JP7199512B2 - 生体分子のコンジュゲーションの方法及び生体分子複合体形成のための金ドナーの新たな使用 - Google Patents
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Description
a.生体分子の調製工程、
b.生体分子と金ドナーとの反応による、生体分子のコンジュゲーション工程、
c.コンジュゲーション生成物の精製工程
を含む。
透過電子顕微鏡法(TEM)
試料を、典型的には最終タンパク質濃度の0.025mg/mlに希釈し、デスクトップ遠心分離機により短時間遠心分離し、上清を、親水化炭素コート銅グリッド(STEM Co.社)に適用し、4%リンタングステン酸(phospotungstic acid)、pH8で陰性染色し、JEOL JEM-1230 80kV機器を使用して視覚化した。
試料を、製造会社(Life Technologies社)の推奨に従って3~12%の未変性ビス-トリスゲルにかけた。試料を4×未変性PAGE試料緩衝液(200mMのビストリス、pH7.2、40%w/vのグリセロール、0.015%w/vのブロモフェノールブルー)と混合した。移行バンドの分子量の定性ガイドとして、NativeMark未染色タンパク質標準(Life Technologies社)を使用した。ブルー未変性PAGEを実施する場合、タンパク質バンドを、製造会社(Life Technologies社)のプロトコールに従って視覚化し、そうでなければ、InstantBlue(商標)タンパク質染色(Expedeon社)を使用した。
試料質量のおよそ2mgを25mlの0.2%HClに溶解した。次いで、ETAAS分光計(PinAAcle 900Z、Perkin Elmer社、Waltham、MA)により、ゼーマンバックグラウンド補正を伴って、242.80nmの波長(スリット幅0.7nm)で実施して総Auを決定する前に、溶液を25×に希釈した。試料溶液の測定体積は10μlであり、各試料に、マトリックス修飾剤の混合物:5μgのPd(NO3)2及び3μgのMg(NO3)2を加えた。各セット3回の反復からなる5セットの測定を実施した。
典型的な精製において、TRAP-CS遺伝子を有するpET21bプラスミドでトランスフォームした大腸菌(E. coli)BL21(DE3)細胞(Novagen社)を、100μg/mlのアンピシリンを有する3LのLB培地においてOD600=0.6になるまで振盪しながら37℃で増殖させ、0.5mMのIPTGで誘導し、次いで更に4時間振盪した。細胞を遠心分離により採取し、ペレットを使用するまで-80℃で保持した。細胞を、50mlの50mMトリスHCl、pH7.9、50mMのNaCl中において、プロテイナーゼ阻害剤(Thermo Scientific社)の存在下及び2mMのDTTの存在又は非存在下で、4℃での超音波処理により溶解し、溶解産物を66,063g、4℃で0.5時間遠心分離した。上清分画を70℃で10分間加熱し、4℃に冷却し、再び66,063g、4℃で0.5時間遠心分離した。上清分画を、50mMのトリスHCI、pH7.9、0.05MのNaCl+/-2mMのDTT緩衝液中で結合させ、0.05~1MのNaCl勾配で溶出する4×5mlのHiTrap QFFカラムを使用して、AKTA精製機(GE Healthcare Life Sciences社)のイオン交換クロマトグラフィーにより精製した。TRAPタンパク質を含有する分画をプールし、Amicon Ultra 10kDa MWCO遠心分離フィルターユニット(Millipore社)を使用して遠心分離し、試料を、HiLoad 16/60 Superdex 200カラム中の50mMのトリスHCl、pH7.9、0.15MのNaClによるサイズ排除クロマトグラフィーに室温で付した。タンパク質濃度を、BCAタンパク質アッセイキット(Pierce Biotechnology社)を使用して計算した。
TRAPケージ試料を8Mの尿素を伴う50mMのトリスHCl緩衝液(pH8.0)において56℃で30分間変性させ、次いで、遠心分離濾過装置(Amicon 3kDa MWCO、Millipore社)を使用して50mMのトリスHCl緩衝液(pH8.0)に緩衝液交換した。変性LC-MS分析では、TRAPタンパク質をC18プレカラム(Acclaim PepMap100、C18、300μm×1cm; Thermo Scientific社)で脱塩し、次いでダイナミックナノスプレー源を介してハイブリッドLTQ Orbitrap XL質量分析計(Thermo Scientific社)に接続しているDionex UltiMate 3000 RSLCnano Systemにより、C18カラム(Acclaim PepMap100、C18、75μm×15cm; Thermo Scientific社)で分離した。二成分緩衝液系を使用し、緩衝液Aは、H2O中の0.1%ギ酸であり、緩衝液Bは、アセトニトリル中の0.1%ギ酸である。タンパク質を、1%~90%の緩衝液Bの勾配により流速300nL分-1で60分間かけて25℃で分離した。LTQ-Orbitrap XLを、ナノエレクトロスプレー電圧1.6kV及び毛管温度275℃で陽イオンモードにより稼働した。サーベイフルスキャン(survey full-scan)MSスペクトルを、解像度60000でOrbitrap(m/z300~4000)により取得した。データを、Xcalibur 2.2(Thermo Scientific社)を使用して処理した。
TRAPケージ試料の0.8mg ml-1を、ミニチュアスピンカラム(miniature spin column)(Micro Bio-Spin P-6、BioRad社)を使用して酢酸アンモニウム(pH6.9)に緩衝液交換することによって未変性MSのために調製した。これを2工程で実施し、第1では2.5Mの酢酸アンモニウムに交換し、第2では200mMの酢酸アンモニウムに交換した。未変性MSの実験を、大型タンパク質イオンの分析用に改変し15、Q-ToF2機器(Waters Corp.社)を用いて、以前に記載された方法14を使用して実施した。関連する機器のパラメーターは、ナノエレクトロスプレー毛管電圧:1.9kV;試料コーン:200V;抽出器コーン:10V;衝突セルへの加速:200Vであった。衝突セルをアルゴンにより約35μbarで加圧した。データを、MassLynxソフトウエア(Waters Corp.社)を使用して外部から較正し、バックグラウンド減算も最小限の平滑化もなしで示した。
TRAP複合体の調製 - Au-TPPMSとの反応
(図1を参照すること)
金化合物:
クロロ[ジフェニル(3-スルホナトフェニル)ホスフィン]金(I)ナトリウム塩水和物(Au-TPPMS、MDL番号MFCD19443491)を、STREM Chemicals UK, limited社から購入し、水に溶解して所望の濃度(典型的には5mM)に構成した。使用した金ナノ粒子(GNP)は、STREM Chemicals UK社からの1~3nmのコア直径を有するジフェニル(m-スルホナトフェニル)ホスフィン-金ナノクラスター(MDL番号MFCD17018839)であった。
Au-TPPMSの使用が成功したことを例示する、使用されたタンパク質は、システインが挿入されたTRAPタンパク質であった。リジン残基(K)番号35からシステインへの変異及びアルギニン残基(R)番号64からセリン(S)への追加の変異を含有するTRAP(「TRAP-CS」と呼ばれる)の発現及び精製は、TRAP-CSについて以前に記載されたもの11(及び上記に詳述されたもの)と類似しており、注目すべき変更は、TCEP(トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン)が溶解工程に含まれないことであった。最終緩衝液は、典型的には20mMのトリスHCl、pH8.0、0.15MのNaClであった。
精製されたTRAPタンパク質を、水性緩衝液中においてAu-TPPMSと室温で反応させた(図1A)。S-Au-S結合が反応によって形成され、TRAPケージ中へのTRAP環の組み立てを生じ、次いで精製し、更に特徴決定した。
TRAP複合体の調製 - Au(I)-トリフェニルホスフィンとの反応
Au-TPPMSの代わりにトリフェニルホスフィン金(I)クロリド(Au-TPP、図1B)を用いて、類似した反応を実施することができる。Au-TPPをDMSOに溶解し、反応を、50mMのトリス、150mMのNaCl、pH7.9及びAu-TPPにおいて最終体積の10%を超えないDMSOと実施し、TRAPモノマーが、およそ1mMの濃度で存在する。Au-TPPのTRAPに対する比は4:2~4:3の範囲である。このことは、Au-TPPMSとの反応で得られる構造と同じ構造のTRAPケージの形成を生じる。試薬の量をそれぞれ調整した。TRAPモノマー/金ドナーの比及び反応の条件は、Au-TPPMSが金ドナーであった場合の反応と同じであった。
クライオEMを使用したTRAP複合体構造の確認
TRAPケージの初期(低解像度)クライオEM構造を、GNPを使用して形成されたTRAPケージにクライオEM単一粒子再構成技術を使用して得て10,11、この構造データを、本発明により得られるハロゲン(トリアリールホスフィン)金(I)との反応によって形成されたTRAPケージの高解像度クライオEM構造の解析用の初期モデルとして使用した。
Au-TPPMSを使用して形成された精製試料(3μlの0.89mg ml-1)を、約10nmの厚さの無定形炭素薄膜が穴を覆っているグロー放電穴あき炭素グリッド(Quantifoil R 1.2/1.3、Mo 200メッシュ)に適用し、4℃及び100%湿度で30秒間インキュベートした。次いでグリッドを3.0秒間ブロットし、Vitrobot Mark IV(FEI社)を使用して液体エタンに浸した。データは、加速電圧の300kV及び名目倍率の75,000×で稼働する透過電子クライオ顕微鏡(FEI Titan Krios)によりEPUソフトウエアを使用して半自動的に記録した。画像(0.91Å/画素)を、Falcon IIダイレクトエレクトロンディテクタ(direct electron detector)(FEI社)により、2.0秒の露光で32フレームとして、全電子線量の40電子/Å2を用いて、およそ-0.9~-3.4μmの範囲のアンダーフォーカス(underfocus)値を適用して記録した。続いてデータを、MotionCor2を使用して整列及び合計して21、最終線量重み付け画像を得て、次いで2×ビニング(binning)を、Bsoftプログラムパッケージを使用して実施し22、1.82Åの画素サイズを得て、更に画像処理した。コントラスト伝達関数の推定を、CTFFIND4を使用して実施した23。Thon環の程度及び規則性に基づいて不十分な電力スペクトルを示す顕微鏡写真を不採用にした(96枚の顕微鏡写真)。最初に、およそ2,000個の粒子を手作業でピッキングし、EMAN2.1を使用して、無基準二次元(2D)分類に付した18。10個の代表的な2Dクラス平均を、Gautomatch(http://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/)を使用して、自動化粒子ピッキング用のテンプレートとして選択した。全ての後続処理工程をRELION 2.0で実施した20。10,290枚の顕微鏡写真から合計1,085,623個の自動ピッキングされた粒子を、無基準2D分類に付して、異常な粒子を取り除いた。球体形状を示す5つの代表的なクラスの粒子(578,865個の粒子)を以下の方法で選択した。選択された粒子を三次元(3D)分類に付して、対称性を有することなく(C1対称性)25回の繰り返しで3.7°の角度サンプリングを使用して3つのクラスに分け、上記に記載された初期低解像度構造を、60Åに低域濾過した後、3D分類における基準として使用した。規則的な密度分布を有する最も対称的なケージ構造を示すクラスにおける粒子(176,463個の粒子)を、以下の処理のために選択した。しかし密度マップは、全体的なTRAPケージ構造を、24個の11員環を有する球体として明確に示したが、個別の環のレベルでの構造は、奇妙なことにタンパク質キラルの特徴を欠いており、2つの鏡映タンパク質構造の混合型の特徴を示し、キラルケージ構造の存在を示唆しているX線結晶学により以前に決定されたタンパク質構造24から予想されるものに反している。したがって、2個のキラルケージ粒子を分離するため、本発明者らは、2回目の3D分類を実施して、対称性を有することなく(C1対称性)25回の繰り返しで1.8°のより精密な角度サンプリングを使用して2つのクラスに分けた。得られた2つのマップは、それぞれ、個別のタンパク質環のレベルで左手系及び右手系構造を明確に示した。各構造(クラスI:94,338個の粒子及びクラスII:82,125個の粒子)を、C1(非対称性再構成)、C4及びD4対称性によって個別に精密化した。データセットの半分を個別に精密化した2つの再構成に軟質球状マスクを適用した後、金基準フーリエシェル相関(FSC=0.143判定基準)により、クラスIの解像度を、3.9Å(D4対称性)、4.1Å(C4対称性)及び4.4Å(C1対称性)と推定し、クラスIIの解像度を、3.9Å(D4対称性)、4.2Å(C4対称性)及び4.5Å(C1対称性)と推定した。個別のタンパク質構造により、クラスIマップの利き手傾向を対向方向に修正した(クラスI:右手系ケージ構造及びクラスII:左手ケージ構造を生じた)。クラスI及びIIのマップを、それぞれ-229及び-231Å2のB因子により鮮明にした。局所解像度を、ResMapを使用して推定した25。図はUCSF Chimeraを使用して調製した26。
初期原子座標モデルは、TRAP結晶構造に基づき(PDB受入4V4F9)、Cys35及びSer64置換をCootにモデル形成して27、TRAP-CS環構造を生成した。残基の位置は、G.ステアロサーモフィルス(G. stearothermophilus)のコード配列における実際の位置を反映して、初期委託PDBにより番号が付け替えられている(例えば、変異Lys→Cys残基は元のPDBファイル4V4Fでは残基番号37が指定されているが、本発明者らの分析では残基番号35に対応している)ことに留意すること。密度マップの初期検査は、弱又は欠測密度の域を明らかにし、したがって、各TRAPサブユニットの構造を残基6~72に切断し、加えて残基22~32(TRAPのアポ形態における高い柔軟性を示すループに対応する5)を、これを反映するモデルから省いた。LH及びRH構造の精密化は、類似したレジームに従った。TRAP-CS環の24個のコピーを、最初に、Phenix実空間精密化(real-space refinement)を使用する剛体精密化によりケージ密度に当てはめた28。高解像度TRAP結晶構造を基準として使用する元のクライオEMマップボクセルサイズの最適化24を、以前の報告と類似した方法において29,30、以下のように実施した。TRAP-CS環原子モデルの模擬マップと様々なボクセルスケール(元の1.82Åボクセル-1から出発し、0.01の増加により変わる)のクライオEMマップとの間の当てはめの相互相関スコアの比較を、Chimeraを使用して実施し、1.74Åボクセル-1のマップスケールに対応する最適な結果を得た。類似した結果を、Phenixを使用して、様々なスケールでクライオEM密度に24個のTRAP-CS環の個別のサブユニットの剛体精密化を実施することによって得た28。Au1原子(合計で120個)を、剛体当てはめモデルの隣接環からのCys35側鎖の間の密度の顕著なブロブに手作業でドッキングさせ、続いて、剛体精密化、大域的最小化、1回の疑似アニーリング及びadp精密化を含む、Phenix実空間精密化の15回のマクロサイクルを、1.74Åボクセル-1マップを使用して実行し、Au-S結合長さ及びS-Au-S結合角度の拘束を、精密化の後半段階に適用した。精密化モデルの確証を、MolProbityを使用して実施した31。TRAPケージモデルの界面接触の分析を、PDBePISA (http://www.ebi.ac.uk/pdbe/pisa/)を使用して実施した32。
質量分析を更に使用して、TRAPケージ構造内のTRAPモノマーを連結する金原子の存在を支持した。
TRAP複合体の安定性試験
熱安定性試験を以下のように実施した。水性緩衝液中の1μgのTRAPケージタンパク質を含有する試料(7.5μl)を、異なる時間(0~180分間)で95℃に加熱した。加熱した後、試料を、ベンチトップ遠心分離機により10,000rpmで5分間遠心分離した。上清を取り出し、2.5μlの4×未変性PAGE試料緩衝液と混合し、試料を、未変性PAGE分析に付し、同じ試料をTEMにより更に分析した。典型的な結果を図4A~Cに示す。
Claims (22)
- 生体分子の部分の遊離チオール基のコンジュゲーションにより、生体分子複合体を形成させる方法であって、生体分子を、-S-Au-S-結合が形成される金ドナー剤との反応を介して接続する反応を含み、金ドナー剤がハロゲン(トリアリールホスフィン)金(I)であることを特徴とする方法。
- 前記生体分子が、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質を含む群から選択される、請求項1に記載の方法。
- コンジュゲーションにより複合体を形成させ、複合体が、同じ生体分子である複数の単位から構成される、請求項1に記載の方法。
- 複合体が、対称又は非対称である、請求項3に記載の方法。
- 前記部分がシステインである、請求項1に記載の方法。
- システイン部分が、前記生体分子における天然の部分である、請求項5に記載の方法。
- システイン部分が、前記生体分子中に人工的に導入されている、請求項5に記載の方法。
- ハロゲン(トリアリールホスフィン)金(I)において、ハロゲンが、クロロ、ブロモ、ヨード、フルオロを含む群から選択され、アリールが、非置換フェニル、又はオルト、メタ若しくはパラ、モノ若しくはポリ置換フェニルを含む群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 金ドナー剤が、クロロ[ジフェニル(3-スルホナトフェニル)ホスフィン]金(I)である、請求項1に記載の方法。
- 金ドナー剤が、クロロ(トリフェニルホスフィン)金(I)である、請求項1に記載の方法。
- a.生体分子の調製工程、
b.生体分子と金ドナーとの反応による、生体分子のコンジュゲーション工程、
c.コンジュゲーション生成物の精製工程
を含む、請求項1に記載の方法。 - 生体分子の調製が、適切な発現系における生体分子の発現及び発現生成物の精製によって実施される、請求項11に記載の方法。
- 工程aの生体分子に少なくとも1個のシステインが導入される、請求項11に記載の方法。
- 前記コンジュゲーションが、水溶液中において、室温で、3日間まで実施され、生体分子:金ドナーのモル比が、3:1~1:4の範囲である、請求項11に記載の方法。
- 前記コンジュゲーション生成物の精製が、濾過、結晶化、遠心分離、カラムクロマトグラフィーの群から選択される方法のうちの少なくとも1つにより実施される、請求項11に記載の方法。
- 前記生体分子複合体がタンパク質ケージである、請求項1に記載の方法。
- 前記生体分子がTRAPタンパク質である、請求項16に記載の方法。
- 前記タンパク質複合体が24個の生体分子単位からなる、請求項16に記載の方法。
- 請求項1から18のいずれか一項に記載の生体分子複合体を形成させる方法における、金ドナー剤としてのハロゲン(トリアリールホスフィン)金(I)分子の使用。
- -S-Au-S-結合の形成による生体分子の部分の遊離チオール基のコンジュゲーションである、複合体形成である、請求項19に記載の使用。
- 複合体がタンパク質ケージである、請求項20に記載の使用。
- タンパク質がTRAPである、請求項21に記載の使用。
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