JP2008088059A - 改変アポフェリチンの製造方法とその利用 - Google Patents

Abstract

【課題】目的に応じた改変がなされた改変アポフェリチンを用いて目的物（Ｐｄを含む金属粒子またはＲｈ錯体との複合体）を製造する方法の提供。
【解決手段】Ｐｄイオン結合サイトにおいてＰｄイオンの結合に関与するアミノ酸残基を置換することにより該サイトの数を減じた改変アポフェリチンを用意し、そのＰｄイオン結合サイトにＰｄイオンを結合させ、該Ｐｄイオンを還元して改変アポフェリチンの内部空間にＰｄを含む金属粒子を形成する。また、Ｒｈ錯体結合サイトにおいてＲｈ錯体の結合に関与するアミノ酸残基を置換することにより該サイトの数を減じた改変アポフェリチンを用意し、そのＲｈ錯体結合サイトにＲｈ錯体を結合させてＲｈ錯体−改変アポフェリチン複合体を製造する。
【選択図】図２

Description

本発明は、特定の化学種の結合サイトの数をアポフェリチン本来の数から異ならせるように改変された改変アポフェリチン、該改変アポフェリチンに上記特定の化学種が結合した改変アポフェリチン複合体の製造方法およびその利用に関する。

フェリチンは生体内で鉄を貯蔵する機能を示すタンパク質であり、２４個のサブユニット（以下、「フェリチンモノマー」ということもある。）が自己組織化して構成された球状構造を有する。その球状構造の外径は１２ｎｍであり、内部には直径８ｎｍの空洞（内部空間）が形成されている。このフェリチンのタンパク部分（以下、「アポフェリチン」という。）を化学反応または合成に利用しようとする試みが種々なされている。例えば非特許文献１には、アポフェリチンの内部空間にＰｄイオンを挿入して還元することによりＰｄの微粒子を構築し得ること、および該Ｐｄ微粒子が水素化触媒として機能し得ることが記載されている。また、非特許文献２には、アポフェリチンの内部に挿入した金属錯体を重合触媒として、該アポフェリチンの内部空間（キャビティ）でフェニルアセチレンを重合させる技術が記載されている。

アンゲヴァンテ・ケミー・インターナショナル・エディション（Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ），第４３号，２００４年，ｐ．２５２７−２５３０ 日本化学会第８５春季年会 講演予稿集，２００５年，講演番号３Ｆ８−０８

上述した技術ではいずれも天然のアポフェリチンを用いている。ここで、目的に応じてアポフェリチンに適切な改変が施された改変アポフェリチンを効率よく設計し、該改変アポフェリチンを用いて目的物を製造する方法が提供されれば有益である。

そこで本発明は、改変アポフェリチンを用いて金属粒子（典型的には、パラジウムを含む金属粒子）を製造する方法であって、粒径および／または組成が的確に調整された金属粒子を製造可能な方法を提供することを一つの目的とする。本発明の他の一つの目的は、改変アポフェリチンを用いてＲｈ錯体−改変アポフェリチン複合体を製造する方法であって、該Ｒｈ錯体が結合しているサイトの数、該結合サイトの種類および／または複数種類の結合サイトの比率が調整されたＲｈ錯体−改変アポフェリチン複合体を効率よく製造する方法を提供することである。

ここに開示される一つの発明は、パラジウム（Ｐｄ）を含む金属粒子の製造方法に関する。その方法は、アポフェリチンの内部空間側にある複数のＰｄイオン結合サイト（該内部空間側にＰｄイオンを結合可能なサイト、すなわちＰｄイオン結合能を有するサイトをいう。以下同じ。）のうち一部個数のサイトにつき、該Ｐｄイオン結合サイトへのＰｄイオンの結合に関与するアミノ酸残基を置換および／または修飾することにより、前記Ｐｄイオン結合サイトの数をアポフェリチン本来の数よりも少なくする改変が施された改変アポフェリチンを用意することを含む。また、該改変アポフェリチンの有する前記Ｐｄイオン結合サイト（すなわち、改変後の個数のＰｄイオン結合サイト）にＰｄイオンを結合させて（前記改変後の個数のＰｄイオン結合サイトのうち一部個数であっても実質的に全部の個数であってもよい。）Ｐｄイオン−改変アポフェリチン複合体を得ることを含む。さらに、該複合体に含まれるＰｄイオンを還元して前記改変アポフェリチンの内部空間（キャビティ）にＰｄを含む金属粒子を形成することを含み得る。
かかる方法では、アポフェリチン本来の数よりも少ない数のＰｄイオン結合サイトを有する改変アポフェリチンの上記Ｐｄイオン結合サイトにＰｄイオンを結合させ、該Ｐｄイオンを還元する（典型的には、酸化数をゼロにする）ことにより、Ｐｄを含む金属粒子（Ｐｄ粒子、Ｐｄ−Ａｕバイメタル粒子等であり得る。）を形成する。このようにＰｄイオン結合サイトの個数を異ならせた改変アポフェリチンを「鋳型」として利用することにより、改変されていないアポフェリチンを用いる場合とは異なる数のＰｄ原子を含む金属粒子を精度よく製造することができる。したがって、例えば、改変されていないアポフェリチンを用いる場合とは粒径および／または金属組成の異なる金属粒子を安定して精度よく製造することができる。

上記方法により得られた金属粒子は、その製造に用いられた改変アポフェリチンに該金属粒子が内包された形態で、例えば各種触媒（オレフィン水素化触媒等）として利用され得る。したがって、ここに開示される発明の他の側面は、アポフェリチンの内部空間側にパラジウム（Ｐｄ）イオンを結合可能な複数のＰｄイオン結合サイトのうち一部個数のサイトにつき、該Ｐｄイオン結合サイトへのＰｄイオンの結合に関与するアミノ酸残基を置換および／または修飾することにより、前記Ｐｄイオン結合サイトの数をアポフェリチン本来の数よりも少なくする改変が施された改変アポフェリチンを用意すること；
該改変アポフェリチンの有する前記Ｐｄイオン結合サイトにＰｄイオンを結合させてＰｄイオン−改変アポフェリチン複合体を得ること；および、
該複合体に含まれるＰｄイオンを還元して前記改変アポフェリチンの内部空間にＰｄを含む金属粒子を形成すること；
を含む、金属粒子内包改変アポフェリチンの製造方法である。
該金属粒子内包改変アポフェリチンを構成する改変アポフェリチンは、例えば、該改変アポフェリチンに内包された金属粒子同士の凝集を防ぐ保護材として機能し得る。また、金属粒子内包改変アポフェリチンの内部空間を用いた化学反応において基質選択性（例えば、該基質のサイズによる選択性）を発揮し得る。かかる金属粒子内包改変アポフェリチンは水溶液とすることができ、これにより上記金属粒子を水溶液として取り扱うことができる。このことは、例えば保存および／または取扱性の点で有利である。ここに開示される金属粒子内包改変アポフェリチンは、例えば、水中で各種化学反応（例えばオレフィンの水素化反応）を促進する触媒として有用である。

ここに開示される方法の好ましい一つの態様では、前記改変アポフェリチンが、下記（Ａ）〜（Ｎ）のＰｄイオン結合サイトのうち少なくとも一種類のＰｄイオン結合サイトがＰｄイオン結合能を維持し、且つ他の少なくとも一種類のＰｄイオン結合サイトのＰｄイオン結合能を失わせるような改変が施された改変アポフェリチンである。
（Ａ）アポフェリチンを構成するフェリチンモノマーの第４５番目のアミノ酸残基であるグルタミン酸が関与するＰｄイオン結合サイト。
（Ｂ）アポフェリチンを構成するフェリチンモノマーの第４８番目のアミノ酸残基であるシステインが関与するＰｄイオン結合サイト。
（Ｃ）アポフェリチンを構成するフェリチンモノマーの第４９番目のアミノ酸残基であるヒスチジンが関与するＰｄイオン結合サイト。
（Ｄ）アポフェリチンを構成するフェリチンモノマーの第５２番目のアミノ酸残基であるアルギニンが関与するＰｄイオン結合サイト。
（Ｅ）アポフェリチンを構成するフェリチンモノマーの第５３番目のアミノ酸残基であるグルタミン酸が関与するＰｄイオン結合サイト。
（Ｆ）アポフェリチンを構成するフェリチンモノマーの第６４番目のアミノ酸残基であるアルギニンが関与するＰｄイオン結合サイト。
（Ｇ）アポフェリチンを構成するフェリチンモノマーの第６８番目のアミノ酸残基であるメチオニンが関与するＰｄイオン結合サイト。
（Ｈ）アポフェリチンを構成するフェリチンモノマーの第９６番目のアミノ酸残基であるメチオニンが関与するＰｄイオン結合サイト。
（Ｉ）アポフェリチンを構成するフェリチンモノマーの第１２６番目のアミノ酸残基であるシステインが関与するＰｄイオン結合サイト。
（Ｊ）アポフェリチンを構成するフェリチンモノマーの第１２７番目のアミノ酸残基であるアスパラギン酸が関与するＰｄイオン結合サイト。
（Ｋ）アポフェリチンを構成するフェリチンモノマーの第１３０番目のアミノ酸残基であるグルタミン酸が関与するＰｄイオン結合サイト。
（Ｌ）アポフェリチンを構成するフェリチンモノマーの第１２４番目のアミノ酸残基であるヒスチジンが関与するＰｄイオン結合サイト。
（Ｍ）アポフェリチンを構成するフェリチンモノマーの第１３６番目のアミノ酸残基であるグルタミン酸が関与するＰｄイオン結合サイト。
（Ｎ）アポフェリチンを構成するフェリチンモノマーの第１４７番目のアミノ酸残基であるヒスジチンが関与するＰｄイオン結合サイト。

例えば、下記（ａ）〜（ｎ）のアミノ酸残基のうち少なくとも一種類のアミノ酸残基を維持し、且つ他の少なくとも一種類のアミノ酸残基を置換および／または修飾するような改変が施された改変アポフェリチンの使用が好ましい。
（ａ）前記フェリチンモノマーの第４５番目のアミノ酸残基であるグルタミン酸。
（ｂ）前記フェリチンモノマーの第４８番目のアミノ酸残基であるシステイン。
（ｃ）前記フェリチンモノマーの第４９番目のアミノ酸残基であるヒスチジン。
（ｄ）前記フェリチンモノマーの第５２番目のアミノ酸残基であるアルギニン。
（ｅ）前記フェリチンモノマーの第５３番目のアミノ酸残基であるグルタミン酸。
（ｆ）前記フェリチンモノマーの第６４番目のアミノ酸残基であるアルギニン。
（ｇ）前記フェリチンモノマーの第６８番目のアミノ酸残基であるメチオニン。
（ｈ）前記フェリチンモノマーの第９６番目のアミノ酸残基であるメチオニン。
（ｉ）前記フェリチンモノマーの第１２６番目のアミノ酸残基であるシステイン。
（ｊ）前記フェリチンモノマーの第１２７番目のアミノ酸残基であるアスパラギン酸。
（ｋ）前記フェリチンモノマーの第１３０番目のアミノ酸残基であるグルタミン酸。
（ｌ）前記フェリチンモノマーの第１２４番目のアミノ酸残基であるヒスチジン。
（ｍ）前記フェリチンモノマーの第１３６番目のアミノ酸残基であるグルタミン酸。
（ｎ）前記フェリチンモノマーの第１４７番目のアミノ酸残基であるヒスジチン。

上記改変において置換および／または修飾されるアミノ酸残基は、上記（Ａ）〜（Ｎ）のＰｄイオン結合サイトのうち少なくとも一つのサイトへのＰｄイオン結合に関与するアミノ酸残基（例えば、上記（ａ）〜（ｎ）から選択される一種または二種以上のアミノ酸残基）であって、システイン（Ｃｙｓ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）およびグルタミン酸（Ｇｌｕ）からなる群から選択される一種または二種以上のアミノ酸残基であり得る。かかるアミノ酸残基を置換するアミノ酸残基としては、置換前の（本来の）アミノ酸残基よりも小さなアミノ酸残基を好ましく選択し得る。Ｐｄイオン配位性の高い官能基（典型的には、チオール基、イミダゾール環、カルボキシル基）を有しないアミノ酸残基に置換することが好ましい。例えば、グリシン（Ｇｌｙ）またはアラニン（Ａｌａ）への置換が好ましい。また、上記改変は、アミノ酸残基の有するＰｄイオン配位性の高い官能基（典型的には、チオール基、イミダゾール環、カルボキシル基）を、よりＰｄイオン配位性の低い官能基に変換する化学修飾を行う改変であってもよい。

ここに開示される方法は、例えば、Ｐｄからなる金属粒子（Ｐｄ粒子）または該Ｐｄ粒子を内包する改変アポフェリチンを製造する方法として好適である。また、Ｐｄと他の一または二以上の金属とを含む金属粒子または該金属粒子を内包する改変アポフェリチンを製造する方法としても好ましく適用され得る。このようにＰｄに加えてＰｄ以外の金属（非Ｐｄ金属）をも含む金属粒子または該金属粒子を内包する改変アポフェリチンは、例えば、アポフェリチンの内部空間側にＰｄイオンを結合させること、その結合したＰｄイオンを還元すること、アポフェリチンの内部空間側に非Ｐｄ金属のイオンを結合させること、およびその結合した非Ｐｄ金属のイオンを還元すること、を含む方法により製造することができる。上記非Ｐｄ金属としては、アポフェリチンの外部からその内部空間に取り込み可能な（典型的には、該内部空間側に結合可能な）金属イオンであってアポフェリチンが安定に存在する条件下で金属に還元可能な金属イオンを形成し得る金属が好ましい。かかる非Ｐｄ金属は、周期表の４族〜１３族（例えば８〜１１族）に属するいずれかの金属（Ｐｄを除く。）であり得る。例えば、金（Ａｕ）ならびに白金族に属するＰｄ以外の金属、すなわちルテニウム（Ｒｕ）、ロジウム（Ｒｈ）、オスミウム（Ｏｓ）、イリジウム（Ｉｒ）および白金（Ｐｔ）が挙げられる。なお、ここでいう周期表の族番号は、ＩＵＰＡＣの定める１〜１８の族番号表示によるものである。これらのうち好ましい非Ｐｄ金属としてＡｕ，ＰｔおよびＲｈが例示される。アポフェリチン内部への取り込み性に優れることから、特にＡｕの使用が好ましい。ここに開示される金属粒子製造方法は、例えば、ＡｕおよびＰｄを含む金属粒子（典型的には、ＰｄおよびＡｕの二成分から実質的に構成されるバイメタル粒子）製造する方法として好適である。

本発明によると、上記ＡｕおよびＰｄを含む金属粒子または該金属粒子を内包する改変アポフェリチンを製造する一つの好ましい方法が提供される。その方法は、前記改変アポフェリチンの内部空間側にＡｕイオンを結合させることを含む。また、上記Ａｕイオンが結合した改変アポフェリチン（Ａｕイオン−改変アポフェリチン複合体）の有する前記Ｐｄイオン結合サイトにＰｄイオンを結合させることを含む。また、上記Ａｕイオン−改変アポフェリチン複合体にさらにＰｄイオンが結合した複合体（Ａｕ／Ｐｄイオン−改変アポフェリチン複合体）の有するＡｕイオンおよびＰｄイオンを共に還元して、前記改変アポフェリチンの内部空間にＡｕおよびＰｄを含む金属粒子を形成することを含む。
上記方法では、改変アポフェリチンの内部空間側にＰｄイオンおよびＡｕイオンを共に結合させた複合体を形成し、これらのイオンを共に還元することにより（以下、この方法を「共還元法」ということもある。）、ＰｄとＡｕとが混在した金属粒子を得る。ここで、かかる共還元法により得られた金属粒子に含まれるＰｄ原子とＡｕ原子との比率は、Ａｕ／Ｐｄイオン−改変アポフェリチン複合体の内部空間側に結合しているＰｄイオンとＡｕイオンとのイオン数の比率に概ね対応する。したがって、上記改変アポフェリチンの有するＰｄイオン結合サイトの数によって該改変アポフェリチンの内部空間側に結合するＰｄイオンとＡｕイオンとのイオン数の比率を調節することができ、これによりＰｄとＡｕとの組成比が精度よく調整された（例えば、改変されていないアポフェリチンを用いる場合よりもＡｕの比率が高い）金属粒子を安定して製造することができる。

本発明によると、上記ＡｕおよびＰｄを含む金属粒子または該金属粒子を内包する改変アポフェリチンを製造する他の一つの好ましい方法が提供される。その方法は、前記改変アポフェリチンの内部空間側にＡｕイオンを結合させることを含む。また、該Ａｕイオン結合改変アポフェリチンの有するＡｕイオンを還元して前記改変アポフェリチンの内部空間にＡｕを含む金属粒子を形成することを含む。また、Ａｕを含む金属粒子を内包する前記改変アポフェリチンの有する前記Ｐｄイオン結合サイトにＰｄイオンを結合させることを含む。さらに、Ｐｄイオン結合改変アポフェリチンの有するＰｄイオンを還元して前記Ａｕを含む金属粒子の外側にＰｄが堆積した金属粒子を形成することを含む。
かかる方法では、アポフェリチンの内部空間側に結合させた金属イオンを還元して金属を析出（堆積）させる過程をＡｕイオンおよびＰｄイオンについて順次行うことにより（以下、この方法を「逐次還元法」ということもある。）、Ａｕを含むコア（典型的にはＡｕからなるコア）の周囲にＰｄが堆積した金属粒子を得る。ここで、Ａｕ粒子の表面に堆積するＰｄの原子数は、改変アポフェリチンの有するＰｄイオン結合サイトの数に概ね対応することから、該改変アポフェリチンの有するＰｄイオン結合サイトの数によって上記堆積量を精度よく調節することができる。

ここに開示される金属粒子または該金属粒子を内包する改変アポフェリチンは、水素化触媒（例えば、オレフィン結合を有する基質の該オレフィン結合に水素を付加する水素化触媒）として機能するものであり得る。例えば、アクリルアミド（ＣＨ_２＝ＣＨＣＯＮＨ_２）、アクリル酸（ＣＨ_２＝ＣＨＣＯＯＨ）、Ｎ−アルキルアクリルアミド（ＣＨ_２＝ＣＨＣＯＮＨＲ、ここでＲは例えば炭素数１〜６のアルキル基であり得る。）、アリルアルコール（ＣＨ_２＝ＣＨＣＨ_２ＯＨ）等の基質の水素化触媒として好適に利用され得る。したがって、本発明の他の側面は、ここに開示されるいずれかの金属粒子または該金属粒子を内包する改変アポフェリチンであって、オレフィンの水素化を促進する機能を有する水素化触媒である。

ここに開示される他の一つの発明は、改変アポフェリチンの内部空間側にロジウム（Ｒｈ錯体が結合したＲｈ錯体−改変アポフェリチン複合体の製造方法に関する。その方法は、アポフェリチンの内部空間側にある複数のＲｈ錯体結合サイト（該内部空間側にＲｈ錯体を結合可能なサイト、すなわちＲｈ錯体結合能を有するサイトをいう。以下同じ。）のうち一部個数のサイトにつき、該Ｒｈ錯体結合サイトへのＲｈ錯体の結合に関与するアミノ酸残基を置換および／または修飾することにより、前記Ｒｈ錯体結合サイトの数をアポフェリチン本来の数よりも少なくする改変が施された改変アポフェリチンを用意することを含む。また、該改変アポフェリチンの有する前記Ｒｈ錯体結合サイトにＲｈ錯体を結合させることを含む。
かかる方法によると、Ｒｈ錯体の結合に関与するアミノ酸残基を狙って改変を行うことにより、Ｒｈ錯体が結合している結合サイトの数、結合サイトの種類および／または複数種類の結合サイトの比率が調整されたＲｈ錯体−改変アポフェリチン複合体を効率よく製造することができる。

前記Ｒｈ錯体は、シクロヘキサジエン骨格またはシクロオクタジエン骨格を有する配位子がＲｈに配位してなる錯体であることが好ましい。このような配位子の例として、シクロヘキサジエン（典型的には１，４−シクロヘキサジエン）、ノルボルナジエン（典型的には２，５−ノルボルナジエン。以下、このノルボルナジエン配位子を「（ｎｂｄ）」と表すことがある。）、シクロオクタジエン（典型的には１，５−シクロオクタジエン。以下、このシクロオクタジエン配位子を「（ｃｏｄ）」と表すことがある。）等の配位子、および、これらの骨格を有し一または二以上の水素原子がアルキル基、アルコキシ基、ニトロ基、カルボキシル基、ハロゲン原子等の置換基で置換された配位子が挙げられる。このような配位子がＲｈに配位したＲｈ錯体は、水中においてアセチレン類の重合反応、オレフィンの水素化反応等に対し良好な触媒活性を示すものであり得る。したがって、かかるＲｈ錯体を用いてなるＲｈ錯体−改変アポフェリチン複合体は、重合触媒、水素化触媒等としてより有用なものとなり得る。本発明にとり特に好ましい配位子として２，５−ノルボルナジエンが例示される。

ここに開示される方法の好ましい一つの態様では、前記改変アポフェリチンが、下記（Ｐ），（Ｑ）および（Ｒ）のＲｈ錯体結合サイトのうち少なくとも一種類のＲｈ錯体結合サイトがＲｈ錯体結合能を維持し、且つ他の少なくとも一種類のＲｈ錯体結合サイトのＲｈ錯体結合能を失わせるような改変が施された改変アポフェリチンである。
（Ｐ）アポフェリチンを構成するフェリチンモノマーの第４８番目のアミノ酸残基であるシステインが関与するＲｈ錯体結合サイト。
（Ｑ）アポフェリチンを構成するフェリチンモノマーの第４９番目のアミノ酸残基であるヒスチジンが関与するＲｈ錯体結合サイト。
（Ｒ）アポフェリチンを構成するフェリチンモノマーの第１１４番目のアミノ酸残基であるヒスチジンが関与するＲｈ錯体結合サイト。

例えば、下記（ｐ），（ｑ）および（ｒ）のアミノ酸残基のうち少なくとも一種類のアミノ酸残基を維持し、且つ他の少なくとも一種類のアミノ酸残基を置換および／または修飾するような改変が施された改変アポフェリチンの使用が好ましい。
（ｐ）前記フェリチンモノマーの第４８番目のアミノ酸残基であるシステイン。
（ｑ）前記フェリチンモノマーの第４９番目のアミノ酸残基であるヒスチジン。
（ｒ）前記フェリチンモノマーの第１１４番目のアミノ酸残基であるヒスチジン。

上記改変において、Ｒｈ錯体の結合に関与するアミノ酸残基（例えば、上記（ｐ）〜（ｒ）から選択される一種または二種以上のアミノ酸残基）を置換するアミノ酸残基としては、置換前のアミノ酸残基よりも小さなアミノ酸残基を好ましく選択し得る。例えば、グリシン（Ｇｌｙ）またはアラニン（Ａｌａ）への置換が好ましい。

ここに開示されるＲｈ錯体−改変アポフェリチン複合体は、当該Ｒｈ錯体が単独で触媒活性を示す化学反応と同種の化学反応を促進する触媒として利用され得る。また、改変されていない（天然の）アポフェリチンの内部空間側に上記Ｒｈ錯体が結合してなるＲｈ錯体−アポフェリチン複合体が触媒活性を示す化学反応と同種の化学反応を促進する触媒として利用され得る。上記Ｒｈ錯体−改変アポフェリチン複合体は、例えば、アセチレン類（典型的には末端アセチレン類）の重合触媒として有用なものであり得る。該アセチレン類としては、フェニルアセチレン、４−クロロフェニルアセチレン等のアリールアセチレン；１−ヘキシン、１−オクチン等の１−アルキン；等を例示することができる。本発明の他の側面は、ここに開示されるいずれかのＲｈ錯体−改変アポフェリチン複合体であって、アセチレン類の重合を促進する（典型的には、該改変アポフェリチンの内部空間においてアセチレン類を重合させる）機能を有する重合触媒である。かかる重合促進機能を水中で発揮する重合触媒であり得る。

ここに開示されるＲｈ錯体−改変アポフェリチン複合体は、また、オレフィン結合を有する基質の該オレフィン結合に水素を付加する水素化触媒として有用なものであり得る。例えば、アクリルアミド（ＣＨ_２＝ＣＨＣＯＮＨ_２）、アクリル酸（ＣＨ_２＝ＣＨＣＯＯＨ）、Ｎ−アルキルアクリルアミド（ＣＨ_２＝ＣＨＣＯＮＨＲ、ここでＲは例えば炭素数１〜６のアルキル基であり得る。）、アリルアルコール（ＣＨ_２＝ＣＨＣＨ_２ＯＨ）等の基質の水素化触媒として好適に利用され得る。本発明の他の側面は、ここに開示されるいずれかのＲｈ錯体−改変アポフェリチン複合体であって、オレフィンの水素化を促進する機能を有する水素化触媒である。かかる水素化促進機能を水中で発揮する水素化触媒であり得る。

以下、本発明の好適な実施形態を説明する。なお、本明細書において特に言及している事項以外の事柄であって本発明の実施に必要な事柄は、当該分野における従来技術に基づく当業者の設計事項として把握され得る。本発明は、本明細書に開示されている内容と当該分野における技術常識とに基づいて実施することができる。

ここに開示される発明は、本発明者により新たに見出された、アポフェリチンのＰｄイオン結合サイトまたはＲｈ錯体結合サイトの構成（位置および結合に関与するアミノ酸残基）に関する知見を利用して好適に実施することができる。かかる知見の要部は、Ｐｄイオン結合サイトについては後述する表１に、Ｒｈ錯体結合サイトについては同じく表２にまとめられている。
上記知見は、特定の化学種を内部空間側に結合させたアポフェリチンをカドミウム（Ｃｄ）イオンの存在下で結晶化し、該結晶についてＸ線結晶構造解析を行って得られたものである。ここで、結晶化のために使用したＣｄイオンを解析対象であるＰｄイオンまたはＲｈイオンから区別するため、ピーク波長による異常分散効果の差を利用して結晶構造解析を行った。ここに開示される発明は、かかる共通の解析手法をＰｄイオンおよびＲｈ錯体にそれぞれ適用することによって得られた知見に基づいてなされたものである。

上記知見を利用して、特定の化学種の結合サイトの数をアポフェリチン本来の数よりも減らす改変が施された改変アポフェリチンを設計および／または製造することができる。ここで、上述のようにアポフェリチンは２４個のフェリチンモノマーからなるところ、上記結合サイトの構成は各フェリチンモノマーに共通である。したがって、該フェリチンモノマーを構成するアミノ酸残基のうち上記結合サイトのうち一部種類のサイトにおいて結合に関与するアミノ酸残基を他の（結合に寄与しない、あるいは寄与の少ない）アミノ酸残基に置換することにより、該一部種類のサイトの結合能を失わせることができる。このように特定の化学種の結合サイトおよび該結合に関与するアミノ酸残基を把握し、それらのうち結合能を失わせようとするサイトを選択し、さらに改変（置換）の対象となる具体的なアミノ酸残基を選択することにより、目的に応じて結合サイトの数が改変された改変アポフェリチン（該改変アポフェリチンのアミノ酸配列）を設計することができる。

各結合サイトにおいて結合に関与するアミノ酸残基は、表１および表２に示されるように、一のアミノ酸残基であることもあり、二以上のアミノ酸残基であることもある。二以上のアミノ酸残基が関与するサイトについて結合能を失わせる改変を行う場合には、それら結合に関与する複数のアミノ酸残基の全てを改変してもよく一部のアミノ酸残基を改変してもよい。通常は、結合への寄与の大きいいずれか一のアミノ酸残基を改変することが効率的であり望ましい。例えばＰｄイオン結合サイトの場合には、上記「寄与の大きいアミノ酸」として、Ｐｄイオン配位性の高い官能基（典型的には、チオール基、イミダゾール環、カルボキシル基）を有するアミノ酸残基を好ましく選択することができる。

なお、上記のようにアミノ酸残基の一部が他のアミノ酸残基に置換された改変アポフェリチンは、一般的なタンパク質変異体の製造に用いられる各種の技法を適宜採用して作製することができる。例えば、当該改変後（置換後）のアミノ酸配列をコードする遺伝子（ＤＮＡ）を化学合成し、該合成遺伝子と上記アミノ酸配列を宿主細胞内で発現させるための種々の調節エレメントとからなる発現用遺伝子構築物を有する組換えベクターを、宿主細胞に応じて構築する。この組み換えベクターを一般的な技法によって適当な宿主細胞（例えば大腸菌）に導入し、所定の条件で当該宿主細胞を培養する。これにより目的とする改変アポフェリチンを細胞内で発現、生産させることができる。なお、組換えベクターの構築方法及び構築した組換えベクターの宿主細胞への導入方法等は、当該分野で従来から行われている方法をそのまま採用すればよく、かかる方法自体は特に本発明を特徴付けるものではないため、詳細な説明は省略する。あるいは、遺伝子工学的手法に代えて化学合成によって目的とするタンパク質（改変アポフェリチン）を構築してもよい。

改変アポフェリチンを用いての金属粒子の製造は、当該改変アポフェリチンを使用する点以外は通常の（天然の）アポフェリチンを用いた金属粒子の製造と同様にして行うことができる。例えば、改変アポフェリチンのＰｄイオン結合サイトにＰｄイオンを結合させる際には、適当な溶媒中において改変アポフェリチンとＰｄイオン源（上記溶媒に溶解してＰｄイオンを供給し得るＰｄ化合物）とを混合するとよい。溶媒としては例えば水を好ましく用いることができ、あるいは水および水と均一に混合し得る有機溶媒との混合溶媒を用いてもよい。該混合溶媒を構成する有機溶媒の好適例としては、アセトン、メタノール、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等が挙げられる。通常は、改変アポフェリチンの有するＰｄイオン結合サイトの数に対して過剰量のＰｄイオンを含むＰｄイオン源を使用することが好ましい。このことによって、改変アポフェリチンの有するＰｄイオン結合サイトの数がよりよく反映された数のＰｄイオンを該改変アポフェリチンに結合させることができる。例えば、Ｐｄイオン結合サイトの数に対して凡そ１．２当量以上（典型的には凡そ１．２〜１０当量）、好ましくは凡そ１．５当量（典型的には凡そ１．５〜５当量）のＰｄイオンを含む量のＰｄイオン源を使用するとよい。特に限定するものではないが、上記のように改変アポフェリチンとＰｄイオンとを混合する際の温度は例えば凡そ４〜７０℃程度とすることができ、混合時間は例えば凡そ１分〜２時間程度とすることができる。その後、次工程（例えば、Ｐｄイオンを還元する工程）に進む前に、過剰のＰｄイオンを除去してＰｄイオン−改変アポフェリチン複合体を精製するとよい。この精製は、透析、ゲルろ過等の従来公知のタンパク質精製方法を適宜採用して行うことができる。

また、Ｐｄイオン−改変アポフェリチン複合体に含まれるＰｄイオンを還元する方法としては、例えば、該複合体を含む溶液（例えば水溶液）に適当な還元剤を添加して混合する方法を採用することができる。還元剤としては、例えばＮａＢＨ_４、Ｎ_２Ｈ_４、ＮａＨ_２ＰＯ_２、ＮａＢＨ_３ＣＮ等を使用することができる。この還元反応は、例えば、凡そ４〜７０℃程度の温度で、凡そ１分〜２４時間かけて行うことができる。改変アポフェリチンに結合した非Ｐｄイオン（例えばＡｕイオン）の還元も同様にして行うことができる。なお、ここに開示される金属粒子製造方法は、改変アポフェリチンに金属イオン（Ｐｄイオンおよび／または非Ｐｄイオン）を結合させ、その結合した金属イオンを還元する（典型的には、金属に還元する）過程を複数回行うものであってもよい。

ここに開示される方法により得られる金属粒子の直径は、典型的にはアポフェリチンの内部空間の直径と同等以下（すなわち凡そ８ｎｍ以下、典型的には凡そ１〜８ｎｍ）であり、好ましくは５ｎｍ以下（典型的には凡そ１〜５ｎｍ）、より好ましくは３ｎｍ以下（典型的には凡そ１〜３ｎｍ）である。

改変アポフェリチンへのＲｈ錯体の結合は、当該改変アポフェリチンを使用する点以外は通常の（天然の）アポフェリチンにＲｈ錯体を結合させる場合と同様にして行うことができる。例えば、適当な溶媒中において改変アポフェリチンとＲｈ錯体（またはその塩）とを混合するとよい。溶媒としては例えば水を好ましく用いることができ、あるいは水と均一に混合し得る有機溶媒と水との混合溶媒を用いてもよい。該混合溶媒を構成する有機溶媒の好適例としては、アセトン、メタノール、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、アセトニトリル等が挙げられる。通常は、改変アポフェリチンの有するＲｈ錯体結合サイトの数に対して過剰量のＲｈ錯体を使用することが好ましい。このことによって、改変アポフェリチンの有するＲｈ錯体結合サイトの数がよりよく反映された数のＲｈ錯体を該改変アポフェリチンに結合させることができる。例えば、Ｒｈ錯体結合サイトの数に対して凡そ１．２当量以上（典型的には凡そ１．２〜１０当量）のＲｈ錯体を使用するとよい。特に限定するものではないが、上記のように改変アポフェリチンとＲｈ錯体とを混合する際の温度は例えば凡そ４〜７０℃程度とすることができ、混合時間は例えば凡そ１分〜２時間程度とすることができる。該混合は不活性ガス雰囲気下（例えばアルゴンガス、窒素ガスまたはこれらの混合ガス雰囲気下）で行うことが好ましい。

以下、本発明の好適な実施態様をさらに詳細に説明する。なお、以下の例で使用したアポフェリチンは、シグマアルドリッチ社から購入したウマ脾臓アポフェリチンである。かかるアポフェリチンは、公知文献（TAKEDA S et al., BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA 1174 (2): 218-220 AUG
19 1993）に基づいて常法により生合成して得ることもできる。

＜例１：Ｐｄイオン結合サイトの特定＞
アポフェリチンにＰｄイオンを結合させ、該Ｐｄイオン結合アポフェリチンを結晶化してＸ線結晶構造解析を行うことにより、アポフェリチンの内部空間側にあるＰｄイオン結合サイトを特定した。

すなわち、アポフェリチン（以下、「ａｐｏ−Ｆｒ」と表記することがある。）の水溶液に、該アポフェリチンに対して５０当量（パラジウム濃度換算）のＫ_２ＰｄＣｌ_４を添加して約３０分間攪拌した。次いでゲルろ過（カラムＧ２００を使用した。）により精製（アポフェリチンの外部にあるＰｄイオンを除去）することにより、アポフェリチンの内部空間側にＰｄイオンが結合したＰｄイオン−アポフェリチン複合体を得た。以下、この複合体を「５０ｅｑ．Ｐｄ^２＋・ａｐｏ−Ｆｒ」ということがある。
また、Ｋ_２ＰｄＣｌ_４の添加量をアポフェリチンに対して１００当量とした点以外は上記５０ｅｑ．Ｐｄ^２＋・ａｐｏ−Ｆｒの作製と同様にしてＰｄイオン−アポフェリチン複合体（以下、「１００ｅｑ．Ｐｄ^２＋・ａｐｏ−Ｆｒ」ということがある。）を得た。さらに、Ｋ_２ＰｄＣｌ_４の添加量を２００当量とした点以外は上記５０ｅｑ．Ｐｄ^２＋・ａｐｏ−Ｆｒの作製と同様にしてＰｄイオン−アポフェリチン複合体（以下、「２００ｅｑ．Ｐｄ^２＋・ａｐｏ−Ｆｒ」ということがある。）を得た。

次いで、上記で得られた５０ｅｑ．Ｐｄ^２＋・ａｐｏ−Ｆｒを１０〜２０ｍｇ／ｍＬの濃度で含む水溶液に、沈殿剤として１０〜２０ｍＭのＣｄＳＯ_４および０．５〜１Ｍの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４を添加し、２０℃でハンギングドロップ蒸気拡散法を行うことにより、５０ｅｑ．Ｐｄ^２＋・ａｐｏ−Ｆｒの結晶を得た。同様の手法により、１００ｅｑ．Ｐｄ^２＋・ａｐｏ−Ｆｒおよび２００ｅｑ．Ｐｄ^２＋・ａｐｏ−Ｆｒの結晶を得た。

これらのＰｄイオン−アポフェリチン複合体結晶のＸ線結晶構造解析を行い、アポフェリチンの内部空間側にあるＰｄイオンの位置（Ｐｄイオン結合サイトの位置）を特定した。Ｘ線回折実験にはＳＰｒｉｎｇ−８のビームラインＢＬ４１ＸＵを使用した。ここで、各結晶には金属としてＰｄの他にＣｄも含まれているため、これらを区別できるように解析を行う必要がある。そこで本例では、同一の結晶に対し、０．５０８６Åのパラジウムのピーク波長と、０．４６３９Åのカドミウムのピーク波長との二波長でデータを収集し、これらの測定結果における異常分散効果の差を利用して結晶構造解析を行った。すなわち、Ｐｄは０．５０８６Å（パラジウムのピーク波長）において異常分散による密度が強く観測され、一方Ｃｄは０．４６３９Å（カドミウムのピーク）波長において強く観測されることを利用して、これらＰｄおよびＣｄを区別して金属の位置を決定した。なお、５０ｅｑ．Ｐｄ^２＋・ａｐｏ−Ｆｒの解析における分解能は１．６５Åであり、１００ｅｑ．Ｐｄ^２＋・ａｐｏ−Ｆｒの分解能は２．１０Åであり、また２００ｅｑ．Ｐｄ^２＋・ａｐｏ−Ｆｒの分解能は２．５０Åであった。

以上の解析結果から、アポフェリチンを構成するサブユニット当たり１２個のＰｄイオン結合サイトが特定された。各サイトにおいてパラジウムイオンの結合に関与するアミノ酸残基を表１に示す。

＜例２：Ｐｄ粒子の作製＞
まず、通常のアポフェリチンを用いたＰｄ粒子および該Ｐｄ粒子を内包するアポフェリチンの合成例につき、図１に示す合成スキームを参照しつつ説明する。
アポフェリチン［１］の水溶液に、該アポフェリチンに対して５００当量（パラジウムイオン換算）のＫ_２ＰｄＣｌ_４を添加して３０分間攪拌することにより、アポフェリチン［１］のＰｄイオン結合サイトにＰｄイオンを結合させてＰｄイオン−アポフェリチン複合体（Ｐｄ^２＋・ａｐｏ−Ｆｒ）［２］を形成させた。次いでＮａＢＨ_４を加えてＰｄイオンを還元し、さらに透析およびゲルろ過（カラムＧ２００を使用した。）により精製した。このようにして、アポフェリチンの内部空間にパラジウム粒子が収容されたＰｄ粒子内包アポフェリチン［３］を得た。以下、このＰｄ粒子内包アポフェリチンを「Ｐｄ・ａｐｏ−Ｆｒ」と表記することがある。ＩＣＰ金属定量およびブラッドフォード蛋白質定量による分析の結果、このＰｄ・ａｐｏ−Ｆｒはアポフェリチン一個当たり約３２０個（より具体的には、３２３±２８個）のＰｄ原子を含んでいた。また、上記Ｐｄ・ａｐｏ−Ｆｒの透過型顕微鏡（ＴＥＭ）像によれば、該Ｐｄ・ａｐｏ−Ｆｒを構成するＰｄ粒子のサイズは直径２．２ｎｍであった。

次に、上記Ｐｄ・ａｐｏ−Ｆｒに内包されたＰｄ粒子よりも小粒径のＰｄ粒子および該粒子を内包する改変アポフェリチンを合成する方法の一例につき、図２に示す合成スキームを参照しつつ説明する。
まず、表１に示すＰｄイオン結合サイトのうちＰｄイオン結合能を失わせるサイトを決定する。ここでは、上記表中のサイトＬおよびサイトＮのＰｄイオン結合能を失わせる例につき説明する。該サイトへのＰｄイオンの結合に関与するアミノ酸残基であって、かつ他のサイトへのＰｄイオンの結合に関与するアミノ酸残基には該当しないアミノ酸残基を、改変対象となるアミノ酸残基として選択する。例えば、アポフェリチンを構成するＬ−サブユニットであるフェリチンモノマー（１７４個のアミノ酸からなるポリペプチド鎖）のうち第１２４番目のアミノ酸残基であるヒスチジン（Ｈｉｓ１２４）および第１４７番目のアミノ酸残基であるヒスチジン（Ｈｉｓ１４７）を選択することができる。そして、これらの改変対象アミノ酸残基を他のアミノ酸残基に変異させたアポフェリチン、例えばＨｉｓ１２４およびＨｉｓ１４７をいずれもアラニンに変異させた改変アポフェリチン［４］を、例えば上述のように組換えベクターを大腸菌に導入する技法により合成する。以下、この改変アポフェリチンをａｐｏ−Ｆｒ（Ｈ１２４Ａ，Ｈ１４７Ａ）ということがある。

そして、アポフェリチン［１］の代わりに改変アポフェリチンａｐｏ−Ｆｒ（Ｈ１２４Ａ，Ｈ１４７Ａ）［４］を用いて、上述したＰｄ・ａｐｏ−Ｆｒの合成例と同様の操作を行う。例えば、改変アポフェリチン［４］の水溶液に、該改変アポフェリチンに対して５００当量（パラジウムイオン換算）のＫ_２ＰｄＣｌ_４を添加して攪拌することにより、Ｐｄイオン−改変アポフェリチン複合体［５］を形成させる。ここで、改変アポフェリチン［４］ではアポフェリチン［１］の有するＰｄイオン結合サイトのうちフェリチンモノマー当たり２個（アポフェリチン全体では４８個）のＰｄイオン結合サイトが失われていることから、Ｐｄイオン−改変アポフェリチン複合体［５］を構成するＰｄイオンの数はＰｄイオン−アポフェリチン複合体［２］よりも少なくなる。したがって、このＰｄイオン−改変アポフェリチン複合体［５］に還元処理を加え、必要に応じて精製（透析、ゲルろ過等）を行うことにより、Ｐｄ粒子内包アポフェリチン［３］を構成するＰｄ粒子よりも少ない原子数のＰｄ原子からなる（すなわち、より小粒径の）Ｐｄ粒子が改変アポフェリチンの内部空間に収容されたＰｄ粒子内包改変アポフェリチン（Ｐｄ・ａｐｏ−Ｆｒ（Ｈ１２４Ａ，Ｈ１４７Ａ））［６］を得ることができる。

＜例３：Ａｕ−Ｐｄバイメタル粒子（アロイ型）の作製＞
まず、通常のアポフェリチンを用いたＡｕ−Ｐｄバイメタル粒子（合金粒子）の合成例につき、図３に示す合成スキームを参照しつつ説明する。
アポフェリチン［７］の水溶液に、該アポフェリチンに対して５００当量（金イオン換算）のＫＡｕＣｌ_４を添加して攪拌し、ゲルろ過（カラムＧ２５を使用した。）により精製を行ってアポフェリチンの外部にあるＡｕイオンを除去した。このようにして、アポフェリチンの内部空間側にＡｕイオンが結合したＡｕイオン−アポフェリチン複合体［８］を得た。続いて、この複合体［８］の水溶液に、該複合体に対して５００当量（パラジウムイオン換算）のＫ_２ＰｄＣｌ_４を添加して攪拌することにより、Ａｕイオン−アポフェリチン複合体［８］の有するＰｄイオン結合サイトにＰｄイオンを結合させた。このようにして、アポフェリチンの内部空間側にＡｕイオンおよびＰｄイオンが結合したＡｕ／Ｐｄイオン−アポフェリチン複合体［９］を形成させた。次いで、ＮａＢＨ_４を加えて該複合体［９］を構成するＡｕイオンおよびＰｄイオンを共に還元し、透析およびゲルろ過（カラムＧ２００を使用した。）により精製した。このようにして、アポフェリチンの内部空間にＡｕおよびＰｄからなるＡｕ−Ｐｄバイメタル粒子（合金粒子）が収容されたＡｕ−Ｐｄバイメタル粒子内包アポフェリチン［１０］を得た。以下、このＡｕ−Ｐｄバイメタル粒子内包アポフェリチンを「ＡｕＰｄ・ａｐｏ−Ｆｒ」と表記することがある。ＩＣＰ金属定量およびブラッドフォード蛋白質定量による分析の結果、このＡｕＰｄ・ａｐｏ−Ｆｒはアポフェリチン一個当たり約１３５個（１３３±１６個）のＡｕ原子および約１６５個（１６５±４１個）のＰｄ粒子を含んでいた。また、上記ＡｕＰｄ・ａｐｏ−Ｆｒの透過型顕微鏡（ＴＥＭ）像によれば、該ＡｕＰｄ・ａｐｏ−Ｆｒを構成するＡｕ−Ｐｄバイメタル粒子のサイズは直径２．２ｎｍであった。

次に、上記ＡｕＰｄ・ａｐｏ−Ｆｒにおいてアポフェリチンに内包されているＡｕ−Ｐｄバイメタル粒子よりも小粒径であり、かつＡｕの組成比が高められたＡｕ−Ｐｄバイメタル粒子および該粒子を内包する改変アポフェリチンを合成する方法の一例につき、図４に示す合成スキームを参照しつつ説明する。
表１に示すＰｄイオン結合サイトのうちＰｄイオン結合能を失わせるサイトを決定する。例えば、カルボキシル基を有するアミノ酸残基（アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基）が関与するＰｄイオン結合サイトが好ましく選択され得る。ここでは上記表中のサイトＭのＰｄイオン結合能を失わせる例につき説明する。該サイトへのＰｄイオンの結合に関与するアミノ酸残基であって、かつ他のサイトへのＰｄイオンの結合に関与するアミノ酸残基には該当しないアミノ酸残基（カルボキシル基を有するアミノ酸残基を好ましく選択し得る。）を、改変対象となるアミノ酸残基として選択する。例えば、フェリチンモノマーの第１３６番目のアミノ酸残基であるグルタミン酸（Ｇｌｕ１３６）を選択することができる。そして、このＧｌｕ１３６を他のアミノ酸残基、例えばグリシンに変異させた改変アポフェリチン［１１］を、例えば上述のように組換えベクターを大腸菌に導入する技法により合成する。以下、この改変アポフェリチンをａｐｏ−Ｆｒ（Ｅ１３６Ｇ）ということがある。

アポフェリチン［７］の代わりに改変アポフェリチンａｐｏ−Ｆｒ（Ｅ１３６Ｇ）［１１］を用いて、上述したＡｕＰｄ・ａｐｏ−Ｆｒの合成例と同様の操作を行う。例えば、改変アポフェリチン［１１］の水溶液に、該改変アポフェリチンに対して５００当量（金イオン換算）のＫＡｕＣｌ_４を添加して攪拌し、ゲルろ過により精製してＡｕイオン−改変アポフェリチン複合体［１２］を得る。ここで、グルタミン酸の有する官能基であるカルボキシル基は、Ｐｄイオンに対して高い配位性を示すがＡｕイオンに対しては配位性を示さないことから、Ｇｌｕ１３６をグリシンに変異させたａｐｏ−Ｆｒ（Ｅ１３６Ｇ）へのＡｕイオン結合量（Ａｕイオン−改変アポフェリチン複合体［１２］に含まれるＡｕイオンの量）は、典型的には改変されていないアポフェリチンへのＡｕイオン結合量（Ａｕイオン−アポフェリチン複合体［８］に含まれるＡｕイオンの量）と略同等となる。

続いて、得られたＡｕイオン−改変アポフェリチン複合体［１２］の水溶液に、該複合体に対して５００当量（パラジウムイオン換算）のＫ_２ＰｄＣｌ_４を添加して攪拌することにより、Ａｕイオン−アポフェリチン複合体［１２］の有するＰｄイオン結合サイトにＰｄイオンを結合させてＡｕ／Ｐｄイオン−アポフェリチン複合体［１３］を形成させる。ここで、改変アポフェリチン［１１］では、アポフェリチン［７］の有するＰｄイオン結合サイトのうちフェリチンモノマー当たり１個（アポフェリチン全体では２４個）のＰｄイオン結合サイトが失われている。このため、Ａｕ／Ｐｄイオン−改変アポフェリチン複合体［１３］を構成するＰｄイオンの数は、Ａｕ／Ｐｄイオン−アポフェリチン複合体［９］よりも少なくなる。したがって、この複合体［１３］に還元処理を加え、必要に応じて精製（透析、ゲルろ過等）を行うことにより、Ａｕ−Ｐｄバイメタル粒子内包アポフェリチン［１０］を構成するバイメタル粒子よりもＰｄの原子数が少なく（このためＡｕの組成比がより高く）、したがってＡｕとＰｄとの合計原子数がより少ない（より小粒径の）Ａｕ−Ｐｄバイメタル粒子（合金粒子）が改変アポフェリチンの内部空間に収容された、Ａｕ−Ｐｄバイメタル粒子内包改変アポフェリチン（ＡｕＰｄ・ａｐｏ−Ｆｒ（Ｅ１３６Ｇ））［１４］を得ることができる。

＜例４：Ａｕ−Ｐｄバイメタル粒子（コアシェル型）の作製＞
まず、通常のアポフェリチンを用いたＡｕ−Ｐｄバイメタル粒子（コアシェル型粒子）の合成例につき、図５に示す合成スキームを参照しつつ説明する。
アポフェリチン［１５］の水溶液に、該アポフェリチンに対して５００当量（金イオン換算）のＫＡｕＣｌ_４を添加して攪拌し、次いでＮａＢＨ_４を加えてＡｕ還元することにより、アポフェリチンの内部空間にＡｕ粒子が収容されたＡｕ粒子内包アポフェリチン［１６］を得た。その後、このＡｕ粒子内包アポフェリチン［１６］の水溶液に、該Ａｕ粒子内包アポフェリチンに対して５００当量（パラジウムイオン換算）のＫ_２ＰｄＣｌ_４を添加して攪拌した。これにより、Ａｕ粒子内包アポフェリチン［１６］の有するＰｄイオン結合サイトにＰｄイオンを結合させて、Ｐｄイオン−Ａｕ粒子内包アポフェリチン複合体［１７］を形成した。次いで、ＮａＢＨ_４を加えて該複合体［１７］を構成するＰｄイオンを還元し、透析およびゲルろ過（カラムＧ２００を使用した。）により精製した。このようにして、Ａｕ粒子（コア）の周囲にＰｄが集積した構成（コアシェル型）のＡｕ−Ｐｄバイメタル粒子が収容されたＡｕ−Ｐｄバイメタル粒子内包アポフェリチン［１８］を得た。以下、このコアシェル型のＡｕ−Ｐｄバイメタル粒子を内包するアポフェリチンを「（Ａｕ）Ｐｄ・ａｐｏ−Ｆｒ」と表記することがある。ＩＣＰ金属定量およびブラッドフォード蛋白質定量による分析の結果、上記（Ａｕ）Ｐｄ・ａｐｏ−Ｆｒはアポフェリチン一個当たり約２００個（２０１±９個）のＡｕ原子および約３０５個（３０５±３３個）のＰｄ粒子を含んでいた。また、上記（Ａｕ）Ｐｄ・ａｐｏ−Ｆｒの透過型顕微鏡（ＴＥＭ）像によれば、該（Ａｕ）Ｐｄ・ａｐｏ−Ｆｒを構成するコアシェル型Ａｕ−Ｐｄバイメタル粒子のサイズは直径２．４ｎｍであった。

次に、上記（Ａｕ）Ｐｄ・ａｐｏ−Ｆｒにおいてアポフェリチンに内包されているコアシェル型Ａｕ−Ｐｄバイメタル粒子よりも小粒径であり、かつＡｕの組成比が高められた（換言すれば、シェル成分であるＰｄが組成比がより少ない）Ａｕ−Ｐｄバイメタル粒子および該粒子を内包する改変アポフェリチンを合成する方法の一例につき、図６に示す合成スキームを参照しつつ説明する。
表１に示すＰｄイオン結合サイトのうちＰｄイオン結合能を失わせるサイトを決定する。例えば、カルボキシル基を有するアミノ酸残基（アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基）が関与するＰｄイオン結合サイトが好ましく選択され得る。上記サイトへのＰｄイオンの結合に関与するアミノ酸残基であって、かつ他のサイトへのＰｄイオンの結合に関与するアミノ酸残基には該当しないアミノ酸残基（カルボキシル基を有するアミノ酸残基を好ましく選択し得る。）を、改変対象となるアミノ酸残基として選択する。ここでは、上述したＡｕ−Ｐｄバイメタル粒子内包改変アポフェリチンの作製と同じ改変アポフェリチン（ａｐｏ−Ｆｒ（Ｅ１３６Ｇ））を用いた例について説明する。

アポフェリチン［１５］の代わりに改変アポフェリチンａｐｏ−Ｆｒ（Ｅ１３６Ｇ）［１９］を用いて、上述した（Ａｕ）Ｐｄ・ａｐｏ−Ｆｒの合成例と同様の操作を行う。例えば、改変アポフェリチン［１９］の水溶液に、該改変アポフェリチンに対して５００当量（金イオン換算）のＫＡｕＣｌ_４を添加して攪拌し、次いでＮａＢＨ_４を加えてＡｕ還元することにより、改変アポフェリチンの内部空間にＡｕ粒子が収容されたＡｕ粒子内包改変アポフェリチン［２０］を得る。このＡｕ粒子内包改変アポフェリチン［２０］の水溶液に、該Ａｕ粒子内包改変アポフェリチンに対して５００当量（パラジウムイオン換算）のＫ_２ＰｄＣｌ_４を添加して攪拌する。これにより、Ａｕ粒子内包改変アポフェリチン［２０］の有するＰｄイオン結合サイトにＰｄイオンを結合させて、Ｐｄイオン−Ａｕ粒子内包改変アポフェリチン複合体［２１］を形成する。ここで、改変アポフェリチン［１９］では、アポフェリチン［１５］の有するＰｄイオン結合サイトのうちフェリチンモノマー当たり１個（アポフェリチン全体では２４個）のＰｄイオン結合サイトが失われている。このため、Ｐｄイオン−Ａｕ粒子内包改変アポフェリチン複合体［２１］を構成するＰｄイオンの数は、Ｐｄイオン−Ａｕ粒子内包アポフェリチン複合体［１７］よりも少なくなる。このＰｄイオン−Ａｕ粒子内包改変アポフェリチン複合体［２１］に還元処理を加え、必要に応じて精製（透析、ゲルろ過等）を行うことにより、Ａｕ−Ｐｄバイメタル粒子内包アポフェリチン［１８］を構成するＡｕ−Ｐｄバイメタル粒子よりもＰｄの原子数が少なく（このためＡｕの組成比がより高く）、したがってＡｕとＰｄとの合計原子数がより少ない（より小粒径の）Ａｕ−Ｐｄバイメタル粒子（コアシェル型粒子）が改変アポフェリチンの内部空間に収容されたＡｕ−Ｐｄバイメタル粒子内包改変アポフェリチン（（Ａｕ）Ｐｄ・ａｐｏ−Ｆｒ（Ｅ１３６Ｇ））［２２］を得ることができる。

＜例５：Ｒｈ錯体結合サイトの特定＞
ロジウムノルボルナジエン錯体（以下、「Ｒｈ（ｎｂｄ）錯体」と表記することもある。）をアポフェリチンに結合させ、該ロジウム錯体結合アポフェリチンを結晶化してＸ線結晶構造解析を行うことによって、アポフェリチンの内部空間側にあるロジウム錯体結合サイトを特定した。

すなわち、図７に示すように、アポフェリチン（ａｐｏ−Ｆｒ）の水溶液に、式［Ｒｈ（ｎｂｄ）Ｃｌ］_２で表されるロジウム二核錯体を、該アポフェリチンに対して１００当量（ロジウム濃度換算）となるように添加した。なお、ここで使用したロジウム二核錯体はシグマアルドリッチ社より購入したものである。２５℃で１時間攪拌した後、透析およびゲルろ過（カラムＧ２００を使用した。）を行って精製することにより、アポフェリチンにＲｈ（ｎｂｄ）錯体が結合したロジウム錯体−アポフェリチン複合体を得た。ＩＣＰ金属定量およびブラッドフォード蛋白質定量による分析の結果、この複合体ではアポフェリチン１分子当たり２０個のロジウム錯体が該アポフェリチンの内部空間側に結合していることがわかった。以下、このロジウム錯体−アポフェリチン複合体を「２０Ｒｈ（ｎｂｄ）・ａｐｏ−Ｆｒ」または「２０Ｒｈ・ａｐｏ−Ｆｒ」と表記することがある。

また、［Ｒｈ（ｎｂｄ）Ｃｌ］_２の添加量をアポフェリチンに対して２００当量（ロジウム濃度換算）に変更した点以外は２０Ｒｈ（ｎｂｄ）Ｆｒの作製と同様にして、アポフェリチンにＲｈ（ｎｂｄ）錯体が結合したロジウム錯体−アポフェリチン複合体を得た。上記と同様に分析を行ったところ、この複合体ではアポフェリチン１分子当たり６０個のロジウム錯体が該アポフェリチンの内部空間側に結合していることがわかった。以下、このロジウム錯体−アポフェリチン複合体を「６０Ｒｈ（ｎｂｄ）・ａｐｏ−Ｆｒ」または「６０Ｒｈ・ａｐｏ−Ｆｒ」と表記することがある。

上記２０Ｒｈ・ａｐｏ−Ｆｒを１０〜２０ｍｇ／ｍＬの濃度で含む水溶液に、沈殿剤として２０〜３５ｍＭのＣｄＳＯ_４および０．２５〜０．５Ｍの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４を添加し、２０℃でハンギングドロップ蒸気拡散法を行うことにより、２０Ｒｈ・ａｐｏ−Ｆｒの結晶を得た。同様の手法により６０Ｒｈ・ａｐｏ−Ｆｒの結晶を得た。

これらのロジウム錯体−アポフェリチン複合体結晶のＸ線結晶構造解析を行うことにより、アポフェリチンの内部空間側におけるロジウム錯体の結合位置を特定した。Ｘ線回折実験にはＳＰｒｉｎｇ−８のビームラインＢＬ４１ＸＵを使用した。ここで、各結晶には金属としてＲｈの他にＣｄも含まれているため、これらを区別できるように解析を行う必要がある。そこで、同一の結晶に対し、０．５３３４Åのロジウムのピーク波長と、０．４６３９Åのカドミウムのピーク波長との二波長でデータを収集し、これらの測定結果における異常分散効果の差を利用して結晶構造解析を行った。すなわち、Ｒｈは０．５３３４Å（ロジウムのピーク波長）において異常分散による密度が強く観測され、一方Ｃｄは０．４６３９Å（カドミウムのピーク波長）において強く観測されることを利用して、これらＲｈおよびＣｄを区別して金属の位置を決定した。なお、２０Ｒｈ・ａｐｏ−Ｆｒの解析における分解能は１．４Åであり、６０Ｒｈ・ａｐｏ−Ｆｒの解析における分解能は１．８Åであった。

以上の解析結果から、アポフェリチンを構成するサブユニット当たり３個のＲｈ（ｎｂｄ）錯体結合サイトが特定された。各サイトにおいてＲｈ（ｎｂｄ）錯体の結合に関与するアミノ酸残基を表２に示す。これらのサイトの位置は、いずれも２０Ｒｈ・ａｐｏ−Ｆｒと６０Ｒｈ・ａｐｏ−Ｆｒとで共通であった。

＜例６：Ｒｈ錯体−アポフェリチン複合体の利用＞
上記で作製した二種類のＲｈ錯体−アポフェリチン複合体（２０Ｒｈ・ａｐｏ−Ｆｒ，６０Ｒｈ・ａｐｏ−Ｆｒ）をそれぞれ重合触媒に用いてフェニルアセチレンの重合を行った（図８参照）。より具体的には、ロジウム錯体−アポフェリチン複合体を１μＭ、ＮａＯＨを０．６ｍＭ、ＮａＣｌを１５Ｍの濃度で含む水溶液に、フェニルアセチレンを３ｍＭの濃度となるように添加し、アルゴン雰囲気下において３０℃で６時間攪拌することによりフェニルアセチレンを重合させた。
また、比較のため、上記ロジウム錯体−アポフェリチン複合体の代わりに［Ｒｈ（ｎｂｄ）Ｃｌ］_２を単独で（アポフェリチンとの複合体を形成することなく）重合触媒に用いてフェニルアセチレンを重合させた。この［Ｒｈ（ｎｂｄ）Ｃｌ］_２の系内における濃度は２０μＭとした。

得られたポリフェニルアセチレンをＣＨＣｌ_３に溶解し、ゲル透過クロマトグラフィ（ＧＰＣ）測定によりポリスチレン換算の平均分子量および分子量分布を求めた。それらの結果を表３に示す。

表３からわかるように、［Ｒｈ（ｎｂｄ）Ｃｌ］_２を重合触媒に用いた場合に比べて、Ｒｈ錯体−アポフェリチン複合体を重合触媒に用いた場合には、２０Ｒｈ・ａｐｏ−Ｆｒおよび６０Ｒｈ・ａｐｏ−Ｆｒのいずれにおいても、より数平均分子量が低く、より分子量分布の狭いポリフェニルアセチレンが得られた。２０Ｒｈ・ａｐｏ−Ｆｒと６０Ｒｈ・ａｐｏ−Ｆｒとでは得られたポリフェニルアセチレンの分子量（重合度）はほぼ同程度であり、いずれも１万程度であった。これは、Ｒｈ錯体−アポフェリチン複合体を重合触媒に用いると該アポフェリチンの内部空間でポリマーが伸長するため、重合度が規制された狭い分子量分布をもつポリマーが得られたものと考えられる。

上記Ｒｈ錯体−アポフェリチン複合体では、表２に示す３種類のＲｈ錯体結合サイト（サイトＰ〜Ｒ）に結合したＲｈ錯体がいずれも重合触媒として機能し得る。ここで、これらのＲｈ錯体の重合活性は結合サイトの種類毎に異なり得る。上記Ｒｈ錯体結合サイトＰ〜Ｒのうちいずれか一種類の結合サイト、例えばサイトＱのみにＲｈ錯体を結合させた複合体を重合触媒に用いれば、Ｒｈ錯体の重合活性がより均一化されることから、より分子量分布の狭いポリマーが合成され得る。
このようにサイトＱのみにＲｈ錯体を結合させた複合体は、該サイトＱがＲｈ錯体結合能を維持し、且つサイトＰおよびサイトＲのＲｈ錯体結合能を失わせるような改変が施された改変アポフェリチンにＲｈ錯体を結合させることにより得ることができる。かかる改変アポフェリチンは、例えば、フェリチンモノマーの第１１４番目のアミノ酸残基であるヒスチジン（Ｈｉｓ１１４）をアラニンに変異させ、また第４８番目のアミノ酸残基であるシステイン（Ｃｙｓ４８）をグリシンに変異させた改変アポフェリチンを、上述のように組換えベクターを大腸菌に導入する技法により合成することによって得ることができる。以下、この改変アポフェリチンをａｐｏ−Ｆｒ（Ｈ１１４Ａ，Ｃ４８Ｇ）ということがある。
このａｐｏ−Ｆｒ（Ｈ１１４Ａ，Ｃ４８Ｇ）を使用する点以外は上記６０Ｒｈ・ａｐｏ−Ｆｒの合成と同様にして、ａｐｏ−Ｆｒ（Ｈ１１４Ａ，Ｃ４８Ｇ）にロジウム錯体が結合したＲｈ錯体−改変アポフェリチン複合体を製造することができる。そして、該複合体を用いてアセチレン系モノマー（例えばフェニルアセチレン）を重合させることにより、６０Ｒｈ・ａｐｏ−Ｆｒを用いた場合よりもさらに分子量分布の狭いポリマー（ポリフェニルアセチレン）が合成され得る。

なお、上記実施形態ではウマ脾臓由来のフェリチン（すなわち、配列番号１に示すＬ鎖（light-chain）および／または配列番号２に示すＨ鎖（heavy-chain）から構成される合計２４個のサブユニットから構成される。）を使用しているが、ウマ脾臓由来のフェリチンに限定されず、ウマの他の器官、組織または細胞由来のフェリチン（典型的には、配列番号１に示すＬ鎖および配列番号２に示すＨ鎖から構成されるフェリチン。ただし該フェリチンを構成するＬ鎖とＨ鎖の割合は産生される部位によって異なり得る。）における上記（Ａ）〜（Ｎ）に対応するＰｄ結合サイトから選択される一または二以上のサイト、あるいは上記（Ｐ）〜（Ｒ）に対応するＲｈ錯体結合サイトから選択される一または二以上のサイトについて同様の改変を行うことにより、上記と同様の効果が達成され得る。あるいは、ウマ以外の他の生物種に由来するフェリチンにおける上記（Ａ）〜（Ｎ）に対応するＰｄ結合サイトから選択される一または二以上のサイト、あるいは上記（Ｐ）〜（Ｒ）に対応するＲｈ錯体結合サイトから選択される一または二以上のサイトについて同様の改変を行うことにより、上記と同様の効果が達成され得る。
なお、上記実施形態のように改変アポフェリチンを構成するサブユニット（上記の例ではウマ脾臓フェリチンＬ鎖）を大腸菌等の異種細胞で生合成する場合、本発明の効果達成に関係しない一個から数個程度のアミノ酸残基の置換（典型的には同類置換）はあり得る。例えば、大腸菌を使用する場合にはウマ脾臓フェリチンＬ鎖のＮ末端から９３番目のプロリン残基がロイシン残基に置換され得るが、本発明の実施には影響しない。

以上の説明から明らかなように、本発明は他の側面として、アポフェリチンに特定の化学種（金属イオン、金属錯体等）が結合する結合サイトを見つける工程と、その見つけた結合サイトの一部または全部について上記特定の化学種との結合能を失わせたアミノ酸配列を有する改変アポフェリチンを合成する工程と、を含む改変アポフェリチンの作製方法を提供する。
上記特定の化学種は例えばＰｄイオンであり得る。本発明は他の側面として、アポフェリチンにＰｄイオンが結合する結合サイトを見つける工程と、その見つけた結合サイトの一部についてＰｄイオンとの結合能を失わせたアミノ酸配列を有する改変アポフェリチンを作製する工程と、該改変アポフェリチンにＰｄイオンを結合させる工程とを包含する、Ｐｄを含む金属粒子の合成方法および該合成に適した改変アポフェリチンの作製方法を提供する。
また、上記特定の化学種は例えばＲｈ錯体であり得る。本発明は他の側面として、アポフェリチンにＲｈ錯体が結合する結合サイトを見つける工程と、その見つけた結合サイトの一部についてＲｈ錯体との結合能を失わせたアミノ酸配列を有する改変アポフェリチンを作製する工程と、該改変アポフェリチンにＲｈ錯体を結合させる工程とを包含する、Ｒｈ錯体−改変アポフェリチン複合体の合成方法および該合成に適した改変アポフェリチンの作製方法を提供する。

アポフェリチンを用いてＰｄ粒子を製造する方法を模式的に示す説明図である。 改変アポフェリチンを用いてＰｄ粒子を製造する方法を模式的に示す説明図である。 アポフェリチンを用いてアロイ型のＡｕ−Ｐｄバイメタル粒子を製造する方法を模式的に示す説明図である。 改変アポフェリチンを用いてアロイ型のＡｕ−Ｐｄバイメタル粒子を製造する方法を模式的に示す説明図である。 アポフェリチンを用いてコアシェル型のＡｕ−Ｐｄバイメタル粒子を製造する方法を模式的に示す説明図である。 改変アポフェリチンを用いてコアシェル型のＡｕ−Ｐｄバイメタル粒子を製造する方法を模式的に示す説明図である。 Ｒｈ錯体−アポフェリチン複合体の製造方法を模式的に示す説明図である。 Ｒｈ錯体−アポフェリチン複合体を用いてフェニルアセチレンを重合する方法を模式的に示す説明図である。

Claims (9)

1. アポフェリチンの内部空間側にパラジウム（Ｐｄ）イオンを結合可能な複数のＰｄイオン結合サイトのうち一部個数のサイトにつき、該Ｐｄイオン結合サイトへのＰｄイオンの結合に関与するアミノ酸残基を置換および／または修飾することにより、前記Ｐｄイオン結合サイトの数をアポフェリチン本来の数よりも少なくする改変が施された改変アポフェリチンを用意すること；
   該改変アポフェリチンの有する前記Ｐｄイオン結合サイトにＰｄイオンを結合させてＰｄイオン−改変アポフェリチン複合体を得ること；および、
   該複合体に含まれるＰｄイオンを還元して前記改変アポフェリチンの内部空間にＰｄを含む金属粒子を形成すること；
   を含む、金属粒子の製造方法。
2. 前記改変アポフェリチンは、以下の（Ａ）〜（Ｎ）のＰｄイオン結合サイト：
   （Ａ）アポフェリチンを構成するフェリチンモノマーの第４５番目のアミノ酸残基であるグルタミン酸が関与するＰｄイオン結合サイト；
   （Ｂ）アポフェリチンを構成するフェリチンモノマーの第４８番目のアミノ酸残基であるシステインが関与するＰｄイオン結合サイト；
   （Ｃ）アポフェリチンを構成するフェリチンモノマーの第４９番目のアミノ酸残基であるヒスチジンが関与するＰｄイオン結合サイト；
   （Ｄ）アポフェリチンを構成するフェリチンモノマーの第５２番目のアミノ酸残基であるアルギニンが関与するＰｄイオン結合サイト；
   （Ｅ）アポフェリチンを構成するフェリチンモノマーの第５３番目のアミノ酸残基であるグルタミン酸が関与するＰｄイオン結合サイト；
   （Ｆ）アポフェリチンを構成するフェリチンモノマーの第６４番目のアミノ酸残基であるアルギニンが関与するＰｄイオン結合サイト；
   （Ｇ）アポフェリチンを構成するフェリチンモノマーの第６８番目のアミノ酸残基であるメチオニンが関与するＰｄイオン結合サイト；
   （Ｈ）アポフェリチンを構成するフェリチンモノマーの第９６番目のアミノ酸残基であるメチオニンが関与するＰｄイオン結合サイト；
   （Ｉ）アポフェリチンを構成するフェリチンモノマーの第１２６番目のアミノ酸残基であるシステインが関与するＰｄイオン結合サイト；
   （Ｊ）アポフェリチンを構成するフェリチンモノマーの第１２７番目のアミノ酸残基であるアスパラギン酸が関与するＰｄイオン結合サイト；
   （Ｋ）アポフェリチンを構成するフェリチンモノマーの第１３０番目のアミノ酸残基であるグルタミン酸が関与するＰｄイオン結合サイト；
   （Ｌ）アポフェリチンを構成するフェリチンモノマーの第１２４番目のアミノ酸残基であるヒスチジンが関与するＰｄイオン結合サイト；
   （Ｍ）アポフェリチンを構成するフェリチンモノマーの第１３６番目のアミノ酸残基であるグルタミン酸が関与するＰｄイオン結合サイト；および、
   （Ｎ）アポフェリチンを構成するフェリチンモノマーの第１４７番目のアミノ酸残基であるヒスジチンが関与するＰｄイオン結合サイト；
   のうち少なくとも一種類のＰｄイオン結合サイトがＰｄイオン結合能を維持し、且つ他の少なくとも一種類のＰｄイオン結合サイトのＰｄイオン結合能を失わせるような改変が施された改変アポフェリチンである、請求項１に記載の方法。
3. 前記改変アポフェリチンは、以下の（ａ）〜（ｎ）のアミノ酸残基：
   （ａ）前記フェリチンモノマーの第４５番目のアミノ酸残基であるグルタミン酸；
   （ｂ）前記フェリチンモノマーの第４８番目のアミノ酸残基であるシステイン；
   （ｃ）前記フェリチンモノマーの第４９番目のアミノ酸残基であるヒスチジン；
   （ｄ）前記フェリチンモノマーの第５２番目のアミノ酸残基であるアルギニン；
   （ｅ）前記フェリチンモノマーの第５３番目のアミノ酸残基であるグルタミン酸；
   （ｆ）前記フェリチンモノマーの第６４番目のアミノ酸残基であるアルギニン；
   （ｇ）前記フェリチンモノマーの第６８番目のアミノ酸残基であるメチオニン；
   （ｈ）前記フェリチンモノマーの第９６番目のアミノ酸残基であるメチオニン；
   （ｉ）前記フェリチンモノマーの第１２６番目のアミノ酸残基であるシステイン；
   （ｊ）前記フェリチンモノマーの第１２７番目のアミノ酸残基であるアスパラギン酸；
   （ｋ）前記フェリチンモノマーの第１３０番目のアミノ酸残基であるグルタミン酸；
   （ｌ）前記フェリチンモノマーの第１２４番目のアミノ酸残基であるヒスチジン；
   （ｍ）前記フェリチンモノマーの第１３６番目のアミノ酸残基であるグルタミン酸；および、
   （ｎ）前記フェリチンモノマーの第１４７番目のアミノ酸残基であるヒスジチン；
   のうち少なくとも一種類のアミノ酸残基を維持し、且つ他の少なくとも一種類のアミノ酸残基を置換および／または修飾するような改変が施された改変アポフェリチンである、請求項２に記載の方法。
4. 前記改変アポフェリチンの内部空間側に金（Ａｕ）イオンを結合させること；
   そのＡｕイオン−改変アポフェリチン複合体の有する前記Ｐｄイオン結合サイトにＰｄイオンを結合させること；および、
   該Ａｕ／Ｐｄイオン−改変アポフェリチン複合体の有するＡｕイオンおよびＰｄイオンを共に還元して前記改変アポフェリチンの内部空間にＡｕおよびＰｄを含む金属粒子を形成すること；
   を含む、請求項２または３に記載の方法。
5. 前記改変アポフェリチンの内部空間側にＡｕイオンを結合させること；
   該Ａｕイオン結合改変アポフェリチンの有するＡｕイオンを還元して前記改変アポフェリチンの内部空間にＡｕを含む金属粒子を形成すること；
   前記Ａｕを含む金属粒子を内包する前記改変アポフェリチンの有する前記Ｐｄイオン結合サイトにＰｄイオンを結合させること；および、
   Ｐｄイオン結合改変アポフェリチンの有するＰｄイオンを還元して前記Ａｕを含む金属粒子の外側にＰｄが堆積した金属粒子を形成すること；
   を含む、請求項２または３に記載の方法。
6. アポフェリチンの内部空間側にロジウム（Ｒｈ）錯体を結合可能な複数のＲｈ錯体結合サイトのうち一部個数のサイトにつき、該Ｒｈ錯体結合サイトへのＲｈ錯体の結合に関与するアミノ酸残基を置換および／または修飾することにより、前記Ｒｈ錯体結合サイトの数をアポフェリチン本来の数よりも少なくする改変が施された改変アポフェリチンを用意すること；および、
   該改変アポフェリチンの有する前記Ｒｈ錯体結合サイトにＲｈ錯体を結合させること；
   を包含する、Ｒｈ錯体−改変アポフェリチン複合体の製造方法。
7. 前記Ｒｈ錯体は、シクロヘキサジエン骨格またはシクロオクタジエン骨格を有する配位子がＲｈに配位してなる錯体である、請求項６に記載の方法。
8. 前記改変アポフェリチンは、以下のＲｈ錯体結合サイト：
   （Ｐ）アポフェリチンを構成するフェリチンモノマーの第４８番目のアミノ酸残基であるシステインが関与するＲｈ錯体結合サイト；
   （Ｑ）アポフェリチンを構成するフェリチンモノマーの第４９番目のアミノ酸残基であるヒスチジンが関与するＲｈ錯体結合サイト；および
   （Ｒ）アポフェリチンを構成するフェリチンモノマーの第１１４番目のアミノ酸残基であるヒスチジンが関与するＲｈ錯体結合サイト；
   のうち少なくとも一種類のＲｈ錯体結合サイトがＲｈ錯体結合能を維持し、且つ他の少なくとも一種類のＲｈ錯体結合サイトのＲｈ錯体結合能を失わせるような改変が施された改変アポフェリチンである、請求項７に記載の方法。
9. 前記改変アポフェリチンは、以下のアミノ酸残基：
   （ｐ）前記フェリチンモノマーの第４８番目のアミノ酸残基であるシステイン；
   （ｑ）前記フェリチンモノマーの第４９番目のアミノ酸残基であるヒスチジン；および
   （ｒ）前記フェリチンモノマーの第１１４番目のアミノ酸残基であるヒスチジン；
   のうち少なくとも一種類のアミノ酸残基を維持し、且つ他の少なくとも一種類のアミノ酸残基を置換および／または修飾するような改変が施された改変アポフェリチンである、請求項８に記載の方法。

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