JP3756928B2 - 貴金属−組み換えタンパク質複合体を製造する方法 - Google Patents

貴金属−組み換えタンパク質複合体を製造する方法 Download PDF

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Description

本発明は、貴金属−組み換えタンパク質複合体を製造する方法に関する。
近年、バイオテクノロジーとエレクトロニクスを融合させたバイオエレクトロニクスの研究が活発に行われ、酵素等のタンパク質を用いたバイオセンサー等、すでに実用化されているものもある。
そういったバイオテクノロジーを他分野に応用する試みの１つとして、金属化合物を保持する機能を持つタンパク質であるアポフェリチンに金属または金属化合物からなる微粒子を取り込ませ、ｎｍオーダーの均一なサイズの微粒子を作製しようという研究がある。微粒子の用途に応じて種々の金属あるいは金属化合物等をアポフェリチンに導入すべく研究が進められている。
ここで、アポフェリチンについて説明する。アポフェリチンは、生物界に広く存在するタンパク質であり、生体内では必須微量元素である鉄の量を調節する役割を担っている。鉄または鉄化合物とアポフェリチンとの複合体はフェリチンと呼ばれる。鉄は必要以上に体内に存在すると生体にとって有害であるため、余剰の鉄分はこのフェリチンの形で体内に貯蔵される。そして、フェリチンは必要に応じて鉄イオンを放出し、アポフェリチンに戻る。
図１は、フェリチン（鉄−アポフェリチン複合体）の構造を示す模式図である。同図に示すように、フェリチンは、１本のポリペプチド鎖から形成されるモノマーサブユニットが非共有結合により２４個集合した分子量約４６万の球状タンパク質であり、その直径は約１２ｎｍで、通常のタンパク質に比べ高い熱安定性と高いｐＨ安定性を示す。この球状のタンパク質（外殻２）の中心には直径約６ｎｍの空洞状の保持部４があり，外部と保持部４とはチャネル３を介してつながっている。例えば、フェリチンに二価の鉄イオンが取り込まれる際、鉄イオンはチャネル３から入り、一部のサブユニット内にあるferrooxidase center(鉄酸化活性中心)と呼ばれる場所で酸化された後、保持部４に到達し、保持部４の内表面の負電荷領域で濃縮される。そして、鉄原子は３０００〜４０００個集合し、フェリハイドライト（５Ｆｅ2Ｏ3・９Ｈ2Ｏ ）結晶の形で保持部４に保持される。 なお、本明細書中では、保持部に保持された金属原子を含む微粒子を「核」と称する。ここで、図１に示す核１の直径は保持部４の直径とほぼ等しく、約６ｎｍとなっている。
また、この核１は比較的簡単な化学操作で除去され、核１が除かれて外殻２のみとなった粒子は、アポフェリチンと呼ばれる。このアポフェリチンを用いて、人工的に鉄以外の金属や金属化合物を担持させたアポフェリチン−微粒子複合体も作製されている。
現在までに、マンガン（P.Mackle,1993,J.Amer.Chem.Soc.115,8471-8472; F.C.Meldrumら,1995,J.Inorg.Biochem.58,59-68)，ウラン（J.F.Hainfeld,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89,11064-11068)，ベリリウム(D.J.Price,1983, J.Biol.Chem.258,10873-10880)，アルミニウム(J.Fleming,1987,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84,7866-7870)，亜鉛（D.Price and J.G.Joshi,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1982,79,3116-3119)，コバルト（T.Douglas and V.T.Stark,Inorg.Chem.,39,2000,1828-1830）といった金属あるいは金属化合物のアポフェリチンへの導入が報告されている。これらの金属あるいは金属化合物からなる核１の直径も、アポフェリチンの保持部４の直径とほぼ等しく、約６ｎｍとなる。
自然界において、鉄原子を含む核１がフェリチン内に形成される過程の概略は次の通りである。
フェリチン粒子の外部と内部とを結ぶチャネル３（図１参照）の表面には、ｐＨ７−８の条件でマイナス電荷を持つアミノ酸が露出しており、プラス電荷を持っているＦｅ2+イオンは静電相互作用によりチャネル３に取り込まれる。このチャネル３は、１つのアポフェリチンあたり８個存在している。
フェリチンの保持部４の内表面には、チャネル３の内表面と同じく，ｐＨ７−８でマイナス電荷を持つアミノ酸残基であるグルタミン酸残基が多く露出しており、チャネル３から取り込まれたＦｅ2+イオンはferroxidase centerで酸化され、さらに内部の保持部４へと導かれる。そして、静電相互作用により鉄イオンは濃縮されて、フェリハイドライト（５Ｆｅ2Ｏ3・９Ｈ2Ｏ）結晶の核形成が起こる。
その後、順次取り込まれる鉄イオンがこの結晶の核に付着して酸化鉄からなる核が成長し、直径６ｎｍの核１が保持部４内に形成される。以上が、鉄イオンの取り込みと酸化鉄からなる核形成の概略である。
次に、アポフェリチンへ鉄を導入するための操作を以下で説明する。
まず、ＨＥＰＥＳ緩衝液、アポフェリチン溶液、硫酸アンモニウム鉄（Ｆｅ（ＮＨ4）2（ＳＯ4）2）溶液の順に各溶液を混合してフェリチン溶液を作製する。このフェリチン溶液中では、それぞれの最終濃度が、ＨＥＰＥＳ緩衝液は１００ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ７．０）に、アポフェリチンは０．５ｍｇ／ｍＬに、硫酸アンモニウム鉄は５ｍｍｏｌ／Ｌになっている。尚、フェリチンを調製するための操作は、すべて室温にて行ない、攪拌はスターラーにて行なう。
次に、鉄イオンのアポフェリチン内部への取り込み反応及び取り込まれた鉄の酸化反応を完了させるため、フェリチン溶液をそのまま一晩放置する。この操作により、アポフェリチンの保持部に均一な大きさの酸化鉄が導入され、フェリチン（アポフェリチンと微粒子の複合体）が生成される。
次に、フェリチン溶液を容器に入れ、遠心分離機を用いて毎分３，０００回転、１５−３０分の条件で遠心分離し、沈殿を除去する。続いて、沈殿を除去した後の上澄み液をさらに毎分１０，０００回転、３０分の条件で遠心分離し、フェリチンが凝集した不要な集合体を沈殿させてから除去する。このとき、上澄み液中には、フェリチンが分散された状態で存在している。
次に、この上澄み液の溶媒をｐＨ７．０、１００ｍｍｏｌ／ＬのＨＥＰＥＳ緩衝液から１５０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ溶液へと透析により置換して、新たなフェリチン溶液を作製する。ここでのｐＨ調整は特に行わなくてよい。
続いて、このフェリチン溶液を１−１０ｍｇ／ｍＬの任意の濃度に濃縮した後、この溶液に最終濃度が１０ｍｍｏｌ／ＬとなるようにＣｄＳＯ4 を加え、フェリチンを凝集させる。
次に、フェリチン溶液を毎分３，０００回転、２０分の条件で遠心分離し、溶液中のフェリチン凝集体を沈殿させる。その後、溶液の緩衝成分を１５０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌが入ったｐＨ８．０、１０−５０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ緩衝液へと透析により置換する。
次に、フェリチン溶液を濃縮後、ゲルろ過カラムによりフェリチン溶液をろ過することにより、フェリチン粒子の凝集体が除かれ、酸化鉄を内包した単体のフェリチンが得られる。
尚、ここまで鉄イオンのフェリチンへの取り込みメカニズム及び酸化鉄を内包したフェリチンの調製法について述べたが、これまでに導入が報告されている他の金属イオンは、いずれもプラスイオンであることから、これらの金属イオンのアポフェリチンへの取り込みは、鉄イオンとほぼ同じメカニズムで進むと考えられる。よって、他の金属イオンも、基本的に鉄イオンと同様の操作によりアポフェリチン内に導入される。
ところで、アポフェリチンは、それが由来する生物種によって保持可能な粒子のサイズが若干異なる。また、アポフェリチンと類似の構造を有し、内部に無機物微粒子を保持可能な球殻状タンパク質も存在する。この中にはリステリア菌由来のリステリアフェリチンやＤｐｓタンパクなどがある。また、球状でなくても、ＣＣＭＶなどのウイルスの外殻タンパク質等、フェリチンと同様に内部に無機物粒子を保持可能なタンパク質もある。
本明細書中では、このような球殻状タンパク質やウイルスの外殻タンパク質など、内部に無機物微粒子を保持可能なタンパク質を総称して「かご状タンパク質」と称することとする。
これらのかご状タンパク質にも、鉄を含む無機物粒子を保持させることが可能である。その他、関連する先行文献として、Levi, S. et al., Biochem. Journal (1996)317,467-473を挙げることができる。
P.Mackle,1993,J.Amer.Chem.Soc.115,8471-8472; F.C.Meldrumら,1995,J.Inorg.Biochem.58,59-68 J.F.Hainfeld,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89,11064-11068 D.J.Price,1983, J.Biol.Chem.258,10873-10880 J.Fleming,1987,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84,7866-7870 D.Price and J.G.Joshi,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1982,79,3116-3119 T.Douglas and V.T.Stark,Inorg.Chem.,39,2000,1828-1830 Levi, S. et al., Biochem. Journal (1996)317,467-473
しかるに、上述の方法により鉄等の金属イオンを保持したフェリチンを作製することができるが、アポフェリチン及びフェリチンのチャネル３の内表面は全体としてマイナスに帯電しているので、同じマイナスの電荷を持つイオンをアポフェリチン内に取り込ませることは困難であった。
一方、金や白金等は水溶液中では単独でイオン化させることができず、水溶液中では錯体イオンとしてしか存在できないため、通常はクロロ金酸イオン（ＡｕＣｌ4）-や（ＰｔＣｌ4 ）2-のマイナスイオンで利用されることが多い。そのため、従来の技術では、アポフェリチン内に金や白金等の貴金属原子を取り込ませることが困難であった。
本発明の目的は、アポフェリチンなどのかご状タンパク質の内部構造を改質することにより金等の貴金属原子をアポフェリチンなどのかご状タンパク質内に導入し、ひいては、各種の微細構造に適用可能な貴金属粒子を形成することにある。
上記課題を解決する本発明は、貴金属粒子および組み換えアポフェリチンを備えている貴金属−組み換えタンパク質複合体を製造する方法であって、前記組み換えアポフェリチンは前記貴金属粒子を内包しており、前記貴金属粒子は金または白金であり、前記組み換えアポフェリチンはウマ由来であり、前記組み換えアポフェリチンの１番目から８番目までのアミノ酸は欠失しており、前記組み換えアポフェリチンの５８番目のアミノ酸が、塩基性アミノ酸、非極性アミノ酸、または中性アミノ酸に置換されており、前記組み換えアポフェリチンの６１番目のアミノ酸が、塩基性アミノ酸、非極性アミノ酸、または中性アミノ酸に置換されており、前記組み換えアポフェリチンの６４番目のアミノ酸が、塩基性アミノ酸、非極性アミノ酸、または中性アミノ酸に置換されており、前記組み換えアポフェリチンの１２８番目のアミノ酸が、セリン、アラニン、またはグリシンに置換されており、前記組み換えアポフェリチンの１３１番目のアミノ酸が、セリン、アラニン、またはグリシンに置換されており、前記方法は、（ＡｕＣｌ 4 ） - を含む緩衝液または（ＰｔＣｌ 4 ） 2- を含む緩衝液に前記組み換えアポフェリチンを添加する工程を包含する。
本発明の貴金属−組み換えタンパク質複合体を製造する方法によれば、遺伝子組み換え技術を用いてアポフェリチンの内部構造を改質することにより、アポフェリチン内に貴金属原子を導入することができ、ひいては、各種の微細構造に適用可能な貴金属粒子を形成することが可能となる。また、本発明の貴金属−組み換えアポフェリチン複合体に用いられる組み換えアポフェリチンは、大腸菌および組み換え遺伝子を用いることにより効率よく作製される。
（第１の実施形態）
本発明の第１の実施形態について、以下に説明する。
−リコンビナント（組み換え）アポフェリチンの作製−
発明者らは、アポフェリチン内に金（Ａｕ）原子を導入する上で、主に次のような２つのことが障害となっていると考えた。
１つは、クロロ金酸イオン（ＡｕＣｌ4）-とアポフェリチンとの間の静電相互作用である。図１に示すフェリチン（アポフェリチン−鉄複合体）のチャネル３の内表面及び保持部４の内表面には、各々グルタミン酸やアスパラギン酸といったマイナスの電荷を持つアミノ酸が露出している。マイナスイオンである（ＡｕＣｌ4）-のアポフェリチン内への取り込みは、これらのマイナス電荷を持つアミノ酸との間の静電相互作用により阻害されている。
もう１つは、（ＡｕＣｌ4）-のサイズが鉄イオンよりも大きいことである。そのため、アポフェリチンのチャネル３のサイズを広げなければ、（ＡｕＣｌ4）-をチャネル３に取り込むことが物理的に難しい。
これらの問題を解決するため、発明者らは、遺伝子組み換えの手法を用いて以下のようにアポフェリチンの改質を行なった。以下、本明細書中で、「組み換えアポフェリチン」と表記するときは、遺伝子組み換え技術によって変異を導入したアポフェリチンのことを指す。また、本明細書中アミノ酸残基の部位を示すときは、特に指定のない限り、変異の入っていないウマ肝臓由来のアポフェリチンにおける部位を意味する。また、アポフェリチンは２４個のモノマーサブユニットから構成されているため、本明細書中で「アポフェリチンのアミノ酸配列」と書くときは、モノマーサブユニットのアミノ酸配列を意味する。
ウマ肝臓由来のアポフェリチンをコードする遺伝子配列及びアポフェリチンのアミノ酸配列は既知であり、立体構造についても解明されている。ワイルドタイプのアポフェリチンのアミノ酸配列を、配列番号３に記載する。アポフェリチンのモノマーは、１７５残基のアミノ酸残基から構成され、そのうち、１２８番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ）と、１３１番目のグルタミン酸（Ｇｌｕ）とは共にチャネル３の内表面に位置し、５８番目，６１番目及び６４番目の各グルタミン酸は、共に保持部４の内表面に位置している。また、アポフェリチンの１〜８番目のアミノ酸残基は、生体内においてプロセシングを受けて欠失している。
次に、アポフェリチンにおける静電相互作用について説明する。
上述のように、中性の溶液中では、アポフェリチンの保持部４及びチャネル３の内表面には、負電荷を有するアスパラギン酸やグルタミン酸が配置されているため、アポフェリチンの内表面全体の電位Ｖｉｎは、アポフェリチンの外部の電位Ｖｏｕｔに比べて低くなっている。すなわち、ΔＶ＝Ｖｉｎ−Ｖｏｕｔで定義されるアポフェリチンの内外電位差ΔＶは、ΔＶ＜０（ｍＶ）となっている。
ここで、（ＡｕＣｌ4）-は、負電荷を有しているため、アポフェリチン内部の（ＡｕＣｌ4）-濃度をＣｉｎ、溶液中の（ＡｕＣｌ4）-濃度をＣｏｕｔとすると、Ｃｉｎ、Ｃｏｕｔ及びΔＶの関係は次式（１）で表されることが知られている。
Ｃｏｕｔ／Ｃｉｎ＝ｅ-ΔV/kT （１）
式（１）において、ｅは自然対数、ｋはボルツマン定数、Ｔは絶対温度である。この式から、ΔＶを大きくすることで、温度が一定の場合、アポフェリチン内部における（ＡｕＣｌ4）-濃度を指数関数的に増加させられることが分かる。例えば、ΔＶが正の値であるとき、ΔＶが４倍になれば、Ｃｏｕｔ／Ｃｉｎは約８０となる。
一方、アポフェリチンの内表面での（ＡｕＣｌ4）-→Ａｕの還元反応は、アポフェリチン内部の濃度が増加すれば加速される。
本願発明者らは以上の条件を考慮し、溶液中でアポフェリチンの保持部４に金粒子を効率良く生じさせるためには、少なくともＣｉｎが、Ｃｏｕｔの３倍以上であることが必要である、との結論に達した。室温において、この条件を満たすΔＶは約２５（ｍＶ）以上である。特に、十分な速度で保持部４に金粒子を生じさせるためには、ΔＶが約１００（ｍＶ）以上であることが好ましいと考えられた。
ここで、ΔＶは、アポフェリチンの内表面に存在する塩基の電荷を、その位置を考慮して総和することで求められる。例えば、アポフェリチンモノマーにおいて、保持部４に位置するグルタミン酸の３つをリジン（Ｌｙｓ）に置き換えることで、アポフェリチンにおけるΔＶは約２００（ｍＶ）になると試算される。これは、アポフェリチンの保持部４に金粒子を生じさせるのに十分な電位差であると考えられる。
本願発明者らは、以上のような計算に基づいて、以下の金粒子を保持可能な組み換えアポフェリチンを作製した。
図２（ａ）〜（ｃ）は、上述の知見に基づいて作製された組み換えアポフェリチンの構造を模式的に示した図である。
まず、図２（ａ）に示されているのは、配列番号３に記載されたウマ肝臓由来のアポフェリチン（以下、アポフェリチンと略す）において、１２８番目のアスパラギン酸と１３１番目のグルタミン酸の両アミノ酸をセリン（Ｓｅｒ）に置換したものである。ここで、アスパラギン酸あるいはグルタミン酸をセリンに置換しても、アポフェリチンの立体構造は保持することができる。また、アポフェリチンの１〜８番目のアミノ酸は、アポフェリチンの外表面上に突き出ており、２次元結晶化などの高次構造の作製に支障を及ぼすおそれがあるため、欠失させている。この組み換えアポフェリチンを、以下fer-8-serと表記する。
ここで、チャネル３の内表面に存在したマイナス電荷を持つアスパラギン酸及びグルタミン酸が、電荷を持たないセリンに置換されることにより、静電的な反発力がなくなり、マイナス電荷を持つ（ＡｕＣｌ4）-（図２（ａ）の７）がチャネル３内に取り込まれやすくなっている。また、セリン残基はアスパラギン酸残基，グルタミン酸残基の両残基に比べてサイズが小さいため、チャネル内へ（ＡｕＣｌ4）-を取り込む際の物理的な障害が少なくなっている。
次に、図２（ｂ）に示されているのは、fer-8-Serのアミノ酸配列の５８番目，６１番目，６４番目のグルタミン酸をそれぞれアルギニン（Ａｒｇ）に置換した組み換えアポフェリチンである。この組み換えアポフェリチンを、以下fer-8-Ser-Argと表記する。
ここで、アポフェリチンの保持部４の内表面部に存在していた５８番目，６１番目，６４番目のグルタミン酸をプラス電荷を持つアルギニンに置換することにより、チャネル３に取り込まれた（ＡｕＣｌ4）-をアポフェリチンの保持部４へと誘導することが可能になる。このとき、グルタミン酸からアルギニンへ置換しても、アポフェリチンの立体構造は保持される。ここで保持部４へ誘導された（ＡｕＣｌ4）-７は、順次還元されて金（Ａｕ）原子７’となる。なお、５８番目，６１番目，６４番目のグルタミン酸と置き換えるアミノ酸としては、負電荷を持たないものであればよく、塩基性アミノ酸であるＬｙｓのほか、Ａｌａなどの非極性アミノ酸、及び中性アミノ酸などであってもよい。
次に、図２（ｃ）に示されているのは、fer-8-Ser-Argのアミノ酸配列の５４番目のグルタミン酸と６５番目のアルギニンの両方をシステインに置換した組み換えアポフェリチンである。以下、この組み換えアポフェリチンをfer-8-Ser-Arg-Cysと表記する。
ここで、fer-8-Ser-Argのアミノ酸配列の５４番目のグルタミン酸と６５番目のアルギニンとは、アポフェリチンの保持部４の内表面に存在するため、これらのアミノ酸を還元作用を持つシステインに置換することにより、保持部４に取り込まれた（ＡｕＣｌ4）-７を還元して保持部４内に金の微粒子を析出させることができる。これにより、後述の操作により保持部４内に金からなる核１を形成することができる。
尚、上述の組み換えアポフェリチンの作製には、以下に説明するように、公知の遺伝子組み換え技術及びタンパク質の発現方法を用いる。
まず、Takedaらにより作製され、ウマ肝臓由来のアポフェリチンのＤＮＡが組み込まれたプラスミドTakeda99224（S.TakedaらBiochim.Biophys.Acta.,1174,218-220,1993参照)から、適当な制限酵素を用いてアポフェリチンのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片を切り出す。
次に、このＤＮＡ断片をタンパク質発現用のベクタープラスミドであるpMK-2に挿入してアポフェリチン発現用のプラスミドを作製する。
続いて、このアポフェリチン発現用のプラスミドを鋳型とし、所望の変異を組み込んだ１本鎖ＤＮＡの断片をプライマーとしてＰＣＲ（polymerase chain reaction）を行ない、アポフェリチンのアミノ酸をコードするＤＮＡの目的の位置に部位特異的に所望の変異を導入する。こうしてアポフェリチンの１〜８番目までのアミノ酸をコードする部分のＤＮＡを欠失させた変異アポフェリチン遺伝子のＤＮＡの断片を含むプラスミドを作製する。このアポフェリチン遺伝子のＤＮＡ断片は、必要な場合には切り出し、別のベクタープラスミドに組み込んでもよい。
続いて、作製されたプラスミドを市販の大腸菌（E.coliの１種、Nova Blue）に導入し、形質転換を行なった後、この大腸菌をジャーファーメンター（大量培養装置）を用いて３７℃にて大量培養する。なお、形質転換された大腸菌はアンピシリンに耐性を持つため、これを指標として形質転換されていない大腸菌と区別し、選択することができる。
この大腸菌内では、プラスミドに組み込まれた組み換えアポフェリチンのＤＮＡが発現し、１〜８番目までのアミノ酸残基が欠失したアポフェリチン（以下fer-8と表記する）が大量に生産されている。fer-8は、後述する手順により大腸菌の菌体内から抽出・精製される。
次に、fer-8-Serを作製するために、先の操作で得られた，fer-8のアミノ酸配列をコードするＤＮＡが組み込まれたプラスミドを鋳型とし、アポフェリチンの１２８番目のアスパラギン酸と１３１番目のグルタミン酸の両アミノ酸をセリンに置き換えたアミノ酸配列をコードする１本鎖ＤＮＡ断片をプライマーとして用いたＰＣＲを行なう。
次に、fer-8の作製と同様の操作により、fer-8-Serのアミノ酸配列をコードするＤＮＡを挿入したプラスミドを作製し、これを大腸菌（Nova Blue）に導入し、形質転換する。形質転換した大腸菌を大量培養した後、後述する手順により大腸菌の菌体内からfer-8-Serを抽出・精製する。
以下、同様の手順により、fer-8-Ser-Argのアミノ酸配列をコードするＤＮＡを挿入したプラスミドとfer-8-Ser-Argを得、次いで、fer-8-Ser-Arg-Cysのアミノ酸配列をコードするＤＮＡを挿入したプラスミドとfer-8-Ser-Arg-Cysを得る。
尚、上述の操作における変異アポフェリチンの抽出・精製手順は以下の通りである。
まず、培養終了後の大腸菌の培養液を遠心チューブに移して遠心分離器内にセットし、４℃、１０，０００回転／分、２５分間の条件で遠心分離し、大腸菌の菌体を沈殿させる。
次に、沈殿した菌体を集めた後、液中で超音波破砕器を用いて菌体を破砕してアポフェリチンを液中に溶出させる。次いで、菌体を破砕した液を遠心チューブに移して遠心分離器内にセットし、４℃、１０，０００回転／分、２５分間の条件で遠心分離し、破砕されずに残った菌体を沈殿させる。
次に、遠心チューブから上清（上澄み液）を採取し、この液を６０℃、１５分間
熱処理した後遠心チューブに移し、４℃、１０，０００回転／分、２５分間の条件で遠心分離する。この操作により不要なタンパク質が変性してチューブの底部に沈殿する。
続いて、遠心チューブから上清を採取した後、４℃下、Q-sepharose HP（ゲルろ過カラム）を用いたカラムクロマトグラフィを行ない、上清中に含まれるアポフェリチン画分を採取する。このアポフェリチン画分をさらに２５℃下、Sephacryl S-300（ゲルろ過カラム）に流してカラムクロマトグラフィを行なうことにより精製する。この操作により、不純物が除かれ、精製された組み換えアポフェリチンが得られる。
なお、本発明において、改質されたアポフェリチンをコードするＤＮＡが一旦得られれば、公知の技術によりこのＤＮＡを増幅することができる。従って、組み換えアポフェリチンを量産する場合には、再度遺伝子の組み替えを工程を行なう必要はない。
−金粒子を保持するアポフェリチンの作製−
まず、組み換えアポフェリチン溶液とＫＡｕＣｌ4溶液（またはＨＡｕＣｌ4）とを混合し、それぞれの最終濃度が、組み換えアポフェリチンは０．５ｍｇ／ｍＬ、ＫＡｕＣｌ4は３ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨが７−９となるように溶液を調製した後、溶液を室温で２４時間以上放置して金粒子をアポフェリチン内部へ取り込ませ、金−アポフェリチン複合体を形成させる。ここで、緩衝剤としては、ｐＨ７−８であれば１００ｍＭのリン酸が、ｐＨ８−９では１００ｍＭのＴｒｉｓ−Ｈｃｌがそれぞれ好ましく用いられる。
このとき、ＮａＢＨ4を１ｍＭ以下の濃度になるように溶液に加えるか、エタノール等のアルコールを１０％以下（ｖ／ｖ）の濃度になるように加えるか、光または紫外線を照射するかのいずれか１つを行なうことで、（ＡｕＣｌ4）-の還元反応を加速して反応時間を短縮することもできる。但し、ＮａＢＨ4の濃度が１ｍＭを越える場合、または、エタノール濃度が１０％（ｖ／ｖ）を越える場合は、（ＡｕＣｌ4）-がアポフェリチン内部に取り込まれる前に還元されてしまい、アポフェリチンの外表面上に金粒子が析出する可能性がある。アポフェリチンの外表面上に析出した金粒子のサイズはアポフェリチンの保持部４で形成される金粒子のサイズと比べると、ばらつきが大きい。
なお、アポフェリチン内部において、析出した金粒子の表面は自身が（ＡｕＣｌ4）-の還元反応を触媒する（自己触媒作用）。これにより、アポフェリチンの保持部４が満たされるまで（ＡｕＣｌ4）-の還元反応が継続する。
また、ここで溶液のｐＨを７−９とするのは、溶液のｐＨが６以下では（ＡｕＣｌ4）-の還元が非常に起こりにくくなり、ｐＨが１０以上では逆に（ＡｕＣｌ4）-の還元の進行が制御できなくなるからである。
その後、鉄を包含したフェリチンの精製と同様の手順で副反応物や金粒子を保持していないアポフェリチンを除去し、得られた溶液をゲルカラムクロマトグラフィーにより分画して、金粒子を包含するアポフェリチンを溶液として採取する。このときに、保持部４ではなく外表面上に金粒子が形成されたアポフェリチン、あるいは少量ではあるが、保持部４と外表面上との両方に金粒子が形成されたアポフェリチンも同時にそれぞれ得られる。
金粒子をアポフェリチンに取り込ませる反応で、組み換えアポフェリチンとしてfer-8-Ser及びfer-8-Ser-Argを用いた場合は、金粒子を内部に包含したアポフェリチンと同様、金粒子が外表面上に形成されたアポフェリチンも生成される。これは、アポフェリチンの外表面上で金が析出する反応の速度が、アポフェリチンの保持部４に金粒子が形成される反応に比べて速いためと考えられる。
これに対し、組み換えアポフェリチンとしてfer-8-Ser-Arg-Cysを用いることにより、金粒子を内部に包含したアポフェリチンの収率が大幅に向上する。これは、保持部４へ導入されたシステイン（Ｃｙｓ）の還元作用により、アポフェリチンの保持部４での（ＡｕＣｌ4）-の還元反応が加速されるためである。尚、アポフェリチン内に包含された金粒子の直径は、約６ｎｍと均一である。つまり、本実施形態において作製された組み換えアポフェリチンfer-8-Ser-Arg-Cysを使用することにより、ナノメーターオーダーの均一な大きさの金粒子が効率よく形成できる。微細な金粒子は、後に述べるＤＮＡセンサーへの応用など、他の金属にはない用途や利点がある。
本実施形態において、使用したアポフェリチンはウマの肝臓由来のものを用いたが、他の臓器由来のものを用いることもできる。
これに加え、内部に金属などを保持可能なかご状タンパク質であれば、本実施形態で行ったように、チャネルと内部の電荷を変えることにより、金粒子を保持させることが可能である。
また、１２個のモノマーサブユニットからなり、内部に無機物を保持する保持部を備えたＤｐｓタンパクなど他のフェリチンファミリータンパクの場合も、アポフェリチンと同様の遺伝子組み換え技術を用いて貴金属粒子を保持させることが可能である。
また、本実施形態においては、アポフェリチンのチャネル３の内表面に存在する１２８番目のアスパラギン酸と１３１番目のグルタミン酸の両方をセリンに置換したが、セリンの代わりとして分子量がより小さい中性アミノ酸であるグリシンまたはアラニンに置換してもよい。
また、本実施形態においては、組み換えアポフェリチンとしてfer-8-Ser-Argを挙げたが、アポフェリチンのアミノ酸配列の５８，６１，６４番目の各グルタミン酸を置換するアミノ酸は、リジンやアラニン等、負電荷を持たない塩基性または非極性あるいは中性アミノ酸であればよい。アミノ酸配列の５８，６１，６４番目の各グルタミン酸をリジンで置換した組み換えアポフェリチンは以下、fer-8-Ser-Lysと表記する。
また、アミノ酸配列の５８，６１，６４番目の各グルタミン酸をアラニンで置換した組み換えアポフェリチンは、fer-8-Ser-Alaと表記する。
尚、fer-8-Ser-Lysの５４番目のグルタミン酸と６５番目のアルギニンの両方をシステインで置換した組み換えアポフェリチンは、fer-8-Ser-Lys-Cysと表記する。また、fer-8-Ser-Alaの５４番目のグルタミン酸と６５番目のアルギニンの両方をシステインで置換した組み換えアポフェリチンは、fer-8-Ser-Ala-Cysと表記する。
このうち、fer-8-Ser-Lys-Cysのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を配列番号１に、fer-8-Ser-Lys-Cysのアミノ酸配列を配列番号２にそれぞれ記載する。尚、配列番号２のアミノ酸配列は、９番目のチロシンから始まっている。
なお、本実施形態において作製されたfer-8-Ser-Lys-Cysにおいて、５８，６１，６４番目（配列番号２においては５０，５３，５６番目）のＬｙｓをコードするＤＮＡ配列は共に”aag”であるが、これに代えてＬｙｓをコードする”aaa”であってもよい。１２８，１３１番目（配列番号２においては１２０，１２３番目）のＳｅｒや、５４，６５番目（配列番号２においては４６，５７番目）のＣｙｓについても、これらのアミノ酸をコードするＤＮＡ配列であれば配列番号１に示す配列と異なっていてもよい。これは、他の組み換えアポフェリチンについても同様である。
また、本実施形態において作製されたfer-8-Ser-Arg-Cys，fer-8-Ser-Lys-Cys及びfer-8-Ser-Ala-Cys等の組み換えアポフェリチンの１２７番目のシステインはアポフェリチンの外表面に位置しており、このシステインがアポフェリチンの外表面上に金粒子を析出させていると推定される。よって、fer-8-Ser-Arg-Cys,fer-8-Ser-Lys-Cys及びfer-8-Ser-Ala-Cysの１２７番目のシステインを当該システインよりも還元機能が小さい物質にすることにより、金粒子のアポフェリチン外表面上での析出が抑制され、金粒子を内包したアポフェリチンの収率をさらに向上させることができると考えられる。この方法としては、１２７番目のシステインを例えばアラニン等のアミノ酸で置換してもよいし、システイン残基と反応して還元機能を抑える化学物質等と反応させてもよい。
また、本実施形態において、金−アポフェリチン複合体を作製したが、アポフェリチンに（ＡｕＣｌ4）-を導入する代わりに、クロロ白金酸（ＰｔＣｌ4 ）2-を組み換えアポフェリチンに導入することにより、白金粒子を保持したアポフェリチンを作製することもできる。但し、（ＰｔＣｌ4 ）2-はｐＨ７−９の溶液中で容易に還元されて溶液中に白金が析出するため、溶液のｐＨは７よりも低くしておく必要がある。このとき緩衝液としては、ｐＨ４付近にする場合は１００ｍＭの酢酸が、ｐＨ３付近にする場合は１００ｍＭのβ−アラニンがそれぞれ用いられる。
本実施形態において作製された貴金属粒子を保持する組み換えアポフェリチンの産業上の利用例を以下の実施形態で述べる。
（第２の実施形態）
まず、本実施形態におけるヌクレオチド検出装置の構成について説明する。図５は、本実施形態のヌクレオチド検出装置の構造を示す断面図である。
同図に示すように、本実施形態のヌクレオチド検出装置１０はＤＮＡセンサであり、図５に示すように、基板１１と、基板１１の表面上に高密度、且つ、高精度（隣接する粒子と互いに約１２ｎｍ間隔）で配置されたナノメーターサイズ（直径６ｎｍ程度）の金粒子１２と、端部に硫黄原子を有する１本鎖ＤＮＡ（チオールＤＮＡ）１３とからなり、金粒子１２にチオールＤＮＡ１３を結合させたものである。
次に、本実施形態のヌクレオチド検出装置１０の作製方法を説明する。本実施形態のヌクレオチド検出装置１０を作製するためには、直径６ｎｍ程度の金粒子１２を、基板１１の表面上に２次元状に高密度且つ高精度に配列および固定する必要がある。
まず、第１の実施形態の金粒子１２を保持する組み換えアポフェリチン（fer-8-Ser-Arg-Cysと金粒子との複合体；以下、金内包アポフェリチン１５と称する）を、後述の方法により基板１１の表面上に配置する。
図３は、基板１１上に配置された金内包アポフェリチン１５を模式的に示す図であり、図４は、基板１１上に配置された金内包アポフェリチン１５の電子顕微鏡写真を示す図である。
図４の撮影に際しては、アポフェリチンに取り込まれない大きさの金グルコースを染色に用いた。ここで、金グルコース染色を用いたのは、通常の色素で染色すると、アポフェリチン内部に色素が入り込んで金粒子の存在を確認できないからである。
この操作により、図３または図４に示すように高密度、且つ高精度で配置された金内包アポフェリチン１５の膜が基板１１上に形成される。図４から、このときのアポフェリチンの外径は約１２ｎｍであることが分かる。
続いて、金内包アポフェリチン１５のうちのタンパク質からなる外殻２を除去して、金粒子１２のみを残存させる。次いで、金粒子１２にチオールＤＮＡ１３を結合させる。ここで使用されるＤＮＡは１本鎖ＤＮＡである。
本実施形態において、金内包アポフェリチン１５を基板１１の表面上に２次元状に高密度、且つ高精度で配置及び固定するためには既知の方法を用いることができる。
例えば、以下に説明する吉村らにより開発された転写法（Adv.Biophys.,Vol.34,p99-107,（1997））による方法を用いることができる。
この方法では、まず、濃度２％のシュークロース溶液に、金内包アポフェリチン１５を分散した液体を、シリンジを用いて注入する。すると、液体は、シュークロース溶液の液面に向かって浮上する。
次に、最初に気液界面に到達した液体は変性したアポフェリチンからなるアモルファス膜を形成し、後から到達した液体はアモルファス膜の下に付着していく。
次に、アモルファス膜の下に、金内包アポフェリチン１５の２次元結晶を形成する。次いで、アモルファス膜と金内包アポフェリチン１５の２次元結晶とからなる膜の上に、基板１１（シリコンウエハ、カーボングリッド、ガラス基板等）を載置すれば、この金内包アポフェリチン１５からなる膜は、基板１１の表面に転写される。
この方法により、図３に示すように、基板１１上に金内包アポフェリチン１５を高密度、高精度で配置することができる。
このとき、基板１１の表面を疎水性に処理しておくことで、より簡単に基板１１の表面に膜を転写することができる。
次に、タンパク質からなる外殻２の除去を行なう。タンパク質分子は、一般に熱に弱いので、以下に示す熱処理により外殻２を除去することができる。
例えば、窒素等の不活性ガス中において、４００〜５００℃にて、約１時間静置すると、外殻２、およびタンパク質からなるアモルファス膜が焼失し、基板１１上には金粒子１２が２次元状に、高密度で、且つ高精度で規則正しく配列したドット状に残存する。
以上のようにして、金内包アポフェリチン１５に保持させた金粒子１２を、基板１１上に２次元状に出現させ、高密度且つ高精度に配列させることができる。
次に、本実施形態のヌクレオチド検出装置１０の形成について以下に説明する。
本実施形態のヌクレオチド検出装置１０は、上述のようにして基板１１上に配置された金粒子１２に、チオールＤＮＡ１３を結合させたものである。
金粒子１２とチオールＤＮＡ１３との結合方法は、金粒子１２を配置した基板１１と、チオールＤＮＡ１３の水溶液とを接触させ、所定の時間放置するだけでよい。これは、硫黄が金と反応し易いので、このチオールＤＮＡ１３またはチオールＲＮＡの端部において金粒子１２と容易に共役結合を形成するからである。
具体的には、水溶液中のチオールＤＮＡ１３と、基板１１上の金粒子１２とが接触すると、チオールＤＮＡ１３の硫黄原子Ｓと金粒子１２とが１対１で共有結合し、チオールＤＮＡ１３が極めて高密度・高精度で基板１１上に配置される。基板１１上の金粒子１２は、２次元状に高密度且つ高精度で配列されているので、金粒子１２と結合したチオールＤＮＡ１３も２次元状に高密度且つ高精度で配列され、粒子の大きさに応じて単位面積当たりの粒子数を均一に配置したヌクレオチド検出装置１０が得られる。
なお、この工程で、チオールＤＮＡ１３の代わりにチオールＲＮＡ、端部をチオール化したＰＣＲプライマーなどのヌクレオチドを用いてもよい。
上記工程において、チオールＤＮＡ１３の水溶液中における濃度は、理論的には、基板１１上の金粒子１２の数とチオールＤＮＡ１３の数とが一致すればよい。しかし、実際には、チオールＤＮＡ１３の数が金粒子１２の数より多数となるようにすることが好ましい。従って、本実施形態では、液体中に分散した状態で含まれる金内包アポフェリチン１５の分子数以上のチオールＤＮＡ１３が含まれるように、高濃度のチオールＤＮＡ１３の水溶液を使用する。
また、チオールＤＮＡ１３の水溶液の温度が高いほど、チオールＤＮＡ１３の硫黄原子Ｓと金粒子１２との結合が促進される。しかし、余り高温であると、対流が激しくなる等、チオールＤＮＡ１３の水溶液の取扱いが困難となる。また、エネルギー消費の観点からも不利となるので、一般には、チオールＤＮＡ１３の水溶液を２０〜６０℃程度に加温して行なうことが好ましい。
以上のようにして、検出したいＤＮＡまたはＲＮＡを簡便に検出することができる本実施形態のヌクレオチド検出装置１０が得られる。
次に、ヌクレオチド検出装置１０をＤＮＡセンサとしたときの、ＤＮＡ検出方法を説明する。
まず、検出対象となるＤＮＡ群（被検出ＤＮＡ群）を含む溶液を用意し、予め被検出ＤＮＡ群を蛍光ラベル処理しておく。
蛍光ラベルした被検出ＤＮＡ群の溶液を、チオールＤＮＡ１３を配置したヌクレオチド検出装置１０に接触させて放置する。
一定時間を経ると、ヌクレオチド検出装置１０のチオールＤＮＡ１３とハイブリダイズするＤＮＡが被検出ＤＮＡ群の中に存在する場合は、ヌクレオチド検出装置１０のチオールＤＮＡ１３と被検出ＤＮＡ群の中のＤＮＡとが、２重螺旋を構成し、安定な結合を完成する。
次に、ヌクレオチド検出装置１０を水等の蛍光物質を含まない溶液で洗浄すれば、被検出ＤＮＡ群のうちのヌクレオチド検出装置１０のチオールＤＮＡ１３と結合しなかったＤＮＡと、ヌクレオチド検出装置１０上に残っていた微量の蛍光物質とが除去される。
この後、ヌクレオチド検出装置１０の表面にレーザ等の光源を照射して蛍光を観察する。このとき、ヌクレオチド検出装置１０のチオールＤＮＡ１３とハイブリダイズする配列を有するＤＮＡが、上記の被検出ＤＮＡ群に存在していれば、蛍光を発する。
以上のように、蛍光を発するか否かで、被検出ＤＮＡ群中に所定の配列を有するＤＮＡが存在するか否かを検出することができる。
特に、本実施形態のヌクレオチド検出装置１０は、チオールＤＮＡ１３が高密度で、且つ高精度で、基板全体に亘って均一に配置されている。このため、蛍光強度が高く、且つ高精度で均一となり、ＳＮ比が非常に高い高性能ＤＮＡセンサとして利用することができる。従って、本実施形態のヌクレオチド検出装置１０をＤＮＡセンサとして利用した場合、所定の値よりも高い蛍光強度が得られれば、被検出ＤＮＡ群中に所定の配列を有するＤＮＡが存在すると判定できる。つまり、所定の配列を有するＤＮＡの有無の判定を誤る可能性がほとんどない。
さらに、本実施形態のヌクレオチド検出装置１０は、チオールＤＮＡ１３が高密度且つ高精度で、基板全体に亘って均一に配置されているとともに、所定の配列を有するＤＮＡのハイブリダイズ後の蛍光強度は、基板毎に異なることがほとんどない。従って、ハイブリダイズしたＤＮＡの有無の判定のために、蛍光強度のしきい値の設定を基板毎に変更する必要が無く、蛍光検出器の調整の手間を大幅に削減することができるという著効を発揮する。
なお、本実施形態では、ヌクレオチド検出装置１０をＤＮＡセンサとした場合について説明したが、検出対象となるＤＮＡ群の代わりに、ＲＮＡ群を用いることによって、ヌクレオチド検出装置１０をＲＮＡセンサとすることができる。
また、従来は、ＤＮＡチップなどのヌクレオチド検出装置は使い捨てであるが、本実施形態のヌクレオチド検出装置１０においては、基板とＤＮＡ（またはＲＮＡ）が硫黄原子および金粒子を介して強固に固定されているため、１００℃の温度でもこの固定を維持することができる。従って、ハイブリダイズしたＤＮＡをチオールＤＮＡから解離させて洗い流すことによって、繰り返し使用することもできる。
また、本実施形態において用いられた金内包アポフェリチン１５の代わりに、第１の実施形態において得られた、外表面上に金粒子が成長した金−アポフェリチン複合体を用いてもよい。アポフェリチンの外表面上で成長した金粒子は、サイズは均一ではないが、本実施形態で用いられる金粒子１２と同様に、高密度且つ高精度で金粒子を基板上に配置することができる。第１の実施形態において、fer-8-Ser-Argを用いると、非常に高い収率で外表面上に金粒子が成長したfer-8-Ser-Argが得られるので、金内包アポフェリチン１５を用いる場合に比べ、ヌクレオチド検出装置１０の製造コストを下げることが可能となる。
（第３の実施形態）
本実施形態では、第１の実施形態において作製された金内包アポフェリチンを利用して形成されるドット体をフローティングゲートとして含む不揮発メモリセルについて説明する。尚、本実施形態の不揮発メモリセル及びその製造方法は、特開平１１−２３３７５２号公報に記載のものである。
図６は、ドット体をフローティングゲートとして利用した不揮発性メモリセルの構造を示す断面図である。同図に示されるように、ｐ型Ｓｉ基板２１上には、制御ゲートとして機能するポリシリコン電極２６と、約６ｎｍの粒径を有する金の微粒子により構成されフローティングゲート電極として機能するドット体２４と、ｐ型Ｓｉ基板２１とフローティングゲートとの間に介在してトンネル絶縁膜として機能するゲート酸化膜２３と、制御ゲートとフローティングゲートとの間にあって制御ゲートの電圧をフローティングゲートに伝える電極間絶縁膜として機能するシリコン酸化膜２５とが設けられている。そして、ｐ型Ｓｉ基板２１内には、ソースもしくはドレインとして機能する第１，第２ｎ型拡散層２７ａ及び２７ｂとが形成されていて、ｐ型Ｓｉ基板２１内の第１，第２ｎ型拡散層２７ａ，２７ｂ間の領域はチャネルとして機能する。また、図示されているメモリセルと隣接するメモリセルとの間には、電気的分離のため、選択酸化法等を用いて形成された素子分離酸化膜２２が形成されている。第１，第２ｎ型拡散層２７ａ，２７ｂは各々タングステンプラグ３０を介して第１，第２アルミニウム配線３１ａ，３１ｂとそれぞれ接続されている。図６には示されていないが、ポリシリコン電極２６やｐ型Ｓｉ基板２１もアルミニウム配線と接続されており、このアルミニウム配線等を用いてメモリセルの各部の電圧を制御するように構成されている。
このメモリセルの以下のように、容易に形成される。
まず、ＬＯＣＯＳ法により、活性領域を取り囲む素子分離酸化膜２２を形成した後、基板上にゲート酸化膜２３を形成する。その後、第１の実施形態において作製された金内包アポフェリチンを用いて、ドット体２４を基板全体に形成する。この際に、金粒子を内包したアポフェリチンを用いることにより、従来の金属酸化物を内包するアポフェリチンを用いたときに必要であったドット体の還元を行なう工程を省くことができる。
次に、基板上に、ＣＶＤ法により、ドット体２４を埋めるシリコン酸化膜及びポリシリコン膜を堆積する。
次に、シリコン酸化膜及びポリシリコン膜のパターニングを行なって電極間絶縁膜となるシリコン酸化膜２５及び制御ゲート電極となるポリシリコン電極２６を形成する。その後、フォトレジストマスク及びポリシリコン電極２６をマスクとして不純物イオンの注入を行なって、第１，第２ｎ型拡散層２７ａ，２７ｂを形成する。
その後、周知の方法により、層間絶縁膜２８の形成と、層間絶縁膜２８へのコンタクトホール２９の開口と、コンタクトホール２９内へのタングステンの埋め込みによるタングステンプラグ３０の形成と、第１，第２アルミニウム配線３１ａ，３１ｂの形成とを行なう。
本実施形態のメモリセルは、制御ゲートとして機能するポリシリコン電極２６と、ソースもしくはドレインとして機能する第１，第２ｎ型拡散層２７ａ，２７ｂとからなるＭＯＳトランジスタ（メモリトランジスタ）を備え、フローティングゲートとして機能するドット体２４に蓄えられた電荷の量で上記メモリトランジスタの閾値電圧が変化することを利用した不揮発性メモリセルである。この不揮発性メモリセルは、二値を記憶するメモリとしての機能が得られるが、ドット体２４に蓄えられる電荷の有無のみだけでなく電荷の蓄積量を制御することで、三値以上の多値メモリを実現することもできる。
データの消去の際には、酸化膜を介したＦＮ（Fowler-Nordheim ）電流や直接トンネリング電流を利用する。
また、データの書き込みには、酸化膜を介したＦＮ電流や直接トンネリング電流あるいはチャネルホットエレクトロン（ＣＨＥ）注入を用いる。
本実施形態の不揮発性メモリセルによると、フローティングゲートが量子ドットとして機能できる程度に粒径の小さい金微粒子により構成されているので、電荷の蓄積量がわずかである。したがって、書き込み，消去の際の電流量を小さくでき、低消費電力の不揮発性メモリセルを構成することができる。
また、本実施形態の不揮発性メモリセルにおいて、フローティングゲートを
構成する金微粒子のサイズが均一であるため、電荷の注入、引き抜きの際の特性が各金微粒子間で揃っており、これらの操作において制御が容易に行えるようになる。
また、上記ドット体２４は、互いに接触しながら連続的につまり全体として膜を構成するような状態で形成されていてもよいし、互いに離れて分散的に形成されていてもよい。本実施形態においては、金微粒子を包含するアポフェリチンを用いているので、基板の所望の部分に疎水処理を施してからアポフェリチンを配置させるなどの方法により、このような微細なドット体パターンを容易に形成することができる。
尚、本実施形態では、ドット体の構成材料として金を用いたが、これに代えて白金を用いてもよい。金内包アポフェリチンに代えて第１の実施形態において作製される白金内包アポフェリチンを用いることで、直径が約６ｎｍの均一サイズの白金からなるドット体を形成することができる。この場合も、金内包アポフェリチンを用いたときと同様に、ドット体の還元工程が不要という利点がある。
（第４の実施形態）
本実施形態として、第１の実施形態の金内包アポフェリチンを利用して金粒子を基板上に配置させ、この金粒子をエッチングマスクとして使用する方法について述べる。
図７（ａ）−（ｃ）は、金粒子をマスクとして微小構造体を形成する方法を示す断面図である。
まず、図７（ａ）に示す工程で、第２の実施形態と同様の方法により、シリコン基板３４上に金内包アポフェリチンを所望の位置に配置させた後、熱処理することにより、タンパク質からなる外殻を除去する。これにより、直径約６ｎｍの金粒子３３が基板３４上に残る。
ここで、金を内包したアポフェリチンを用いることにより、金属酸化物内包アポフェリチンを用いたときに行なう還元工程が不要になる。
続いて、図７（ｂ）に示す工程で、ＳＦ6 ガスを用いて、シリコン基板３４に対し、５分間イオン反応性エッチング（ＲＩＥ）を行なうことにより、シリコン基板３４が選択的に削られる。これは、金粒子３３がシリコン基板３４に比べエッチングされにくいためである。
次に、図７（ｃ）に示す工程で、さらにエッチングが進むと最終的には金粒子３３も除去され、所望のパターンを施されたシリコン基板３４が残る。本実施形態の方法により、上面の直径が約６ｎｍで均一な微細柱状のパターン（以下「微細柱状のパターン」を「微細柱」と称する）を基板上に正確に形成することができる。つまり、従来困難であったサイズが均一で且つ微細な構造体の形成（すなわち、微小構造体の精密加工）が本実施形態の方法により可能となる。
本実施形態の方法により形成された微小構造体は、例えば後述する量子効果を利用した発光素子等に利用することができる。
尚、本実施形態においては、エッチングマスクとして金粒子を用いたが、これに代えて白金粒子を用いることもできる。このためには、工程（ａ）において、金内包アポフェリチンに代えて、第１の実施形態の白金内包アポフェリチンを用いればよい。
尚、状況によってはＦｅを内包するフェリチン及びＮｉ、Ｃｏなどを内包するアポフェリチンを用いても還元工程が不要であることがあるが、本実施形態の貴金属内包アポフェリチンを用いることにより、いずれの状況下でも、還元工程を省くことができる。
尚、本実施形態の工程（ａ）において、金内包アポフェリチンの外殻を除去するために熱処理を用いたが、これに代えてオゾン分解あるいは臭化シアン（ＣＮＢｒ）による化学分解を用いてもよい。
（第５の実施形態）
第５の実施形態として、第４の実施形態の加工方法により形成された微細柱を用いて、江利口らにより報告された特開平０８−０８３９４０号公報に記載の光半導体装置を製造する方法について以下に説明する。
図８は第４の実施形態により形成された上面の直径が６ｎｍの半導体微細柱を用いた光半導体装置の断面図である。
まず、第４の実施形態において、基板としてｎ型シリコンの一部にｐ型ウェル５１が形成され、さらにｐ型ウェル５１上にｎ型ウェルを形成したものを用いる。この基板を第４の実施形態の方法により加工し、ｎ型シリコンからなる半導体微細柱４２を高密度で形成する。
次に、熱酸化法により半導体微細柱４２の側面をシリコン酸化膜からなる絶縁層４３で覆った後、半導体微細柱４２間の隙間を絶縁層４３で埋め、その先端面を平坦化する。
さらに、絶縁層４３のうち平坦化された半導体微細柱４２先端部の表面の絶縁層を除去し、その上に透明電極４４を形成する。
尚、シリコン基板４１上の量子化領域Ｒｑａの側方はあらかじめ形成された絶縁分離層４９によって他の領域と区画されている。また、絶縁分離層４９を貫通する側方電極５０も前もって形成され、各半導体微細柱４２の上部電極である透明電極４４に対し下部電極として機能するシリコン基板４１に接続されている。
これにより、光半導体装置が形成され、透明電極４４と側方電極５０との間に順方向の電圧を印加すると、室温でエレクトロルミネッセンスが生じる。さらに、キャリア注入電圧を変化させることにより、赤、青、黄色、それぞれの発光に対応した可視光のエレクトロルミネッセンスが生じる。
本実施形態によれば、これまで実施が困難であった高い発光効率を持った光半導体装置を実現することができる。
（その他の実施形態）
第１の実施形態の金−アポフェリチン複合体の作製過程において、外表面上と保持部の両方に金粒子を保持する金−アポフェリチン複合体が少量得られる。
図９は、外表面上と保持部の両方に金粒子を保持する金−アポフェリチン複合体を示す図である。同図で、保持部に保持されている第１の金粒子６１の直径は約６ｎｍ、アポフェリチンの外表面上に形成されている第２の金粒子６２の大きさはばらつきがあるが、少なくともアポフェリチンに内包される第１の金粒子６１よりもサイズが大きい。また、保持部に保持されている第１の金粒子６１はアポフェリチンの外殻６３で囲まれている。
この金−アポフェリチン複合体をシリコン基板等の上に、第２の金粒子６２が上にくるように膜状に配置する。
この基板をさらに加工し、第１の金粒子６１及び第２の金粒子６２をフローティングゲートとして有するダブルドットタイプの不揮発メモリセルを作製することができる。この不揮発メモリセルは、データの保持時間が長いことが特徴であるが、これは、サイズが異なる粒子では電荷の入りやすさ及び放出しやすさが互いに違うため、入力された情報を電荷を放出しにくい方の金粒子に保持しておけるからである。ここで、金−アポフェリチン複合体を用いることで、保持時間の長い不揮発メモリセルを容易に作成することができる。
また、アポフェリチンを用いることにより、ナノメーターサイズの金粒子をフローティングゲートとして使用することができるので、メモリセルを微細化することもできる。
また、本実施形態では金−アポフェリチン複合体のみを用いたが、他の金属とアポフェリチンとの複合体を金−アポフェリチン複合体と組み合わせて使用することにより、準位の異なったドットを作製することができ、保持時間の長い不揮発メモリを容易に作成することができる。
尚、本実施形態において、外表面上と保持部とに金を保持するアポフェリチンの代わりに外表面上と保持部とに白金を保持するアポフェリチンを用いてもよいし、これと金を保持するアポフェリチンとを組み合わせて使用してもよい。
本発明の貴金属−組み換えタンパク質複合体を製造する方法によれば、遺伝子組み換え技術を用いてアポフェリチンの内部構造を改質することにより、アポフェリチン内に貴金属原子を導入することができ、ひいては、各種の微細構造に適用可能な貴金属粒子を形成することが可能となる。
フェリチンの構造を模式的に示す図である。 （ａ）−（ｃ）は、本発明の第１の実施形態に係る組み換えアポフェリチンを模式的に示す断面図である。 基板上に配置された金内包アポフェリチンを模式的に示す図である。 基板上に配置された金内包アポフェリチンの電子顕微鏡写真を示す図である。 本発明の第２の実施形態に係るヌクレオチド検出装置を概略的に示す図である。 本発明の第３の実施形態に係る，金粒子からなるドット体をフローティングゲートとして利用した不揮発性メモリセルの構造を示す断面図である。 （ａ）−（ｃ）は、本発明の第４の実施形態に係る微小構造体の形成工程を示す断面図である。 本発明の第５の実施形態に係り、第４の実施形態において形成された微小構造体形を利用した光半導体装置の断面図である。 本発明により形成された、外表面と保持部の両方に貴金属粒子を保持する金−アポフェリチン複合体を模式的に示す図である。
符号の説明
１ 核
２ 外殻
３ チャネル
４ 保持部
７ クロロ金酸イオン（ＡｕＣｌ4）-
７’ 金（Ａｕ）原子
１０ ヌクレオチド検出装置
１１ 基板
１２ 金粒子
１３ チオールＤＮＡ
１５ 金内包アポフェリチン
２１ ｐ型Ｓｉ基板
２２ 素子分離酸化膜
２３ ゲート酸化膜
２４ ドット体
２５ シリコン酸化膜
２６ ポリシリコン電極
２７ａ 第１のｎ型拡散層
２７ｂ 第２のｎ型拡散層
２８ 層間絶縁膜
２９ コンタクトホール
３０ タングステンプラグ
３１ａ 第１のアルミニウム配線
３１ｂ 第２のアルミニウム配線
３３ 金粒子
３４ シリコン基板
４１ シリコン基板
４２ 半導体微細柱
４３ 絶縁層
４４ 透明電極
４９ 絶縁分離層
５０ 側方電極
５１ ｐ型ウェル
Ｒｑａ 量子化領域
６１ 第１の金粒子
６２ 第２の金粒子
６３ 外殻

Claims (22)

  1. 貴金属粒子および組み換えアポフェリチンを備えている貴金属−組み換えタンパク質複合体を製造する方法であって、
    前記組み換えアポフェリチンは前記貴金属粒子を内包しており、
    前記貴金属粒子は金または白金であり、
    前記組み換えアポフェリチンはウマ由来であり、
    前記組み換えアポフェリチンの１番目から８番目までのアミノ酸は欠失しており、
    前記組み換えアポフェリチンの５８番目のアミノ酸が、塩基性アミノ酸、非極性アミノ酸、または中性アミノ酸に置換されており、
    前記組み換えアポフェリチンの６１番目のアミノ酸が、塩基性アミノ酸、非極性アミノ酸、または中性アミノ酸に置換されており、
    前記組み換えアポフェリチンの６４番目のアミノ酸が、塩基性アミノ酸、非極性アミノ酸、または中性アミノ酸に置換されており、
    前記組み換えアポフェリチンの１２８番目のアミノ酸が、セリン、アラニン、またはグリシンに置換されており、
    前記組み換えアポフェリチンの１３１番目のアミノ酸が、セリン、アラニン、またはグリシンに置換されており、
    前記方法は、
    （ＡｕＣｌ 4 ） - を含む緩衝液または（ＰｔＣｌ 4 ） 2- を含む緩衝液に前記組み換えアポフェリチンを添加する工程を包含する。
  2. 前記組み換えアポフェリチンの５８番目のアミノ酸が、塩基性アミノ酸に置換されている、請求項１に記載の貴金属−組み換えタンパク質複合体を製造する方法。
  3. 前記塩基性アミノ酸がアルギニンである、請求項２に記載の貴金属−組み換えタンパク質複合体を製造する方法。
  4. 前記塩基性アミノ酸がリジンである、請求項２に記載の貴金属−組み換えタンパク質複合体を製造する方法。
  5. 前記組み換えアポフェリチンの５８番目のアミノ酸が、非極性アミノ酸に置換されている、請求項１に記載の貴金属−組み換えタンパク質複合体を製造する方法。
  6. 前記非極性アミノ酸がアラニンである、請求項５に記載の貴金属−組み換えタンパク質複合体を製造する方法。
  7. 前記組み換えアポフェリチンの５８番目のアミノ酸が、中性アミノ酸に置換されている、請求項１に記載の貴金属−組み換えタンパク質複合体を製造する方法。
  8. 前記組み換えアポフェリチンの６１番目のアミノ酸が、塩基性アミノ酸に置換されている、請求項１に記載の貴金属−組み換えタンパク質複合体を製造する方法。
  9. 前記塩基性アミノ酸がアルギニンである、請求項８に記載の貴金属−組み換えタンパク質複合体を製造する方法。
  10. 前記塩基性アミノ酸がリジンである、請求項８に記載の貴金属−組み換えタンパク質複合体を製造する方法。
  11. 前記組み換えアポフェリチンの６１番目のアミノ酸が、非極性アミノ酸に置換されている、請求項１に記載の貴金属−組み換えタンパク質複合体を製造する方法。
  12. 前記非極性アミノ酸がアラニンである、請求項１１に記載の貴金属−組み換えタンパク質複合体を製造する方法。
  13. 前記組み換えアポフェリチンの６１番目のアミノ酸が、中性アミノ酸に置換されている、請求項１に記載の貴金属−組み換えタンパク質複合体を製造する方法。
  14. 前記組み換えアポフェリチンの６４番目のアミノ酸が、塩基性アミノ酸に置換されている、請求項１に記載の貴金属−組み換えタンパク質複合体を製造する方法。
  15. 前記塩基性アミノ酸がアルギニンである、請求項１４に記載の貴金属−組み換えタンパク質複合体を製造する方法。
  16. 前記塩基性アミノ酸がリジンである、請求項１４に記載の貴金属−組み換えタンパク質複合体を製造する方法。
  17. 前記組み換えアポフェリチンの６４番目のアミノ酸が、非極性アミノ酸に置換されている、請求項１に記載の貴金属−組み換えタンパク質複合体を製造する方法。
  18. 前記非極性アミノ酸がアラニンである、請求項１７に記載の貴金属−組み換えタンパク質複合体を製造する方法。
  19. 前記組み換えアポフェリチンの６４番目のアミノ酸が、中性アミノ酸に置換されている、請求項１に記載の貴金属−組み換えタンパク質複合体を製造する方法。
  20. 前記組み換えアポフェリチンの１２８番目のアミノ酸が、セリンに置換されている、請求項１に記載の貴金属−組み換えタンパク質複合体を製造する方法。
  21. 前記組み換えアポフェリチンの１３１番目のアミノ酸が、セリンに置換されている、請求項１に記載の貴金属−組み換えタンパク質複合体を製造する方法。
  22. 前記組み換えアポフェリチンの５４番目のアミノ酸が、システインに置換されている、請求項１に記載の貴金属−組み換えタンパク質複合体を製造する方法。
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