JP2003033191A - 組み換えかご状タンパク質、その作製方法、貴金属−組み換えかご状タンパク質複合体、その作製方法、及び組み換えｄｎａ - Google Patents
組み換えかご状タンパク質、その作製方法、貴金属−組み換えかご状タンパク質複合体、その作製方法、及び組み換えｄｎａInfo
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 貴金属粒子をアポフェリチンに導入し、貴金
属−アポフェリチン複合体を作製する。 【解決手段】 遺伝子組み換え技術を用いて、アポフェ
リチンのチャネル３に位置するグルタミン酸及びアスパ
ラギン酸を、電荷を持たず、且つサイズの小さいセリン
で置換する。次に、保持部４に位置するグルタミン酸を
リジン等の塩基性アミノ酸または中性アミノ酸で置換す
る。さらに、保持部に１つ以上のシステインを導入す
る。これにより、負電荷を持つ（ＡｕＣｌ4）-と負電荷
を持つアミノ酸との間に静電相互作用による斥力が生じ
ることを防ぐことができ、（ＡｕＣｌ4）-がチャネル及
び保持部に取り込まれやすくなる。保持部に取り込まれ
た（ＡｕＣｌ4）-は続いてＡｕに還元され、金粒子を包
含したアポフェリチンが作製される。
属−アポフェリチン複合体を作製する。 【解決手段】 遺伝子組み換え技術を用いて、アポフェ
リチンのチャネル３に位置するグルタミン酸及びアスパ
ラギン酸を、電荷を持たず、且つサイズの小さいセリン
で置換する。次に、保持部４に位置するグルタミン酸を
リジン等の塩基性アミノ酸または中性アミノ酸で置換す
る。さらに、保持部に１つ以上のシステインを導入す
る。これにより、負電荷を持つ（ＡｕＣｌ4）-と負電荷
を持つアミノ酸との間に静電相互作用による斥力が生じ
ることを防ぐことができ、（ＡｕＣｌ4）-がチャネル及
び保持部に取り込まれやすくなる。保持部に取り込まれ
た（ＡｕＣｌ4）-は続いてＡｕに還元され、金粒子を包
含したアポフェリチンが作製される。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、遺伝子組み換え技
術を用いて作製された貴金属−組み換えアポフェリチン
複合体及びその作製方法、及びその関連技術に関する。
術を用いて作製された貴金属−組み換えアポフェリチン
複合体及びその作製方法、及びその関連技術に関する。
【０００２】
【従来の技術】近年、バイオテクノロジーとエレクトロ
ニクスを融合させたバイオエレクトロニクスの研究が活
発に行われ、酵素等のタンパク質を用いたバイオセンサ
ー等、すでに実用化されているものもある。
ニクスを融合させたバイオエレクトロニクスの研究が活
発に行われ、酵素等のタンパク質を用いたバイオセンサ
ー等、すでに実用化されているものもある。
【０００３】そういったバイオテクノロジーを他分野に
応用する試みの１つとして、金属化合物を保持する機能
を持つタンパク質であるアポフェリチンに金属または金
属化合物からなる微粒子を取り込ませ、ｎｍオーダーの
均一なサイズの微粒子を作製しようという研究がある。
微粒子の用途に応じて種々の金属あるいは金属化合物等
をアポフェリチンに導入すべく研究が進められている。
応用する試みの１つとして、金属化合物を保持する機能
を持つタンパク質であるアポフェリチンに金属または金
属化合物からなる微粒子を取り込ませ、ｎｍオーダーの
均一なサイズの微粒子を作製しようという研究がある。
微粒子の用途に応じて種々の金属あるいは金属化合物等
をアポフェリチンに導入すべく研究が進められている。
【０００４】ここで、アポフェリチンについて説明す
る。アポフェリチンは、生物界に広く存在するタンパク
質であり、生体内では必須微量元素である鉄の量を調節
する役割を担っている。鉄または鉄化合物とアポフェリ
チンとの複合体はフェリチンと呼ばれる。鉄は必要以上
に体内に存在すると生体にとって有害であるため、余剰
の鉄分はこのフェリチンの形で体内に貯蔵される。そし
て、フェリチンは必要に応じて鉄イオンを放出し、アポ
フェリチンに戻る。
る。アポフェリチンは、生物界に広く存在するタンパク
質であり、生体内では必須微量元素である鉄の量を調節
する役割を担っている。鉄または鉄化合物とアポフェリ
チンとの複合体はフェリチンと呼ばれる。鉄は必要以上
に体内に存在すると生体にとって有害であるため、余剰
の鉄分はこのフェリチンの形で体内に貯蔵される。そし
て、フェリチンは必要に応じて鉄イオンを放出し、アポ
フェリチンに戻る。
【０００５】図１は、フェリチン（鉄−アポフェリチン
複合体）の構造を示す模式図である。同図に示すよう
に、フェリチンは、１本のポリペプチド鎖から形成され
るモノマーサブユニットが非共有結合により２４個集合
した分子量約４６万の球状タンパク質であり、その直径
は約１２ｎｍで、通常のタンパク質に比べ高い熱安定性
と高いｐＨ安定性を示す。この球状のタンパク質（外殻
２）の中心には直径約６ｎｍの空洞状の保持部４があ
り，外部と保持部４とはチャネル３を介してつながって
いる。例えば、フェリチンに二価の鉄イオンが取り込ま
れる際、鉄イオンはチャネル３から入り、一部のサブユ
ニット内にあるferrooxidase center(鉄酸化活性中心)
と呼ばれる場所で酸化された後、保持部４に到達し、保
持部４の内表面の負電荷領域で濃縮される。そして、鉄
原子は３０００〜４０００個集合し、フェリハイドライ
ト（５Ｆｅ2Ｏ3・９Ｈ2Ｏ ）結晶の形で保持部４に保持
される。 なお、本明細書中では、保持部に保持された
金属原子を含む微粒子を「核」と称する。ここで、図１
に示す核１の直径は保持部４の直径とほぼ等しく、約６
ｎｍとなっている。
複合体）の構造を示す模式図である。同図に示すよう
に、フェリチンは、１本のポリペプチド鎖から形成され
るモノマーサブユニットが非共有結合により２４個集合
した分子量約４６万の球状タンパク質であり、その直径
は約１２ｎｍで、通常のタンパク質に比べ高い熱安定性
と高いｐＨ安定性を示す。この球状のタンパク質（外殻
２）の中心には直径約６ｎｍの空洞状の保持部４があ
り，外部と保持部４とはチャネル３を介してつながって
いる。例えば、フェリチンに二価の鉄イオンが取り込ま
れる際、鉄イオンはチャネル３から入り、一部のサブユ
ニット内にあるferrooxidase center(鉄酸化活性中心)
と呼ばれる場所で酸化された後、保持部４に到達し、保
持部４の内表面の負電荷領域で濃縮される。そして、鉄
原子は３０００〜４０００個集合し、フェリハイドライ
ト（５Ｆｅ2Ｏ3・９Ｈ2Ｏ ）結晶の形で保持部４に保持
される。 なお、本明細書中では、保持部に保持された
金属原子を含む微粒子を「核」と称する。ここで、図１
に示す核１の直径は保持部４の直径とほぼ等しく、約６
ｎｍとなっている。
【０００６】また、この核１は比較的簡単な化学操作で
除去され、核１が除かれて外殻２のみとなった粒子は、
アポフェリチンと呼ばれる。このアポフェリチンを用い
て、人工的に鉄以外の金属や金属化合物を担持させたア
ポフェリチン−微粒子複合体も作製されている。
除去され、核１が除かれて外殻２のみとなった粒子は、
アポフェリチンと呼ばれる。このアポフェリチンを用い
て、人工的に鉄以外の金属や金属化合物を担持させたア
ポフェリチン−微粒子複合体も作製されている。
【０００７】現在までに、マンガン（P.Mackle,1993,J.
Amer.Chem.Soc.115,8471-8472; F.C.Meldrumら,1995,
J.Inorg.Biochem.58,59-68)，ウラン（J.F.Hainfeld,19
92,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89,11064-11068)，ベリリ
ウム(D.J.Price,1983, J.Biol.Chem.258,10873-1088
0)，アルミニウム(J.Fleming,1987,Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA,84,7866-7870)，亜鉛（D.Price and J.G.Joshi,P
roc.Natl.Acad.Sci.USA,1982,79,3116-3119)，コバルト
（T.Douglas and V.T.Stark,Inorg.Chem.,39,2000,1828
-1830）といった金属あるいは金属化合物のアポフェリ
チンへの導入が報告されている。これらの金属あるいは
金属化合物からなる核１の直径も、アポフェリチンの保
持部４の直径とほぼ等しく、約６ｎｍとなる。
Amer.Chem.Soc.115,8471-8472; F.C.Meldrumら,1995,
J.Inorg.Biochem.58,59-68)，ウラン（J.F.Hainfeld,19
92,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89,11064-11068)，ベリリ
ウム(D.J.Price,1983, J.Biol.Chem.258,10873-1088
0)，アルミニウム(J.Fleming,1987,Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA,84,7866-7870)，亜鉛（D.Price and J.G.Joshi,P
roc.Natl.Acad.Sci.USA,1982,79,3116-3119)，コバルト
（T.Douglas and V.T.Stark,Inorg.Chem.,39,2000,1828
-1830）といった金属あるいは金属化合物のアポフェリ
チンへの導入が報告されている。これらの金属あるいは
金属化合物からなる核１の直径も、アポフェリチンの保
持部４の直径とほぼ等しく、約６ｎｍとなる。
【０００８】自然界において、鉄原子を含む核１がフェ
リチン内に形成される過程の概略は次の通りである。
リチン内に形成される過程の概略は次の通りである。
【０００９】フェリチン粒子の外部と内部とを結ぶチャ
ネル３（図１参照）の表面には、ｐＨ７−８の条件でマ
イナス電荷を持つアミノ酸が露出しており、プラス電荷
を持っているＦｅ2+イオンは静電相互作用によりチャネ
ル３に取り込まれる。このチャネル３は、１つのアポフ
ェリチンあたり８個存在している。
ネル３（図１参照）の表面には、ｐＨ７−８の条件でマ
イナス電荷を持つアミノ酸が露出しており、プラス電荷
を持っているＦｅ2+イオンは静電相互作用によりチャネ
ル３に取り込まれる。このチャネル３は、１つのアポフ
ェリチンあたり８個存在している。
【００１０】フェリチンの保持部４の内表面には、チャ
ネル３の内表面と同じく，ｐＨ７−８でマイナス電荷を
持つアミノ酸残基であるグルタミン酸残基が多く露出し
ており、チャネル３から取り込まれたＦｅ2+イオンはfe
rroxidase centerで酸化され、さらに内部の保持部４へ
と導かれる。そして、静電相互作用により鉄イオンは濃
縮されて、フェリハイドライト（５Ｆｅ2Ｏ3・９Ｈ
2Ｏ）結晶の核形成が起こる。
ネル３の内表面と同じく，ｐＨ７−８でマイナス電荷を
持つアミノ酸残基であるグルタミン酸残基が多く露出し
ており、チャネル３から取り込まれたＦｅ2+イオンはfe
rroxidase centerで酸化され、さらに内部の保持部４へ
と導かれる。そして、静電相互作用により鉄イオンは濃
縮されて、フェリハイドライト（５Ｆｅ2Ｏ3・９Ｈ
2Ｏ）結晶の核形成が起こる。
【００１１】その後、順次取り込まれる鉄イオンがこの
結晶の核に付着して酸化鉄からなる核が成長し、直径６
ｎｍの核１が保持部４内に形成される。以上が、鉄イオ
ンの取り込みと酸化鉄からなる核形成の概略である。
結晶の核に付着して酸化鉄からなる核が成長し、直径６
ｎｍの核１が保持部４内に形成される。以上が、鉄イオ
ンの取り込みと酸化鉄からなる核形成の概略である。
【００１２】次に、アポフェリチンへ鉄を導入するため
の操作を以下で説明する。
の操作を以下で説明する。
【００１３】まず、ＨＥＰＥＳ緩衝液、アポフェリチン
溶液、硫酸アンモニウム鉄（Ｆｅ（ＮＨ4）2（Ｓ
Ｏ4）2）溶液の順に各溶液を混合してフェリチン溶液を
作製する。このフェリチン溶液中では、それぞれの最終
濃度が、ＨＥＰＥＳ緩衝液は１００ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ
７．０）に、アポフェリチンは０．５ｍｇ／ｍＬに、硫
酸アンモニウム鉄は５ｍｍｏｌ／Ｌになっている。尚、
フェリチンを調製するための操作は、すべて室温にて行
ない、攪拌はスターラーにて行なう。
溶液、硫酸アンモニウム鉄（Ｆｅ（ＮＨ4）2（Ｓ
Ｏ4）2）溶液の順に各溶液を混合してフェリチン溶液を
作製する。このフェリチン溶液中では、それぞれの最終
濃度が、ＨＥＰＥＳ緩衝液は１００ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ
７．０）に、アポフェリチンは０．５ｍｇ／ｍＬに、硫
酸アンモニウム鉄は５ｍｍｏｌ／Ｌになっている。尚、
フェリチンを調製するための操作は、すべて室温にて行
ない、攪拌はスターラーにて行なう。
【００１４】次に、鉄イオンのアポフェリチン内部への
取り込み反応及び取り込まれた鉄の酸化反応を完了させ
るため、フェリチン溶液をそのまま一晩放置する。この
操作により、アポフェリチンの保持部に均一な大きさの
酸化鉄が導入され、フェリチン（アポフェリチンと微粒
子の複合体）が生成される。
取り込み反応及び取り込まれた鉄の酸化反応を完了させ
るため、フェリチン溶液をそのまま一晩放置する。この
操作により、アポフェリチンの保持部に均一な大きさの
酸化鉄が導入され、フェリチン（アポフェリチンと微粒
子の複合体）が生成される。
【００１５】次に、フェリチン溶液を容器に入れ、遠心
分離機を用いて毎分３，０００回転、１５−３０分の条
件で遠心分離し、沈殿を除去する。続いて、沈殿を除去
した後の上澄み液をさらに毎分１０，０００回転、３０
分の条件で遠心分離し、フェリチンが凝集した不要な集
合体を沈殿させてから除去する。このとき、上澄み液中
には、フェリチンが分散された状態で存在している。
分離機を用いて毎分３，０００回転、１５−３０分の条
件で遠心分離し、沈殿を除去する。続いて、沈殿を除去
した後の上澄み液をさらに毎分１０，０００回転、３０
分の条件で遠心分離し、フェリチンが凝集した不要な集
合体を沈殿させてから除去する。このとき、上澄み液中
には、フェリチンが分散された状態で存在している。
【００１６】次に、この上澄み液の溶媒をｐＨ７．０、
１００ｍｍｏｌ／ＬのＨＥＰＥＳ緩衝液から１５０ｍｍ
ｏｌ／ＬのＮａＣｌ溶液へと透析により置換して、新た
なフェリチン溶液を作製する。ここでのｐＨ調整は特に
行わなくてよい。
１００ｍｍｏｌ／ＬのＨＥＰＥＳ緩衝液から１５０ｍｍ
ｏｌ／ＬのＮａＣｌ溶液へと透析により置換して、新た
なフェリチン溶液を作製する。ここでのｐＨ調整は特に
行わなくてよい。
【００１７】続いて、このフェリチン溶液を１−１０ｍ
ｇ／ｍＬの任意の濃度に濃縮した後、この溶液に最終濃
度が１０ｍｍｏｌ／ＬとなるようにＣｄＳＯ4 を加え、
フェリチンを凝集させる。
ｇ／ｍＬの任意の濃度に濃縮した後、この溶液に最終濃
度が１０ｍｍｏｌ／ＬとなるようにＣｄＳＯ4 を加え、
フェリチンを凝集させる。
【００１８】次に、フェリチン溶液を毎分３，０００回
転、２０分の条件で遠心分離し、溶液中のフェリチン凝
集体を沈殿させる。その後、溶液の緩衝成分を１５０ｍ
ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌが入ったｐＨ８．０、１０−５０
ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ緩衝液へと透析により置換す
る。
転、２０分の条件で遠心分離し、溶液中のフェリチン凝
集体を沈殿させる。その後、溶液の緩衝成分を１５０ｍ
ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌが入ったｐＨ８．０、１０−５０
ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ緩衝液へと透析により置換す
る。
【００１９】次に、フェリチン溶液を濃縮後、ゲルろ過
カラムによりフェリチン溶液をろ過することにより、フ
ェリチン粒子の凝集体が除かれ、酸化鉄を内包した単体
のフェリチンが得られる。
カラムによりフェリチン溶液をろ過することにより、フ
ェリチン粒子の凝集体が除かれ、酸化鉄を内包した単体
のフェリチンが得られる。
【００２０】尚、ここまで鉄イオンのフェリチンへの取
り込みメカニズム及び酸化鉄を内包したフェリチンの調
製法について述べたが、これまでに導入が報告されてい
る他の金属イオンは、いずれもプラスイオンであること
から、これらの金属イオンのアポフェリチンへの取り込
みは、鉄イオンとほぼ同じメカニズムで進むと考えられ
る。よって、他の金属イオンも、基本的に鉄イオンと同
様の操作によりアポフェリチン内に導入される。
り込みメカニズム及び酸化鉄を内包したフェリチンの調
製法について述べたが、これまでに導入が報告されてい
る他の金属イオンは、いずれもプラスイオンであること
から、これらの金属イオンのアポフェリチンへの取り込
みは、鉄イオンとほぼ同じメカニズムで進むと考えられ
る。よって、他の金属イオンも、基本的に鉄イオンと同
様の操作によりアポフェリチン内に導入される。
【００２１】ところで、アポフェリチンは、それが由来
する生物種によって保持可能な粒子のサイズが若干異な
る。また、アポフェリチンと類似の構造を有し、内部に
無機物微粒子を保持可能な球殻状タンパク質も存在す
る。この中にはリステリア菌由来のリステリアフェリチ
ンやＤｐｓタンパクなどがある。また、球状でなくて
も、ＣＣＭＶなどのウイルスの外殻タンパク質等、フェ
リチンと同様に内部に無機物粒子を保持可能なタンパク
質もある。
する生物種によって保持可能な粒子のサイズが若干異な
る。また、アポフェリチンと類似の構造を有し、内部に
無機物微粒子を保持可能な球殻状タンパク質も存在す
る。この中にはリステリア菌由来のリステリアフェリチ
ンやＤｐｓタンパクなどがある。また、球状でなくて
も、ＣＣＭＶなどのウイルスの外殻タンパク質等、フェ
リチンと同様に内部に無機物粒子を保持可能なタンパク
質もある。
【００２２】本明細書中では、このような球殻状タンパ
ク質やウイルスの外殻タンパク質など、内部に無機物微
粒子を保持可能なタンパク質を総称して「かご状タンパ
ク質」と称することとする。
ク質やウイルスの外殻タンパク質など、内部に無機物微
粒子を保持可能なタンパク質を総称して「かご状タンパ
ク質」と称することとする。
【００２３】これらのかご状タンパク質にも、鉄を含む
無機物粒子を保持させることが可能である。
無機物粒子を保持させることが可能である。
【００２４】
【発明が解決しようとする課題】しかるに、上述の方法
により鉄等の金属イオンを保持したフェリチンを作製す
ることができるが、アポフェリチン及びフェリチンのチ
ャネル３の内表面は全体としてマイナスに帯電している
ので、同じマイナスの電荷を持つイオンをアポフェリチ
ン内に取り込ませることは困難であった。
により鉄等の金属イオンを保持したフェリチンを作製す
ることができるが、アポフェリチン及びフェリチンのチ
ャネル３の内表面は全体としてマイナスに帯電している
ので、同じマイナスの電荷を持つイオンをアポフェリチ
ン内に取り込ませることは困難であった。
【００２５】一方、金や白金等は水溶液中では単独でイ
オン化させることができず、水溶液中では錯体イオンと
してしか存在できないため、通常はクロロ金酸イオン
（ＡｕＣｌ4）-や（ＰｔＣｌ4 ）2-のマイナスイオンで
利用されることが多い。そのため、従来の技術では、ア
ポフェリチン内に金や白金等の貴金属原子を取り込ませ
ることが困難であった。
オン化させることができず、水溶液中では錯体イオンと
してしか存在できないため、通常はクロロ金酸イオン
（ＡｕＣｌ4）-や（ＰｔＣｌ4 ）2-のマイナスイオンで
利用されることが多い。そのため、従来の技術では、ア
ポフェリチン内に金や白金等の貴金属原子を取り込ませ
ることが困難であった。
【００２６】本発明の目的は、アポフェリチンなどのか
ご状タンパク質の内部構造を改質することにより金等の
貴金属原子をアポフェリチンなどのかご状タンパク質内
に導入し、ひいては、各種の微細構造に適用可能な貴金
属粒子を形成することにある。
ご状タンパク質の内部構造を改質することにより金等の
貴金属原子をアポフェリチンなどのかご状タンパク質内
に導入し、ひいては、各種の微細構造に適用可能な貴金
属粒子を形成することにある。
【００２７】
【課題を解決するための手段】本発明の組み換えかご状
タンパク質は、遺伝子組み換え技術により作製された組
み換えかご状タンパク質であって、上記組み換えかご状
タンパク質の内部にあり貴金属粒子を保持可能な保持部
と、上記保持部と上記組み換えかご状タンパク質の外部
とを結ぶトンネル状のチャネルとを備えている。
タンパク質は、遺伝子組み換え技術により作製された組
み換えかご状タンパク質であって、上記組み換えかご状
タンパク質の内部にあり貴金属粒子を保持可能な保持部
と、上記保持部と上記組み換えかご状タンパク質の外部
とを結ぶトンネル状のチャネルとを備えている。
【００２８】これにより、サイズが均一で、且つナノメ
ーターオーダーの貴金属粒子を組み換えかご状タンパク
質の保持部に形成することができるので、例えば貴金属
−組み換えかご状タンパク質複合体を基板上に配置し、
タンパク質部分を除去する等の操作を行なうことによ
り、基板上に化学的安定性に優れた貴金属からなる微細
なドット体を形成することができる。このドット体は例
えば、半導体の製造工程等に利用することができる。
ーターオーダーの貴金属粒子を組み換えかご状タンパク
質の保持部に形成することができるので、例えば貴金属
−組み換えかご状タンパク質複合体を基板上に配置し、
タンパク質部分を除去する等の操作を行なうことによ
り、基板上に化学的安定性に優れた貴金属からなる微細
なドット体を形成することができる。このドット体は例
えば、半導体の製造工程等に利用することができる。
【００２９】上記組み換えかご状タンパク質は、アポフ
ェリチンであることにより、ナノメータオーダーの大き
さの貴金属粒子を効率的に作製することができる。
ェリチンであることにより、ナノメータオーダーの大き
さの貴金属粒子を効率的に作製することができる。
【００３０】上記貴金属粒子は金または白金であること
により、ドット体の形成が容易になる。作製した微粒子
を単電子トランジスタなどに応用することが可能にな
る。
により、ドット体の形成が容易になる。作製した微粒子
を単電子トランジスタなどに応用することが可能にな
る。
【００３１】上記チャネルの内表面における、第１のグ
ルタミン酸（Ｇｌｕ）及び第１のアスパラギン酸の存在
すべき位置に、分子サイズがグルタミン酸及びアスパラ
ギン酸よりも小さい第１の中性アミノ酸を備えているこ
とにより、負電荷を持つ貴金属の錯体イオンとチャネル
との間に静電相互作用による斥力が生じることを防ぐこ
とができる。この結果、貴金属の錯体イオンをチャネル
に取り込ませることが可能になる。
ルタミン酸（Ｇｌｕ）及び第１のアスパラギン酸の存在
すべき位置に、分子サイズがグルタミン酸及びアスパラ
ギン酸よりも小さい第１の中性アミノ酸を備えているこ
とにより、負電荷を持つ貴金属の錯体イオンとチャネル
との間に静電相互作用による斥力が生じることを防ぐこ
とができる。この結果、貴金属の錯体イオンをチャネル
に取り込ませることが可能になる。
【００３２】上記第１の中性アミノ酸がセリン，アラニ
ン，グリシンのうちから選ばれることにより、組み換え
かご状タンパク質の立体構造を崩すことなく、貴金属の
錯体イオンをチャネルに取り込ませることが可能にな
る。
ン，グリシンのうちから選ばれることにより、組み換え
かご状タンパク質の立体構造を崩すことなく、貴金属の
錯体イオンをチャネルに取り込ませることが可能にな
る。
【００３３】上記保持部の内表面における、第２のグル
タミン酸の存在すべき位置に、塩基性アミノ酸または第
２の中性アミノ酸をさらに備えていることにより、負電
荷を持つ貴金属の錯体イオンと保持部との間に静電相互
作用による斥力が生じることを防ぐことができる。特に
第２のグルタミン酸の存在すべき位置に塩基性アミノ酸
を備えた場合は、この塩基性アミノ酸が持つ正電荷によ
り負電荷を持つ貴金属の錯体イオンが取り込まれ、この
結果、貴金属の錯体イオンを保持部に高濃度に取り込ま
せることが可能になる。
タミン酸の存在すべき位置に、塩基性アミノ酸または第
２の中性アミノ酸をさらに備えていることにより、負電
荷を持つ貴金属の錯体イオンと保持部との間に静電相互
作用による斥力が生じることを防ぐことができる。特に
第２のグルタミン酸の存在すべき位置に塩基性アミノ酸
を備えた場合は、この塩基性アミノ酸が持つ正電荷によ
り負電荷を持つ貴金属の錯体イオンが取り込まれ、この
結果、貴金属の錯体イオンを保持部に高濃度に取り込ま
せることが可能になる。
【００３４】上記塩基性アミノ酸または上記第２の中性
アミノ酸が、アルギニン，リジン，アラニンのうちから
選ばれることにより、組み換えかご状タンパク質の立体
構造を崩すことなく貴金属の錯体イオンを保持部に取り
込ませることが可能になる。
アミノ酸が、アルギニン，リジン，アラニンのうちから
選ばれることにより、組み換えかご状タンパク質の立体
構造を崩すことなく貴金属の錯体イオンを保持部に取り
込ませることが可能になる。
【００３５】上記保持部の内表面には、アミノ酸と置換
された１つ以上のシステインが存在することにより、保
持部に取り込まれた貴金属の錯体イオンを効果的に還元
して貴金属粒子を析出させることができる。
された１つ以上のシステインが存在することにより、保
持部に取り込まれた貴金属の錯体イオンを効果的に還元
して貴金属粒子を析出させることができる。
【００３６】上記組み換えかご状タンパク質の外表面に
は、システインの存在すべき位置に、当該システインよ
りも還元機能が小さい物質を備えていることにより、組
み換えかご状タンパク質の外表面上で貴金属の錯体イオ
ンが還元されるのを防ぐことができる。その結果、組み
換えかご状タンパク質の外表面上での貴金属粒子の析出
が抑制され、貴金属−組み換えかご状タンパク質複合体
のうち、保持部に貴金属粒子を保持するものの収率を上
げることができる。
は、システインの存在すべき位置に、当該システインよ
りも還元機能が小さい物質を備えていることにより、組
み換えかご状タンパク質の外表面上で貴金属の錯体イオ
ンが還元されるのを防ぐことができる。その結果、組み
換えかご状タンパク質の外表面上での貴金属粒子の析出
が抑制され、貴金属−組み換えかご状タンパク質複合体
のうち、保持部に貴金属粒子を保持するものの収率を上
げることができる。
【００３７】本発明の貴金属−組み換えかご状タンパク
質複合体は、貴金属粒子を保持可能な保持部と、上記保
持部と上記組み換えかご状タンパク質の外部とを結ぶト
ンネル状のチャネルとを備えている。
質複合体は、貴金属粒子を保持可能な保持部と、上記保
持部と上記組み換えかご状タンパク質の外部とを結ぶト
ンネル状のチャネルとを備えている。
【００３８】これにより、例えば貴金属−組み換えかご
状タンパク質複合体を基板上に配置し、タンパク質部分
を除去する等の操作を行なうことにより、基板上に貴金
属からなる微細なドット体を形成することができる。こ
のドット体は、例えば半導体の製造工程等に利用するこ
とができる。
状タンパク質複合体を基板上に配置し、タンパク質部分
を除去する等の操作を行なうことにより、基板上に貴金
属からなる微細なドット体を形成することができる。こ
のドット体は、例えば半導体の製造工程等に利用するこ
とができる。
【００３９】上記組み換えかご状タンパク質は、アポフ
ェリチンであってもよい。
ェリチンであってもよい。
【００４０】外表面上に金または白金粒子を保持してい
てもよい。
てもよい。
【００４１】上記チャネルの内表面における、第１のグ
ルタミン酸及び第１のアスパラギン酸の存在すべき位置
に、分子サイズがグルタミン酸及びアスパラギン酸より
も小さい第１の中性アミノ酸を備えていることにより、
負電荷を持つ貴金属の錯体イオンとチャネルとの間に静
電相互作用による斥力が生じることを防ぐことができる
ので、貴金属−組み換えかご状タンパク質複合体が、効
率よく作製される。
ルタミン酸及び第１のアスパラギン酸の存在すべき位置
に、分子サイズがグルタミン酸及びアスパラギン酸より
も小さい第１の中性アミノ酸を備えていることにより、
負電荷を持つ貴金属の錯体イオンとチャネルとの間に静
電相互作用による斥力が生じることを防ぐことができる
ので、貴金属−組み換えかご状タンパク質複合体が、効
率よく作製される。
【００４２】上記第１の中性アミノ酸がセリン，アラニ
ン，グリシンのうちから選ばれることにより、立体構造
を崩すことなく貴金属−組み換えかご状タンパク質複合
体を形成することができる。
ン，グリシンのうちから選ばれることにより、立体構造
を崩すことなく貴金属−組み換えかご状タンパク質複合
体を形成することができる。
【００４３】上記保持部の内表面における、第２のグル
タミン酸の存在すべき位置に、塩基性アミノ酸または第
２の中性アミノ酸をさらに備えていることにより、負電
荷を持つ貴金属の錯体イオンと保持部との間に静電相互
作用による斥力が生じることを防ぐことができるので、
本発明の貴金属−組み換えかご状タンパク質複合体は、
効率よく作製される。
タミン酸の存在すべき位置に、塩基性アミノ酸または第
２の中性アミノ酸をさらに備えていることにより、負電
荷を持つ貴金属の錯体イオンと保持部との間に静電相互
作用による斥力が生じることを防ぐことができるので、
本発明の貴金属−組み換えかご状タンパク質複合体は、
効率よく作製される。
【００４４】上記塩基性アミノ酸または上記第２の中性
アミノ酸が、アルギニン，リジン，アラニンのうちから
選ばれることにより、立体構造を崩すことなく貴金属粒
子を保持することが可能になる。
アミノ酸が、アルギニン，リジン，アラニンのうちから
選ばれることにより、立体構造を崩すことなく貴金属粒
子を保持することが可能になる。
【００４５】上記保持部の内表面には、アミノ酸と置換
された１つ以上のシステインが存在することにより、貴
金属イオンを含む溶液中で、本発明の貴金属−組み換え
かご状タンパク質複合体を容易に形成することができる
ようになる。
された１つ以上のシステインが存在することにより、貴
金属イオンを含む溶液中で、本発明の貴金属−組み換え
かご状タンパク質複合体を容易に形成することができる
ようになる。
【００４６】本発明の組み換えＤＮＡは、貴金属粒子を
保持可能な保持部と、上記保持部と上記組み換えかご状
タンパク質の外部とを結ぶトンネル状のチャネルとを有
する組み換えかご状タンパク質のアミノ酸配列をコード
している。
保持可能な保持部と、上記保持部と上記組み換えかご状
タンパク質の外部とを結ぶトンネル状のチャネルとを有
する組み換えかご状タンパク質のアミノ酸配列をコード
している。
【００４７】この組み換えＤＮＡにより、タンパク工学
の手法を用いて組み換えかご状タンパク質の大量生産が
可能となる。
の手法を用いて組み換えかご状タンパク質の大量生産が
可能となる。
【００４８】上記組み換えかご状タンパク質は、アポフ
ェリチンであってもよい。
ェリチンであってもよい。
【００４９】上記貴金属粒子は金または白金であっても
よい。
よい。
【００５０】上記チャネルの内表面における、第１のグ
ルタミン酸及び第１のアスパラギン酸の存在すべき位置
に、分子サイズがグルタミン酸及びアスパラギン酸より
も小さい第１の中性アミノ酸を備えていることにより、
該組み換えタンパク質を容易に得ることができるように
なる。
ルタミン酸及び第１のアスパラギン酸の存在すべき位置
に、分子サイズがグルタミン酸及びアスパラギン酸より
も小さい第１の中性アミノ酸を備えていることにより、
該組み換えタンパク質を容易に得ることができるように
なる。
【００５１】上記第１の中性アミノ酸がセリン，アラニ
ン，グリシンのうちから選ばれることにより、保持部に
貴金属粒子を効率良く形成するための組み換えかご状タ
ンパク質を大量に得ることが可能になる。
ン，グリシンのうちから選ばれることにより、保持部に
貴金属粒子を効率良く形成するための組み換えかご状タ
ンパク質を大量に得ることが可能になる。
【００５２】上記保持部の内表面における、第２のグル
タミン酸の存在すべき位置に、塩基性アミノ酸または第
２の中性アミノ酸をさらに備えていることにより、保持
部に貴金属粒子を効率良く形成するための均質な組み換
えかご状タンパク質を大量に得ることが可能になる。
タミン酸の存在すべき位置に、塩基性アミノ酸または第
２の中性アミノ酸をさらに備えていることにより、保持
部に貴金属粒子を効率良く形成するための均質な組み換
えかご状タンパク質を大量に得ることが可能になる。
【００５３】上記塩基性アミノ酸または上記第２の中性
アミノ酸が、アルギニン，リジン，アラニンのうちから
選ばれることにより、貴金属粒子を効率よく保持可能な
組み換えかご状タンパク質を容易に作製することができ
る。
アミノ酸が、アルギニン，リジン，アラニンのうちから
選ばれることにより、貴金属粒子を効率よく保持可能な
組み換えかご状タンパク質を容易に作製することができ
る。
【００５４】上記保持部の内表面には、アミノ酸と置換
された１つ以上のシステインが存在することにより、貴
金属粒子をさらに効率よく保持可能な組み換えかご状タ
ンパク質を容易に作製することができる。
された１つ以上のシステインが存在することにより、貴
金属粒子をさらに効率よく保持可能な組み換えかご状タ
ンパク質を容易に作製することができる。
【００５５】本発明の組み換えかご状タンパク質の作製
方法は、チャネルの内表面に位置する第１のグルタミン
酸及び第１のアスパラギン酸を、分子サイズがグルタミ
ン酸及びアスパラギン酸よりも小さい第１の中性アミノ
酸に置換する工程（ａ）を含んでいる。
方法は、チャネルの内表面に位置する第１のグルタミン
酸及び第１のアスパラギン酸を、分子サイズがグルタミ
ン酸及びアスパラギン酸よりも小さい第１の中性アミノ
酸に置換する工程（ａ）を含んでいる。
【００５６】この方法により、チャネルに貴金属粒子を
効率的に取り込みうる組み換えかご状タンパク質を容易
に作製することができる。
効率的に取り込みうる組み換えかご状タンパク質を容易
に作製することができる。
【００５７】上記組み換えかご状タンパク質はアポフェ
リチンであってもよい。
リチンであってもよい。
【００５８】上記工程（ａ）では、上記第１の中性アミ
ノ酸が、セリン，アラニン，グリシンのうちから選ばれ
ることにより、組み換えかご状タンパク質の立体構造が
崩れず、且つ、貴金属の錯体イオンをチャネルに取り込
ませることが可能な組み換えかご状タンパク質を作製す
ることができる。
ノ酸が、セリン，アラニン，グリシンのうちから選ばれ
ることにより、組み換えかご状タンパク質の立体構造が
崩れず、且つ、貴金属の錯体イオンをチャネルに取り込
ませることが可能な組み換えかご状タンパク質を作製す
ることができる。
【００５９】上記組み換えかご状タンパク質内部にある
保持部の内表面に存在する第２のグルタミン酸を、塩基
性アミノ酸または第２の中性アミノ酸に置換する工程
（ｂ）をさらに含むことにより、保持部に貴金属粒子を
効率的に取り込みうる組み換えかご状タンパク質を容易
に作製することができる。
保持部の内表面に存在する第２のグルタミン酸を、塩基
性アミノ酸または第２の中性アミノ酸に置換する工程
（ｂ）をさらに含むことにより、保持部に貴金属粒子を
効率的に取り込みうる組み換えかご状タンパク質を容易
に作製することができる。
【００６０】上記工程（ｂ）では、上記塩基性アミノ酸
または上記第２の中性アミノ酸が、アルギニン，リジ
ン，アラニンのうちから選ばれることにより、組み換え
かご状タンパク質の立体構造が崩れず、且つ、貴金属の
錯体イオンを保持部に取り込ませることが可能な組み換
えかご状タンパク質を作製することができる。
または上記第２の中性アミノ酸が、アルギニン，リジ
ン，アラニンのうちから選ばれることにより、組み換え
かご状タンパク質の立体構造が崩れず、且つ、貴金属の
錯体イオンを保持部に取り込ませることが可能な組み換
えかご状タンパク質を作製することができる。
【００６１】上記保持部の内表面に位置する１つ以上の
アミノ酸をシステインに置換する工程（ｃ）をさらに含
むことにより、保持部に取り込まれた貴金属の錯体イオ
ンを効果的に還元して貴金属粒子を析出させることがで
きる組み換えかご状タンパク質を作製することができ
る。貴金属の錯体イオンが還元されると分子サイズが減
少するので、保持部への貴金属の錯体イオンの取り込み
が促進される。
アミノ酸をシステインに置換する工程（ｃ）をさらに含
むことにより、保持部に取り込まれた貴金属の錯体イオ
ンを効果的に還元して貴金属粒子を析出させることがで
きる組み換えかご状タンパク質を作製することができ
る。貴金属の錯体イオンが還元されると分子サイズが減
少するので、保持部への貴金属の錯体イオンの取り込み
が促進される。
【００６２】上記組み換えかご状タンパク質の外表面に
位置する１つ以上のシステインを当該システインよりも
還元機能が小さい物質に代える工程（ｄ）をさらに含む
ことにより、外表面上での貴金属の錯体イオンの還元が
抑制される組み換えかご状タンパク質を作製することが
できる。
位置する１つ以上のシステインを当該システインよりも
還元機能が小さい物質に代える工程（ｄ）をさらに含む
ことにより、外表面上での貴金属の錯体イオンの還元が
抑制される組み換えかご状タンパク質を作製することが
できる。
【００６３】本発明の貴金属−組み換えかご状タンパク
質複合体の作製方法は、貴金属の錯体イオン溶液と、組
み換えかご状タンパク質溶液とを混合することにより、
貴金属−組み換えかご状タンパク質複合体を形成する工
程（ａ）と、上記工程（ａ）において調製された貴金属
−組み換えかご状タンパク質複合体を含む溶液をゲルろ
過カラムに通すことにより、貴金属−組み換えかご状タ
ンパク質複合体を精製する工程（ｂ）とを含んでいる。
質複合体の作製方法は、貴金属の錯体イオン溶液と、組
み換えかご状タンパク質溶液とを混合することにより、
貴金属−組み換えかご状タンパク質複合体を形成する工
程（ａ）と、上記工程（ａ）において調製された貴金属
−組み換えかご状タンパク質複合体を含む溶液をゲルろ
過カラムに通すことにより、貴金属−組み換えかご状タ
ンパク質複合体を精製する工程（ｂ）とを含んでいる。
【００６４】この方法により、外表面上に貴金属を保持
する組み換えかご状タンパク質と貴金属を内包する組み
換えかご状タンパク質と副反応物等とがサイズによって
互いに分画されるので、精製された所望の貴金属−組み
換えかご状タンパク質複合体を選び取ることができる。
する組み換えかご状タンパク質と貴金属を内包する組み
換えかご状タンパク質と副反応物等とがサイズによって
互いに分画されるので、精製された所望の貴金属−組み
換えかご状タンパク質複合体を選び取ることができる。
【００６５】上記工程（ａ）における上記貴金属は、金
または白金であることにより、上述のように、例えば半
導体装置の製造工程等に利用される金または白金からな
るドット体を形成することができ、この際に、従来必要
であったドット体の還元工程が不要となる。
または白金であることにより、上述のように、例えば半
導体装置の製造工程等に利用される金または白金からな
るドット体を形成することができ、この際に、従来必要
であったドット体の還元工程が不要となる。
【００６６】
【発明の実施の形態】（第１の実施形態）本発明の第１
の実施形態について、以下に説明する。
の実施形態について、以下に説明する。
【００６７】−リコンビナント（組み換え）アポフェリ
チンの作製−発明者らは、アポフェリチン内に金（Ａ
ｕ）原子を導入する上で、主に次のような２つのことが
障害となっていると考えた。
チンの作製−発明者らは、アポフェリチン内に金（Ａ
ｕ）原子を導入する上で、主に次のような２つのことが
障害となっていると考えた。
【００６８】１つは、クロロ金酸イオン（ＡｕＣｌ4）-
とアポフェリチンとの間の静電相互作用である。図１に
示すフェリチン（アポフェリチン−鉄複合体）のチャネ
ル３の内表面及び保持部４の内表面には、各々グルタミ
ン酸やアスパラギン酸といったマイナスの電荷を持つア
ミノ酸が露出している。マイナスイオンである（ＡｕＣ
ｌ4）-のアポフェリチン内への取り込みは、これらのマ
イナス電荷を持つアミノ酸との間の静電相互作用により
阻害されている。
とアポフェリチンとの間の静電相互作用である。図１に
示すフェリチン（アポフェリチン−鉄複合体）のチャネ
ル３の内表面及び保持部４の内表面には、各々グルタミ
ン酸やアスパラギン酸といったマイナスの電荷を持つア
ミノ酸が露出している。マイナスイオンである（ＡｕＣ
ｌ4）-のアポフェリチン内への取り込みは、これらのマ
イナス電荷を持つアミノ酸との間の静電相互作用により
阻害されている。
【００６９】もう１つは、（ＡｕＣｌ4）-のサイズが鉄
イオンよりも大きいことである。そのため、アポフェリ
チンのチャネル３のサイズを広げなければ、（ＡｕＣｌ
4）-をチャネル３に取り込むことが物理的に難しい。
イオンよりも大きいことである。そのため、アポフェリ
チンのチャネル３のサイズを広げなければ、（ＡｕＣｌ
4）-をチャネル３に取り込むことが物理的に難しい。
【００７０】これらの問題を解決するため、発明者ら
は、遺伝子組み換えの手法を用いて以下のようにアポフ
ェリチンの改質を行なった。以下、本明細書中で、「組
み換えアポフェリチン」と表記するときは、遺伝子組み
換え技術によって変異を導入したアポフェリチンのこと
を指す。また、本明細書中アミノ酸残基の部位を示すと
きは、特に指定のない限り、変異の入っていないウマ肝
臓由来のアポフェリチンにおける部位を意味する。ま
た、アポフェリチンは２４個のモノマーサブユニットか
ら構成されているため、本明細書中で「アポフェリチン
のアミノ酸配列」と書くときは、モノマーサブユニット
のアミノ酸配列を意味する。
は、遺伝子組み換えの手法を用いて以下のようにアポフ
ェリチンの改質を行なった。以下、本明細書中で、「組
み換えアポフェリチン」と表記するときは、遺伝子組み
換え技術によって変異を導入したアポフェリチンのこと
を指す。また、本明細書中アミノ酸残基の部位を示すと
きは、特に指定のない限り、変異の入っていないウマ肝
臓由来のアポフェリチンにおける部位を意味する。ま
た、アポフェリチンは２４個のモノマーサブユニットか
ら構成されているため、本明細書中で「アポフェリチン
のアミノ酸配列」と書くときは、モノマーサブユニット
のアミノ酸配列を意味する。
【００７１】ウマ肝臓由来のアポフェリチンをコードす
る遺伝子配列及びアポフェリチンのアミノ酸配列は既知
であり、立体構造についても解明されている。アポフェ
リチンのモノマーは、１７５残基のアミノ酸残基から構
成され、そのうち、１２８番目のアスパラギン酸（Ａｓ
ｐ）と、１３１番目のグルタミン酸（Ｇｌｕ）とは共に
チャネル３の内表面に位置し、５８番目，６１番目及び
６４番目の各グルタミン酸は、共に保持部４の内表面に
位置している。また、アポフェリチンの１〜８番目のア
ミノ酸残基は、生体内においてプロセシングを受けて欠
失している。
る遺伝子配列及びアポフェリチンのアミノ酸配列は既知
であり、立体構造についても解明されている。アポフェ
リチンのモノマーは、１７５残基のアミノ酸残基から構
成され、そのうち、１２８番目のアスパラギン酸（Ａｓ
ｐ）と、１３１番目のグルタミン酸（Ｇｌｕ）とは共に
チャネル３の内表面に位置し、５８番目，６１番目及び
６４番目の各グルタミン酸は、共に保持部４の内表面に
位置している。また、アポフェリチンの１〜８番目のア
ミノ酸残基は、生体内においてプロセシングを受けて欠
失している。
【００７２】次に、アポフェリチンにおける静電相互作
用について説明する。
用について説明する。
【００７３】上述のように、中性の溶液中では、アポフ
ェリチンの保持部４及びチャネル３の内表面には、負電
荷を有するアスパラギン酸やグルタミン酸が配置されて
いるため、アポフェリチンの内表面全体の電位Ｖｉｎ
は、アポフェリチンの外部の電位Ｖｏｕｔに比べて低く
なっている。すなわち、ΔＶ＝Ｖｉｎ−Ｖｏｕｔで定義
されるアポフェリチンの内外電位差ΔＶは、ΔＶ＜０
（ｍＶ）となっている。
ェリチンの保持部４及びチャネル３の内表面には、負電
荷を有するアスパラギン酸やグルタミン酸が配置されて
いるため、アポフェリチンの内表面全体の電位Ｖｉｎ
は、アポフェリチンの外部の電位Ｖｏｕｔに比べて低く
なっている。すなわち、ΔＶ＝Ｖｉｎ−Ｖｏｕｔで定義
されるアポフェリチンの内外電位差ΔＶは、ΔＶ＜０
（ｍＶ）となっている。
【００７４】ここで、（ＡｕＣｌ4）-は、負電荷を有し
ているため、アポフェリチン内部の（ＡｕＣｌ4）-濃度
をＣｉｎ、溶液中の（ＡｕＣｌ4）-濃度をＣｏｕｔとす
ると、Ｃｉｎ、Ｃｏｕｔ及びΔＶの関係は次式（１）で
表されることが知られている。
ているため、アポフェリチン内部の（ＡｕＣｌ4）-濃度
をＣｉｎ、溶液中の（ＡｕＣｌ4）-濃度をＣｏｕｔとす
ると、Ｃｉｎ、Ｃｏｕｔ及びΔＶの関係は次式（１）で
表されることが知られている。
【００７５】
Ｃｏｕｔ／Ｃｉｎ＝ｅ-ΔV/kT （１）
式（１）において、ｅは自然対数、ｋはボルツマン定
数、Ｔは絶対温度である。この式から、ΔＶを大きくす
ることで、温度が一定の場合、アポフェリチン内部にお
ける（ＡｕＣｌ4）-濃度を指数関数的に増加させられる
ことが分かる。例えば、ΔＶが正の値であるとき、ΔＶ
が４倍になれば、Ｃｏｕｔ／Ｃｉｎは約８０となる。
数、Ｔは絶対温度である。この式から、ΔＶを大きくす
ることで、温度が一定の場合、アポフェリチン内部にお
ける（ＡｕＣｌ4）-濃度を指数関数的に増加させられる
ことが分かる。例えば、ΔＶが正の値であるとき、ΔＶ
が４倍になれば、Ｃｏｕｔ／Ｃｉｎは約８０となる。
【００７６】一方、アポフェリチンの内表面での（Ａｕ
Ｃｌ4）-→Ａｕの還元反応は、アポフェリチン内部の濃
度が増加すれば加速される。
Ｃｌ4）-→Ａｕの還元反応は、アポフェリチン内部の濃
度が増加すれば加速される。
【００７７】本願発明者らは以上の条件を考慮し、溶液
中でアポフェリチンの保持部４に金粒子を効率良く生じ
させるためには、少なくともＣｉｎが、Ｃｏｕｔの３倍
以上であることが必要である、との結論に達した。室温
において、この条件を満たすΔＶは約２５（ｍＶ）以上
である。特に、十分な速度で保持部４に金粒子を生じさ
せるためには、ΔＶが約１００（ｍＶ）以上であること
が好ましいと考えられた。
中でアポフェリチンの保持部４に金粒子を効率良く生じ
させるためには、少なくともＣｉｎが、Ｃｏｕｔの３倍
以上であることが必要である、との結論に達した。室温
において、この条件を満たすΔＶは約２５（ｍＶ）以上
である。特に、十分な速度で保持部４に金粒子を生じさ
せるためには、ΔＶが約１００（ｍＶ）以上であること
が好ましいと考えられた。
【００７８】ここで、ΔＶは、アポフェリチンの内表面
に存在する塩基の電荷を、その位置を考慮して総和する
ことで求められる。例えば、アポフェリチンモノマーに
おいて、保持部４に位置するグルタミン酸の３つをリジ
ン（Ｌｙｓ）に置き換えることで、アポフェリチンにお
けるΔＶは約２００（ｍＶ）になると試算される。これ
は、アポフェリチンの保持部４に金粒子を生じさせるの
に十分な電位差であると考えられる。
に存在する塩基の電荷を、その位置を考慮して総和する
ことで求められる。例えば、アポフェリチンモノマーに
おいて、保持部４に位置するグルタミン酸の３つをリジ
ン（Ｌｙｓ）に置き換えることで、アポフェリチンにお
けるΔＶは約２００（ｍＶ）になると試算される。これ
は、アポフェリチンの保持部４に金粒子を生じさせるの
に十分な電位差であると考えられる。
【００７９】本願発明者らは、以上のような計算に基づ
いて、以下の金粒子を保持可能な組み換えアポフェリチ
ンを作製した。
いて、以下の金粒子を保持可能な組み換えアポフェリチ
ンを作製した。
【００８０】図２（ａ）〜（ｃ）は、上述の知見に基づ
いて作製された組み換えアポフェリチンの構造を模式的
に示した図である。
いて作製された組み換えアポフェリチンの構造を模式的
に示した図である。
【００８１】まず、図２（ａ）に示されているのは、ウ
マ肝臓由来のアポフェリチン（以下、アポフェリチンと
略す）において、１２８番目のアスパラギン酸と１３１
番目のグルタミン酸の両アミノ酸をセリン（Ｓｅｒ）に
置換したものである。ここで、アスパラギン酸あるいは
グルタミン酸をセリンに置換しても、アポフェリチンの
立体構造は保持することができる。また、アポフェリチ
ンの１〜８番目のアミノ酸は、アポフェリチンの外表面
上に突き出ており、２次元結晶化などの高次構造の作製
に支障を及ぼすおそれがあるため、欠失させている。こ
の組み換えアポフェリチンを、以下fer-8-serと表記す
る。
マ肝臓由来のアポフェリチン（以下、アポフェリチンと
略す）において、１２８番目のアスパラギン酸と１３１
番目のグルタミン酸の両アミノ酸をセリン（Ｓｅｒ）に
置換したものである。ここで、アスパラギン酸あるいは
グルタミン酸をセリンに置換しても、アポフェリチンの
立体構造は保持することができる。また、アポフェリチ
ンの１〜８番目のアミノ酸は、アポフェリチンの外表面
上に突き出ており、２次元結晶化などの高次構造の作製
に支障を及ぼすおそれがあるため、欠失させている。こ
の組み換えアポフェリチンを、以下fer-8-serと表記す
る。
【００８２】ここで、チャネル３の内表面に存在したマ
イナス電荷を持つアスパラギン酸及びグルタミン酸が、
電荷を持たないセリンに置換されることにより、静電的
な反発力がなくなり、マイナス電荷を持つ（ＡｕＣ
ｌ4）-（図２（ａ）の７）がチャネル３内に取り込まれ
やすくなっている。また、セリン残基はアスパラギン酸
残基，グルタミン酸残基の両残基に比べてサイズが小さ
いため、チャネル内へ（ＡｕＣｌ4）-を取り込む際の物
理的な障害が少なくなっている。
イナス電荷を持つアスパラギン酸及びグルタミン酸が、
電荷を持たないセリンに置換されることにより、静電的
な反発力がなくなり、マイナス電荷を持つ（ＡｕＣ
ｌ4）-（図２（ａ）の７）がチャネル３内に取り込まれ
やすくなっている。また、セリン残基はアスパラギン酸
残基，グルタミン酸残基の両残基に比べてサイズが小さ
いため、チャネル内へ（ＡｕＣｌ4）-を取り込む際の物
理的な障害が少なくなっている。
【００８３】次に、図２（ｂ）に示されているのは、fe
r-8-Serのアミノ酸配列の５８番目，６１番目，６４番
目のグルタミン酸をそれぞれアルギニン（Ａｒｇ）に置
換した組み換えアポフェリチンである。この組み換えア
ポフェリチンを、以下fer-8-Ser-Argと表記する。
r-8-Serのアミノ酸配列の５８番目，６１番目，６４番
目のグルタミン酸をそれぞれアルギニン（Ａｒｇ）に置
換した組み換えアポフェリチンである。この組み換えア
ポフェリチンを、以下fer-8-Ser-Argと表記する。
【００８４】ここで、アポフェリチンの保持部４の内表
面部に存在していた５８番目，６１番目，６４番目のグ
ルタミン酸をプラス電荷を持つアルギニンに置換するこ
とにより、チャネル３に取り込まれた（ＡｕＣｌ4）-を
アポフェリチンの保持部４へと誘導することが可能にな
る。このとき、グルタミン酸からアルギニンへ置換して
も、アポフェリチンの立体構造は保持される。ここで保
持部４へ誘導された（ＡｕＣｌ4）-７は、順次還元され
て金（Ａｕ）原子７’となる。なお、５８番目，６１番
目，６４番目のグルタミン酸と置き換えるアミノ酸とし
ては、負電荷を持たないものであればよく、塩基性アミ
ノ酸であるＬｙｓのほか、Ａｌａなどの非極性アミノ
酸、及び中性アミノ酸などであってもよい。
面部に存在していた５８番目，６１番目，６４番目のグ
ルタミン酸をプラス電荷を持つアルギニンに置換するこ
とにより、チャネル３に取り込まれた（ＡｕＣｌ4）-を
アポフェリチンの保持部４へと誘導することが可能にな
る。このとき、グルタミン酸からアルギニンへ置換して
も、アポフェリチンの立体構造は保持される。ここで保
持部４へ誘導された（ＡｕＣｌ4）-７は、順次還元され
て金（Ａｕ）原子７’となる。なお、５８番目，６１番
目，６４番目のグルタミン酸と置き換えるアミノ酸とし
ては、負電荷を持たないものであればよく、塩基性アミ
ノ酸であるＬｙｓのほか、Ａｌａなどの非極性アミノ
酸、及び中性アミノ酸などであってもよい。
【００８５】次に、図２（ｃ）に示されているのは、fe
r-8-Ser-Argのアミノ酸配列の５４番目のグルタミン酸
と６５番目のアルギニンの両方をシステインに置換した
組み換えアポフェリチンである。以下、この組み換えア
ポフェリチンをfer-8-Ser-Arg-Cysと表記する。
r-8-Ser-Argのアミノ酸配列の５４番目のグルタミン酸
と６５番目のアルギニンの両方をシステインに置換した
組み換えアポフェリチンである。以下、この組み換えア
ポフェリチンをfer-8-Ser-Arg-Cysと表記する。
【００８６】ここで、fer-8-Ser-Argのアミノ酸配列の
５４番目のグルタミン酸と６５番目のアルギニンとは、
アポフェリチンの保持部４の内表面に存在するため、こ
れらのアミノ酸を還元作用を持つシステインに置換する
ことにより、保持部４に取り込まれた（ＡｕＣｌ4）-７
を還元して保持部４内に金の微粒子を析出させることが
できる。これにより、後述の操作により保持部４内に金
からなる核１を形成することができる。
５４番目のグルタミン酸と６５番目のアルギニンとは、
アポフェリチンの保持部４の内表面に存在するため、こ
れらのアミノ酸を還元作用を持つシステインに置換する
ことにより、保持部４に取り込まれた（ＡｕＣｌ4）-７
を還元して保持部４内に金の微粒子を析出させることが
できる。これにより、後述の操作により保持部４内に金
からなる核１を形成することができる。
【００８７】尚、上述の組み換えアポフェリチンの作製
には、以下に説明するように、公知の遺伝子組み換え技
術及びタンパク質の発現方法を用いる。
には、以下に説明するように、公知の遺伝子組み換え技
術及びタンパク質の発現方法を用いる。
【００８８】まず、Takedaらにより作製され、ウマ肝臓
由来のアポフェリチンのＤＮＡが組み込まれたプラスミ
ドTakeda99224（S.TakedaらBiochim.Biophys.Acta.,117
4,218-220,1993参照)から、適当な制限酵素を用いてア
ポフェリチンのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片を
切り出す。
由来のアポフェリチンのＤＮＡが組み込まれたプラスミ
ドTakeda99224（S.TakedaらBiochim.Biophys.Acta.,117
4,218-220,1993参照)から、適当な制限酵素を用いてア
ポフェリチンのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片を
切り出す。
【００８９】次に、このＤＮＡ断片をタンパク質発現用
のベクタープラスミドであるpMK-2に挿入してアポフェ
リチン発現用のプラスミドを作製する。
のベクタープラスミドであるpMK-2に挿入してアポフェ
リチン発現用のプラスミドを作製する。
【００９０】続いて、このアポフェリチン発現用のプラ
スミドを鋳型とし、所望の変異を組み込んだ１本鎖ＤＮ
Ａの断片をプライマーとしてＰＣＲ（polymerase chain
reaction）を行ない、アポフェリチンのアミノ酸をコ
ードするＤＮＡの目的の位置に部位特異的に所望の変異
を導入する。こうしてアポフェリチンの１〜８番目まで
のアミノ酸をコードする部分のＤＮＡを欠失させた変異
アポフェリチン遺伝子のＤＮＡの断片を含むプラスミド
を作製する。このアポフェリチン遺伝子のＤＮＡ断片
は、必要な場合には切り出し、別のベクタープラスミド
に組み込んでもよい。
スミドを鋳型とし、所望の変異を組み込んだ１本鎖ＤＮ
Ａの断片をプライマーとしてＰＣＲ（polymerase chain
reaction）を行ない、アポフェリチンのアミノ酸をコ
ードするＤＮＡの目的の位置に部位特異的に所望の変異
を導入する。こうしてアポフェリチンの１〜８番目まで
のアミノ酸をコードする部分のＤＮＡを欠失させた変異
アポフェリチン遺伝子のＤＮＡの断片を含むプラスミド
を作製する。このアポフェリチン遺伝子のＤＮＡ断片
は、必要な場合には切り出し、別のベクタープラスミド
に組み込んでもよい。
【００９１】続いて、作製されたプラスミドを市販の大
腸菌（E.coliの１種、Nova Blue）に導入し、形質転換
を行なった後、この大腸菌をジャーファーメンター（大
量培養装置）を用いて３７℃にて大量培養する。なお、
形質転換された大腸菌はアンピシリンに耐性を持つた
め、これを指標として形質転換されていない大腸菌と区
別し、選択することができる。
腸菌（E.coliの１種、Nova Blue）に導入し、形質転換
を行なった後、この大腸菌をジャーファーメンター（大
量培養装置）を用いて３７℃にて大量培養する。なお、
形質転換された大腸菌はアンピシリンに耐性を持つた
め、これを指標として形質転換されていない大腸菌と区
別し、選択することができる。
【００９２】この大腸菌内では、プラスミドに組み込ま
れた組み換えアポフェリチンのＤＮＡが発現し、１〜８
番目までのアミノ酸残基が欠失したアポフェリチン（以
下fer-8と表記する）が大量に生産されている。fer-8
は、後述する手順により大腸菌の菌体内から抽出・精製
される。
れた組み換えアポフェリチンのＤＮＡが発現し、１〜８
番目までのアミノ酸残基が欠失したアポフェリチン（以
下fer-8と表記する）が大量に生産されている。fer-8
は、後述する手順により大腸菌の菌体内から抽出・精製
される。
【００９３】次に、fer-8-Serを作製するために、先の
操作で得られた，fer-8のアミノ酸配列をコードするＤ
ＮＡが組み込まれたプラスミドを鋳型とし、アポフェリ
チンの１２８番目のアスパラギン酸と１３１番目のグル
タミン酸の両アミノ酸をセリンに置き換えたアミノ酸配
列をコードする１本鎖ＤＮＡ断片をプライマーとして用
いたＰＣＲを行なう。
操作で得られた，fer-8のアミノ酸配列をコードするＤ
ＮＡが組み込まれたプラスミドを鋳型とし、アポフェリ
チンの１２８番目のアスパラギン酸と１３１番目のグル
タミン酸の両アミノ酸をセリンに置き換えたアミノ酸配
列をコードする１本鎖ＤＮＡ断片をプライマーとして用
いたＰＣＲを行なう。
【００９４】次に、fer-8の作製と同様の操作により、f
er-8-Serのアミノ酸配列をコードするＤＮＡを挿入した
プラスミドを作製し、これを大腸菌（Nova Blue）に導
入し、形質転換する。形質転換した大腸菌を大量培養し
た後、後述する手順により大腸菌の菌体内からfer-8-Se
rを抽出・精製する。
er-8-Serのアミノ酸配列をコードするＤＮＡを挿入した
プラスミドを作製し、これを大腸菌（Nova Blue）に導
入し、形質転換する。形質転換した大腸菌を大量培養し
た後、後述する手順により大腸菌の菌体内からfer-8-Se
rを抽出・精製する。
【００９５】以下、同様の手順により、fer-8-Ser-Arg
のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを挿入したプラスミ
ドとfer-8-Ser-Argを得、次いで、fer-8-Ser-Arg-Cysの
アミノ酸配列をコードするＤＮＡを挿入したプラスミド
とfer-8-Ser-Arg-Cysを得る。
のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを挿入したプラスミ
ドとfer-8-Ser-Argを得、次いで、fer-8-Ser-Arg-Cysの
アミノ酸配列をコードするＤＮＡを挿入したプラスミド
とfer-8-Ser-Arg-Cysを得る。
【００９６】尚、上述の操作における変異アポフェリチ
ンの抽出・精製手順は以下の通りである。
ンの抽出・精製手順は以下の通りである。
【００９７】まず、培養終了後の大腸菌の培養液を遠心
チューブに移して遠心分離器内にセットし、４℃、１
０，０００回転／分、２５分間の条件で遠心分離し、大
腸菌の菌体を沈殿させる。
チューブに移して遠心分離器内にセットし、４℃、１
０，０００回転／分、２５分間の条件で遠心分離し、大
腸菌の菌体を沈殿させる。
【００９８】次に、沈殿した菌体を集めた後、液中で超
音波破砕器を用いて菌体を破砕してアポフェリチンを液
中に溶出させる。次いで、菌体を破砕した液を遠心チュ
ーブに移して遠心分離器内にセットし、４℃、１０，０
００回転／分、２５分間の条件で遠心分離し、破砕され
ずに残った菌体を沈殿させる。
音波破砕器を用いて菌体を破砕してアポフェリチンを液
中に溶出させる。次いで、菌体を破砕した液を遠心チュ
ーブに移して遠心分離器内にセットし、４℃、１０，０
００回転／分、２５分間の条件で遠心分離し、破砕され
ずに残った菌体を沈殿させる。
【００９９】次に、遠心チューブから上清（上澄み液）
を採取し、この液を６０℃、１５分間熱処理した後遠心
チューブに移し、４℃、１０，０００回転／分、２５分
間の条件で遠心分離する。この操作により不要なタンパ
ク質が変性してチューブの底部に沈殿する。
を採取し、この液を６０℃、１５分間熱処理した後遠心
チューブに移し、４℃、１０，０００回転／分、２５分
間の条件で遠心分離する。この操作により不要なタンパ
ク質が変性してチューブの底部に沈殿する。
【０１００】続いて、遠心チューブから上清を採取した
後、４℃下、Q-sepharose HP（ゲルろ過カラム）を用い
たカラムクロマトグラフィを行ない、上清中に含まれる
アポフェリチン画分を採取する。このアポフェリチン画
分をさらに２５℃下、Sephacryl S-300（ゲルろ過カラ
ム）に流してカラムクロマトグラフィを行なうことによ
り精製する。この操作により、不純物が除かれ、精製さ
れた組み換えアポフェリチンが得られる。
後、４℃下、Q-sepharose HP（ゲルろ過カラム）を用い
たカラムクロマトグラフィを行ない、上清中に含まれる
アポフェリチン画分を採取する。このアポフェリチン画
分をさらに２５℃下、Sephacryl S-300（ゲルろ過カラ
ム）に流してカラムクロマトグラフィを行なうことによ
り精製する。この操作により、不純物が除かれ、精製さ
れた組み換えアポフェリチンが得られる。
【０１０１】なお、本発明において、改質されたアポフ
ェリチンをコードするＤＮＡが一旦得られれば、公知の
技術によりこのＤＮＡを増幅することができる。従っ
て、組み換えアポフェリチンを量産する場合には、再度
遺伝子の組み替えを工程を行なう必要はない。
ェリチンをコードするＤＮＡが一旦得られれば、公知の
技術によりこのＤＮＡを増幅することができる。従っ
て、組み換えアポフェリチンを量産する場合には、再度
遺伝子の組み替えを工程を行なう必要はない。
【０１０２】−金粒子を保持するアポフェリチンの作製
− まず、組み換えアポフェリチン溶液とＫＡｕＣｌ4溶液
（またはＨＡｕＣｌ4）とを混合し、それぞれの最終濃
度が、組み換えアポフェリチンは０．５ｍｇ／ｍＬ、Ｋ
ＡｕＣｌ4は３ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨが７−９となるよう
に溶液を調製した後、溶液を室温で２４時間以上放置し
て金粒子をアポフェリチン内部へ取り込ませ、金−アポ
フェリチン複合体を形成させる。ここで、緩衝剤として
は、ｐＨ７−８であれば１００ｍＭのリン酸が、ｐＨ８
−９では１００ｍＭのＴｒｉｓ−Ｈｃｌがそれぞれ好ま
しく用いられる。
− まず、組み換えアポフェリチン溶液とＫＡｕＣｌ4溶液
（またはＨＡｕＣｌ4）とを混合し、それぞれの最終濃
度が、組み換えアポフェリチンは０．５ｍｇ／ｍＬ、Ｋ
ＡｕＣｌ4は３ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨが７−９となるよう
に溶液を調製した後、溶液を室温で２４時間以上放置し
て金粒子をアポフェリチン内部へ取り込ませ、金−アポ
フェリチン複合体を形成させる。ここで、緩衝剤として
は、ｐＨ７−８であれば１００ｍＭのリン酸が、ｐＨ８
−９では１００ｍＭのＴｒｉｓ−Ｈｃｌがそれぞれ好ま
しく用いられる。
【０１０３】このとき、ＮａＢＨ4を１ｍＭ以下の濃度
になるように溶液に加えるか、エタノール等のアルコー
ルを１０％以下（ｖ／ｖ）の濃度になるように加える
か、光または紫外線を照射するかのいずれか１つを行な
うことで、（ＡｕＣｌ4）-の還元反応を加速して反応時
間を短縮することもできる。但し、ＮａＢＨ4の濃度が
１ｍＭを越える場合、または、エタノール濃度が１０％
（ｖ／ｖ）を越える場合は、（ＡｕＣｌ4）-がアポフェ
リチン内部に取り込まれる前に還元されてしまい、アポ
フェリチンの外表面上に金粒子が析出する可能性があ
る。アポフェリチンの外表面上に析出した金粒子のサイ
ズはアポフェリチンの保持部４で形成される金粒子のサ
イズと比べると、ばらつきが大きい。
になるように溶液に加えるか、エタノール等のアルコー
ルを１０％以下（ｖ／ｖ）の濃度になるように加える
か、光または紫外線を照射するかのいずれか１つを行な
うことで、（ＡｕＣｌ4）-の還元反応を加速して反応時
間を短縮することもできる。但し、ＮａＢＨ4の濃度が
１ｍＭを越える場合、または、エタノール濃度が１０％
（ｖ／ｖ）を越える場合は、（ＡｕＣｌ4）-がアポフェ
リチン内部に取り込まれる前に還元されてしまい、アポ
フェリチンの外表面上に金粒子が析出する可能性があ
る。アポフェリチンの外表面上に析出した金粒子のサイ
ズはアポフェリチンの保持部４で形成される金粒子のサ
イズと比べると、ばらつきが大きい。
【０１０４】なお、アポフェリチン内部において、析出
した金粒子の表面は自身が（ＡｕＣｌ4）-の還元反応を
触媒する（自己触媒作用）。これにより、アポフェリチ
ンの保持部４が満たされるまで（ＡｕＣｌ4）-の還元反
応が継続する。
した金粒子の表面は自身が（ＡｕＣｌ4）-の還元反応を
触媒する（自己触媒作用）。これにより、アポフェリチ
ンの保持部４が満たされるまで（ＡｕＣｌ4）-の還元反
応が継続する。
【０１０５】また、ここで溶液のｐＨを７−９とするの
は、溶液のｐＨが６以下では（ＡｕＣｌ4）-の還元が非
常に起こりにくくなり、ｐＨが１０以上では逆に（Ａｕ
Ｃｌ4）-の還元の進行が制御できなくなるからである。
は、溶液のｐＨが６以下では（ＡｕＣｌ4）-の還元が非
常に起こりにくくなり、ｐＨが１０以上では逆に（Ａｕ
Ｃｌ4）-の還元の進行が制御できなくなるからである。
【０１０６】その後、鉄を包含したフェリチンの精製と
同様の手順で副反応物や金粒子を保持していないアポフ
ェリチンを除去し、得られた溶液をゲルカラムクロマト
グラフィーにより分画して、金粒子を包含するアポフェ
リチンを溶液として採取する。このときに、保持部４で
はなく外表面上に金粒子が形成されたアポフェリチン、
あるいは少量ではあるが、保持部４と外表面上との両方
に金粒子が形成されたアポフェリチンも同時にそれぞれ
得られる。
同様の手順で副反応物や金粒子を保持していないアポフ
ェリチンを除去し、得られた溶液をゲルカラムクロマト
グラフィーにより分画して、金粒子を包含するアポフェ
リチンを溶液として採取する。このときに、保持部４で
はなく外表面上に金粒子が形成されたアポフェリチン、
あるいは少量ではあるが、保持部４と外表面上との両方
に金粒子が形成されたアポフェリチンも同時にそれぞれ
得られる。
【０１０７】金粒子をアポフェリチンに取り込ませる反
応で、組み換えアポフェリチンとしてfer-8-Ser及びfer
-8-Ser-Argを用いた場合は、金粒子を内部に包含したア
ポフェリチンと同様、金粒子が外表面上に形成されたア
ポフェリチンも生成される。これは、アポフェリチンの
外表面上で金が析出する反応の速度が、アポフェリチン
の保持部４に金粒子が形成される反応に比べて速いため
と考えられる。
応で、組み換えアポフェリチンとしてfer-8-Ser及びfer
-8-Ser-Argを用いた場合は、金粒子を内部に包含したア
ポフェリチンと同様、金粒子が外表面上に形成されたア
ポフェリチンも生成される。これは、アポフェリチンの
外表面上で金が析出する反応の速度が、アポフェリチン
の保持部４に金粒子が形成される反応に比べて速いため
と考えられる。
【０１０８】これに対し、組み換えアポフェリチンとし
てfer-8-Ser-Arg-Cysを用いることにより、金粒子を内
部に包含したアポフェリチンの収率が大幅に向上する。
これは、保持部４へ導入されたシステイン（Ｃｙｓ）の
還元作用により、アポフェリチンの保持部４での（Ａｕ
Ｃｌ4）-の還元反応が加速されるためである。尚、アポ
フェリチン内に包含された金粒子の直径は、約６ｎｍと
均一である。つまり、本実施形態において作製された組
み換えアポフェリチンfer-8-Ser-Arg-Cysを使用するこ
とにより、ナノメーターオーダーの均一な大きさの金粒
子が効率よく形成できる。微細な金粒子は、後に述べる
ＤＮＡセンサーへの応用など、他の金属にはない用途や
利点がある。
てfer-8-Ser-Arg-Cysを用いることにより、金粒子を内
部に包含したアポフェリチンの収率が大幅に向上する。
これは、保持部４へ導入されたシステイン（Ｃｙｓ）の
還元作用により、アポフェリチンの保持部４での（Ａｕ
Ｃｌ4）-の還元反応が加速されるためである。尚、アポ
フェリチン内に包含された金粒子の直径は、約６ｎｍと
均一である。つまり、本実施形態において作製された組
み換えアポフェリチンfer-8-Ser-Arg-Cysを使用するこ
とにより、ナノメーターオーダーの均一な大きさの金粒
子が効率よく形成できる。微細な金粒子は、後に述べる
ＤＮＡセンサーへの応用など、他の金属にはない用途や
利点がある。
【０１０９】本実施形態において、使用したアポフェリ
チンはウマの肝臓由来のものを用いたが、他の臓器由来
のものや、他の生物由来のアポフェリチン、つまりモノ
マーサブユニットの多量体からなり内部に保持部を備え
たタンパク質などを用いることもできる。リステリア菌
由来のリステリアフェリチンなど、他の生物由来のアポ
フェリチンもウマ由来のものと同様の立体構造を持って
いるため、同様の操作で組み換えアポフェリチンを得る
ことができる。金属−アポフェリチン複合体の核の直径
は、種によって若干異なるため、これにより、金粒子の
直径にバリエーションを持たせることができる。
チンはウマの肝臓由来のものを用いたが、他の臓器由来
のものや、他の生物由来のアポフェリチン、つまりモノ
マーサブユニットの多量体からなり内部に保持部を備え
たタンパク質などを用いることもできる。リステリア菌
由来のリステリアフェリチンなど、他の生物由来のアポ
フェリチンもウマ由来のものと同様の立体構造を持って
いるため、同様の操作で組み換えアポフェリチンを得る
ことができる。金属−アポフェリチン複合体の核の直径
は、種によって若干異なるため、これにより、金粒子の
直径にバリエーションを持たせることができる。
【０１１０】これに加え、内部に金属などを保持可能な
かご状タンパク質であれば、本実施形態で行ったよう
に、チャネルと内部の電荷を変えることにより、金粒子
を保持させることが可能である。
かご状タンパク質であれば、本実施形態で行ったよう
に、チャネルと内部の電荷を変えることにより、金粒子
を保持させることが可能である。
【０１１１】また、１２個のモノマーサブユニットから
なり、内部に無機物を保持する保持部を備えたＤｐｓタ
ンパクなど他のフェリチンファミリータンパクの場合
も、アポフェリチンと同様の遺伝子組み換え技術を用い
て貴金属粒子を保持させることが可能である。
なり、内部に無機物を保持する保持部を備えたＤｐｓタ
ンパクなど他のフェリチンファミリータンパクの場合
も、アポフェリチンと同様の遺伝子組み換え技術を用い
て貴金属粒子を保持させることが可能である。
【０１１２】また、本実施形態においては、アポフェリ
チンのチャネル３の内表面に存在する１２８番目のアス
パラギン酸と１３１番目のグルタミン酸の両方をセリン
に置換したが、セリンの代わりとして分子量がより小さ
い中性アミノ酸であるグリシンまたはアラニンに置換し
てもよい。
チンのチャネル３の内表面に存在する１２８番目のアス
パラギン酸と１３１番目のグルタミン酸の両方をセリン
に置換したが、セリンの代わりとして分子量がより小さ
い中性アミノ酸であるグリシンまたはアラニンに置換し
てもよい。
【０１１３】また、本実施形態においては、組み換えア
ポフェリチンとしてfer-8-Ser-Argを挙げたが、アポフ
ェリチンのアミノ酸配列の５８，６１，６４番目の各グ
ルタミン酸を置換するアミノ酸は、リジンやアラニン
等、負電荷を持たない塩基性または非極性あるいは中性
アミノ酸であればよい。アミノ酸配列の５８，６１，６
４番目の各グルタミン酸をリジンで置換した組み換えア
ポフェリチンは以下、fer-8-Ser-Lysと表記する。
ポフェリチンとしてfer-8-Ser-Argを挙げたが、アポフ
ェリチンのアミノ酸配列の５８，６１，６４番目の各グ
ルタミン酸を置換するアミノ酸は、リジンやアラニン
等、負電荷を持たない塩基性または非極性あるいは中性
アミノ酸であればよい。アミノ酸配列の５８，６１，６
４番目の各グルタミン酸をリジンで置換した組み換えア
ポフェリチンは以下、fer-8-Ser-Lysと表記する。
【０１１４】また、アミノ酸配列の５８，６１，６４番
目の各グルタミン酸をアラニンで置換した組み換えアポ
フェリチンは、fer-8-Ser-Alaと表記する。
目の各グルタミン酸をアラニンで置換した組み換えアポ
フェリチンは、fer-8-Ser-Alaと表記する。
【０１１５】尚、fer-8-Ser-Lysの５４番目のグルタミ
ン酸と６５番目のアルギニンの両方をシステインで置換
した組み換えアポフェリチンは、fer-8-Ser-Lys-Cysと
表記する。また、fer-8-Ser-Alaの５４番目のグルタミ
ン酸と６５番目のアルギニンの両方をシステインで置換
した組み換えアポフェリチンは、fer-8-Ser-Ala-Cysと
表記する。
ン酸と６５番目のアルギニンの両方をシステインで置換
した組み換えアポフェリチンは、fer-8-Ser-Lys-Cysと
表記する。また、fer-8-Ser-Alaの５４番目のグルタミ
ン酸と６５番目のアルギニンの両方をシステインで置換
した組み換えアポフェリチンは、fer-8-Ser-Ala-Cysと
表記する。
【０１１６】このうち、fer-8-Ser-Lys-Cysのアミノ酸
配列をコードするＤＮＡ配列を配列番号１に、fer-8-Se
r-Lys-Cysのアミノ酸配列を配列番号２にそれぞれ記載
する。尚、配列番号２のアミノ酸配列は、９番目のチロ
シンから始まっている。
配列をコードするＤＮＡ配列を配列番号１に、fer-8-Se
r-Lys-Cysのアミノ酸配列を配列番号２にそれぞれ記載
する。尚、配列番号２のアミノ酸配列は、９番目のチロ
シンから始まっている。
【０１１７】なお、本実施形態において作製されたfer-
8-Ser-Lys-Cysにおいて、５８，６１，６４番目（配列
番号２においては５０，５３，５６番目）のＬｙｓをコ
ードするＤＮＡ配列は共に”aag”であるが、これに代
えてＬｙｓをコードする”aaa”であってもよい。１２
８，１３１番目（配列番号２においては１２０，１２３
番目）のＳｅｒや、５４，６５番目（配列番号２におい
ては４６，５７番目）のＣｙｓについても、これらのア
ミノ酸をコードするＤＮＡ配列であれば配列番号１に示
す配列と異なっていてもよい。これは、他の組み換えア
ポフェリチンについても同様である。
8-Ser-Lys-Cysにおいて、５８，６１，６４番目（配列
番号２においては５０，５３，５６番目）のＬｙｓをコ
ードするＤＮＡ配列は共に”aag”であるが、これに代
えてＬｙｓをコードする”aaa”であってもよい。１２
８，１３１番目（配列番号２においては１２０，１２３
番目）のＳｅｒや、５４，６５番目（配列番号２におい
ては４６，５７番目）のＣｙｓについても、これらのア
ミノ酸をコードするＤＮＡ配列であれば配列番号１に示
す配列と異なっていてもよい。これは、他の組み換えア
ポフェリチンについても同様である。
【０１１８】また、本実施形態において作製されたfer-
8-Ser-Arg-Cys，fer-8-Ser-Lys-Cys及びfer-8-Ser-Ala-
Cys等の組み換えアポフェリチンの１２７番目のシステ
インはアポフェリチンの外表面に位置しており、このシ
ステインがアポフェリチンの外表面上に金粒子を析出さ
せていると推定される。よって、fer-8-Ser-Arg-Cys,fe
r-8-Ser-Lys-Cys及びfer-8-Ser-Ala-Cysの１２７番目の
システインを当該システインよりも還元機能が小さい物
質にすることにより、金粒子のアポフェリチン外表面上
での析出が抑制され、金粒子を内包したアポフェリチン
の収率をさらに向上させることができると考えられる。
この方法としては、１２７番目のシステインを例えばア
ラニン等のアミノ酸で置換してもよいし、システイン残
基と反応して還元機能を抑える化学物質等と反応させて
もよい。
8-Ser-Arg-Cys，fer-8-Ser-Lys-Cys及びfer-8-Ser-Ala-
Cys等の組み換えアポフェリチンの１２７番目のシステ
インはアポフェリチンの外表面に位置しており、このシ
ステインがアポフェリチンの外表面上に金粒子を析出さ
せていると推定される。よって、fer-8-Ser-Arg-Cys,fe
r-8-Ser-Lys-Cys及びfer-8-Ser-Ala-Cysの１２７番目の
システインを当該システインよりも還元機能が小さい物
質にすることにより、金粒子のアポフェリチン外表面上
での析出が抑制され、金粒子を内包したアポフェリチン
の収率をさらに向上させることができると考えられる。
この方法としては、１２７番目のシステインを例えばア
ラニン等のアミノ酸で置換してもよいし、システイン残
基と反応して還元機能を抑える化学物質等と反応させて
もよい。
【０１１９】また、本実施形態において、金−アポフェ
リチン複合体を作製したが、アポフェリチンに（ＡｕＣ
ｌ4）-を導入する代わりに、クロロ白金酸（ＰｔＣ
ｌ4 ）2-を組み換えアポフェリチンに導入することによ
り、白金粒子を保持したアポフェリチンを作製すること
もできる。但し、（ＰｔＣｌ4 ）2-はｐＨ７−９の溶液
中で容易に還元されて溶液中に白金が析出するため、溶
液のｐＨは７よりも低くしておく必要がある。このとき
緩衝液としては、ｐＨ４付近にする場合は１００ｍＭの
酢酸が、ｐＨ３付近にする場合は１００ｍＭのβ−アラ
ニンがそれぞれ用いられる。
リチン複合体を作製したが、アポフェリチンに（ＡｕＣ
ｌ4）-を導入する代わりに、クロロ白金酸（ＰｔＣ
ｌ4 ）2-を組み換えアポフェリチンに導入することによ
り、白金粒子を保持したアポフェリチンを作製すること
もできる。但し、（ＰｔＣｌ4 ）2-はｐＨ７−９の溶液
中で容易に還元されて溶液中に白金が析出するため、溶
液のｐＨは７よりも低くしておく必要がある。このとき
緩衝液としては、ｐＨ４付近にする場合は１００ｍＭの
酢酸が、ｐＨ３付近にする場合は１００ｍＭのβ−アラ
ニンがそれぞれ用いられる。
【０１２０】本実施形態において作製された貴金属粒子
を保持する組み換えアポフェリチンの産業上の利用例を
以下の実施形態で述べる。
を保持する組み換えアポフェリチンの産業上の利用例を
以下の実施形態で述べる。
【０１２１】（第２の実施形態）まず、本実施形態にお
けるヌクレオチド検出装置の構成について説明する。図
５は、本実施形態のヌクレオチド検出装置の構造を示す
断面図である。
けるヌクレオチド検出装置の構成について説明する。図
５は、本実施形態のヌクレオチド検出装置の構造を示す
断面図である。
【０１２２】同図に示すように、本実施形態のヌクレオ
チド検出装置１０はＤＮＡセンサであり、図５に示すよ
うに、基板１１と、基板１１の表面上に高密度、且つ、
高精度（隣接する粒子と互いに約１２ｎｍ間隔）で配置
されたナノメーターサイズ（直径６ｎｍ程度）の金粒子
１２と、端部に硫黄原子を有する１本鎖ＤＮＡ（チオー
ルＤＮＡ）１３とからなり、金粒子１２にチオールＤＮ
Ａ１３を結合させたものである。
チド検出装置１０はＤＮＡセンサであり、図５に示すよ
うに、基板１１と、基板１１の表面上に高密度、且つ、
高精度（隣接する粒子と互いに約１２ｎｍ間隔）で配置
されたナノメーターサイズ（直径６ｎｍ程度）の金粒子
１２と、端部に硫黄原子を有する１本鎖ＤＮＡ（チオー
ルＤＮＡ）１３とからなり、金粒子１２にチオールＤＮ
Ａ１３を結合させたものである。
【０１２３】次に、本実施形態のヌクレオチド検出装置
１０の作製方法を説明する。本実施形態のヌクレオチド
検出装置１０を作製するためには、直径６ｎｍ程度の金
粒子１２を、基板１１の表面上に２次元状に高密度且つ
高精度に配列および固定する必要がある。
１０の作製方法を説明する。本実施形態のヌクレオチド
検出装置１０を作製するためには、直径６ｎｍ程度の金
粒子１２を、基板１１の表面上に２次元状に高密度且つ
高精度に配列および固定する必要がある。
【０１２４】まず、第１の実施形態の金粒子１２を保持
する組み換えアポフェリチン（fer-8-Ser-Arg-Cysと金
粒子との複合体；以下、金内包アポフェリチン１５と称
する）を、後述の方法により基板１１の表面上に配置す
る。
する組み換えアポフェリチン（fer-8-Ser-Arg-Cysと金
粒子との複合体；以下、金内包アポフェリチン１５と称
する）を、後述の方法により基板１１の表面上に配置す
る。
【０１２５】図３は、基板１１上に配置された金内包ア
ポフェリチン１５を模式的に示す図であり、図４は、基
板１１上に配置された金内包アポフェリチン１５の電子
顕微鏡写真を示す図である。
ポフェリチン１５を模式的に示す図であり、図４は、基
板１１上に配置された金内包アポフェリチン１５の電子
顕微鏡写真を示す図である。
【０１２６】図４の撮影に際しては、アポフェリチンに
取り込まれない大きさの金グルコースを染色に用いた。
ここで、金グルコース染色を用いたのは、通常の色素で
染色すると、アポフェリチン内部に色素が入り込んで金
粒子の存在を確認できないからである。
取り込まれない大きさの金グルコースを染色に用いた。
ここで、金グルコース染色を用いたのは、通常の色素で
染色すると、アポフェリチン内部に色素が入り込んで金
粒子の存在を確認できないからである。
【０１２７】この操作により、図３または図４に示すよ
うに高密度、且つ高精度で配置された金内包アポフェリ
チン１５の膜が基板１１上に形成される。図４から、こ
のときのアポフェリチンの外径は約１２ｎｍであること
が分かる。
うに高密度、且つ高精度で配置された金内包アポフェリ
チン１５の膜が基板１１上に形成される。図４から、こ
のときのアポフェリチンの外径は約１２ｎｍであること
が分かる。
【０１２８】続いて、金内包アポフェリチン１５のうち
のタンパク質からなる外殻２を除去して、金粒子１２の
みを残存させる。次いで、金粒子１２にチオールＤＮＡ
１３を結合させる。ここで使用されるＤＮＡは１本鎖Ｄ
ＮＡである。
のタンパク質からなる外殻２を除去して、金粒子１２の
みを残存させる。次いで、金粒子１２にチオールＤＮＡ
１３を結合させる。ここで使用されるＤＮＡは１本鎖Ｄ
ＮＡである。
【０１２９】本実施形態において、金内包アポフェリチ
ン１５を基板１１の表面上に２次元状に高密度、且つ高
精度で配置及び固定するためには既知の方法を用いるこ
とができる。
ン１５を基板１１の表面上に２次元状に高密度、且つ高
精度で配置及び固定するためには既知の方法を用いるこ
とができる。
【０１３０】例えば、以下に説明する吉村らにより開発
された転写法（Adv.Biophys.,Vol.34,p99-107,（199
7））による方法を用いることができる。
された転写法（Adv.Biophys.,Vol.34,p99-107,（199
7））による方法を用いることができる。
【０１３１】この方法では、まず、濃度２％のシューク
ロース溶液に、金内包アポフェリチン１５を分散した液
体を、シリンジを用いて注入する。すると、液体は、シ
ュークロース溶液の液面に向かって浮上する。
ロース溶液に、金内包アポフェリチン１５を分散した液
体を、シリンジを用いて注入する。すると、液体は、シ
ュークロース溶液の液面に向かって浮上する。
【０１３２】次に、最初に気液界面に到達した液体は変
性したアポフェリチンからなるアモルファス膜を形成
し、後から到達した液体はアモルファス膜の下に付着し
ていく。
性したアポフェリチンからなるアモルファス膜を形成
し、後から到達した液体はアモルファス膜の下に付着し
ていく。
【０１３３】次に、アモルファス膜の下に、金内包アポ
フェリチン１５の２次元結晶を形成する。次いで、アモ
ルファス膜と金内包アポフェリチン１５の２次元結晶と
からなる膜の上に、基板１１（シリコンウエハ、カーボ
ングリッド、ガラス基板等）を載置すれば、この金内包
アポフェリチン１５からなる膜は、基板１１の表面に転
写される。
フェリチン１５の２次元結晶を形成する。次いで、アモ
ルファス膜と金内包アポフェリチン１５の２次元結晶と
からなる膜の上に、基板１１（シリコンウエハ、カーボ
ングリッド、ガラス基板等）を載置すれば、この金内包
アポフェリチン１５からなる膜は、基板１１の表面に転
写される。
【０１３４】この方法により、図３に示すように、基板
１１上に金内包アポフェリチン１５を高密度、高精度で
配置することができる。
１１上に金内包アポフェリチン１５を高密度、高精度で
配置することができる。
【０１３５】このとき、基板１１の表面を疎水性に処理
しておくことで、より簡単に基板１１の表面に膜を転写
することができる。
しておくことで、より簡単に基板１１の表面に膜を転写
することができる。
【０１３６】次に、タンパク質からなる外殻２の除去を
行なう。タンパク質分子は、一般に熱に弱いので、以下
に示す熱処理により外殻２を除去することができる。
行なう。タンパク質分子は、一般に熱に弱いので、以下
に示す熱処理により外殻２を除去することができる。
【０１３７】例えば、窒素等の不活性ガス中において、
４００〜５００℃にて、約１時間静置すると、外殻２、
およびタンパク質からなるアモルファス膜が焼失し、基
板１１上には金粒子１２が２次元状に、高密度で、且つ
高精度で規則正しく配列したドット状に残存する。
４００〜５００℃にて、約１時間静置すると、外殻２、
およびタンパク質からなるアモルファス膜が焼失し、基
板１１上には金粒子１２が２次元状に、高密度で、且つ
高精度で規則正しく配列したドット状に残存する。
【０１３８】以上のようにして、金内包アポフェリチン
１５に保持させた金粒子１２を、基板１１上に２次元状
に出現させ、高密度且つ高精度に配列させることができ
る。
１５に保持させた金粒子１２を、基板１１上に２次元状
に出現させ、高密度且つ高精度に配列させることができ
る。
【０１３９】次に、本実施形態のヌクレオチド検出装置
１０の形成について以下に説明する。
１０の形成について以下に説明する。
【０１４０】本実施形態のヌクレオチド検出装置１０
は、上述のようにして基板１１上に配置された金粒子１
２に、チオールＤＮＡ１３を結合させたものである。
は、上述のようにして基板１１上に配置された金粒子１
２に、チオールＤＮＡ１３を結合させたものである。
【０１４１】金粒子１２とチオールＤＮＡ１３との結合
方法は、金粒子１２を配置した基板１１と、チオールＤ
ＮＡ１３の水溶液とを接触させ、所定の時間放置するだ
けでよい。これは、硫黄が金と反応し易いので、このチ
オールＤＮＡ１３またはチオールＲＮＡの端部において
金粒子１２と容易に共役結合を形成するからである。
方法は、金粒子１２を配置した基板１１と、チオールＤ
ＮＡ１３の水溶液とを接触させ、所定の時間放置するだ
けでよい。これは、硫黄が金と反応し易いので、このチ
オールＤＮＡ１３またはチオールＲＮＡの端部において
金粒子１２と容易に共役結合を形成するからである。
【０１４２】具体的には、水溶液中のチオールＤＮＡ１
３と、基板１１上の金粒子１２とが接触すると、チオー
ルＤＮＡ１３の硫黄原子Ｓと金粒子１２とが１対１で共
有結合し、チオールＤＮＡ１３が極めて高密度・高精度
で基板１１上に配置される。基板１１上の金粒子１２
は、２次元状に高密度且つ高精度で配列されているの
で、金粒子１２と結合したチオールＤＮＡ１３も２次元
状に高密度且つ高精度で配列され、粒子の大きさに応じ
て単位面積当たりの粒子数を均一に配置したヌクレオチ
ド検出装置１０が得られる。
３と、基板１１上の金粒子１２とが接触すると、チオー
ルＤＮＡ１３の硫黄原子Ｓと金粒子１２とが１対１で共
有結合し、チオールＤＮＡ１３が極めて高密度・高精度
で基板１１上に配置される。基板１１上の金粒子１２
は、２次元状に高密度且つ高精度で配列されているの
で、金粒子１２と結合したチオールＤＮＡ１３も２次元
状に高密度且つ高精度で配列され、粒子の大きさに応じ
て単位面積当たりの粒子数を均一に配置したヌクレオチ
ド検出装置１０が得られる。
【０１４３】なお、この工程で、チオールＤＮＡ１３の
代わりにチオールＲＮＡ、端部をチオール化したＰＣＲ
プライマーなどのヌクレオチドを用いてもよい。
代わりにチオールＲＮＡ、端部をチオール化したＰＣＲ
プライマーなどのヌクレオチドを用いてもよい。
【０１４４】上記工程において、チオールＤＮＡ１３の
水溶液中における濃度は、理論的には、基板１１上の金
粒子１２の数とチオールＤＮＡ１３の数とが一致すれば
よい。しかし、実際には、チオールＤＮＡ１３の数が金
粒子１２の数より多数となるようにすることが好まし
い。従って、本実施形態では、液体中に分散した状態で
含まれる金内包アポフェリチン１５の分子数以上のチオ
ールＤＮＡ１３が含まれるように、高濃度のチオールＤ
ＮＡ１３の水溶液を使用する。
水溶液中における濃度は、理論的には、基板１１上の金
粒子１２の数とチオールＤＮＡ１３の数とが一致すれば
よい。しかし、実際には、チオールＤＮＡ１３の数が金
粒子１２の数より多数となるようにすることが好まし
い。従って、本実施形態では、液体中に分散した状態で
含まれる金内包アポフェリチン１５の分子数以上のチオ
ールＤＮＡ１３が含まれるように、高濃度のチオールＤ
ＮＡ１３の水溶液を使用する。
【０１４５】また、チオールＤＮＡ１３の水溶液の温度
が高いほど、チオールＤＮＡ１３の硫黄原子Ｓと金粒子
１２との結合が促進される。しかし、余り高温である
と、対流が激しくなる等、チオールＤＮＡ１３の水溶液
の取扱いが困難となる。また、エネルギー消費の観点か
らも不利となるので、一般には、チオールＤＮＡ１３の
水溶液を２０〜６０℃程度に加温して行なうことが好ま
しい。
が高いほど、チオールＤＮＡ１３の硫黄原子Ｓと金粒子
１２との結合が促進される。しかし、余り高温である
と、対流が激しくなる等、チオールＤＮＡ１３の水溶液
の取扱いが困難となる。また、エネルギー消費の観点か
らも不利となるので、一般には、チオールＤＮＡ１３の
水溶液を２０〜６０℃程度に加温して行なうことが好ま
しい。
【０１４６】以上のようにして、検出したいＤＮＡまた
はＲＮＡを簡便に検出することができる本実施形態のヌ
クレオチド検出装置１０が得られる。
はＲＮＡを簡便に検出することができる本実施形態のヌ
クレオチド検出装置１０が得られる。
【０１４７】次に、ヌクレオチド検出装置１０をＤＮＡ
センサとしたときの、ＤＮＡ検出方法を説明する。
センサとしたときの、ＤＮＡ検出方法を説明する。
【０１４８】まず、検出対象となるＤＮＡ群（被検出Ｄ
ＮＡ群）を含む溶液を用意し、予め被検出ＤＮＡ群を蛍
光ラベル処理しておく。
ＮＡ群）を含む溶液を用意し、予め被検出ＤＮＡ群を蛍
光ラベル処理しておく。
【０１４９】蛍光ラベルした被検出ＤＮＡ群の溶液を、
チオールＤＮＡ１３を配置したヌクレオチド検出装置１
０に接触させて放置する。
チオールＤＮＡ１３を配置したヌクレオチド検出装置１
０に接触させて放置する。
【０１５０】一定時間を経ると、ヌクレオチド検出装置
１０のチオールＤＮＡ１３とハイブリダイズするＤＮＡ
が被検出ＤＮＡ群の中に存在する場合は、ヌクレオチド
検出装置１０のチオールＤＮＡ１３と被検出ＤＮＡ群の
中のＤＮＡとが、２重螺旋を構成し、安定な結合を完成
する。
１０のチオールＤＮＡ１３とハイブリダイズするＤＮＡ
が被検出ＤＮＡ群の中に存在する場合は、ヌクレオチド
検出装置１０のチオールＤＮＡ１３と被検出ＤＮＡ群の
中のＤＮＡとが、２重螺旋を構成し、安定な結合を完成
する。
【０１５１】次に、ヌクレオチド検出装置１０を水等の
蛍光物質を含まない溶液で洗浄すれば、被検出ＤＮＡ群
のうちのヌクレオチド検出装置１０のチオールＤＮＡ１
３と結合しなかったＤＮＡと、ヌクレオチド検出装置１
０上に残っていた微量の蛍光物質とが除去される。
蛍光物質を含まない溶液で洗浄すれば、被検出ＤＮＡ群
のうちのヌクレオチド検出装置１０のチオールＤＮＡ１
３と結合しなかったＤＮＡと、ヌクレオチド検出装置１
０上に残っていた微量の蛍光物質とが除去される。
【０１５２】この後、ヌクレオチド検出装置１０の表面
にレーザ等の光源を照射して蛍光を観察する。このと
き、ヌクレオチド検出装置１０のチオールＤＮＡ１３と
ハイブリダイズする配列を有するＤＮＡが、上記の被検
出ＤＮＡ群に存在していれば、蛍光を発する。
にレーザ等の光源を照射して蛍光を観察する。このと
き、ヌクレオチド検出装置１０のチオールＤＮＡ１３と
ハイブリダイズする配列を有するＤＮＡが、上記の被検
出ＤＮＡ群に存在していれば、蛍光を発する。
【０１５３】以上のように、蛍光を発するか否かで、被
検出ＤＮＡ群中に所定の配列を有するＤＮＡが存在する
か否かを検出することができる。
検出ＤＮＡ群中に所定の配列を有するＤＮＡが存在する
か否かを検出することができる。
【０１５４】特に、本実施形態のヌクレオチド検出装置
１０は、チオールＤＮＡ１３が高密度で、且つ高精度
で、基板全体に亘って均一に配置されている。このた
め、蛍光強度が高く、且つ高精度で均一となり、ＳＮ比
が非常に高い高性能ＤＮＡセンサとして利用することが
できる。従って、本実施形態のヌクレオチド検出装置１
０をＤＮＡセンサとして利用した場合、所定の値よりも
高い蛍光強度が得られれば、被検出ＤＮＡ群中に所定の
配列を有するＤＮＡが存在すると判定できる。つまり、
所定の配列を有するＤＮＡの有無の判定を誤る可能性が
ほとんどない。
１０は、チオールＤＮＡ１３が高密度で、且つ高精度
で、基板全体に亘って均一に配置されている。このた
め、蛍光強度が高く、且つ高精度で均一となり、ＳＮ比
が非常に高い高性能ＤＮＡセンサとして利用することが
できる。従って、本実施形態のヌクレオチド検出装置１
０をＤＮＡセンサとして利用した場合、所定の値よりも
高い蛍光強度が得られれば、被検出ＤＮＡ群中に所定の
配列を有するＤＮＡが存在すると判定できる。つまり、
所定の配列を有するＤＮＡの有無の判定を誤る可能性が
ほとんどない。
【０１５５】さらに、本実施形態のヌクレオチド検出装
置１０は、チオールＤＮＡ１３が高密度且つ高精度で、
基板全体に亘って均一に配置されているとともに、所定
の配列を有するＤＮＡのハイブリダイズ後の蛍光強度
は、基板毎に異なることがほとんどない。従って、ハイ
ブリダイズしたＤＮＡの有無の判定のために、蛍光強度
のしきい値の設定を基板毎に変更する必要が無く、蛍光
検出器の調整の手間を大幅に削減することができるとい
う著効を発揮する。
置１０は、チオールＤＮＡ１３が高密度且つ高精度で、
基板全体に亘って均一に配置されているとともに、所定
の配列を有するＤＮＡのハイブリダイズ後の蛍光強度
は、基板毎に異なることがほとんどない。従って、ハイ
ブリダイズしたＤＮＡの有無の判定のために、蛍光強度
のしきい値の設定を基板毎に変更する必要が無く、蛍光
検出器の調整の手間を大幅に削減することができるとい
う著効を発揮する。
【０１５６】なお、本実施形態では、ヌクレオチド検出
装置１０をＤＮＡセンサとした場合について説明した
が、検出対象となるＤＮＡ群の代わりに、ＲＮＡ群を用
いることによって、ヌクレオチド検出装置１０をＲＮＡ
センサとすることができる。
装置１０をＤＮＡセンサとした場合について説明した
が、検出対象となるＤＮＡ群の代わりに、ＲＮＡ群を用
いることによって、ヌクレオチド検出装置１０をＲＮＡ
センサとすることができる。
【０１５７】また、従来は、ＤＮＡチップなどのヌクレ
オチド検出装置は使い捨てであるが、本実施形態のヌク
レオチド検出装置１０においては、基板とＤＮＡ（また
はＲＮＡ）が硫黄原子および金粒子を介して強固に固定
されているため、１００℃の温度でもこの固定を維持す
ることができる。従って、ハイブリダイズしたＤＮＡを
チオールＤＮＡから解離させて洗い流すことによって、
繰り返し使用することもできる。
オチド検出装置は使い捨てであるが、本実施形態のヌク
レオチド検出装置１０においては、基板とＤＮＡ（また
はＲＮＡ）が硫黄原子および金粒子を介して強固に固定
されているため、１００℃の温度でもこの固定を維持す
ることができる。従って、ハイブリダイズしたＤＮＡを
チオールＤＮＡから解離させて洗い流すことによって、
繰り返し使用することもできる。
【０１５８】また、本実施形態において用いられた金内
包アポフェリチン１５の代わりに、第１の実施形態にお
いて得られた、外表面上に金粒子が成長した金−アポフ
ェリチン複合体を用いてもよい。アポフェリチンの外表
面上で成長した金粒子は、サイズは均一ではないが、本
実施形態で用いられる金粒子１２と同様に、高密度且つ
高精度で金粒子を基板上に配置することができる。第１
の実施形態において、fer-8-Ser-Argを用いると、非常
に高い収率で外表面上に金粒子が成長したfer-8-Ser-Ar
gが得られるので、金内包アポフェリチン１５を用いる
場合に比べ、ヌクレオチド検出装置１０の製造コストを
下げることが可能となる。
包アポフェリチン１５の代わりに、第１の実施形態にお
いて得られた、外表面上に金粒子が成長した金−アポフ
ェリチン複合体を用いてもよい。アポフェリチンの外表
面上で成長した金粒子は、サイズは均一ではないが、本
実施形態で用いられる金粒子１２と同様に、高密度且つ
高精度で金粒子を基板上に配置することができる。第１
の実施形態において、fer-8-Ser-Argを用いると、非常
に高い収率で外表面上に金粒子が成長したfer-8-Ser-Ar
gが得られるので、金内包アポフェリチン１５を用いる
場合に比べ、ヌクレオチド検出装置１０の製造コストを
下げることが可能となる。
【０１５９】（第３の実施形態）本実施形態では、第１
の実施形態において作製された金内包アポフェリチンを
利用して形成されるドット体をフローティングゲートと
して含む不揮発メモリセルについて説明する。尚、本実
施形態の不揮発メモリセル及びその製造方法は、特開平
１１−２３３７５２号公報に記載のものである。
の実施形態において作製された金内包アポフェリチンを
利用して形成されるドット体をフローティングゲートと
して含む不揮発メモリセルについて説明する。尚、本実
施形態の不揮発メモリセル及びその製造方法は、特開平
１１−２３３７５２号公報に記載のものである。
【０１６０】図６は、ドット体をフローティングゲート
として利用した不揮発性メモリセルの構造を示す断面図
である。同図に示されるように、ｐ型Ｓｉ基板２１上に
は、制御ゲートとして機能するポリシリコン電極２６
と、約６ｎｍの粒径を有する金の微粒子により構成され
フローティングゲート電極として機能するドット体２４
と、ｐ型Ｓｉ基板２１とフローティングゲートとの間に
介在してトンネル絶縁膜として機能するゲート酸化膜２
３と、制御ゲートとフローティングゲートとの間にあっ
て制御ゲートの電圧をフローティングゲートに伝える電
極間絶縁膜として機能するシリコン酸化膜２５とが設け
られている。そして、ｐ型Ｓｉ基板２１内には、ソース
もしくはドレインとして機能する第１，第２ｎ型拡散層
２７ａ及び２７ｂとが形成されていて、ｐ型Ｓｉ基板２
１内の第１，第２ｎ型拡散層２７ａ，２７ｂ間の領域は
チャネルとして機能する。また、図示されているメモリ
セルと隣接するメモリセルとの間には、電気的分離のた
め、選択酸化法等を用いて形成された素子分離酸化膜２
２が形成されている。第１，第２ｎ型拡散層２７ａ，２
７ｂは各々タングステンプラグ３０を介して第１，第２
アルミニウム配線３１ａ，３１ｂとそれぞれ接続されて
いる。図６には示されていないが、ポリシリコン電極２
６やｐ型Ｓｉ基板２１もアルミニウム配線と接続されて
おり、このアルミニウム配線等を用いてメモリセルの各
部の電圧を制御するように構成されている。
として利用した不揮発性メモリセルの構造を示す断面図
である。同図に示されるように、ｐ型Ｓｉ基板２１上に
は、制御ゲートとして機能するポリシリコン電極２６
と、約６ｎｍの粒径を有する金の微粒子により構成され
フローティングゲート電極として機能するドット体２４
と、ｐ型Ｓｉ基板２１とフローティングゲートとの間に
介在してトンネル絶縁膜として機能するゲート酸化膜２
３と、制御ゲートとフローティングゲートとの間にあっ
て制御ゲートの電圧をフローティングゲートに伝える電
極間絶縁膜として機能するシリコン酸化膜２５とが設け
られている。そして、ｐ型Ｓｉ基板２１内には、ソース
もしくはドレインとして機能する第１，第２ｎ型拡散層
２７ａ及び２７ｂとが形成されていて、ｐ型Ｓｉ基板２
１内の第１，第２ｎ型拡散層２７ａ，２７ｂ間の領域は
チャネルとして機能する。また、図示されているメモリ
セルと隣接するメモリセルとの間には、電気的分離のた
め、選択酸化法等を用いて形成された素子分離酸化膜２
２が形成されている。第１，第２ｎ型拡散層２７ａ，２
７ｂは各々タングステンプラグ３０を介して第１，第２
アルミニウム配線３１ａ，３１ｂとそれぞれ接続されて
いる。図６には示されていないが、ポリシリコン電極２
６やｐ型Ｓｉ基板２１もアルミニウム配線と接続されて
おり、このアルミニウム配線等を用いてメモリセルの各
部の電圧を制御するように構成されている。
【０１６１】このメモリセルの以下のように、容易に形
成される。
成される。
【０１６２】まず、ＬＯＣＯＳ法により、活性領域を取
り囲む素子分離酸化膜２２を形成した後、基板上にゲー
ト酸化膜２３を形成する。その後、第１の実施形態にお
いて作製された金内包アポフェリチンを用いて、ドット
体２４を基板全体に形成する。この際に、金粒子を内包
したアポフェリチンを用いることにより、従来の金属酸
化物を内包するアポフェリチンを用いたときに必要であ
ったドット体の還元を行なう工程を省くことができる。
り囲む素子分離酸化膜２２を形成した後、基板上にゲー
ト酸化膜２３を形成する。その後、第１の実施形態にお
いて作製された金内包アポフェリチンを用いて、ドット
体２４を基板全体に形成する。この際に、金粒子を内包
したアポフェリチンを用いることにより、従来の金属酸
化物を内包するアポフェリチンを用いたときに必要であ
ったドット体の還元を行なう工程を省くことができる。
【０１６３】次に、基板上に、ＣＶＤ法により、ドット
体２４を埋めるシリコン酸化膜及びポリシリコン膜を堆
積する。
体２４を埋めるシリコン酸化膜及びポリシリコン膜を堆
積する。
【０１６４】次に、シリコン酸化膜及びポリシリコン膜
のパターニングを行なって電極間絶縁膜となるシリコン
酸化膜２５及び制御ゲート電極となるポリシリコン電極
２６を形成する。その後、フォトレジストマスク及びポ
リシリコン電極２６をマスクとして不純物イオンの注入
を行なって、第１，第２ｎ型拡散層２７ａ，２７ｂを形
成する。
のパターニングを行なって電極間絶縁膜となるシリコン
酸化膜２５及び制御ゲート電極となるポリシリコン電極
２６を形成する。その後、フォトレジストマスク及びポ
リシリコン電極２６をマスクとして不純物イオンの注入
を行なって、第１，第２ｎ型拡散層２７ａ，２７ｂを形
成する。
【０１６５】その後、周知の方法により、層間絶縁膜２
８の形成と、層間絶縁膜２８へのコンタクトホール２９
の開口と、コンタクトホール２９内へのタングステンの
埋め込みによるタングステンプラグ３０の形成と、第
１，第２アルミニウム配線３１ａ，３１ｂの形成とを行
なう。
８の形成と、層間絶縁膜２８へのコンタクトホール２９
の開口と、コンタクトホール２９内へのタングステンの
埋め込みによるタングステンプラグ３０の形成と、第
１，第２アルミニウム配線３１ａ，３１ｂの形成とを行
なう。
【０１６６】本実施形態のメモリセルは、制御ゲートと
して機能するポリシリコン電極２６と、ソースもしくは
ドレインとして機能する第１，第２ｎ型拡散層２７ａ，
２７ｂとからなるＭＯＳトランジスタ（メモリトランジ
スタ）を備え、フローティングゲートとして機能するド
ット体２４に蓄えられた電荷の量で上記メモリトランジ
スタの閾値電圧が変化することを利用した不揮発性メモ
リセルである。この不揮発性メモリセルは、二値を記憶
するメモリとしての機能が得られるが、ドット体２４に
蓄えられる電荷の有無のみだけでなく電荷の蓄積量を制
御することで、三値以上の多値メモリを実現することも
できる。
して機能するポリシリコン電極２６と、ソースもしくは
ドレインとして機能する第１，第２ｎ型拡散層２７ａ，
２７ｂとからなるＭＯＳトランジスタ（メモリトランジ
スタ）を備え、フローティングゲートとして機能するド
ット体２４に蓄えられた電荷の量で上記メモリトランジ
スタの閾値電圧が変化することを利用した不揮発性メモ
リセルである。この不揮発性メモリセルは、二値を記憶
するメモリとしての機能が得られるが、ドット体２４に
蓄えられる電荷の有無のみだけでなく電荷の蓄積量を制
御することで、三値以上の多値メモリを実現することも
できる。
【０１６７】データの消去の際には、酸化膜を介したＦ
Ｎ（Fowler-Nordheim ）電流や直接トンネリング電流を
利用する。
Ｎ（Fowler-Nordheim ）電流や直接トンネリング電流を
利用する。
【０１６８】また、データの書き込みには、酸化膜を介
したＦＮ電流や直接トンネリング電流あるいはチャネル
ホットエレクトロン（ＣＨＥ）注入を用いる。
したＦＮ電流や直接トンネリング電流あるいはチャネル
ホットエレクトロン（ＣＨＥ）注入を用いる。
【０１６９】本実施形態の不揮発性メモリセルによる
と、フローティングゲートが量子ドットとして機能でき
る程度に粒径の小さい金微粒子により構成されているの
で、電荷の蓄積量がわずかである。したがって、書き込
み，消去の際の電流量を小さくでき、低消費電力の不揮
発性メモリセルを構成することができる。
と、フローティングゲートが量子ドットとして機能でき
る程度に粒径の小さい金微粒子により構成されているの
で、電荷の蓄積量がわずかである。したがって、書き込
み，消去の際の電流量を小さくでき、低消費電力の不揮
発性メモリセルを構成することができる。
【０１７０】また、本実施形態の不揮発性メモリセルに
おいて、フローティングゲートを構成する金微粒子のサ
イズが均一であるため、電荷の注入、引き抜きの際の特
性が各金微粒子間で揃っており、これらの操作において
制御が容易に行えるようになる。
おいて、フローティングゲートを構成する金微粒子のサ
イズが均一であるため、電荷の注入、引き抜きの際の特
性が各金微粒子間で揃っており、これらの操作において
制御が容易に行えるようになる。
【０１７１】また、上記ドット体２４は、互いに接触し
ながら連続的につまり全体として膜を構成するような状
態で形成されていてもよいし、互いに離れて分散的に形
成されていてもよい。本実施形態においては、金微粒子
を包含するアポフェリチンを用いているので、基板の所
望の部分に疎水処理を施してからアポフェリチンを配置
させるなどの方法により、このような微細なドット体パ
ターンを容易に形成することができる。
ながら連続的につまり全体として膜を構成するような状
態で形成されていてもよいし、互いに離れて分散的に形
成されていてもよい。本実施形態においては、金微粒子
を包含するアポフェリチンを用いているので、基板の所
望の部分に疎水処理を施してからアポフェリチンを配置
させるなどの方法により、このような微細なドット体パ
ターンを容易に形成することができる。
【０１７２】尚、本実施形態では、ドット体の構成材料
として金を用いたが、これに代えて白金を用いてもよ
い。金内包アポフェリチンに代えて第１の実施形態にお
いて作製される白金内包アポフェリチンを用いること
で、直径が約６ｎｍの均一サイズの白金からなるドット
体を形成することができる。この場合も、金内包アポフ
ェリチンを用いたときと同様に、ドット体の還元工程が
不要という利点がある。
として金を用いたが、これに代えて白金を用いてもよ
い。金内包アポフェリチンに代えて第１の実施形態にお
いて作製される白金内包アポフェリチンを用いること
で、直径が約６ｎｍの均一サイズの白金からなるドット
体を形成することができる。この場合も、金内包アポフ
ェリチンを用いたときと同様に、ドット体の還元工程が
不要という利点がある。
【０１７３】（第４の実施形態）本実施形態として、第
１の実施形態の金内包アポフェリチンを利用して金粒子
を基板上に配置させ、この金粒子をエッチングマスクと
して使用する方法について述べる。
１の実施形態の金内包アポフェリチンを利用して金粒子
を基板上に配置させ、この金粒子をエッチングマスクと
して使用する方法について述べる。
【０１７４】図７（ａ）−（ｃ）は、金粒子をマスクと
して微小構造体を形成する方法を示す断面図である。
して微小構造体を形成する方法を示す断面図である。
【０１７５】まず、図７（ａ）に示す工程で、第２の実
施形態と同様の方法により、シリコン基板３４上に金内
包アポフェリチンを所望の位置に配置させた後、熱処理
することにより、タンパク質からなる外殻を除去する。
これにより、直径約６ｎｍの金粒子３３が基板３４上に
残る。
施形態と同様の方法により、シリコン基板３４上に金内
包アポフェリチンを所望の位置に配置させた後、熱処理
することにより、タンパク質からなる外殻を除去する。
これにより、直径約６ｎｍの金粒子３３が基板３４上に
残る。
【０１７６】ここで、金を内包したアポフェリチンを用
いることにより、金属酸化物内包アポフェリチンを用い
たときに行なう還元工程が不要になる。
いることにより、金属酸化物内包アポフェリチンを用い
たときに行なう還元工程が不要になる。
【０１７７】続いて、図７（ｂ）に示す工程で、ＳＦ6
ガスを用いて、シリコン基板３４に対し、５分間イオン
反応性エッチング（ＲＩＥ）を行なうことにより、シリ
コン基板３４が選択的に削られる。これは、金粒子３３
がシリコン基板３４に比べエッチングされにくいためで
ある。
ガスを用いて、シリコン基板３４に対し、５分間イオン
反応性エッチング（ＲＩＥ）を行なうことにより、シリ
コン基板３４が選択的に削られる。これは、金粒子３３
がシリコン基板３４に比べエッチングされにくいためで
ある。
【０１７８】次に、図７（ｃ）に示す工程で、さらにエ
ッチングが進むと最終的には金粒子３３も除去され、所
望のパターンを施されたシリコン基板３４が残る。本実
施形態の方法により、上面の直径が約６ｎｍで均一な微
細柱状のパターン（以下「微細柱状のパターン」を「微
細柱」と称する）を基板上に正確に形成することができ
る。つまり、従来困難であったサイズが均一で且つ微細
な構造体の形成（すなわち、微小構造体の精密加工）が
本実施形態の方法により可能となる。
ッチングが進むと最終的には金粒子３３も除去され、所
望のパターンを施されたシリコン基板３４が残る。本実
施形態の方法により、上面の直径が約６ｎｍで均一な微
細柱状のパターン（以下「微細柱状のパターン」を「微
細柱」と称する）を基板上に正確に形成することができ
る。つまり、従来困難であったサイズが均一で且つ微細
な構造体の形成（すなわち、微小構造体の精密加工）が
本実施形態の方法により可能となる。
【０１７９】本実施形態の方法により形成された微小構
造体は、例えば後述する量子効果を利用した発光素子等
に利用することができる。
造体は、例えば後述する量子効果を利用した発光素子等
に利用することができる。
【０１８０】尚、本実施形態においては、エッチングマ
スクとして金粒子を用いたが、これに代えて白金粒子を
用いることもできる。このためには、工程（ａ）におい
て、金内包アポフェリチンに代えて、第１の実施形態の
白金内包アポフェリチンを用いればよい。
スクとして金粒子を用いたが、これに代えて白金粒子を
用いることもできる。このためには、工程（ａ）におい
て、金内包アポフェリチンに代えて、第１の実施形態の
白金内包アポフェリチンを用いればよい。
【０１８１】尚、状況によってはＦｅを内包するフェリ
チン及びＮｉ、Ｃｏなどを内包するアポフェリチンを用
いても還元工程が不要であることがあるが、本実施形態
の貴金属内包アポフェリチンを用いることにより、いず
れの状況下でも、還元工程を省くことができる。
チン及びＮｉ、Ｃｏなどを内包するアポフェリチンを用
いても還元工程が不要であることがあるが、本実施形態
の貴金属内包アポフェリチンを用いることにより、いず
れの状況下でも、還元工程を省くことができる。
【０１８２】尚、本実施形態の工程（ａ）において、金
内包アポフェリチンの外殻を除去するために熱処理を用
いたが、これに代えてオゾン分解あるいは臭化シアン
（ＣＮＢｒ）による化学分解を用いてもよい。
内包アポフェリチンの外殻を除去するために熱処理を用
いたが、これに代えてオゾン分解あるいは臭化シアン
（ＣＮＢｒ）による化学分解を用いてもよい。
【０１８３】（第５の実施形態）第５の実施形態とし
て、第４の実施形態の加工方法により形成された微細柱
を用いて、江利口らにより報告された特開平０８−０８
３９４０号公報に記載の光半導体装置を製造する方法に
ついて以下に説明する。
て、第４の実施形態の加工方法により形成された微細柱
を用いて、江利口らにより報告された特開平０８−０８
３９４０号公報に記載の光半導体装置を製造する方法に
ついて以下に説明する。
【０１８４】図８は第４の実施形態により形成された上
面の直径が６ｎｍの半導体微細柱を用いた光半導体装置
の断面図である。
面の直径が６ｎｍの半導体微細柱を用いた光半導体装置
の断面図である。
【０１８５】まず、第４の実施形態において、基板とし
てｎ型シリコンの一部にｐ型ウェル５１が形成され、さ
らにｐ型ウェル５１上にｎ型ウェルを形成したものを用
いる。この基板を第４の実施形態の方法により加工し、
ｎ型シリコンからなる半導体微細柱４２を高密度で形成
する。
てｎ型シリコンの一部にｐ型ウェル５１が形成され、さ
らにｐ型ウェル５１上にｎ型ウェルを形成したものを用
いる。この基板を第４の実施形態の方法により加工し、
ｎ型シリコンからなる半導体微細柱４２を高密度で形成
する。
【０１８６】次に、熱酸化法により半導体微細柱４２の
側面をシリコン酸化膜からなる絶縁層４３で覆った後、
半導体微細柱４２間の隙間を絶縁層４３で埋め、その先
端面を平坦化する。
側面をシリコン酸化膜からなる絶縁層４３で覆った後、
半導体微細柱４２間の隙間を絶縁層４３で埋め、その先
端面を平坦化する。
【０１８７】さらに、絶縁層４３のうち平坦化された半
導体微細柱４２先端部の表面の絶縁層を除去し、その上
に透明電極４４を形成する。
導体微細柱４２先端部の表面の絶縁層を除去し、その上
に透明電極４４を形成する。
【０１８８】尚、シリコン基板４１上の量子化領域Ｒｑ
ａの側方はあらかじめ形成された絶縁分離層４９によっ
て他の領域と区画されている。また、絶縁分離層４９を
貫通する側方電極５０も前もって形成され、各半導体微
細柱４２の上部電極である透明電極４４に対し下部電極
として機能するシリコン基板４１に接続されている。
ａの側方はあらかじめ形成された絶縁分離層４９によっ
て他の領域と区画されている。また、絶縁分離層４９を
貫通する側方電極５０も前もって形成され、各半導体微
細柱４２の上部電極である透明電極４４に対し下部電極
として機能するシリコン基板４１に接続されている。
【０１８９】これにより、光半導体装置が形成され、透
明電極４４と側方電極５０との間に順方向の電圧を印加
すると、室温でエレクトロルミネッセンスが生じる。さ
らに、キャリア注入電圧を変化させることにより、赤、
青、黄色、それぞれの発光に対応した可視光のエレクト
ロルミネッセンスが生じる。
明電極４４と側方電極５０との間に順方向の電圧を印加
すると、室温でエレクトロルミネッセンスが生じる。さ
らに、キャリア注入電圧を変化させることにより、赤、
青、黄色、それぞれの発光に対応した可視光のエレクト
ロルミネッセンスが生じる。
【０１９０】本実施形態によれば、これまで実施が困難
であった高い発光効率を持った光半導体装置を実現する
ことができる。
であった高い発光効率を持った光半導体装置を実現する
ことができる。
【０１９１】（その他の実施形態）第１の実施形態の金
−アポフェリチン複合体の作製過程において、外表面上
と保持部の両方に金粒子を保持する金−アポフェリチン
複合体が少量得られる。
−アポフェリチン複合体の作製過程において、外表面上
と保持部の両方に金粒子を保持する金−アポフェリチン
複合体が少量得られる。
【０１９２】図９は、外表面上と保持部の両方に金粒子
を保持する金−アポフェリチン複合体を示す図である。
同図で、保持部に保持されている第１の金粒子６１の直
径は約６ｎｍ、アポフェリチンの外表面上に形成されて
いる第２の金粒子６２の大きさはばらつきがあるが、少
なくともアポフェリチンに内包される第１の金粒子６１
よりもサイズが大きい。また、保持部に保持されている
第１の金粒子６１はアポフェリチンの外殻６３で囲まれ
ている。
を保持する金−アポフェリチン複合体を示す図である。
同図で、保持部に保持されている第１の金粒子６１の直
径は約６ｎｍ、アポフェリチンの外表面上に形成されて
いる第２の金粒子６２の大きさはばらつきがあるが、少
なくともアポフェリチンに内包される第１の金粒子６１
よりもサイズが大きい。また、保持部に保持されている
第１の金粒子６１はアポフェリチンの外殻６３で囲まれ
ている。
【０１９３】この金−アポフェリチン複合体をシリコン
基板等の上に、第２の金粒子６２が上にくるように膜状
に配置する。
基板等の上に、第２の金粒子６２が上にくるように膜状
に配置する。
【０１９４】この基板をさらに加工し、第１の金粒子６
１及び第２の金粒子６２をフローティングゲートとして
有するダブルドットタイプの不揮発メモリセルを作製す
ることができる。この不揮発メモリセルは、データの保
持時間が長いことが特徴であるが、これは、サイズが異
なる粒子では電荷の入りやすさ及び放出しやすさが互い
に違うため、入力された情報を電荷を放出しにくい方の
金粒子に保持しておけるからである。ここで、金−アポ
フェリチン複合体を用いることで、保持時間の長い不揮
発メモリセルを容易に作成することができる。
１及び第２の金粒子６２をフローティングゲートとして
有するダブルドットタイプの不揮発メモリセルを作製す
ることができる。この不揮発メモリセルは、データの保
持時間が長いことが特徴であるが、これは、サイズが異
なる粒子では電荷の入りやすさ及び放出しやすさが互い
に違うため、入力された情報を電荷を放出しにくい方の
金粒子に保持しておけるからである。ここで、金−アポ
フェリチン複合体を用いることで、保持時間の長い不揮
発メモリセルを容易に作成することができる。
【０１９５】また、アポフェリチンを用いることによ
り、ナノメーターサイズの金粒子をフローティングゲー
トとして使用することができるので、メモリセルを微細
化することもできる。
り、ナノメーターサイズの金粒子をフローティングゲー
トとして使用することができるので、メモリセルを微細
化することもできる。
【０１９６】また、本実施形態では金−アポフェリチン
複合体のみを用いたが、他の金属とアポフェリチンとの
複合体を金−アポフェリチン複合体と組み合わせて使用
することにより、準位の異なったドットを作製すること
ができ、保持時間の長い不揮発メモリを容易に作成する
ことができる。
複合体のみを用いたが、他の金属とアポフェリチンとの
複合体を金−アポフェリチン複合体と組み合わせて使用
することにより、準位の異なったドットを作製すること
ができ、保持時間の長い不揮発メモリを容易に作成する
ことができる。
【０１９７】尚、本実施形態において、外表面上と保持
部とに金を保持するアポフェリチンの代わりに外表面上
と保持部とに白金を保持するアポフェリチンを用いても
よいし、これと金を保持するアポフェリチンとを組み合
わせて使用してもよい。
部とに金を保持するアポフェリチンの代わりに外表面上
と保持部とに白金を保持するアポフェリチンを用いても
よいし、これと金を保持するアポフェリチンとを組み合
わせて使用してもよい。
【０１９８】
【発明の効果】本発明の組み換えアポフェリチン及びそ
の作製方法、貴金属−組み換えアポフェリチン複合体及
びその作製方法によれば、遺伝子組み換え技術を用いて
内部構造を改質することにより、アポフェリチン内に貴
金属原子を導入することができ、ひいては、各種の微細
構造に適用可能な貴金属粒子を形成することが可能とな
る。また、本発明の大腸菌及び組み換え遺伝子を用いる
ことにより、上記の組み換えアポフェリチンを効率よく
得ることができる。
の作製方法、貴金属−組み換えアポフェリチン複合体及
びその作製方法によれば、遺伝子組み換え技術を用いて
内部構造を改質することにより、アポフェリチン内に貴
金属原子を導入することができ、ひいては、各種の微細
構造に適用可能な貴金属粒子を形成することが可能とな
る。また、本発明の大腸菌及び組み換え遺伝子を用いる
ことにより、上記の組み換えアポフェリチンを効率よく
得ることができる。
【０１９９】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> Matsushita Electric Industrial Co., Ltd.
<120> 組み換えかご状タンパク質、その作製方法、貴金属−組み換えかご状タン
パク質複合体、その作製方法、及び組み換えＤＮＡ
<130> Apoferritin DNA PRT
<150> JP P2001-142983
<151> 2001-05-14
<160> 2
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 504
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> Description of Artificial Sequence:Recombinant DNA
of Liver Apoferritin of Equus cebellus
<400> 1
tattctactg aagtggaggc cgccgtcaac cgcctggtca acctgtacct gcgggcctcc 60
tacacctacc tctctctggg cttctatttc gaccgcgacg atgtggctct ggagggcgta 120
tgccacttct tccgctgctt ggcggagaag aagcgcaagg gtgccaagtg cctcttgaag 180
atgcaaaacc agcgcggcgg ccgcgccctc ttccagagct tgtccaagcc gtcccaggat 240
gaatggggta caaccccgga tgccatgaaa gccgccattg tcctggagaa gagcctgaac 300
caggcccttt tggatctgca tgccctgggt tctgcccagg cagaccccca tctctgtagc 360
ttcttgtcta gccacttcct agacgaggag gtgaaactca tcaagaagat gggcgaccat 420
ctgaccaaca tccagaggct cgttggctcc caagctgggc tgggcgagta tctctttgaa 480
aggctcactc tcaagcacga ctaa 504
<210> 2
<211> 167
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<223> Description of Artificial Sequence:Recombinant Liver Apoferritin
of Equus cebellus
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (46)
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (50)
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (53)
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (56)
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (57)
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (120)
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (123)
<400> 2
Tyr Ser Thr Glu Val Glu Ala Ala Val Asn Arg Leu Val Asn Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Arg Ala Ser Tyr Thr Tyr Leu Ser Leu Gly Phe Tyr Phe Asp Arg
20 25 30
Asp Asp Val Ala Leu Glu Gly Val Cys His Phe Phe Arg Cys Leu Ala
35 40 45
Glu Lys Lys Arg Lys Gly Ala Lys Cys Leu Leu Lys Met Gln Asn Gln
50 55 60
Arg Gly Gly Arg Ala Leu Phe Gln Asp Leu Gln Lys Pro Ser Gln Asp
65 70 75 80
Glu Trp Gly Thr Thr Pro Asp Ala Met Lys Ala Ala Ile Val Leu Glu
85 90 95
Lys Ser Leu Asn Gln Ala Leu Leu Asp Leu His Ala Leu Gly Ser Ala
100 105 110
Gln Ala Asp Pro His Leu Cys Ser Phe Leu Ser Ser His Phe Leu Asp
115 120 125
Glu Glu Val Lys Leu Ile Lys Lys Met Gly Asp His Leu Thr Asn Ile
130 135 140
Gln Arg Leu Val Gly Ser Gln Ala Gly Leu Gly Glu Tyr Leu Phe Glu
145 150 155 160
Arg Leu Thr Leu Lys His Asp
165
【図１】フェリチンの構造を模式的に示す図である。
【図２】（ａ）−（ｃ）は、本発明の第１の実施形態に
係る組み換えアポフェリチンを模式的に示す断面図であ
る。
係る組み換えアポフェリチンを模式的に示す断面図であ
る。
【図３】基板上に配置された金内包アポフェリチンを模
式的に示す図である。
式的に示す図である。
【図４】基板上に配置された金内包アポフェリチンの電
子顕微鏡写真を示す図である。
子顕微鏡写真を示す図である。
【図５】本発明の第２の実施形態に係るヌクレオチド検
出装置を概略的に示す図である。
出装置を概略的に示す図である。
【図６】本発明の第３の実施形態に係る，金粒子からな
るドット体をフローティングゲートとして利用した不揮
発性メモリセルの構造を示す断面図である。
るドット体をフローティングゲートとして利用した不揮
発性メモリセルの構造を示す断面図である。
【図７】（ａ）−（ｃ）は、本発明の第４の実施形態に
係る微小構造体の形成工程を示す断面図である。
係る微小構造体の形成工程を示す断面図である。
【図８】本発明の第５の実施形態に係り、第４の実施形
態において形成された微小構造体形を利用した光半導体
装置の断面図である。
態において形成された微小構造体形を利用した光半導体
装置の断面図である。
【図９】本発明により形成された、外表面と保持部の両
方に貴金属粒子を保持する金−アポフェリチン複合体を
模式的に示す図である。
方に貴金属粒子を保持する金−アポフェリチン複合体を
模式的に示す図である。
１ 核
２ 外殻
３ チャネル
４ 保持部
７ クロロ金酸イオン（ＡｕＣｌ4）-
７’ 金（Ａｕ）原子
１０ ヌクレオチド検出装置
１１ 基板
１２ 金粒子
１３ チオールＤＮＡ
１５ 金内包アポフェリチン
２１ ｐ型Ｓｉ基板
２２ 素子分離酸化膜
２３ ゲート酸化膜
２４ ドット体
２５ シリコン酸化膜
２６ ポリシリコン電極
２７ａ 第１のｎ型拡散層
２７ｂ 第２のｎ型拡散層
２８ 層間絶縁膜
２９ コンタクトホール
３０ タングステンプラグ
３１ａ 第１のアルミニウム配線
３１ｂ 第２のアルミニウム配線
３３ 金粒子
３４ シリコン基板
４１ シリコン基板
４２ 半導体微細柱
４３ 絶縁層
４４ 透明電極
４９ 絶縁分離層
５０ 側方電極
５１ ｐ型ウェル
Ｒｑａ 量子化領域
６１ 第１の金粒子
６２ 第２の金粒子
６３ 外殻
Claims (34)
- 【請求項１】 遺伝子組み換え技術により作製された組
み換えかご状タンパク質であって、 上記組み換えかご状タンパク質の内部にあり貴金属粒子
を保持可能な保持部と、 上記保持部と上記組み換えかご状タンパク質の外部とを
結ぶトンネル状のチャネルとを備えた組み換えかご状タ
ンパク質。 - 【請求項２】 請求項１に記載の組み換えかご状タンパ
ク質において、 上記組み換えかご状タンパク質は、アポフェリチンであ
ることを特徴とする組み換えかご状タンパク質。 - 【請求項３】 請求項１または２に記載の組み換えかご
状タンパク質において、 上記貴金属粒子は金または白金であることを特徴とする
組み換えかご状タンパク質。 - 【請求項４】 請求項１〜３のうちいずれか１つに記載
の組み換えかご状タンパク質において、 上記チャネルの内表面における、第１のグルタミン酸
（Ｇｌｕ）及び第１のアスパラギン酸（Ａｓｐ）の存在
すべき位置に、分子サイズがグルタミン酸及びアスパラ
ギン酸よりも小さい第１の中性アミノ酸を備えているこ
とを特徴とする組み換えかご状タンパク質。 - 【請求項５】 請求項４に記載の組み換えかご状タンパ
ク質において、 上記第１の中性アミノ酸がセリン（Ｓｅｒ），アラニン
（Ａｌａ），グリシン（Ｇｌｙ）のうちから選ばれるこ
とを特徴とする組み換えかご状タンパク質。 - 【請求項６】 請求項１〜５のうちいずれか１つに記載
の組み換えかご状タンパク質において、 上記保持部の内表面における、第２のグルタミン酸の存
在すべき位置に、塩基性アミノ酸または第２の中性アミ
ノ酸をさらに備えていることを特徴とする組み換えかご
状タンパク質。 - 【請求項７】 請求項６に記載の組み換えかご状タンパ
ク質において、 上記塩基性アミノ酸または上記第２の中性アミノ酸が、
アルギニン（Ａｒｇ），リジン（Ｌｙｓ），アラニン
（Ａｌａ）のうちから選ばれることを特徴とする組み換
えかご状タンパク質。 - 【請求項８】 請求項１〜７のうちいずれか１つに記載
の組み換えかご状タンパク質において、 上記保持部の内表面には、アミノ酸と置換された１つ以
上のシステイン（Ｃｙｓ）が存在することを特徴とする
組み換えかご状タンパク質。 - 【請求項９】 請求項１〜８のうちいずれか１つに記載
の組み換えかご状タンパク質において、 上記組み換えかご状タンパク質の外表面には、システイ
ンの存在すべき位置に、当該システインよりも還元機能
が小さい物質を備えていることを特徴とする組み換えか
ご状タンパク質。 - 【請求項１０】 貴金属粒子と組み換えかご状タンパク
質とから構成される貴金属−組み換えかご状タンパク質
複合体であって、 上記組み換えかご状タンパク質は、貴金属粒子を保持可
能な保持部と、上記保持部と上記組み換えかご状タンパ
ク質の外部とを結ぶトンネル状のチャネルとを備えてい
る貴金属−組み換えかご状タンパク質複合体。 - 【請求項１１】 請求項１０に記載の貴金属−組み換え
かご状タンパク質複合体において、 上記組み換えかご状タンパク質は、アポフェリチンであ
ることを特徴とする貴金属−組み換えかご状タンパク質
複合体。 - 【請求項１２】 請求項１０または１１に記載の貴金属
−組み換えかご状タンパク質複合体において、 外表面上に金または白金粒子を保持していることを特徴
とする貴金属−組み換えかご状タンパク質複合体。 - 【請求項１３】 請求項１０〜１２のうちいずれか１つ
に記載の貴金属−組み換えかご状タンパク質複合体にお
いて、 上記チャネルの内表面における、第１のグルタミン酸及
び第１のアスパラギン酸の存在すべき位置に、分子サイ
ズがグルタミン酸及びアスパラギン酸よりも小さい第１
の中性アミノ酸を備えていることを特徴とする貴金属−
組み換えかご状タンパク質複合体。 - 【請求項１４】 請求項１３に記載の貴金属−組み換え
かご状タンパク質複合体において、 上記第１の中性アミノ酸がセリン，アラニン，グリシン
のうちから選ばれることを特徴とする貴金属−組み換え
かご状タンパク質複合体。 - 【請求項１５】 請求項１０〜１４のうちいずれか１つ
に記載の貴金属−組み換えかご状タンパク質複合体にお
いて、上記保持部の内表面における、第２のグルタミン
酸の存在すべき位置に、塩基性アミノ酸または第２の中
性アミノ酸をさらに備えていることを特徴とする貴金属
−組み換えかご状タンパク質複合体。 - 【請求項１６】 請求項１５に記載の貴金属−組み換え
かご状タンパク質複合体において、 上記塩基性アミノ酸または上記第２の中性アミノ酸が、
アルギニン，リジン，アラニンのうちから選ばれること
を特徴とする貴金属−組み換えかご状タンパク質複合
体。 - 【請求項１７】 請求項１０〜１６のうちいずれか１つ
に記載の貴金属−組み換えかご状タンパク質複合体にお
いて、 上記保持部の内表面には、アミノ酸と置換された１つ以
上のシステインが存在することを特徴とする貴金属−組
み換えかご状タンパク質複合体。 - 【請求項１８】 貴金属粒子を保持可能な保持部と、上
記保持部と上記組み換えかご状タンパク質の外部とを結
ぶトンネル状のチャネルとを有する組み換えかご状タン
パク質のアミノ酸配列をコードする組み換えＤＮＡ。 - 【請求項１９】 請求項１８に記載の組み換えＤＮＡで
あって、 上記組み換えかご状タンパク質は、アポフェリチンであ
ることを特徴とする組み換えＤＮＡ。 - 【請求項２０】 請求項１８または１９に記載の組み換
えＤＮＡにおいて、 上記貴金属粒子は金または白金であることを特徴とする
組み換えＤＮＡ。 - 【請求項２１】 請求項１８〜２０のうちいずれか１つ
に記載の組み換えＤＮＡにおいて、 上記チャネルの内表面における、第１のグルタミン酸及
び第１のアスパラギン酸の存在すべき位置に、分子サイ
ズがグルタミン酸及びアスパラギン酸よりも小さい第１
の中性アミノ酸を備えていることを特徴とする組み換え
ＤＮＡ。 - 【請求項２２】 請求項２１に記載の組み換えＤＮＡに
おいて、 上記第１の中性アミノ酸がセリン，アラニン，グリシン
のうちから選ばれることを特徴とする組み換えＤＮＡ。 - 【請求項２３】 請求項１８〜２２のうちいずれか１つ
に記載の組み換えＤＮＡにおいて、 上記保持部の内表面における、第２のグルタミン酸の存
在すべき位置に、塩基性アミノ酸または第２の中性アミ
ノ酸をさらに備えていることを特徴とする組み換えＤＮ
Ａ。 - 【請求項２４】 請求項２３に記載の組み換えＤＮＡに
おいて、 上記塩基性アミノ酸または上記第２の中性アミノ酸が、
アルギニン，リジン，アラニンのうちから選ばれること
を特徴とする組み換えＤＮＡ。 - 【請求項２５】 請求項１８〜２４のうちいずれか１つ
に記載の組み換えＤＮＡにおいて、 上記保持部の内表面には、アミノ酸と置換された１つ以
上のシステインが存在することを特徴とする組み換えＤ
ＮＡ。 - 【請求項２６】 チャネルの内表面に位置する第１のグ
ルタミン酸及び第１のアスパラギン酸を、分子サイズが
グルタミン酸及びアスパラギン酸よりも小さい第１の中
性アミノ酸に置換する工程（ａ）を含む組み換えかご状
タンパク質の作製方法。 - 【請求項２７】 請求項２６に記載の組み換えかご状タ
ンパク質の作製方法において、 上記組み換えかご状タンパク質はアポフェリチンである
ことを特徴とする組み換えかご状タンパク質の作製方
法。 - 【請求項２８】 請求項２６または２７に記載の組み換
えかご状タンパク質の作製方法において、 上記工程（ａ）では、上記第１の中性アミノ酸が、セリ
ン，アラニン，グリシンのうちから選ばれることを特徴
とする組み換えかご状タンパク質の作製方法。 - 【請求項２９】 請求項２６〜２８のうちいずれか１つ
に記載の組み換えかご状タンパク質の作製方法におい
て、 上記組み換えかご状タンパク質内部にある保持部の内表
面に存在する第２のグルタミン酸を、塩基性アミノ酸ま
たは第２の中性アミノ酸に置換する工程（ｂ）をさらに
含むことを特徴とする組み換えかご状タンパク質の作製
方法。 - 【請求項３０】 請求項２６〜２９のうちいずれか１つ
に記載の組み換えかご状タンパク質の作製方法におい
て、 上記工程（ｂ）では、上記塩基性アミノ酸または上記第
２の中性アミノ酸が、アルギニン，リジン，アラニンの
うちから選ばれることを特徴とする組み換えかご状タン
パク質の作製方法。 - 【請求項３１】 請求項２６〜３０のうちいずれか１つ
に記載の組み換えかご状タンパク質の作製方法におい
て、 上記保持部の内表面に位置する１つ以上のアミノ酸をシ
ステインに置換する工程（ｃ）をさらに含むことを特徴
とする組み換えかご状タンパク質の作製方法。 - 【請求項３２】 請求項２６〜３１のうちいずれか１つ
に記載の組み換えかご状タンパク質の作製方法におい
て、 上記組み換えかご状タンパク質の外表面に位置する１つ
以上のシステインを当該システインよりも還元機能が小
さい物質に代える工程（ｄ）をさらに含むことを特徴と
する組み換えかご状タンパク質の作製方法。 - 【請求項３３】 貴金属の錯体イオン溶液と、組み換え
かご状タンパク質溶液とを混合することにより、貴金属
−組み換えかご状タンパク質複合体を形成する工程
（ａ）と、 上記工程（ａ）において調製された貴金属−組み換えか
ご状タンパク質複合体を含む溶液をゲルろ過カラムに通
すことにより、貴金属−組み換えかご状タンパク質複合
体を精製する工程（ｂ）とを含む貴金属−組み換えかご
状タンパク質複合体の作製方法。 - 【請求項３４】 請求項３３に記載の貴金属−組み換え
かご状タンパク質複合体の作製方法において、 上記工程（ａ）における上記貴金属は、金または白金で
あることを特徴とする貴金属−組み換えかご状タンパク
質複合体の作製方法。
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| JP2002127922A JP3719665B2 (ja) | 2001-05-14 | 2002-04-30 | 組み換えかご状タンパク質および貴金属−組み換えかご状タンパク質複合体 |
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2002
- 2002-04-30 JP JP2002127922A patent/JP3719665B2/ja not_active Expired - Fee Related
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