で CdSの沈殿が防がれることとによる ものと考えられる。
[0036] なお、図 2 (a)に示すステップ SIでは、酢酸アンモ-ゥム溶液に代えてアンモ-ゥム イオンを加えた酢酸など、アンモ-ゥムイオンと酢酸イオンを含む溶液を用いても Cd
S -アポフェリチン複合体を形成させることができる。
[0037] また、図 2 (a)に示すステップ S2やステップ S4では、反応液を室温で放置したが、 室温以外の温度であっても錯体ゃ CdS—アポフェリチン複合体を形成させることは 可能である。
[0038] また、ィォゥ源としてはチォ酢酸が最も好ま 、が、硫ィ匕アンモ-ゥム（ (NH ) S)
4 2 ゃチォ硫酸塩 (K S O、 Na S O )等をチォ酢酸の代わりに用いても CdS—アポフ
2 2 3 2 2 3
エリチン複合体を形成させることはできる。反応時間を長くすればチォ尿素を用いて も CdS—アポフェリチン複合体は多少形成されるが、複合体形成数が少なく実用的 ではない。
[0039] また、以上で説明した例ではゥマ脾臓由来のアポフェリチンを用いたが、他の臓器（ 心臓や肝臓など）由来のアポフェリチンを用いてもよいし、他の生物のアポフェリチン を用いても、本実施形態と同様の方法で CdS—アポフェリチン複合体を形成させるこ とがでさる。 [0040] なお、本実施形態の CdS—アポフェリチン複合体は、 CdSからなる微粒子を用いた 半導体記憶装置や蛍光を発する特性を用いたマーカーとしての利用など、種々の分 野に用いることが可能である。
[0041] (第 2の実施形態）
図 9 (a)は、本発明の第 2の実施形態に係る化合物半導体—アポフェリチン複合体 の作製方法を示すフローチャートであり、（b)は、各試薬の最終濃度を示す図である 。本実施形態では、硫ィ匕亜鉛 (ZnS)カゝらなる微粒子をアポフェリチン内に形成させる 方法を説明する。
[0042] まず、図 9 (a)に示すステップ SI 1では、酢酸アンモ-ゥム溶液と酢酸亜鉛溶液とを 混合する。具体的には、 300mLの純水に、 1Mの酢酸アンモ-ゥム、 1Mのアンモ- ァ水、 lOOmMの酢酸亜鉛溶液を混合する。酢酸アンモニゥムの最終濃度が 40mM 、アンモニアの最終濃度がそれぞれ 7. 5mM〜75mM、酢酸亜鉛の最終濃度が lm Mとなるように各試薬を混合する。その後、反応液にアポフェリチン溶液を加える。具 体的には、適当な濃度のアポフェリチン溶液を最終濃度が例えば 0. 3mgZmLにな るよう力!]える。なお、本実施形態の方法で用いられる試薬の濃度は、ここで例示した ものに限られない。
[0043] 次に、ステップ S12では、ステップ S 11で調整された反応液を室温で 10分間放置 する。これ〖こより、亜鉛のアンモ-ゥム錯体が形成される。
[0044] 次いで、ステップ S13では、反応液にチォ酢酸を添加する。具体的には、チォ酢酸 を最終濃度が 10mMとなるように反応液に加える。なお、本実施形態で用いられるァ ポフェリチンはゥマ脾臓由来のアポフェリチンである。
[0045] その後、ステップ S14では、反応液を室温で 12時間以上放置して ZnS—アポフェリ チン複合体を形成させる。この際の pHは 4. 0以上 9. 0以下程度とする。ここで、アポ フェリチン内に形成される ZnSは、条件によっては一部が ZnSなど ZnS以外の亜鉛
2
硫ィ匕物になっている場合がある。なお、ステップ S 14の反応時間は 24時間程度であ つてもよい。
[0046] なお、各試薬の最終濃度は上述の値に限られない。各試薬の濃度範囲の例は、図 9 (b)の通りである。ただし、反応液中のアポフェリチンの最終濃度が 0. 3mg/mL 以上 lmgZmL以下の範囲外であっても ZnS—アポフェリチン複合体を形成すること は可能である。また、酢酸アンモ-ゥムの濃度も 40mMに限られない。
[0047] 図 10 (a)は、ィォゥ源としてチォ尿素を用いた場合の反応液中のアポフェリチンを 示す透過電子顕微鏡 (TEM)写真であり、（b)は、ィォゥ源としてチォ酢酸を用いた 場合の反応液中のアポフェリチンを示す TEM写真である。
[0048] 図 10 (b)に示すように、本実施形態の方法によれば、アポフェリチン中に ZnSを含 む亜鉛硫ィ匕物からなるコアを形成できることが分かる。これに対し、チォ酢酸に代え てィォゥ源としてチォ尿素を用いた場合には、アポフェリチン中にはほとんど亜鉛硫 化物からなるコアが形成されな力つた。また、反応液中のアンモニア濃度を 1. OmM 〜100mMに変化させても ZnS—アポフェリチン複合体が形成できた（図示せず)。
[0049] 図 11は、 ZnS—アポフェリチン複合体の蛍光スペクトルを示す図である。ここでは、 ZnS—アポフェリチン複合体を含む反応液中で、波長 325nmの光で ZnS微粒子を 励起した際の蛍光スペクトルを示す。同図において、波長 400nm以下の領域にある ピークは、 150mMNaCl溶液であるブランク試料との比較から、 ZnS粒子には依存 しない蛍光であると考えられる。そして、反応液中のアンモニア濃度が 7. 5mM〜： LO OmMの範囲で波長 400nm〜500nmの領域に、 ZnS微粒子によるものと考えられ る蛍光が見られた。特に、反応液中のアンモニア濃度が 15mM以上 lOOmMの範囲 であれば、より強い蛍光が見られた。なお、 ZnS微粒子による蛍光は目視では青色 に見え、長期保存（1年)後の消光もほとんど見られな力つた。また、 CdS微粒子と同 様に、反応液中のアンモニア濃度の上昇に伴って ZnS微粒子の粒径は変化する。
[0050] 本実施形態の方法により作製された ZnS—アポフェリチン複合体は、図 10 (b)に示 すように、多数（24個）のモノマーサブユニット 13により構成され、内部に空洞が形成 された外殻 12と、外殻 12の空洞内に形成された ZnSからなり、励起された場合に蛍 光を発するコア (微粒子） 11とを備えている。なお、本実施形態の ZnS—アポフェリチ ン複合体は、 ZnSからなる微粒子を用いた半導体記憶装置や蛍光を発する特性を 用いたマーカーとしての利用など、種々の分野に用いることが可能である。
[0051] なお、図 9 (a)に示すステップ SI 2やステップ S 14では、反応液を室温で放置した 1S 室温以外の温度であってもアンモ-ゥム錯体や ZnS—アポフェリチン複合体を形 成させることは可能である。
[0052] また、ィォゥ源としてはチォ酢酸が最も好ま 、が、硫ィ匕アンモ-ゥム（ (NH ) S)
4 2 ゃチォ硫酸塩 (K S O、 Na S O )等をチォ酢酸の代わりに用いても ZnS アポフ
2 2 3 2 2 3
エリチン複合体を形成させることはできる。
[0053] また、以上で説明した例ではゥマ脾臓由来のアポフェリチンを用いた力 他の臓器 ( 心臓や肝臓など）由来のアポフェリチンを用いてもよいし、他の生物のアポフェリチン を用いても、本実施形態と同様の条件で ZnS アポフェリチン複合体を形成させるこ とがでさる。
[0054] また、酢酸アンモ-ゥムの代わりにアンモニア水をカ卩えた酢酸緩衝液などのアンモ -ゥムイオンと酢酸イオンとを含む溶液を用いても ZnS アポフェリチン複合体を形 成することはでさる。
[0055] (第 3の実施形態）
図 12 (a)は、本発明の第 3の実施形態に係る化合物半導体 リステリアアポフェリ チン複合体の作製方法を示すフローチャートであり、（b)は、各試薬の最終濃度を示 す図である。本実施形態では、 CdSからなる微粒子をリステリアアポフェリチン内に形 成させる方法を説明する。
[0056] まず、図 12 (a)に示すステップ S21では、酢酸アンモ-ゥム溶液と酢酸カドミウム溶 液とを混合する。具体的には、 300mLの純水に、 1Mの酢酸アンモ-ゥム、 1Mのァ ンモユア水、 lOOmMの酢酸カドミウム溶液を混合する。酢酸アンモ-ゥムの最終濃 度が 40mM、アンモニアの最終濃度がそれぞれ 7. 5mM〜75mM、酢酸カドミウム の最終濃度が ImMとなるように各試薬を混合する。その後、反応液にリステリアアポ フェリチン溶液を添加する。具体的には、適当な濃度のリステリアアポフェリチン溶液 を最終濃度が例えば 0. 3mgZmLになるように反応液に加える。なお、本実施形態 の方法で用いられる試薬の濃度は、ここで例示したものに限られない。
[0057] 次に、ステップ S22では、ステップ S21で調整された反応液を室温で 10分間放置 する。これにより、カドミウムのアンモ-ゥム錯体が形成される。
[0058] 次いで、ステップ S23では、反応液にチォ酢酸を添加する。具体的には、チォ酢酸 を最終濃度が 5〜： LOmMとなるように反応液に加える。なお、本実施形態で用いられ るリステリアアポフェリチンはリステリア菌由来の Dps様タンパク質とその変異タンパク 質である。
[0059] その後、ステップ S24では、反応液を室温で 12時間以上放置して CdS アポフェリ チン複合体を形成させる。この際の pHは 4. 0以上 9. 0以下程度とする。なお、反応 液を 0°C〜55°Cの範囲の温度下で放置するのが好ましい。
[0060] なお、各試薬の最終濃度は上述の値に限られない。各試薬の濃度範囲の例は、図 12 (b)の通りである。ただし、反応液中のリステリアアポフェリチンの最終濃度が 0. 3 mg/mL以上 lmg/mL以下の範囲外であっても CdS リステリアアポフェリチン複 合体を形成することは可能である。また、酢酸アンモ-ゥムの濃度も 40mMに限られ ない。
[0061] 以上の方法により作製される CdS リステリアアポフェリチン複合体は、リステリアァ ポフェリチンの 12個のモノマーサブユニットからなり、内部に空洞が形成された外殻と 、空洞内に形成された CdSからなる微粒子とを備えている。微粒子の直径は約 5nm あるいはそれ以下である。
[0062] 第 3の実施形態の変形例
図 12 (c)は、第 3の実施形態の変形例に係る化合物半導体 リステリアアポフェリ チン複合体の作製条件を示す図である。
[0063] 本変形例の方法では、図 12 (a)に示すステップ S21において、図 12 (c)に示す濃 度になるように酢酸アンモ-ゥム溶液と、酢酸カドミウム溶液と、アンモニア水、リステリ ァアポフェリチン溶液とを混合する。この際に、反応温度は 0〜15°Cとする。特に、 4 °C程度であることが好ましい。また、酢酸カドミウム溶液の濃度は第 3の実施形態に比 ベて高くすることが好まし 、。
[0064] 次に、ステップ S22において、 10分間放置した後、ステップ S23において図 12 (a) に示す濃度になるようにチォ酢酸を反応液に添加する。ここで、酢酸カドミウムとチォ 酢酸の濃度は第 3の実施形態の方法に比べて高めにすることが好まし 、。
[0065] 次に、ステップ S24において、反応液を 0°C以上 15°C以下で 12時間以上放置して CdS -リステリアアポフェリチン複合体を形成させる。
[0066] この方法により、リステリアアポフェリチン内での CdS微粒子の形成率を 100%近く にまで高めることができる。
[0067] 図 13は、 CdS—リステリアアポフェリチン複合体の形成方法の条件を変えた場合の コア形成率を示す図である。この結果から、 25°Cで反応させる場合よりも 4°Cで反応 させる方がコアの形成率が向上できること、および低温においては反応液中の酢酸 カドミウム濃度 (すなわちカドミウム濃度）が高い方がコア形成率が向上できることが分 かる。特に、カドミウム濃度を 3mMにした場合には、コア形成率はほぼ 100%になつ ている。 25°Cにおいてカドミウム濃度を上げた場合にはリステリアアポフェリチン外部 での CdSの析出が増えるためにコア形成率の向上は見られないことから、低温にし つつカドミウム濃度を上げることで、 CdSの析出が緩やかになり、リステリアアポフェリ チン内での微粒子の形成率が上昇するものと推測される。
[0068] この方法によれば、より確実に CdS微粒子を作製することができる。そのため、微粒 子作製時のコストダウンを図ることもできる。
[0069] (第 4の実施形態）
図 14 (a)は、本発明の第 4の実施形態に係る化合物半導体—リステリアアポフェリ チン複合体の作製方法を示すフローチャートであり、（b)は、各試薬の最終濃度を示 す図である。本実施形態では、硫ィ匕亜鉛 (ZnS)力 なる微粒子をリステリアアポフエ リチン内に形成させる方法を説明する。
[0070] まず、図 14 (a)に示すステップ S31では、酢酸アンモ-ゥム溶液と酢酸亜鉛溶液と を混合する。具体的には、 300mLの純水に、 1Mの酢酸アンモ-ゥム、 1Mのアンモ ユア水、 50mMの酢酸亜鉛溶液を混合する。酢酸アンモ-ゥムの最終濃度が 40m M、アンモニアの最終濃度が 10mM、酢酸亜鉛の最終濃度が ImMとなるように各 試薬を混合する。その後、反応液にリステリアアポフェリチン溶液を添加する。具体的 には、適当な濃度のリステリアアポフェリチン溶液を最終濃度が例えば 0. 3mg/mL になるように反応液に加える。なお、本実施形態の方法で用いられる試薬の濃度は、 ここで例示したものに限られな!/、。
[0071] 次に、ステップ S32では、ステップ S31で調整された反応液を室温で 10分間放置 する。これ〖こより、亜鉛のアンモ-ゥム錯体が形成される。
[0072] 次いで、ステップ S33では、反応液にチォ酢酸を添加する。具体的には、チォ酢酸 を最終濃度が 10mMとなるように反応液に加える。
[0073] その後、ステップ S34では、反応液を室温で 12時間以上放置して ZnS リステリア アポフェリチン複合体を形成させる。この際の pHは 4. 0以上 9. 0以下程度とする。
[0074] なお、各試薬の最終濃度は上述の値に限られない。各試薬の濃度範囲の例は、図 14 (b)の通りである。ただし、反応液中のリステリアアポフェリチンの最終濃度が 0. 3 mg/mL以上 lmg/mL以下の範囲外であっても ZnS リステリアアポフェリチン複 合体を形成することは可能である。また、酢酸アンモ-ゥムの濃度も 40mMに限られ ない。
[0075] 以上の方法により作製される ZnS リステリアアポフェリチン複合体は、リステリアァ ポフェリチンの 12個のモノマーサブユニットからなり、内部に空洞が形成された外殻と 、空洞内に形成された ZnSからなる微粒子とを備えている。微粒子の直径は約 5nm あるいはそれ以下である。
[0076] 第 4の実施形態の変形例
図 14 (c)は、第 3の実施形態の変形例に係る化合物半導体—リステリアアポフェリ チン複合体の作製条件を示す図である。
[0077] 本変形例の方法では、図 14 (a)に示すステップ S31において、図 14 (c)に示す濃 度になるように酢酸アンモ-ゥム溶液と酢酸亜鉛溶液とリステリアアポフェリチン溶液 とを混合する。この際に、反応温度は 0°C以上 15°C以下とする。特に、 4°C程度であ ることが好ましい。また、酢酸亜鉛溶液の濃度は第 3の実施形態に比べて高くするこ とが好ましい。
[0078] 次に、ステップ S32において、 10分間放置した後、ステップ S33において図 14 (c) に示す濃度になるようにチォ酢酸を反応液に添加する。ここで、チォ酢酸の濃度は 第 4の実施形態の方法に比べて高めにすることが好まし 、。
[0079] 次に、ステップ S34において、反応液を 0〜15°Cで 12時間以上放置して ZnS リ ステリアアポフェリチン複合体を形成させる。
[0080] この方法により、リステリアアポフェリチン内での ZnS微粒子の形成率を 100%近く にまで高めることができる。 CdS リステリアアポフェリチン複合体の形成時と同様に 、低温にしつつ亜鉛濃度を上げることで、 ZnSの析出が緩やかになってリステリアァ ポフェリチン外部での析出が抑えられると考えられる。そのため、リステリアアポフェリ チン内での微粒子の形成率が上昇するものと推測される。
[0081] この方法によれば、第 4の実施形態に係る方法よりも確実に ZnS微粒子を作製する ことができる。そのため、微粒子作製時のコストダウンを図ることもできる。
[0082] (第 5の実施形態）
本発明の第 5の実施形態として、遺伝子組み換え技術を用いて作製されたリコンビ ナントアポフェリチンを用いて化合物半導体力もなる微粒子—タンパク質複合体を形 成させる方法を説明する。
[0083] 上述したように、第 1および第 2の実施形態の方法で用いられた市販のアポフェリチ ンは、 Hサブユニットと Lサブユニットという 2種類のモノマーサブユニットの混成体で ある。 Lサブユニットのアミノ酸配列は配列番号 1に示された通りである。天然に存在 するアポフェリチンは体内で N末端から 8残基分がプロセシングを受けて欠失すると 言われている。この 8残基のうちの一部はアポフェリチンの外表面に突きだしており、 この部分を失うことでアポフェリチンの表面電荷の状態は変わると考えられる。本実施 形態の方法では、 N末端の 8残基のうちアミノ酸配列の先頭に位置するメチォニンを 除く 7残基分を欠失させた Lサブユニットのみ力 なるリコンビナントアポフェリチンを 用 ヽて微粒子 タンパク質複合体の形成を行う。
[0084] まず、遺伝子組み換え技術を用いてゥマ L—アポフェリチンの (N末端から） 2〜8番 目のアミノ酸を欠失させた Lサブユニットを作製する。具体的には、 2〜8番目のァミノ 酸を欠失させた Lサブユニットをコードする DNAを発現ベクターに導入し、これを用 いて大腸菌を形質転換することで N末端アミノ酸を欠失させた Lサブユニットのみ力も なるリコンビナントアポフェリチンを得る。このリコンビナントアポフェリチンを以後「Fer8 アポフェリチン」と呼ぶ。この Fer8アポフェリチンのアミノ酸配列は、配列番号 2に記載 している。
[0085] 次に、市販のアポフェリチンを用いる場合と同様の手順 (第 1の実施形態参照）によ つて CdS— Fer8アポフェリチン複合体を形成させる。これにより、 CdS— Fer8アポフエ リチン複合体が高い収率で得られた。ただし、 Fer8アポフェリチンを用いた場合、反 応液の pHが 4. 0〜9. 5の範囲で CdSからなるコアを形成することができた。 [0086] 図 15は、市販のアポフェリチン（C-Apoferritin)および Fer8アポフェリチンを用いた 場合で、反応液の上清中に残存するタンパク質量を示す図である。本測定結果は、 微粒子—アポフェリチン複合体を形成させた後に反応液を 12000rpmで 10分間程 度遠心分離し、得られた上清中のタンパク質を測定したものである。
[0087] その結果、図 15に示すように、 Fer8アポフェリチンを用いた例では、市販のゥマ脾 臓由来アポフェリチンを用いた例に比べて 、ずれのアンモニア濃度にぉ 、ても上清 内に残存するタンパク質量が多くなつていた。これは、 Fer8を用いた場合の方が巿販 のアポフェリチンを用いた場合に比べて反応液中でアポフェリチン同士が集合して沈 殿する割合が低いことを意味する。従って、 Fer8アポフェリチンを用いれば市販のァ ポフェリチンを用いる場合よりも高い収率で CdS—アポフェリチン複合体を得ることが できると推察される。
[0088] 次に、図 16は、反応液中のアンモニア濃度を 7. 5mM、 37. 5mM、 75mMとした 場合の CdS— Fer8アポフェリチン複合体の蛍光スペクトルを示す図である。なお、図 16にお!/、て「C- apoferritinjとあるのは市販のゥマ脾臓由来のアポフェリチンのみの 蛍光スペクトルを示し、「Fer8」とあるのは Fer8アポフェリチンのみの蛍光スペクトルを 示すものとする。図 16からは、 CdS— Fer8アポフェリチン複合体は、励起光を受けて 500〜600nmの付近に蛍光を発することが分かる。また、市販のアポフェリチンのみ と Fer8アポフェリチンのみを用いた場合の結果の比較から、 Fer8アポフェリチンに由 来する蛍光は市販のアポフェリチンに由来する蛍光に比べて強度が小さいことが分 かる。従って、 CdS— Fer8アポフェリチン複合体においては、 CdSに起因する蛍光が Fer8アポフェリチンからの蛍光の影響をより受けにくくなつている。
[0089] さらに、図 17は、市販のアポフェリチンを用いた場合と Fer8アポフェリチンを用いた 場合とでアポフェリチン内にコアが形成される割合を比較した図である。なお、この試 験においては、反応液中の Cd濃度を lmM、 S2—濃度を ImMとし、アンモニア濃度 を 75mMとした。
[0090] 図 17から分力るように、 Fer8アポフェリチンを用いた場合には、市販のアポフェリチ ンを用いた場合に比べて CdSからなるコアがアポフェリチン内に形成する率が高くな つていた。従って、 Fer8アポフェリチンを用いれば、 CdS—アポフェリチン複合体の収 率を大幅に向上させることが可能になる。
[0091] また、 Fer8アポフェリチンは、遺伝子組み換え技術によって大量供給が確保されて
V、るので、低コストで CdSからなる微粒子を作製することが可能となる。
[0092] 以上のように、 Fer8アポフェリチンを用いれば、高!、収率で安価に CdS力もなる微 粒子を形成することができ、 CdSによる蛍光がタンパク質部分の蛍光の影響を受けに くい CdS アポフェリチン複合体を形成できる。従って、半導体装置などへの利用を 図る上では本実施形態の方法を用いることがより好ましい。
[0093] なお、ここでは CdSからなる微粒子を Fer8アポフェリチンに導入する方法について 説明したが、第 2の実施形態と同様の手順によって ZnSからなる微粒子を Fer8アポフ エリチンに導入することができる。
[0094] また、リステリアアポフェリチンにっ 、ても、 N末端の一部を除去することで、コア形 成率を向上させることができる可能性がある。このようなリステリアアポフェリチンも大 腸菌などを用いた遺伝子組み換え技術を用いて大量に作製することが可能である。
[0095] (第 6の実施形態）
これ以降の実施形態では、化合物半導体—アポフェリチン (またはリステリアフェリ チン)複合体の応用例について説明する。
[0096] 一半導体装置の構成および機能
図 18は、本発明の第 6の実施形態に係る半導体装置を示す断面図である。同図に 示す半導体装置は、化合物半導体力もなる量子ドットを利用した不揮発性メモリセル である。
[0097] 図 18に示すように、本実施形態の半導体装置 120は、 Siなどの第 1導電型の半導 体からなる半導体基板 101と、半導体基板 101上の活性領域を囲む素子分離用絶 縁膜 102と、半導体基板 101の活性領域上に設けられた SiOなどカゝらなるトンネル
2
絶縁膜 103と、トンネル絶縁膜 103上に間隔を空けて配置されたィ匕合物半導体から なる微粒子 104と、トンネル絶縁膜 103上に設けられ、微粒子 104を埋め込む SiO
2 など力もなる絶縁膜 105と、絶縁膜 105上に設けられた A1などの導電体力もなるコン トロールゲート（ゲート電極） 106と、半導体基板 101のうちコントロールゲート 106の 両側方に位置する領域に設けられ、第 2導電型の不純物を含むソース領域 107aお よびドレイン領域 107b (不純物拡散層）と、基板の全面上に設けられた層間絶縁膜 1 08と、層間絶縁膜 108に形成されたコンタクトホール 109と、コンタクトホール 109を 埋めるプラグを介してソース領域 107aおよびドレイン領域 107bにそれぞれ接続され る A1配線 l l la、 11 lbとを備えている。トンネル絶縁膜 103の厚みは例えば 1. 5nm 以上 4nm以下程度であり、絶縁膜 105の厚みは例えば 17nm程度である。
[0098] また、微粒子 104は直径が約 7nmの球状をしている。微粒子 104の中心同士の間 隔は約 12nmで、トンネル絶縁膜 103上に 2次元状に配置されている。微粒子 104の 材料としては、 CdSおよび ZnSが挙げられる。
[0099] なお、図 18に示す半導体装置の例では、ソース領域 107aおよびドレイン領域 107 bは高濃度の n型不純物を含み、半導体基板 101は p型不純物を含んでいるものとす る。
[0100] 本実施形態の半導体装置においては、微粒子 104に電荷が保持されているか否 かによつて二通りのドレイン電流 ゲート電圧特性を示すと考えられる。すなわち、本 実施形態の半導体装置は、電子が微粒子 104に注入された状態と、電子が微粒子 1 04から引き抜かれた状態とでは、異なるドレイン電流—ゲート電圧特性を示すと考え られる。そのため、本実施形態の半導体装置を以下のように動作させることにより、不 揮発性メモリセルとして機能させることができる。
[0101] まず、微粒子 104に電子を注入する際には、コントロールゲート 106に正電圧を印 加する。これにより、トンネル絶縁膜 103を介した直接トンネリングにより微粒子 104に 注入される。これに対し、微粒子 104から電子を引き抜く際には、コントロールゲート 1 06に負電圧を印加する。微粒子 104に電子が注入された状態とされていない状態を 「1」または「0」の 、ずれかの情報に対応させれば、上述のようにして情報の書き込み が行われる。情報を読み出す際には、所定のゲート電圧を印力!]した状態でのドレイン 電流をセンスアンプ（図示せず)で読み出す。
[0102] なお、本実施形態の半導体装置において微粒子 104の直径は約 7nmであるが、こ れ以下の直径を有する微粒子を用いてもよい。直径が 7nmより小さい微粒子は、第 1 の実施形態で説明したように、 CdS アポフェリチン複合体の形成させる際に、反応 液中のアンモニア濃度を変更することによって作製することができる。 [0103] 一半導体装置の製造方法
図 19 (a)〜 (f)は、本実施形態の半導体装置の製造方法を説明するための断面図 である。
[0104] まず、図 19 (a)に示すように、第 1〜第 4の実施形態で説明した方法により、アポフ エリチン 132またはリステリアアポフェリチンなどのかご状タンパク質に金属イオンおよ び硫化物イオン 135を 3回対称のチャネル 130を介して導入し、 CdSあるいは ZnS力 らなる微粒子を形成させる。
[0105] 次に、図 19 (b)に示すように、 l〜5 X 1016cm_3程度の p型不純物を含む半導体 基板 101上に熱酸ィ匕によって厚さ 1. 5nm以上 4nm以下の SiO膜 103aを形成後、
2
LOCOS法によって素子分離用絶縁膜 102を形成する。素子分離用絶縁膜 102は STI (Shllow Trench Isolation)によって形成されてもよい。次に、基板を 3- (2- aminoet hyl amino)propyl-trimethoxy silane(APTMS)などのメトキシシラン化合物を用いて素 子分離用絶縁膜 102および SiO膜 103aの表面をァミノ基で修飾する。その後、素
2
子分離用絶縁膜 102および SiO膜 103aの上に先の工程で作製された、微粒子—
2
アポフェリチン複合体 137を 2次元状に配置する。微粒子 アポフェリチン複合体 13 7の基板への配置方法としては、例えば特開平 11—45990号公報に記載された方 法などが用いられる。
[0106] 次に、図 19 (c)に示すように、オゾン存在下で基板に紫外線 (UV)を 110Wの強度 で 10分間照射することによってアポフェリチン 132 (外殻部分）および 3-(2- aminoeth yl amino)propyl-trimethoxy silane (APTMS)分子を除去する。これにより、基板上に 中心間隔が約 12nmで 2次元状に配置された直径約 7nmの微粒子 104が残される。 本工程ではオゾンを含む雰囲気中、波長がそれぞれ 253. 7nmおよび 184. 9nmの UVを 110Wの強度で 40分間基板に照射する。本工程は、水分を除去するために 1 15°Cで行う。なお、アポフェリチン 132等の有機物は、室温での酸素プラズマ処理や 、窒素雰囲気下、 400°Cでの熱処理などによっても除去することができる。
[0107] 続いて、図 19 (d)に示すように、素子分離用絶縁膜 102および SiO膜 103aの上（
2
基板全面上）にスパッタリングにより微粒子 104を埋める厚さ 17nmの SiO膜 105aを
2 形成する。本工程のスパッタリングは、例えば SiOをターゲットとして用い、室温下、 圧力が 4. 7〜5. 3 X 10 Pa、RF出力が 200W、アルゴン流量が 16sccm (mL/min at 0°C、 101.3kPa)、酸素流量が 4sccmの条件で 4分 30秒間行う。なお、 SiO膜 105
2 aの形成は、 CVD法により行ってもよ!ヽ。
[0108] 次に、図 19 (e)に示すように、基板上に A1膜を堆積する。続いて、フォトレジストマ スク Prlを用いて、 SiO膜 103a、絶縁膜 105および A1膜のパターユングを行なって
2
トンネル絶縁膜 103、電極間絶縁膜となる絶縁膜 105および A1カゝらなるコントロール ゲート 106をそれぞれ形成する。その後、フォトレジストマスク及びコントロールゲート 106をマスクとして n型不純物イオンの注入を行なって、ソース領域 107aおよびドレ イン領域 107bを形成する。
[0109] その後、図 19 (f)に示す工程で、周知の方法により、層間絶縁膜 108の形成と、層 間絶縁膜 108へのコンタクトホール 109の開口と、コンタクトホール 109内へのタンダ ステンの埋め込みによるタングステンプラグ 110の形成と、 A1配線 l l la、 11 lbの形 成とを行なう。
[0110] 以上の方法により、本実施形態の半導体装置を作製することができる。ここで示す ように、第 1〜第 4の方法によって作製された化合物半導体 タンパク質複合体を用 いて量子ドットの性質を利用した半導体記憶装置を実現することができる。
[0111] (第 7の実施形態）
本発明の第 7の実施形態として、本発明の化合物半導体 タンパク質複合体を蛍 光標識として用いる方法にっ 、て説明する。
[0112] 第 1の方法
図 20 (a)〜 (g)は、本実施形態の第 1の蛍光標識方法を説明するための図である。 ここでは、化合物半導体 タンパク質複合体を用いて標的物質を蛍光標識する方法 を説明する。
[0113] まず、図 20 (a)に示すように、プラスミド中に先頭部分（5 '側）にシスティン（図中で は「Cys」と表記）をコードする配列を付カ卩したアポフェリチン DNAを組み込む。この プラスミドは発現ベクターである。
[0114] 次に、図 20 (b)に示すように、作製されたプラスミドをホストである大腸菌に導入し、 大腸菌の形質転換を行う。 [0115] 次いで、図 20 (c)、（d)に示すように、形質転換された大腸菌を培養し、菌体内で 生産された変異アポフェリチン (N末端に Cysが導入されたアポフェリチン)を抽出、 精製する。その後、精製された変異アポフェリチン内に第 1または第 2の実施形態に 係る方法を用いて CdSあるいは ZnSからなる微粒子を形成させる。これにより、微粒 子と N末端に Cysが付加されたアポフェリチンとの複合体が形成できる。
[0116] 一方で、図 20 (e)に示すように、標識したい物質 (例えば図中のタンパク質 A)の表 面に露出しているアミノ酸残基を Cysに置換する。あるいは、標識したいタンパク質の 表面露出部に Cysあるいは SH基を置換または付加する。なお、標的物質はタンパク 質に限らず SH基を導入できるものであれば何でもよい。例えば、 DNAやポリマー等 の高分子化合物などを標的物質とすることもできる。
[0117] 次に、図 20 (f)に示すように、タンパク質 Aを含む溶液と微粒子—変異アポフェリチ ン複合体を含む溶液とを混合する。これにより、タンパク質 Aの Cysと微粒子—変異 アポフェリチン複合体の Cysとが S - S結合 (ジスルフイド結合)を形成し、タンパク質 Aと微粒子 変異アポフェリチン複合体とが結合される。微粒子 変異アポフェリチ ン複合体中の微粒子は例えば波長 350nmの励起光に対して蛍光を発するので、こ の蛍光を用いてタンパク質 Aを検出することができるようになる。以上のようにして、目 的のタンパク質を蛍光標識することができる。標的物質力 Sタンパク質以外の物質であ る場合には、標的物質に付加された SH基と微粒子—変異アポフェリチン複合体の C ysとで S— S結合を形成させればよい。なお、図 20 (g)に示すように、この S— S結合 は、還元剤の添カ卩によって容易に切断することができる。
[0118] この方法によれば、任意のタンパク質を蛍光標識することができる上、微粒子の直 径が異なる微粒子—変異アポフェリチン複合体を用いることで、標識されたタンパク 質の蛍光波長を変えることもできる。このように、本発明の化合物半導体 タンパク質 複合体は、生体物質等のマーカーとして利用することができる。
[0119] なお、以上で説明した方法以外にも、本発明の化合物半導体 タンパク質複合体 は、アビジン ピオチン結合や抗原抗体反応を用いた蛍光標識方法に利用すること ができる。
[0120] また、本実施形態の方法では、アポフェリチンに代えてリステリアアポフェリチンを用 いることちでさる。
[0121] また、上述のように、タンパク質だけでなく DNA、抗原、ウィルス、ポリマーなどの高 分子化合物など、 SH基を保持しているもの、あるいは SH基で修飾可能なものであ れば蛍光標識することができる。
[0122] 第 2の方法
図 21 (a)、 (b)は、本実施形態の第 2の蛍光標識方法を説明するための図である。
[0123] まず、図 21 (a)に示すように、第 1および第 2の実施形態に係る方法によって微粒 子—アポフェリチン複合体を作製する。そして、微粒子—アポフェリチン複合体を含 む溶液と標識したい対象物 (抗体、抗原を含むタンパク質、細胞などの標的生体物 質）を含む溶液とを混合する。次いで、 DEC (1- (3- (Dimethyl amino)propyl)- 3- ethylc arbodiimide)などのカップリング剤を反応液に添加すると、アポフェリチン外表面に存 在するカルボキシル基と標識対象物のアミノ基末端とが縮合反応を起こし、図 21 (b) に示すように、アミド結合が形成される。これにより、微粒子 アポフェリチン複合体が 結合された標識対象物を作製することができる。微粒子—アポフェリチン複合体中の 微粒子は、例えば波長 350nmの励起光に対して蛍光を発するので、標識対象物を 容易に観察することができるようになる。
[0124] なお、アポフェリチン溶液に標識したい対象物とカップリング剤をカ卩えてアポフェリ チンと標識対象物とを結合させた後で、アポフェリチン内に微粒子を形成させてもよ い。
[0125] なお、本方法において、標的物質としてはタンパク質や細胞などの他、 DNA、ポリ マー、カーボンナノホーンなど、アミノ基を保持しているもの、または化学的にアミノ基 を修飾可能な物質を用いることができる。
[0126] (第 8の実施形態）
本発明の第 8の実施形態として、基板に対して蛍光標識を行う方法について説明 する。
[0127] チタン (Ti)などを認識して結合する Ti認識ペプチドが、文献等により発表されて!ヽ る（Kenichi Sanoら, Small,No.8-9,p826- 832(2005))。この Ti認識ペプチドは Arg- Lys- Leu-Pro-Asp-Alaの 6残基のアミノ酸からなり、 Ti、 Siなどに結合する性質がある。本 実施形態の蛍光標識方法では、 Ti認識ペプチドを用いて微粒子 アポフェリチン複 合体を基板の所望の位置に配置させる。以下にその手順を説明する。
[0128] 図 22 (a)〜 (c)は、本発明の第 8の実施形態に係る基板に対する蛍光標識方法の 概略を示す図である。
[0129] まず、図 22 (a)に示すように、アポフェリチンの外表面上に Ti認識ペプチド 150を 付加する。 Ti認識ペプチド 150はカップリング剤などを用いてアポフェリチンの外表 面上に結合されてもよいが、遺伝子組み換え技術を用いてアポフェリチンの N末端に Ti認識ペプチド 150を導入する方力 生産性の面力も見て好ましい。具体的には、 アポフェリチンをコードする DNAの上流（5 '側）に Ti認識ペプチド 150をコードする D NAをカ卩えたものを発現ベクターに入れ、これを大腸菌などに導入する。この大腸菌 内では Ti認識ペプチド 150が N末端側に付加されたリコンビナントアポフェリチンが 大量に生産される。次に、リコンビナントアポフェリチンを菌体内から抽出し、精製す る。リコンビナントアポフェリチンはモノマーサブユニットが集合した形で精製すること が可能である。モノマーサブユニットの N末端はアポフェリチンの外表面上に突出し て ヽるため、 N末端側に付加された Ti認識ペプチドもリコンビナントアポフェリチンの 外表面上に突出している。なお、配列番号 3には、リコンビナントアポフェリチンのモノ マーサブユニットのアミノ酸配列を示して 、る。
[0130] 次に、図 22 (b)に示すように、 CdSまたは ZnSからなる微粒子をリコンビナントアポ フェリチン内に形成させる。本工程は、第 1および第 2の実施形態と同一の方法によ つて行われる。
[0131] 次いで、図 22 (c)に示すように、微粒子一リコンビナントアポフェリチン複合体を基 板上に配置する。ここで、基板のうち微粒子ーリコンビナントアポフェリチン複合体を 配置させたい領域上には事前に Ti膜を形成しておく。この基板を微粒子ーリコンビ ナントアポフェリチン複合体を含む水溶液中に置けば、微粒子ーリコンビナントアポフ エリチン複合体が、基板の Ti膜が形成された部分にのみ結合する。 CdSまたは ZnS は紫外光などによって励起すると蛍光を発するので、図 22 (c)に示すように、基板の うち微粒子ーリコンビナントアポフェリチン複合体が配置された部分のみに蛍光が見 られる。 [0132] このように、本実施形態の方法によれば、基板上に Ti膜のパターン通りに微粒子 リコンビナントアポフェリチン複合体を配置することができるので、種々の蛍光模様を 基板上に描くことができる。
[0133] また、基板の異なる領域に異なる粒径の微粒子を有する微粒子ーリコンビナントァ ポフェリチン複合体を配置することで、領域ごとに異なる蛍光を生じさせることも可能 となる。また、青色を発する ZnS リコンビナントアポフェリチン複合体と赤色を発する CdS リコンビナントアポフェリチン複合体とをそれぞれ基板の異なる領域上に配置 し、ナノ蛍光パターンやナノ蛍光文字を作成することもできる。あるいは、基板の任意 の位置に化合物半導体力もなる微粒子を配置させることができるので、従来よりもより 複雑な半導体デバイスや光デバイスを作製することが可能となる。
[0134] なお、ここではゥマ肝臓由来のアポフェリチンの N末端に Ti認識ペプチドを付カロし たものを用いる例を示した力 他の臓器由来のアポフェリチンや他の生物由来のアポ フェリチンの N末端に Ti認識ペプチドを付加したものを用いても基板上の任意の領 域に配置することができる。
[0135] また、リステリアフェリチンの N末端側に Ti認識ペプチドを付加してもアポフェリチン の場合と同様の効果を得ることができる。
[0136] (第 9の実施形態）
図 23は、本発明の第 9の実施形態に係る化合物半導体 アポフェリチン複合体の 作成方法を示すフローチャートである。本実施形態では、 CdSからなる微粒子をアポ フェリチン内に形成させる方法を説明する。
[0137] まず、図 23に示すステップ S51では、第 1の実施形態に係る方法で CdS アポフ エリチン複合体を形成させた後、カラムなどを用いて CdS アポフェリチン複合体を 精製する。
[0138] 次に、ステップ S52では、再度図 2 (b)に示す組成の反応液中に精製された CdS— アポフェリチン複合体をカ卩える。ここで、 CdS アポフェリチン複合体はアポフェリチ ンの代わりに用い、その濃度はアポフェリチン濃度と同じ 0. 3mgZmL〜l. Omg/ mLであることが好ましい。その後、ステップ S53では、反応液を室温で 12時間以上 放置する。 [0139] 次に、ステップ S54では、最終濃度が ImMとなるように反応液に酢酸カドミウムを 添加し、ステップ S55ではこの反応液を室温で 10分間放置する。
[0140] 次いで、ステップ S56では、チォ酢酸を最終濃度が ImMとなるように反応液にカロえ る。その後、ステップ S57では、反応液を室温で 12時間以上放置する。
[0141] 次に、ステップ S58では、ステップ S54からステップ S57までのステップを繰り返す。
[0142] 以上の方法により、アポフェリチン内の微粒子をさらに成長させることができる。
[0143] 図 24 (a)は、本実施形態の方法において 7. 5mMアンモニア水を用いて作製され た CdS微粒子の直径を示す図であり、（b)は、第 1の実施形態の方法で形成させた C dS—アポフェリチン複合体の TEM写真であり、（c)は、本実施形態の方法で形成さ せた CdS—アポフェリチン複合体の TEM写真である。
[0144] 図 24 (a)に示す「条件 1」は、第 1の実施形態に係る方法により形成された微粒子を 表しており、「条件 2」は、 ImMのカドミウムと ImMのチォ酢酸を CdS—アポフェリチ ン複合体の精製後に 1回添加することにより形成された微粒子を表しており、「条件 3 」は、 ImMのカドミウムと ImMのチォ酢酸を CdS—アポフェリチン複合体の精製後 に 2回添加することにより形成された微粒子を表しており、「条件 4」は、 ImMのカドミ ゥムと ImMのチォ酢酸を CdS—アポフェリチン複合体の精製後に 3回添加すること により形成された微粒子を表して 、る。
[0145] これらの結果から、一度 CdS—アポフェリチン複合体を形成させた後にカドミウムと チォ酢酸とを交互に添加することで、アポフェリチン内に形成される CdS微粒子のサ ィズを大きくすることができることが分かる。カドミウムとチォ酢酸を CdS—アポフェリチ ン複合体の精製後に 3回添加した場合には CdS微粒子の直径がほぼ 7nmとなって おり、 CdS微粒子の直径がほぼアポフェリチン内の空洞のサイズと等しくなつているこ とが分かる。また、本実施形態の方法によれば、カドミウムとチォ酢酸の添加を繰り返 すことで、 CdS微粒子の直径のバラツキを小さくすることも可能である。
[0146] なお、本実施形態の方法において、ステップ S55で反応液の放置時間は 10分に 限られない。また、ステップ S54で添加される酢酸カドミウムの濃度は ImMに限られ ず、ステップ S56で添加されるチォ酢酸の濃度も ImMに限られない。
[0147] また、上述の反応を 0〜15°Cで行ってもよい。 [0148] また、本実施形態と同様の方法を用いて ZnS—アポフェリチン複合体や CdS—リス テリアアポフェリチン複合体、 ZnS—リステリアアポフェリチン複合体を形成することも できる。
[0149] 例えば、 ZnS—アポフェリチン複合体を形成する際には、第 2の実施形態の方法で ZnS -アポフェリチン複合体を形成させた後にこれを精製し、 ZnS -アポフェリチン 複合体を反応液に加える。その後、 ImMの酢酸亜鉛、 ImMのチォ酢酸を順次反 応液に加える。以後、酢酸亜鉛とチォ酢酸を交互に添加していくことで、 ZnS微粒子 を成長させることができる。また、 CdS—リステリアアポフェリチン複合体や ZnS—リス テリアアポフェリチン複合体を作製する際には、上述の方法において、アポフェリチン とリステリアアポフヱリチンを置き換えればよ 、。
[0150] 以上の方法により、高いレベルで均一なサイズの化合物半導体力 なる微粒子を 形成することができる。
[0151] なお、第 1の実施形態以外の方法で作製した CdS—アポフェリチン複合体を用い てステップ S51〜ステップ S58を行ってもよい。
産業上の利用可能性
[0152] 以上説明したように、本発明の方法により作製されたィ匕合物半導体—タンパク質複 合体は、量子ドットを利用した半導体装置や生体物質の蛍光標識などの種々の用途 に用いることができる。

Claims

請求の範囲
[1] 複数のモノマーサブユニットから構成され、内部に空洞が形成された外殻と、
前記外殻内に形成され、化合物半導体からなり、励起された場合に蛍光を発する 微粒子とを備え、
前記外殻は、 N末端の一部を欠失させた単一のモノマーサブユニットからなるリコン ビナントアポフェリチンまたは、 N末端の一部を欠失させた単一のモノマーサブュ-ッ トからなるリコンビナントリステリアアポフェリチンである、微粒子—タンパク質複合体。
[2] 前記微粒子は、 CdSまたは ZnSを含むことを特徴とする請求項 1に記載の微粒子
—タンパク質複合体。
[3] 水溶液中で金属のアンモ-ゥム錯体を形成させる工程 (a)と、
内部に空洞が形成されたタンパク質の溶液とチォ酢酸とを前記水溶液中で混合し て、前記タンパク質の前記空洞内に前記金属の硫化物からなる微粒子を形成させる 工程 (b)とを備えていることを特徴とする微粒子一タンパク質複合体の作製方法。
[4] 前記タンパク質はアポフェリチン、リステリアアポフェリチンまたはこれらの組み換え 体であることを特徴とする請求項 3に記載の微粒子 タンパク質複合体の作製方法。
[5] 前記金属は、 Cdまたは Znであることを特徴とする請求項 3に記載の微粒子—タン パク質複合体の作製方法。
[6] 前記工程 (a)では、酢酸イオンとアンモ-ゥムイオンとを含む溶液と、前記金属の酢 酸塩溶液と、アンモニア水とを混合することを特徴とする請求項 5に記載の微粒子 タンパク質複合体の作製方法。
[7] 前記金属は Cdまたは Znであり、
前記工程 (b)では、前記水溶液中のアンモニア濃度によって直径の異なる微粒子 が形成されることを特徴とする請求項 6に記載の微粒子一タンパク質複合体の作製 方法。
[8] 前記タンパク質はリステリアアポフェリチンまたはリステリアアポフェリチンの組み換 え体であり、
前記工程 (a)および前記工程 (b)は、共に 0°C以上 15°C以下で行うことを特徴とす る請求項 3に記載の微粒子 タンパク質複合体の作製方法。
[9] 前記工程 (b)で形成された前記微粒子と前記タンパク質との複合体を精製するェ 程 (c)と、
前記工程 (c)で精製された前記微粒子と前記タンパク質との複合体を含む溶液と 前記金属を含む溶液とを混合する工程 (d)と、
前記工程 (d)で作製された混合液にチォ酢酸を加え、前記タンパク質内に形成さ れた前記微粒子を成長させる工程 (e)と、
前記工程 (e)の後、前記混合液に前記金属を含む溶液と前記チォ酢酸とを交互に 加える工程を繰り返して前記微粒子を成長させる工程 (f)とをさらに備えていることを 特徴とする請求項 3に記載の微粒子 タンパク質複合体の作製方法。
[10] 内部に空洞が形成されたタンパク質と、前記空洞内に形成された金属の硫ィ匕物か らなる微粒子との複合体を含む溶液を作製する工程 (a)と、
前記微粒子と前記タンパク質との複合体を含む溶液に前記金属を含む溶液を加え る工程 (b)と、
前記工程 (b)の後に、前記微粒子と前記タンパク質との複合体を含む溶液にチォ 酢酸を加えて前記微粒子を成長させる工程 (c)と、
前記工程 (b)と前記工程 (c)とを繰り返して前記微粒子を成長させる工程 (d)とを備 えて ヽる微粒子―タンパク質複合体の作製方法。
[11] 水溶液中で Cdまたは Znのアンモ-ゥム錯体を形成させる工程 (a)と、
内部に空洞が形成されたタンパク質の溶液とチォ酢酸とを前記水溶液中で混合し て、前記空洞内に CdSまたは ZnSを含み、励起された場合に蛍光を発する微粒子を 形成させ、微粒子 タンパク質複合体を作製する工程 (b)と、
前記微粒子—タンパク質複合体を標的物質に結合させて前記標的物質を標識す る工程 (c)とを備えていることを特徴とする蛍光標識方法。
[12] 内部に空洞を有する前記タンパク質はアポフェリチン、リステリアアポフェリチンまた はこれらの組み換え体であることを特徴とする請求項 11に記載の蛍光標識方法。
[13] 前記工程 (c)の前に、 N末端にシスティンを付加した第 1の変異アポフェリチンまた は第 1の変異リステリアアポフェリチンを作製する工程 (d)と、
前記工程 (c)の前に、前記標的物質を SH基を有する化合物で修飾する工程 ( と をさらに備え、
前記工程 (c)では、前記第 1の変異アポフェリチンまたは前記第 1の変異リステリア アポフェリチンと前記標的物質とをジスルフイド結合によって結合させることを特徴と する請求項 12に記載の蛍光標識方法。
[14] 前記標的物質は外表面にアミノ基を有しており、
前記工程 (c)では、カップリング剤を用いて前記標的物質の外表面に位置するアミ ノ基と前記アポフェリチンまたは前記リステリアアポフェリチンの外表面に位置する力 ルポキシル基とを縮合反応させてアミド結合を形成させることを特徴とする請求項 12 に記載の蛍光標識方法。
[15] 前記タンパク質は、 N末端に Ti認識ペプチドが付加された第 2の変異アポフェリチ ンであり、
前記標的物質は表面の一部に Ti膜を有する基板であることを特徴とする請求項 12 に記載の蛍光標識方法。
[16] 前記工程 (a)の前に、遺伝子組み換え技術を用いて前記第 2の変異アポフェリチン を作製する工程をさらに備えていることを特徴とする請求項 15に記載の蛍光標識方 法。
[17] 水溶液中で Cdまたは Znのアンモ-ゥム錯体を形成させる工程 (a)と、
内部に空洞が形成されたタンパク質の溶液とチォ酢酸とを前記水溶液中で混合し て、前記空洞内に CdSまたは ZnSを含み、励起された場合に蛍光を発する微粒子を 形成させ、微粒子 タンパク質複合体を作製する工程 (b)と、
内部に空洞を有するタンパク質を標的物質に結合させる工程 (c)と、
前記タンパク質内に CdSまたは ZnSを含み、励起された場合に蛍光を発する微粒 子を形成させ、微粒子—タンパク質複合体を作製する工程 (d)とを備えていることを 特徴とする蛍光標識方法。
[18] 内部に空洞を有する前記タンパク質はアポフェリチン、リステリアアポフェリチンまた はこれらの組み換え体であることを特徴とする請求項 17に記載の蛍光標識方法。
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