CN112251458B - 一种基于非同源末端连接机制的解脂耶氏酵母基因组整合的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于非同源末端连接机制的解脂耶氏酵母基因组整合的方法，将解脂耶氏酵母内源基因DL4和XRCC4，外源智人基因PAXX以rDNA位点整合的方式整合到解脂耶氏酵母ATCC201249菌株的基因组rDNA位点，得到重组菌株YNH01；将待转入基因表达盒与启动子截短到11bp的URA3营养标签U11连接，得到的连接片段转化到YNH01得到高压力筛选标签菌株；将连接片段转化到高压力筛选标签菌株，得到经过两轮转化的重组菌株；将连接片段再次转化到经过两轮转化的重组菌株，得到转入的基因高表达的菌株。本发明在短时间内获得大量的多样性菌株，实现了NHEJ整合技术在天然产物微生物合成中的高效应用。

Description

一种基于非同源末端连接机制的解脂耶氏酵母基因组整合的 方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体的说是涉及一种基于非同源末端连接机制的解脂耶氏酵母基因组整合的方法。

背景技术

在生物体中，DNA分子作为生命信息的载体，在遗传信息的存储、复制及传递过程中有着至关重要的作用。DNA分子的损伤严重影响细胞的生长及功能，其中，DNA双链断裂(DNA double-strand breaks，DSBs)是最有害的DNA损伤之一，不仅会导致潜在的序列信息丢失，还会影响细胞的生长状态。为了有效修复生长过程中发生的DNA双链断裂，细胞主要通过两种途径实现，分别为同源重组(Homologous recombination，HR)和非同源末端连接(Non-homologous end-joining，NHEJ)。DSB两种修复途径的根本区别在于是否需要同源DNA序列。同源重组过程需要一段同源序列，在一系列关键酶的催化作用下，将断裂的DNA分子双链重接整合起来，这种修复方式在原核生物及低等真核生物的DSBs修复中起主要作用。而在高等真核生物中，DSBs主要通过非同源末端连接的方式进行修复。与同源重组不同的是，非同源重组无需任何序列同源性，直接将无同源性的DNA末端连接起来。尽管已经在一些真核生物(如酿酒酵母)中发现了NHEJ机制，但在这些生物中它仅用作修复DSBs的备用系统，占主导作用的仍是同源重组机制。

近年来，解脂耶氏酵母逐渐引起研究人员的关注，不仅拥有强大的脂质合成能力及异源蛋白表达能力，还能够利用廉价底物合成价值较高的化合物，逐渐成为具有潜力的底盘菌株被广泛应用于细胞工厂的生产中。由于解脂耶氏酵母的同源重组效率远低于酿酒酵母，非同源重组效率占主要地位，这些常规的生物技术在解脂耶氏酵母中无法实现有效的应用。因此，探索优化解脂耶氏酵母的非同源末端连接机制，在解脂耶氏酵母中建立NHEJ整合技术，是亟需解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种基于非同源末端连接机制的解脂耶氏酵母基因组整合的方法。

本发明的技术方案概述如下：

一种基于非同源末端连接机制的解脂耶氏酵母基因组整合的方法，包括如下步骤：

(1)将解脂耶氏酵母内源基因DL4和XRCC4，外源智人基因PAXX以rDNA位点整合的方式整合到解脂耶氏酵母ATCC201249菌株的基因组rDNA位点，得到解脂耶氏酵母非同源重组修复机制增强的重组菌株YNH01；

所述DL4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述PAXX基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述XRCC4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

(2)将待转入基因表达盒与启动子截短到11bp的URA3营养标签U11相连接，得到连接片段；将所述连接片段转化到所述重组菌株YNH01，得到高压力筛选标签菌株；

所述启动子截短到11bp的URA3营养标签U11核苷酸序列如SEQ ID NO.49所示；

(3)将所述连接片段再次转化到高压力筛选标签菌株，得到经过两轮转化的重组菌株；

(4)将所述连接片段再次转化到经过两轮转化的重组菌株，得到转入的基因高表达的菌株。

待转入基因表达盒为绿色荧光蛋白GFP基因表达盒或番茄红素合成基因CrtE、CrtB和CrtI表达盒；

所述绿色荧光蛋白GFP基因表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

所述CrtE基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

所述CrtB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示

所述CrtI基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

本发明的优点：

本发明一种基于非同源末端连接机制的解脂耶氏酵母基因组整合的方法，在短时间内获得大量的多样性菌株。利用本发明的方法，建立以番茄红素的异源合成为代表的途径，成功得到一系列产量差异显著的菌株。实现了NHEJ整合技术在天然产物微生物合成中的高效应用。

附图说明

图1为基于非同源末端连接机制的解脂耶氏酵母基因组整合的方法概念图。

图2为优化关键连接酶非同源重组修复机制增强的重组菌株YNH01绿色荧光蛋白荧光强度图。

图3为优化高压力筛选标签的重组解脂耶氏酵母菌株绿色荧光蛋白荧光强度图。

图4为优化多轮迭代转化的重组解脂耶氏酵母菌株绿色荧光蛋白荧光强度图。

图5为利用本发明的方法合成番茄红素重组解脂耶氏酵母菌株番茄红素产量图。

具体实施方式

原始菌株解脂耶氏酵母Yarrowia lipolytica ATCC201249，即解脂耶氏酵母菌株Yarrowia lipolytica(Wickerham et al.)van der Walt et von Arx(

201249^TM)于2014年9月在ATCC官网购买。

(https://www.atcc.org/products/all/201249.aspx)

向解脂耶氏酵母ATCC201249菌株中转入绿色荧光蛋白GFP基因表达盒(SEQ IDNO.4)得到对照菌株YNH00。

DL4基因:来自解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica CLIB122)

PAXX基因:来自智人(Homo sapiens)

XRCC4基因:来自解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica CLIB122)

GFP基因:来自合成型构建(synthetic construct)

CrtE基因:来自斯塔瓦特氏欧文氏菌(Pantoea stewartii DC413)

CrtB基因:来自斯塔瓦特氏欧文氏菌(Pantoea stewartii DC413)

CrtI基因:来自斯塔瓦特氏欧文氏菌(Pantoea stewartii DC413)

实施例1

一种基于非同源末端连接机制的解脂耶氏酵母基因组整合的方法(见图1)，包括如下步骤：

(1)从NCBI数据库获得Yarrowia lipolytica CLIB122来源的基因DL4(SEQ IDNO.1)和XRCC4(SEQ ID NO.3)，Homo sapiens来源的基因PAXX氨基酸序列，通过密码子优化人工合成PAXX基因(SEQ ID NO.2)的序列，同时组装三个基因的表达盒。

通过同源重组的方法，向解脂耶氏酵母ATCC201249菌株的基因组rDNA位点整合了DL4基因表达盒,PAXX基因表达盒和XRCC4基因表达盒，得到解脂耶氏酵母非同源重组修复机制增强的重组菌株YNH01。

以YNH01为底盘转入绿色荧光蛋白GFP基因表达盒(SEQ ID NO.4)，观察荧光强度(见图2)。

(2)第一种高压力筛选标签菌株的构建方法，包括如下步骤：

将URA3标签进行扩增，上游引物的结合位点设置在URA3启动子的不同位置处，分别在启动子的41bp、21bp、16bp、15bp、14bp、11bp、9bp、8bp及6bp处，得到一系列突变标签，命名为U41、U21、U16、U15、U14、U11、U9、U8及U6。

将截短启动子之后的URA3标签与绿色荧光蛋白GFP基因表达盒(SEQ ID NO.4)进行连接，得到相应的一系列重组片段，将上述9个线性片段分别转入重组菌株YNH01中测量荧光强度。其中绿色荧光蛋白GFP基因表达盒(SEQ ID NO.4)与启动子截短到11bp的URA3营养标签U11(SEQ ID NO.49)相连接得到的片段命名为连接片段-1，将连接片段-1转化到重组菌株YNH01后得到最优化第一种高压力筛选标签菌株(见图3)。

(3)第一种多轮迭代转化重组解脂耶氏酵母菌株的构建，包括如下步骤：

将上一步得到的最优化第一种高压力筛选标签菌株的300μL的转化体系接入50mL液体YPD培养基的250ml锥形瓶中，于28℃、250rpm的条件下培养36h。待摇瓶中的菌株生长至OD600为0.6-0.8时，用无菌水洗涤2次，于4500rpm/min离心1分钟，弃去上清后，用连接片段-1进行第二轮转化，得到第一种经过两轮转化的重组菌株，以上述操作流程为准，将连接片段-1再次转化上一步得到的第一种经过两轮转化的重组菌株最终得到经过三轮转化后绿色荧光蛋白GFP基因高表达的菌株。

在第二轮转化结束后，接入50mL液体YPD培养基中的体系只需培养24h。主要是由于前两轮的迭代转化，使得菌株数量有所积累，OD600达到0.6-0.8所需时间会缩短。同理，第3轮转化结束后，接入50mL液体YPD中的体系，只需12h即可进行第4轮转化。经过多轮迭代转化后，挑取每一轮固体培养基上的转化子，接入无菌96孔板上进行培养发酵，48h后测定荧光值(见图4)。

实施例2

一种基于非同源末端连接机制的解脂耶氏酵母基因组整合的方法，包括如下步骤：

(1)同实施例1步骤(1)重组菌株YNH01的制备；

(2)第二种高压力筛选标签菌株的构建方法，包括如下步骤：

将启动子截短到11bp的URA3营养标签U11与番茄红素合成基因CrtE(SEQ IDNO.5)表达盒H0-LD01-CrtE-H1、番茄红素合成基因CrtB(SEQ ID NO.6)表达盒H1-LD02in-CrtB-H2和番茄红素合成基因CrtI(SEQ ID NO.7)表达盒H2-LD03-CrtI-H3，4个片段相连接得到连接片段-2；将连接片段-2转化到重组菌株YNH01后，得到第二种高压力筛选标签菌株；

CrtE(SEQ ID NO.5)、CrtB(SEQ ID NO.6)和CrtI(SEQ ID NO.7)是来自斯塔瓦特氏欧文氏菌Pantoea stewartii DC413经基因密码子优化后人工合成的；

(3)第二种多轮迭代转化重组解脂耶氏酵母菌株的构建，包括如下步骤：

将上一步得到的最优化第二种高压力筛选标签菌株的300μL的转化体系接入50mL液体YPD培养基的250ml锥形瓶中，于28℃、250rpm的条件下培养36h。待摇瓶中的菌株生长至OD600为0.6-0.8时，用无菌水洗涤2次，于4500rpm/min离心1分钟，弃去上清后，用连接片段-2进行第二轮转化，得到第二种经过两轮转化的重组菌株，以上述操作流程为准，将连接片段-2再次转化上一步得到的经过第二种两轮转化的重组菌株最终得到经过三轮转化后番茄红素合成基因高表达的菌株。

将启动子截短到11bp的URA3营养标签U11、H0-LD01-CrtE-H1；H1-LD02in-CrtB-H2；H2-LD03-CrtI-H3四个片段转化到出发菌株解脂耶氏酵母ATCC201249中，得到对照菌株NHEJ-Ly00。

另一方面，为了与同源重组整合效率进行对比，我们将带有rDNA位点同源臂的

rDNAup-hyg-H0(rDNA位点上同源臂片段)；

H0-LD01-CrtE-H1；

H1-LD02in-CrtB-H2；

H2-LD03-CrtI-H3；

H3-rDNA-down(rDNA位点下同源臂片段)

5个片段转化到出发菌株解脂耶氏酵母ATCC201249中，经过菌落PCR及测序验证正确整合后，得到成功通过同源重组方式整合到rDNA位点的转化子HR-Ly00系列对照菌株，菌株接入50mL的YPD发酵培养基的250ml锥形瓶中进行发酵，72h后提取番茄红素，用高效液相色谱测定番茄红素的产量(见图5)。

1、模块的构建

同源臂rDNA-up(SEQ ID NO.14)和rDNA-down(SEQ ID NO.15)均来自解脂耶氏酵母ATCC201249基因组；

筛选标记基因URA3(SEQ ID NO.8)和潮霉素B抗性基因hyg表达盒(SEQ ID NO.9)来自天津大学元英进教授元件库。

以解脂耶氏酵母ATCC 201249基因组为模板，以rDNAup-F(SEQ ID NO.10)，rDNAup-hyg-R(SEQ ID NO.11)以及rDNAdown-H3-F(SEQ ID NO.12)，rDNAdown-R(SEQ IDNO.13)为引物，分别扩增同源臂得到rDNA-up(SEQ ID NO.14)和rDNA-down(SEQ ID NO.15)

以H3-F(SEQ ID NO.16)和H3-R(SEQ ID NO.17)分别为前后引物，Yl-LD03载体(SEQ ID NO.21)为模板，扩增rDNA位点基因组下臂和Yl-LD03载体(SEQ ID NO.21)之间连接的同源臂H3(SEQ ID NO.18)；

将rDNA-up(SEQ ID NO.14)和潮霉素B抗性基因hyg表达盒(SEQ ID NO.9)通过overlap PCR连接得到rDNAup-hyg-H0线性片段；

将rDNA-down(SEQ ID NO.15)和H3(SEQ ID NO.18)通过overlap PCR连接得到H3-rDNA-down线性片段；

将Yl-LD01(SEQ ID NO.19)载体用BsaI酶切后与DL4(SEQ ID NO.1)基因连接，然后再用NotI酶切释放得到H0-LD01-DL4-H1线性片段；

将Yl-LD02in(SEQ ID NO.20)载体用BsmbI酶切后与PAXX(SEQ ID NO.2)基因连接，然后再用NotI酶切释放得到H1-LD02in-PAXX-H2线性片段；

将Yl-LD03(SEQ ID NO.21)载体用BsaI酶切后与XRCC4(SEQ ID NO.3)基因连接，然后再用NotI酶切释放得到H2-LD03-XRCC4-H3线性片段；

然后将这些片段按照每个片段的摩尔比为1:1，片段总量达到1μg，使用Frozen-EZYeast Transformation II试剂盒(ZYMO RESEARCH公司)转化解脂耶氏酵母。在添加潮霉素B(hyg终浓度100mg/L)的YPD固体培养基(20g/L葡萄糖，20g/L蛋白胨，10g/L酵母提取物，20g/L琼脂)涂板48h后挑选正确的转化子，构建得到重组菌株YNH01。

GFP绿色荧光蛋白基因表达盒(SEQ ID NO.4)和完整URA3(SEQ ID NO.8)筛选标签通过overlap PCR连接得到GFP-URA3线性片段；所用的两对引物分别为(GFP-F(SEQ IDNO.22)；GFP-Ura-R(SEQ ID NO.23)；Ura-GFP-F(SEQ ID NO.24)；Ura-R(SEQ ID NO.25))；将1μg的GFP-URA3线性片段使用Frozen-EZ Yeast Transformation II试剂盒(ZYMORESEARCH公司)转化解脂耶氏酵母菌株YNH01，涂板SC-Ura固体培养基(20g/L葡萄糖，2g/L不含尿嘧啶的氨基酸混合物，6.7g/L不含氨基酸的酵母氮碱基，20g/L琼脂)，在28℃下孵育36h后，挑单菌落在28℃，250rpm的YPD液体培养基(20g/L葡萄糖，20g/L蛋白胨，10g/L酵母提取物，20g/L琼脂固体培养基)中培养过夜。

用前引物GFP-F(SEQ ID NO.22)分别和后引物GFP–U41-R(SEQ ID NO.26)；GFP-U21-R(SEQ ID NO.27)；GFP-U16-R(SEQ ID NO.28)；GFP-U15-R(SEQ ID NO.29)；GFP-U14-R(SEQ ID NO.30)；GFP-U11-R(SEQ ID NO.31)；GFP-U9-R(SEQ ID NO.32)；GFP-U8-R(SEQ IDNO.33)；GFP-U6-R(SEQ ID NO.34)扩增GFP表达盒片段用于和各种突变的URA3标签连接；

再用前引物U41-GFP-F(SEQ ID NO.35)；U21-GFP-F(SEQ ID NO.36)；U16-GFP-F(SEQ ID NO.37)；U15-GFP-F(SEQ ID NO.38)；U14-GFP-F(SEQ ID NO.39)；U11-GFP-F(SEQID NO.40)；U9-GFP-F(SEQ ID NO.41)；U8-GFP-F(SEQ ID NO.42)；U6-GFP-F(SEQ IDNO.43)分别和后引物Ura-R(SEQ ID NO.25)扩增突变URA3标签得到突变标签U41；U21；U16；U15；U14；U11；U9；U8和U6。将上一步扩增的GFP表达盒片段和突变标签U41；U21；U16；U15；U14；U11；U9；U8；U6分别连接得到对应的线性片段GFP-U41、GFP-U21、GFP-U16、GFP-U15、GFP-U14、GFP-U11、GFP-U9、GFP-U8及GFP-U6。将各个线性片段转化解脂耶氏酵母YNH01，测量荧光强度。

将Yl-LD01(SEQ ID NO.19)载体用BsaI酶切后与CrtE(SEQ ID NO.5)基因连接，然后再用NotI酶切释放得到H0-LD01-CrtE-H1线性片段；

将Yl-LD02in(SEQ ID NO.20)载体用BsmbI酶切后与CrtB(SEQ ID NO.6)基因连接，然后再用NotI酶切释放得到H1-LD02in-CrtB-H2线性片段；

将Yl-LD03(SEQ ID NO.21)载体用BsaI酶切后与CrtI(SEQ ID NO.7)基因连接，然后再用NotI酶切释放得到H2-LD03-CrtI-H3线性片段；

以H0-U11-F(SEQ ID NO.44)和H0-R(SEQ ID NO.45)分别为前后引物扩增筛选标记基因URA3(SEQ ID NO.8)和Yl-LD01载体之间连接的同源臂H0(SEQ ID NO.46)；

以URA3(SEQ ID NO.8)为模板，分别以U11-H0-F(SEQ ID NO.47)、U11-H0-R(SEQID NO.48)为引物扩增标记基因U11(SEQ ID NO.49)，通过overlap PCR将片段U11(SEQ IDNO.49)和H0(SEQ ID NO.46)连接得到线性片段U11-H0；

然后将U11-H0；H0-LD01-CrtE-H1；H1-LD02in-CrtB-H2；H2-LD03-CrtI-H3这4个片段按照每个片段的摩尔比为1:1，片段总量达到1μg，使用Frozen-EZ YeastTransformation II试剂盒(ZYMO RESEARCH公司)转化解脂耶氏酵母菌株YNH01为实验组；转化解脂耶氏酵母菌株YNH00为NHEJ对照组。将片段rDNAup-hyg-H0；H0-LD01-CrtE-H1；H1-LD02in-CrtB-H2；H2-LD03-CrtI-H3；H3-rDNA-down这5个片段按照每个片段的摩尔比为1:1，片段总量达到1μg转化解脂耶氏酵母菌株ATCC201249作为为通过同源重组整合这些片段的对照组。

所用序列见序列表。

本发明所用PCR酶为南京诺唯赞生物科技有限公司的

Super-Fidelity聚合酶。50μL的PCR扩增体系如下：DNA模板，1μL；前引(10μM)和后引(10μM)各2μL；dNTP(10mM)，1μL；2×Phanta Max Buffer，20μL；

Super-Fidelity聚合酶，1μL；最后用双蒸水补齐至50μL。在PCR仪上设置扩增程序。扩增条件为95℃预变性3min(1个循环)；95℃变性15sec、退火56℃15sec、72℃延伸60sec/kb(35个循环)；72℃延伸5min(1个循环)。Overlap PCR扩增条件同PCR，按照等摩尔比添加不同的模板。

2、培养基组成

Sc-Ura缺陷液体培养基：20g/L葡萄糖，2g/L氨基酸混合物(不含尿嘧啶)，6.7g/L不含氨基酸的酵母氮源；

Sc-Ura缺陷固体培养基：20g/L葡萄糖，2g/L氨基酸混合物(不含尿嘧啶)，6.7g/L不含氨基酸的酵母氮源，20g/L琼脂；

YPD种子培养基：20g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨、10g/L酵母浸粉，余量为水；

YPD固体培养基：20g/L葡萄糖，20g/L蛋白胨，10g/L酵母提取物，20g/L琼脂；

YPD发酵培养基：50g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨、10g/L酵母浸粉，余量为水。

3、发酵条件

对照组：将重组菌株NHEJ-Ly00和HR-Ly00接入5mL种子培养基28℃,250转/分，培养24h，再将这5mL培养基转接到50mL新鲜的发酵培养基中，调整菌密度，使最终菌密度在OD600nm下为0.2，28℃,250转/分，培养72h，取培养液用于产物分析。

实验组：将经过三轮转化的高产番茄红素重组菌株接入5mL种子培养基28℃,250转/分，培养24h，再将这5mL培养基转接到50mL新鲜的发酵培养基中，调整菌密度，使最终菌密度在OD600nm下为0.2，28℃,250转/分，培养72h，取培养液用于产物分析。

4、荧光强度测量和番茄红素产物分析

GFP荧光强度测量：用GFP报告基因转化的菌株在3mL Sc-Ura液体培养基中于28℃生长24h。以4500rpm/min离心2min后，转移中度培养液悬浮液放入含有200uL新鲜Sc-Ura液体培养基的96孔聚苯乙烯板(黑色板，透明底部)(Corning Incorporated 3603，美国)中，最终OD600nm为0.2。然后将细胞在28℃孵育48小时。取合适体积的培养液稀释至细胞OD600nm在0.4至0.8之间。使用多模式酶标仪(SpectraMax M2，分子设备公司，美国)分析GFP荧光(激发：488nm，发射：530nm)，并使用紫外分光光度计(TU-1810)测量细胞密度(OD600)。通过荧光显微镜(Olympus CX41，东京，日本)观察GFP荧光的图像。

番茄红素的提取和分析：发酵72h后，分别取对照组和实验组500μL发酵液于2mL离心管中，12000rpm/min下离心5分钟，弃上清液。然后吸取1mL超纯水清洗细胞，吹吸均匀后，12000rpm/min下离心5分钟，重复操作2次。然后再加入1mL 3M HCl溶液，沸水浴3分钟，冰浴2min，重复3次后，12000rpm/min下离心5分钟，弃去上清液。然后吸取1mL超纯水清洗细胞，吹吸均匀后，12000rpm/min下离心5分钟，重复操作2次，去上清。然后加入含有0.1％BHT(w/v)的丙酮中，震荡15min后，12000rpm/min下离心5分钟。最后用一次性医用注射器吸取上清液，经0.22μm有机滤膜过滤，使用配备BDS Hypersil C18色谱柱(4.6×150mm，5μm)和UV/VIS检测器(Waters 2489)的HPLC系统(Waters e2695)用于分析生产的类胡萝卜素。其中，检测器Water 2489UV/VIS在471nm处检测到番茄红素的信号,同时配制不同浓度梯度的番茄红素标品得到标准曲线，并对实验菌株的番茄红素谱图进行峰面积积分，根据标准曲线与样品的峰面积确定出实验菌株的番茄红素产量；波长设置为470nm；流动相：乙腈:甲醇:二氯甲烷(9:40:1)；柱温设定为22℃，流速为0.3mL/min。

5、结果

在这项研究中，我们通过对解脂耶氏酵母非同源重组机制中的关键连接酶DL4及协同因子PAXX和XRCC4的过表达，使得荧光强度提升了4.67倍；同时，截短URA3标签的启动子得到高压力筛选标签，荧光强度提升了22.74倍；采用优化后的多轮迭代转化流程，荧光强度再次提升了1.87倍。综合上述三方面的优化，在解脂耶氏酵母中成功建立了一种基于非同源末端连接机制的基因组整合方法。该方法实现了多个外源片段多拷贝随机地插入到基因组中。利用该方法能够将CrtE、CrtB及CrtI三个外源片段同时整合到解脂耶氏酵母基因组中，得到一系列高产番茄红素产量的菌株。与依赖同源重组机制整合到rDNA位点的菌株相比，利用基于非同源末端连接机制的基因组整合方法得到的菌株，番茄红素产量提升了23.88倍。

序列表

<110> 天津大学

<120> 一种基于非同源末端连接机制的解脂耶氏酵母基因组整合的方法

<160> 49

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2871

<212> DNA

<213> 解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)

<400> 1

atgtcgagcg agcggcgacc cgagctggaa gaaactgccg ttgacccggc aacgggctct 60

gcggcgtctc gaaagttttc cattgtccag gacgcggtgg aaacgacaat tgtggcaccg 120

accaaccatg ggccctctcc tcggttttcc actctcgtcc gcaacctgtt cgagccgctg 180

gtcaatctct cggccgtggt tgcagctctg cgcaagaaac cgaccgaggc caaggctcac 240

attgcctctc agttcatcaa ggggtgggta gaggaggttg gcaaggacat ttatcctgcc 300

ttccgtctca tcttaccgga caaagaccga gaacgggccg tgtacgggct caaggaaaag 360

gcgctgggcc gtctgtgggt caaggtgctc aatttggcca aagattcgcc cgatgccaag 420

gcgttgagtg aatggaaaca aggaggcaac gaaagcgccg gcaacttctc caaacggtgc 480

tacgaagtgc tgagcaagcg aaccagtctt accgactacg gccatatgac cgtggacgag 540

gtcaatgagc gactggatct tttggccgac ggagaaacgg accaggccaa gcagattgag 600

attctaacct acttctacaa gcacatgaac gccacggagc tcaaatggct ggtgaatatc 660

attttgcggc agatgaagat gaacgcgacg gaaaaggtgt tttttgagcc ctggcatccc 720

gatgccgagt ccttgttcaa cgtcactgcc agtttgaaac gcgtctgctg ggaattgaca 780

gatcctacta aacggctgac ttccgcagag gcccaagtgt cgttattcgc ctgtttcatg 840

ccgcaaatcg ccgcgtttcc gaaatactcg ggccaggaca ttgccggaaa acacttcaag 900

ggcagaccgt tctacattga agaaaagatt gacggagaga gaatgcagat gcacatgagc 960

gaatatggca acaagttcca ctggtggagc agacggtcca aggacttcac cgagacgtat 1020

ggaaactctc tggatgacgc ttctggctct ctgaccaaac gtcttagagg tatcatcaac 1080

cccaaagtca gaaactgtgt gctggacggc gaaatggtgg cttatgatcc tgccaccaag 1140

aagattatcc cgtttggaac tctgagaacg gccaaccgaa acgaacagaa cgacctgaac 1200

ctcactaaac ccatgttcat ggtatttgac attcttttac tcaacgataa gcctctggtg 1260

gactacactc tagctgagcg caagagaaca cttcggacca tctttgcaag gactgataac 1320

gagactgtgg gtcaggaagg agttctggaa gtgttaccct acaccgaggc caccaccgct 1380

gctgaaatcg agacttgcat gcgaaagatc attgcagagt cgtccgaagg actggtcatc 1440

aaagacccta cttctgtcta cagggtgaac actcgagacg attcgtggct gaaaatgaaa 1500

cctgagtaca tgtctgaatt cggcgagaag ctcgatgttg tcattattgg aggctactac 1560

ggttcaggaa aacgaggcag tattctttcc tcgtatcttt gcggtcttcg ggctgatgga 1620

tcggaccagt tttggtcctt tttcaaagtg gggggtggcc tgactgcggg tgactaccag 1680

gctattcgca ccaagaccga gggcaaatgg aaacgatggg acaagaacga caagcccaaa 1740

aacgtgcttc tggcgggccc caatggcgac ctagaacgtc cagatgtctg gatcgagccg 1800

tcggacagtg tggtggtcga ggtcaaggct gcttcagtag ttgctagtga ccagtacaag 1860

gtggggttgt gtctgcggtt tcctagattc cgagccctgc gactggataa gacatgggaa 1920

gacggactga ccatttctca gtttgcggag ctcagacaaa cagttgaaat ggaggctgaa 1980

aacaaggagt tggagctgga ggacagaaag agacgcaatg caggtcccgg aagaggggcc 2040

aaacggctga aactggcaaa cgtgtcttct gacgaagacg agctgggtac tgatgaaagg 2100

ccgacgtctg ttttcaaagc cacgtctttt gctgtgctct cagacatgtc ttctcctcgg 2160

tacatgtcta aagccgcggt ggaaaatctc atcaagaagc acggaggtac tgtgtttcag 2220

acggtcgaag gaccacacac gattcccgtt gcagacaccc gaactatcaa ggtccaggct 2280

ctgactaaac gggtccatgg tgtggatgtg attcgaccca actggctgtt ggattgcatc 2340

aacgaggaga aactagtggc tctggagccg cgaaatctgc tggagtcgag tgccgaaaca 2400

cttgcacttg ccaagacaaa tgtcgacgag tttggagaca gttacacccg ccctctgacc 2460

tacaaagaga tgcaggaggt gttgcggttc atggaccagt ttgatctgga tcaaacaaac 2520

ccccctgact tgatgatgga ggttctggaa accaatgatg gagccgtgcc caagggaatg 2580

ctcttctatg gcaaaaaggt gtacatgtcg acttccaata tggacactgt tgctctggaa 2640

acccagttca gagcctacga cgccttgaga tgcctgcaat ttggaggagc caatctcgtg 2700

accgacatga aagacctggt ggtggcggtt gccaaaacgg aagaggaggc taaagagctg 2760

agaagggtgt cctcggaaca ggtgtttccg ttcagagtgg tgtccatcaa gtgggtcgag 2820

gagagctgga agaacggaac ggtggagatt gaggacgatt accctctata a 2871

<210> 2

<211> 647

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gcggccgcgg tctccgcagg accccctctc ccctcccctg tgtaccctgc ctcccggacc 60

tgagcctccc cgattcgtct gctactgtga gggtgaagag tctggagagg gcgaccgagg 120

cggtttcaac ctctacgtga ccgacgccgc tgagctgtgg tctacctgtt tcacccccga 180

ctccctggct gctctgaagg ctcgattcgg cctctctgcc gctgaggaca tcacccctcg 240

attccgagcc gcttgtgagc agcaggctgt cgccctgacc ctccaggaag accgagcctc 300

cctgaccctc tctggaggcc cttctgctct ggctttcgac ctgtctaagg tgcccggtcc 360

tgaggctgct ccccgactgc gagctctgac cctcggactg gccaagcgag tctggtccct 420

cgagcgacga ctggccgctg ccgaggagac tgctgtgtct ccccgaaagt ctccccgacc 480

cgctggtcct cagctcttcc tgcctgaccc tgaccctcag cgaggtggac ccggtcccgg 540

cgtccgacga cgatgtcccg gcgagtctct gattaacccc ggtttcaagt ccaagaagcc 600

tgccggcggt gtggacttcg acgagactta aaggagaccg cggccgc 647

<210> 3

<211> 1209

<212> DNA

<213> 解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)

<400> 3

atggtggaag ccaaccccaa agccggagct tgggttccta tcacaactga cgacggcagc 60

ttccaatttt tcgccagatt gaccatttcc aatggcggat acaccctgca tcttgctgat 120

gtcgccagct ttcaattctg gattgaagac ctgcgcaagg accgagtcac tataagagcc 180

gaagatgacg attgcctcat cgatgccaac gaccccacac agcatgcact gcttctcgac 240

aagctgggtc aggctctgcg agagggccag atcgacatcc gcaagacctc ccgaggacta 300

cgtatcagtg tgtctatgaa gatgggtggg ggcacttttg aatggacctt ccgtgtgtct 360

caggtaacag agacgcgtga gctggtggac cttcaacgga cctttttcag tggacttatc 420

acagttagcc attcactgct gtcccaggtt gagtttctcg agtctcagct gtctctgaag 480

gactaccata ttggagctat gcagaagctg ttggctgata ccgagccagg acgatctaca 540

gagtataggc cacggcggtt cactgaggca gcatacaaga ccgaccctgt gaagctaact 600

gagagttgga aggaagaacg accagcagta accgaaaaag aggccatgct gtctttggca 660

aaggtggacc cctcactgtg gatgctacga gagactgaga aggaggtgga gatcacagaa 720

attaaagaag acacgagttt cgcggatgac tttgtggatg atcaggtgga atcagcctcg 780

caactcccta cacaagacaa gtcagagact ccaaccgagt ttgaaaccaa ggacgagatg 840

gcccagatgg gcgtcgacac cccagacctg tgcgagactg aagatgagga atctgctgag 900

gaaaaagaga atattggaaa aactgcagac gtgagtaaag aagaaactcc ttcaagtgaa 960

cctccacaga ccccggagaa accaaaacct acacctgcaa gcactttcac cgagccttca 1020

gcaagccaaa acgatagcca aggctctcct aaacgaagaa ttggaagtct gatcaagaac 1080

atcccgtctt cgcctatcaa gggagaggac ccaggtgtcg catcaaacac tgaaacactg 1140

aagagaaaac agctggaaca gacactacag aaacagcgaa gtgctgtcaa gaagaaacgg 1200

agattttag 1209

<210> 4

<211> 1501

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agagaccggg ttggcggcgc atttgtgtcc caaaaaacag ccccaattgc cccaattgac 60

cccaaattga cccagtagcg ggcccaaccc cggcgagagc ccccttctcc ccacatatca 120

aacctccccc ggttcccaca cttgccgtta agggcgtagg gtactgcagt ctggaatcta 180

cgcttgttca gactttgtac tagtttcttt gtctggccat ccgggtaacc catgccggac 240

gcaaaataga ctactgaaaa tttttttgct ttgtggttgg gactttagcc aagggtataa 300

aagaccaccg tccccgaatt acctttcctc ttcttttctc tctctccttg tcaactcaca 360

cccgaaatcg ttaagcattt ccttctgagt ataagaatca ttcaaaatgg tgagtttcag 420

aggcagcagc aattgccacg ggctttgagc acacggccgg gtgtggtccc attcccatcg 480

acacaagacg ccacgtcatc cgaccagcac tttttgcagt actaaccgca gcgaaagggt 540

gaggagctgt tcaccggtgt ggtgcccatc ctggtggagc tggacggcga cgtcaacggt 600

cacaagttct ctgtgcgagg tgagggcgag ggcgacgcca ctaacggtaa actgaccctg 660

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acctacggcg tgcagtgttt cgcccgatac cccgaccaca tgaagcagca cgacttcttc 780

aagtccgcca tgcccgaggg ctacgtgcag gagcgaacca tctccttcaa ggacgacggc 840

acctacaaga cccgagccga ggtgaagttc gagggtgaca ccctggtgaa ccgaatcgag 900

ctgaagggta tcgacttcaa ggaggacggt aacatcctgg gccacaagct ggagtacaac 960

ttcaactctc acaacgtcta catcaccgcc gacaagcaga agaacggcat caaggccaac 1020

ttcaagatcc gacacaacgt cgaggacggc tccgtgcagc tggccgacca ctaccagcag 1080

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tccgtcctgt ctaaggaccc caacgagaag cgagatcata tggtgctgct ggagttcgtg 1200

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ggaagtgagt gcccggttct gtgtgcacaa ttggcaatcc aagatggatg gattcaacac 1320

agggatatag cgagctacgt ggtggtgcga ggatatagca acggatattt atgtttgaca 1380

cttgagaatg tacgatacaa gcactgtcca agtacaatac taaacatact gtacatactc 1440

atactcgtac ccgggcaacg gtttcacttg agtgcagtgg ctagtgctct tactcgtaca 1500

g 1501

<210> 5

<211> 909

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atggctatct tcgctgagag agactccact ctcatctact ctgatcctct gatgctcctt 60

gccatcattg agcagcgtct cgaccgactt ctgcctgtcg aatccgagcg agactgcgtt 120

ggtctcgcca tgcgagaagg cgctttggca cccggaaagc gaatcagacc tgtccttctc 180

atgctggctg cccacgacct tggctaccga gacgaactct ctggacttct cgacttcgcc 240

tgtgctgtcg agatggttca cgcagcctcc ctgatcctgg atgacattcc ctgcatggac 300

gatgccgagc ttcgacgtgg ccgacctacc atccatcgac agttcggtga acccgtggct 360

atcctcgcag ccgttgctct gctttcacga gccttcggag tcattgctct ggcagacggc 420

atctcttccc aggccaagac tcaggccgtg gctgagctta gccactccgt cggtattcag 480

ggtctggttc aaggacagtt tctcgatctg accgaaggag gtcaaccacg atccgctgat 540

gccattcagc ttaccaacca cttcaagact tctgccctgt tttcggctgc catgcagatg 600

gctgccatca ttgctggtgc tcctctggca tcccgagaga agttgcatcg tttcgctcga 660

gacctcggac aagcctttca gctgctcgac gatctgacag acggccagag cgacactggc 720

aaggatgccc atcaggacgt cggaaagtct accctggtca acatgttggg ttccaaagca 780

gtcgagaagc gactgagaga ccacttgcga cgtgccgatc gacatctcgc ttctgcctgt 840

gactccggat acgccacccg acactttgtg caggcttggt tcgacaaaaa gctcgcaatg 900

gtcggttaa 909

<210> 6

<211> 936

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atggacaacc ctactctcct gcaccatgct gtcgagacta tggaggttgg atccaagtcg 60

ttcgctaccg cttccaagct ctttgacgcc aagactcgac gttctgtcct gatgctctac 120

gcttggtgtc gacactgtga cgatgtcatc gacgatcagc aactcggctt tcctggtgag 180

gttccctctg cacagacacc tcaacagcga cttgctaacc tcgaacgaaa gactcgacag 240

gcctacgctg gagctcagat gcacgaacct gccttcgctg ccttccagga ggttgccatt 300

gctcacgaca tctctccagc atacgccttc gatcatctcg aaggctttgc tatggacgtt 360

cgaggtgcta gatacgagac cttccaggac actctgcgat actgttacca cgttgctgga 420

gtcgttggtc tcatgatggc tcagatcatg ggagttcgag acgaagccgt gctggatcga 480

gcttgtgacc tcggtctggc ctttcagctt accaacattg ctcgagacat tgtcgaggat 540

gcacgagttg gacgttgcta cctgcctgag tcctggctcg aggaagctgg actcgatcga 600

ctgcacttcg ctgacagagc ccatcgacct gctcttgcca acttggcacg aagactcgtc 660

tccgaggctg aaccctacta tgcctctgcc agcgctggcc tcgcaggtct tcccttgcga 720

tctgcctggg ctattgcaac tgccaaggaa gtctacagac gaatcggagt gaaggtttac 780

ggtgctggcg agactgcctg ggacagacga cagtctacct cgaagcagga gaagctcctg 840

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<210> 7

<211> 1484

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atggctcaca ccactgtcat cggagctggc tttggtggac tggctctcgc cattcgactg 60

caggctgcag gcgttcccac ccgacttctg gagcagcgag acaagcctgg tggcagagcc 120

tacgtgtacc aggaccaagg cttcaccttt gatgctggac ccactgtcat taccgatccc 180

tccgccatcg aagagctctt cgctcttgcc ggcaagtcca tgcgagacta cgttgagctg 240

cttcccgtta cccctttcta ccgactctgc tgggagactg gcgaggtctt taactacgat 300

aacgatcagg ctcgactgga agccgagatt cggaagttca atcctgccga cgtggctggc 360

tatcagcgat tcctcgacta ctctcgagcc gtcttcgcag aaggttacct caagttggga 420

accgttccct ttctgtcctt tcgagacatg cttcgagccg ctcctcagct cgcacgtctt 480

caggcttggc gatctgtcta ctccaaggtg gccagcttca ttgaggatga caagctgaga 540

caagccttct cctttcactc gttgctcgtt ggtggcaacc cattcgctac ttcctctatc 600

tacaccctga ttcatgcatt ggagcgagaa tggggtgtct ggtttcctcg aggtggcaca 660

ggagctctgg ttcagggtat gctcaagctg ttccaggact tgggtggaac cctggagctc 720

aacgccagag tctctcacat cgaggccaag gaggctgcca tttccgcagt gcacttggag 780

gatggtcgag tcttcgaaac tcgagctgtt gcctccaacg ccgacgtggt tcatacctat 840

ggcgatcttc tcggaagaca tcccgctgca gccgctcagg ccaaaaagct gaagggcaag 900

cgaatgtcga actccttgtt tgtcctctac ttcggactga accaccatca cgaccagctt 960

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cgagatggac ttgccgaaga cttctctctc taccttcatg ctccctgtgt gactgatccc 1080

tcgcttgcac ctcccggatg tggcagctac tatgtcctgg ctcccgttcc tcaccttggt 1140

acagccgatc tcgactggaa cgtcgagggt cctcgactga gagaccgaat ctttgcctat 1200

ctcgaagagc actacatgcc tggactgcga tctcaactgg ttactcatcg aatcttcact 1260

cccttcgact ttcgagatca gctcaatgcc taccaaggtt ccgcattctc ggtggagccc 1320

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tatctggtcg gtgccggaac ccatcccggt gctggcattc ctggagtgat cggttctgcc 1440

aaggctactg cctccctgat gctcgaggat ctgcacgcct aagc 1484

<210> 8

<211> 1907

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ggtgtgttct gtggagcatt ctcacttttg gtaaacgaca ttgcttcaag tgcagcggaa 60

tcaaaaagta taaagtgggc agcgagtata cctgtacaga ctgtaggcga taactcaatc 120

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gtgagaaatg gaccgacaag acatattctg ctatccacgg actgttgcct gtgtcggtgg 300

ctacaatacg tgagtcagaa gggctgacgg tggtggttcc caaggaaaag gtcgacgagt 360

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tcactttgac gatacattct tcgttggagg ctgtgggtct gacagctgcg ttttcggcgc 480

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tcttcaccac caaaatgccc tcctacgaag ctcgagctaa cgtccacaag tccgcctttg 780

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aggaacttgc tcttaagcac ggtttcttcc tgttcgagga cagaaagttc gcagatattg 1020

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agctgtcttg caagggctct ctggccactg gcgagtactc caagcagacc attgagcttg 1320

cccgatccga ccccgagttt gtggttggct tcattgccca gaaccgacct aagggcgact 1380

ctgaggactg gcttattctg acccccgggg tgggtcttga cgacaagggt gacgctctcg 1440

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ctggctggga ggcttaccag aagattaact gttagaggtt agactatgga tatgtaattt 1620

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caatggggca tgttgttgtg tttctcgata cggagatgct gggtacaagt agctaatacg 1800

attgaactac ttatacttat atgaggcttg aagaaagctg acttgtgtat gacttattct 1860

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<210> 9

<211> 2264

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gtcgacacca tatcatataa aactaacaat gcattgctta ttacgaagac tacccgttgc 60

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ggggtgcaac cttgagcaca tagtactttt ccgaaaaccg gcgataatta agtgtgcact 180

ccaacttttc acactgagcg taaaatgtgg agaagaaatc ggcactaaaa agtcaggtag 240

actggaaaat gcgccatgaa atgaatatct cttgctacag taatgcccag catcgagggg 300

tattgtgtca ccaacactat agtggcagct gaagcgctcg tgattgtagt atgagtcttt 360

attggtgatg ggaagagttc actcaatatt ctcgttactg ccaaaacacc acggtaatcg 420

gccagacacc atggatgtag atcaccaagc ctgtgaatgt tattcgagct aaaatgcaca 480

tggttggtga aaggagtagt tgctgtcgaa ttccgtcgtc gcctgagtca tcatttattt 540

accagttggc cacaaaccct tgacgatctc gtatgtcccc tccgacatac tcccggccgg 600

ctggggtacg ttcgatagcg ctatcggcat cgacaaggtt tgggtcccta gccgataccg 660

cactacctga gtcacaatct tcggaggttt agtcttccac atagcacggg caaaagtgcg 720

tatatataca agagcgtttg ccagccacag attttcactc cacacaccac atcacacata 780

caaccacaca catccacaat gggcaagaag cccgagctga ccgccacctc tgtggagaag 840

ttcctgatcg agaagttcga ctctgtctcc gacctgatgc agctgtccga gggagaggag 900

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gccgacggct tctacaagga ccgatacgtg taccgacact tcgcttccgc tgctctgcct 1020

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ggtcctttcg gtcctcaggg aattggacag tacaccacct ggcgagactt catctgtgct 1260

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ttctggcgac cctggctggc ttgtatggag cagcagaccc gatacttcga gcgacgacac 1560

cctgagctgg ctggatctcc ccgactgcga gcttacatgc tgcgaattgg tctggaccag 1620

ctgtaccagt ccctggtgga cggcaacttc gacgacgctg cctgggctca gggacgatgt 1680

gacgccatcg tgcgatctgg cgctggaacc gtcggacgaa cccagattgc ccgacgatcc 1740

gctgctgtct ggaccgacgg atgcgtggag gtcctggctg actctggtaa ccgacgaccc 1800

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<210> 10

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tcgatcctaa ggggtggca 19

<210> 11

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tatatgatat ggtgtcgact ggctacctta agagagtc 38

<210> 12

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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cttcggtatg ataggaagag cc 22

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<212> DNA

<213> 解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)

<400> 14

tcgatcctaa ggggtggcat aactgtcgcg tacggcccga taagggcctt ctccaaaagg 60

gaagccggtt gaaattccgg cacttggatg tggattctcc acggcaacgt aactgaatgt 120

ggggacggtg gcacaagtct tggaaggagt tatcttttct ttttaacgga gtcaacaccc 180

tggaattagt ttgtctagag atagggtatc gttccggaag aggggggcag ctttgtcccc 240

tccgatgcac ttgtgacgcc ccttgaaaac ccgcaggaag gaatagtttt cacgccaagt 300

cgtactgata accgcagcag gtctccaagg tgaacagcct ctagttgata gaataatgta 360

gataagggaa gtcggcaaaa tagatccgta acttcgggat aaggattggc tctgggggtt 420

ggtggatgga agcgtgggag accccaaggg actggcggct gggcaactgg cagccggacc 480

cgcggcagac actgcgtcgc tccgtccaca tcatcaaccg ccccagaact ggtacggaca 540

aggggaatct gactgtctaa ttaaaacata gctttgcgat ggttgtaaaa caatgttgac 600

gcaaagtgat ttctgcccag tgctctgaat gtcaaagtga agaaattcaa ccaagcgcgg 660

gtaaacggcg ggagtaacta tgactctctt aaggtagcca gtcgacacca tatcatata 719

<210> 15

<211> 617

<212> DNA

<213> 解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)

<400> 15

aaagcctagc tcatctttaa tgcctcgtca tctaattagt gacgcgcatg aatggattaa 60

cgagattccc actgtcccta tctactatct agcgaaacca cagccaaggg aacgggcttg 120

gcagaatcag cggggaaaga agaccctgtt gagcttgact ctagtttgac attgtgaaga 180

gacatagggg gtgtagaata agtgggagct tcggcgccgg tgaaatacca ctacccttat 240

cgtttcttta cttatttagt aagtggaagt ggtttaacaa ccattttcta gcattccttt 300

ccaggctgaa gacattgtca ggtggggagt ttggctgggg cggcacatct gttaaaagat 360

aacgcagatg tcctaagggg gactcaatga gaacagaaat ctcatgtaga acaaaagggt 420

aaaagtcccc ttgattttga ttttcagtgt gaatacaaac catgaaagtg tggcctatcg 480

atcctttagt tgttcggagt ttgaacctag aggtgccaga aaagttacca cagggataac 540

tggcttgtgg cagtcaagcg ttcatagcga cattgctttt tgatccttcg atgtcggctc 600

ttcctatcat accgaag 617

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gttaattcaa attaattgat at 22

<210> 17

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

actaattaga tgacgaggca ttaaagatga gctaggcttt 40

<210> 18

<211> 799

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gttaattcaa attaattgat atagtttttt aatgagtatt gaatctgttt agaaataatg 60

gaatattatt tttatttatt tatttatatt attggtcggc tcttttcttc tgaaggtcaa 120

tgacaaaatg atatgaagga aataatgatt tctaaaattt tacaacgtaa gatattttta 180

caaaagccta gctcatcttt aatgcctcgt catctaatta gtgacgcgca tgaatggatt 240

aacgagattc ccactgtccc tatctactat ctagcgaaac cacagccaag ggaacgggct 300

tggcagaatc agcggggaaa gaagaccctg ttgagcttga ctctagtttg acattgtgaa 360

gagacatagg gggtgtagaa taagtgggag cttcggcgcc ggtgaaatac cactaccctt 420

atcgtttctt tacttattta gtaagtggaa gtggtttaac aaccattttc tagcattcct 480

ttccaggctg aagacattgt caggtgggga gtttggctgg ggcggcacat ctgttaaaag 540

ataacgcaga tgtcctaagg gggactcaat gagaacagaa atctcatgta gaacaaaagg 600

gtaaaagtcc ccttgatttt gattttcagt gtgaatacaa accatgaaag tgtggcctat 660

cgatccttta gttgttcgga gtttgaacct agaggtgcca gaaaagttac cacagggata 720

actggcttgt ggcagtcaag cgttcatagc gacattgctt tttgatcctt cgatgtcggc 780

tcttcctatc ataccgaag 799

<210> 19

<211> 1686

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

gcggccgcag tgcttttaac taagaattat tagtcttttc tgcttatttt ttcatcatag 60

tttagaacac tttatattaa cgaatagttt atgaatctat ttaggtttaa aaattgatac 120

agttttataa gttacttttt caaagactcg tgctgtctat tgcataatgc actggaaggg 180

gaaaaaaaag gtgcacacgc gtggctttgg agtttggcgc ccgttttttc gagccccaca 240

cgtttcggtg agtatgagcg gcggcagatt cgagcgtttc cggtttccgc ggctggacga 300

gagcccatga tgggggctcc caccaccagc aatcagggcc ctgattacac acccacctgt 360

aatgtcatgc tgttcatcgt ggttaatgct gctgtgtgct gtgtgtgtgt gttgtttggc 420

gctcattgtt gcgttatgca gcgtacacca caatattgga agcttattag cctttctatt 480

ttttcgtttg caaggcttaa caacattgct gtggagaggg atggggatat ggaggccgct 540

ggagggagtc ggagaggcgt tttggagcgg cttggcctgg cgcccagctc gcgaaacgca 600

cctaggaccc tttggcacgc cgaaatgtgc cacttttcag tctagtaacg ccttacctac 660

gtcattccat gcatgcatgt ttgcgccttt tttcccttgc ccttgatcgc cacacagtac 720

agtgcactgt acagtggagg ttttgggggg gtcttagatg ggagctaaaa gcggcctagc 780

ggtacactag tgggattgta tggagtggca tggagcctag gtggagcctg acaggacgca 840

cgaccggcta gcccgtgaca gacgatgggt ggctcctgtt gtccaccgcg tacaaatgtt 900

tgggccaaag tcttgtcagc cttgcttgcg aacctaattc ccaattttgt cacttcgcac 960

ccccattgat cgagccctaa cccctgccca tcaggcaatc caattaagct cgcattgtct 1020

gccttgttta gtttggctcc tgcccgtttc ggcgtccact tgcacaaaca caaacaagca 1080

ttatatataa ggctcgtctc tccctcccaa ccacactcac ttttttgccc gtcttccctt 1140

gctaacacaa aagtcaagaa cacaaacaac caccccaacc cccttacaca caagacatat 1200

ctacagcaaa tgggagaccg gtctcctaaa gcaattaaca gatagtttgc cggtgataat 1260

tctcttaacc tcccacactc ctttgacata acgatttatg taacgaaact gaaatttgac 1320

cagatattgt tgtaaataga aaatctggct tgtaggtggc aaaatgcggc gtctttgttc 1380

atcaattccc tctgtgacta ctcgtcatcc ctttatgttc gactgtcgta tttcttattt 1440

tccatacata tgcaagtgag atgcccgtgt ccgaattcgt ctgaagaatg aatgatttga 1500

tgatttcttt ttccctccat ttttcttact gaatatatca atgatataga cttgtatagt 1560

ttattatttc aaattaagta gctatatata gtcaagataa cgtttgtttg acacgattac 1620

attattcgtc gacatctttt ttcagcctgt cgtggtagca atttgaggag tattattagc 1680

ggccgc 1686

<210> 20

<211> 1546

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

cgcggatccg cggccgcgtc tgaagaatga atgatttgat gatttctttt tccctccatt 60

tttcttactg aatatatcaa tgatatagac ttgtatagtt tattatttca aattaagtag 120

ctatatatag tcaagataac gtttgtttga cacgattaca ttattcgtcg acatcttttt 180

tcagcctgtc gtggtagcaa tttgaggagt attattaaga gaccgggttg gcggcgcatt 240

tgtgtcccaa aaaacagccc caattgcccc aattgacccc aaattgaccc agtagcgggc 300

ccaaccccgg cgagagcccc cttctcccca catatcaaac ctcccccggt tcccacactt 360

gccgttaagg gcgtagggta ctgcagtctg gaatctacgc ttgttcagac tttgtactag 420

tttctttgtc tggccatccg ggtaacccat gccggacgca aaatagacta ctgaaaattt 480

ttttgctttg tggttgggac tttagccaag ggtataaaag accaccgtcc ccgaattacc 540

tttcctcttc ttttctctct ctccttgtca actcacaccc gaaatcgtta agcatttcct 600

tctgagtata agaatcattc aaaatggtga gtttcagagg cagcagcaat tgccacgggc 660

tttgagcaca cggccgggtg tggtcccatt cccatcgaca caagacgcca cgtcatccga 720

ccagcacttt ttgcagtact aaccgcaggg agacgacgtc tcctaaagct atttatcact 780

ctttacaact tctacctcaa ctatctactt taataaatga atatcgttta ttctctatga 840

ttactgtata tgcgttcctc taagacaaat cgaaaccagc atgcgatcga atggcataca 900

aaagtttctt ccgaagttga tcaatgtcct gatagtcagg cagcttgaga agattgacac 960

aggtggaggc cgtagggaac cgatcaacct gtctaccagc gttacgaatg gcaaatgacg 1020

ggttcaaagc cttgaatcct tgcaatggtg ccttggatac tgatgtcaca aacttaagaa 1080

gcagccgctt gtcctcttcc tcgaaactct caaacacagt ccagaggtcc tttatagctt 1140

gatctgtatc cagatagcct ccgtaattgg tgtgtgtctt caaatcccag acgtccacat 1200

tggcatgtcc tccactgata agcatttgaa gttcatctgc gttgaacatt gagacccacg 1260

aagggtcaat gagctggtat agaccgccca agaatgcatc tgtctgtgtt ctgatactgg 1320

tgttaagctt gtgaatttac tttaaatctt gcatttaaat aaattttctt tttatagctt 1380

tatgacttag tttcaattta tatactattt taatgacatt ttcgattcat tgattgaaag 1440

ctttgtgttt tttcttgatg cgctattgca ttgttcttgt ctttttcgcc acatgtaata 1500

tctgtagtag atacctgata cattgtggat gcggccgctc tagacg 1546

<210> 21

<211> 1546

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

cgcggatccg cggccgcgtc tgaagaatga atgatttgat gatttctttt tccctccatt 60

tttcttactg aatatatcaa tgatatagac ttgtatagtt tattatttca aattaagtag 120

ctatatatag tcaagataac gtttgtttga cacgattaca ttattcgtcg acatcttttt 180

tcagcctgtc gtggtagcaa tttgaggagt attattaaga gaccgggttg gcggcgcatt 240

tgtgtcccaa aaaacagccc caattgcccc aattgacccc aaattgaccc agtagcgggc 300

ccaaccccgg cgagagcccc cttctcccca catatcaaac ctcccccggt tcccacactt 360

gccgttaagg gcgtagggta ctgcagtctg gaatctacgc ttgttcagac tttgtactag 420

tttctttgtc tggccatccg ggtaacccat gccggacgca aaatagacta ctgaaaattt 480

ttttgctttg tggttgggac tttagccaag ggtataaaag accaccgtcc ccgaattacc 540

tttcctcttc ttttctctct ctccttgtca actcacaccc gaaatcgtta agcatttcct 600

tctgagtata agaatcattc aaaatggtga gtttcagagg cagcagcaat tgccacgggc 660

tttgagcaca cggccgggtg tggtcccatt cccatcgaca caagacgcca cgtcatccga 720

ccagcacttt ttgcagtact aaccgcaggg agacgacgtc tcctaaagct atttatcact 780

ctttacaact tctacctcaa ctatctactt taataaatga atatcgttta ttctctatga 840

ttactgtata tgcgttcctc taagacaaat cgaaaccagc atgcgatcga atggcataca 900

aaagtttctt ccgaagttga tcaatgtcct gatagtcagg cagcttgaga agattgacac 960

aggtggaggc cgtagggaac cgatcaacct gtctaccagc gttacgaatg gcaaatgacg 1020

ggttcaaagc cttgaatcct tgcaatggtg ccttggatac tgatgtcaca aacttaagaa 1080

gcagccgctt gtcctcttcc tcgaaactct caaacacagt ccagaggtcc tttatagctt 1140

gatctgtatc cagatagcct ccgtaattgg tgtgtgtctt caaatcccag acgtccacat 1200

tggcatgtcc tccactgata agcatttgaa gttcatctgc gttgaacatt gagacccacg 1260

aagggtcaat gagctggtat agaccgccca agaatgcatc tgtctgtgtt ctgatactgg 1320

tgttaagctt gtgaatttac tttaaatctt gcatttaaat aaattttctt tttatagctt 1380

tatgacttag tttcaattta tatactattt taatgacatt ttcgattcat tgattgaaag 1440

ctttgtgttt tttcttgatg cgctattgca ttgttcttgt ctttttcgcc acatgtaata 1500

tctgtagtag atacctgata cattgtggat gcggccgctc tagacg 1546

<210> 22

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

agagaccggg ttggcg 16

<210> 23

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

tgctccacag aacacaccct gtacgagtaa gagcactagc 40

<210> 24

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

tagtgctctt actcgtacag ggtgtgttct gtggagcatt c 41

<210> 25

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

ggtgtagtgg tagtgcagtg gtg 23

<210> 26

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

ctgaaataaa tttagtctgc agctgtacga gtaagagcac tagcc 45

<210> 27

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

cattttggtg gtgaagagga gactctgtac gagtaagagc actagcc 47

<210> 28

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

ggcattttgg tggtgaagag gctgtacgag taagagcact agcc 44

<210> 29

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

ggcattttgg tggtgaagag agactctgta cgagtaagag cactagcc 48

<210> 30

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

gtaggagggc atttggtggt gaagagctgt acgagtaaga gcactagcc 49

<210> 31

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

aggagggcat ttgggtggtg actgtacgag taagagcact agcc 44

<210> 32

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

cgtaggaggg cattttggtg gtctgtacga gtaagagcac tagcc 45

<210> 33

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

tcgtaggagg gcattttggt ggctgtacga gtaagagcac tagcc 45

<210> 34

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

gcttcgtagg agggcatttt ggtctgtacg agtaagagca ctagcc 46

<210> 35

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

ggctagtgct cttactcgta cagctgcaga ctaaatttat ttcagtctcc tc 52

<210> 36

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

ggctagtgct cttactcgta cagagtctcc tcttcaccac caaaatg 47

<210> 37

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

ggctagtgct cttactcgta cagcctcttc accaccaaaa tgcc 44

<210> 38

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

ggctagtgct cttactcgta cagagtctct cttcaccacc aaaatgcc 48

<210> 39

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

ggctagtgct cttactcgta cagctcttca ccaccaaatg ccctcctac 49

<210> 40

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

ggctagtgct cttactcgta cagtcaccac ccaaatgccc tcct 44

<210> 41

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

ggctagtgct cttactcgta cagaccacca aaatgccctc ctacg 45

<210> 42

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

ggctagtgct cttactcgta cagccaccaa aatgccctcc tacga 45

<210> 43

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 43

ggctagtgct cttactcgta cagaccaaaa tgccctccta cgaag 45

<210> 44

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 44

cactgcacta ccactacacc agtgctttta actaaga 37

<210> 45

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 45

aaagccacgc gtgtgcac 18

<210> 46

<211> 200

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 46

agtgctttta actaagaatt attagtcttt tctgcttatt ttttcatcat agtttagaac 60

actttatatt aacgaatagt ttatgaatct atttaggttt aaaaattgat acagttttat 120

aagttacttt ttcaaagact cgtgctgtct attgcataat gcactggaag gggaaaaaaa 180

aggtgcacac gcgtggcttt 200

<210> 47

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 47

tcaccaccaa aatgccctc 19

<210> 48

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 48

tcttagttaa aagcactggt gtagtggtag tgcagtg 37

<210> 49

<211> 1184

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 49

tcaccaccaa aatgccctcc tacgaagctc gagctaacgt ccacaagtcc gcctttgccg 60

ctcgagtgct caagctcgtg gcagccaaga aaaccaacct gtgtgcttct ctggatgtta 120

ccaccaccaa ggagctcatt gagcttgccg ataaggtcgg accttatgtg tgcatgatca 180

agacccatat cgacatcatt gacgacttca cctacgccgg cactgtgctc cccctcaagg 240

aacttgctct taagcacggt ttcttcctgt tcgaggacag aaagttcgca gatattggca 300

acactgtcaa gcaccagtac aagaacggtg tctaccgaat cgccgagtgg tccgatatca 360

ccaacgccca cggtgtaccc ggaaccggaa tcattgctgg cctgcgagct ggtgccgagg 420

aaactgtctc tgaacagaag aaggaggatg tctctgacta cgagaactcc cagtacaagg 480

agttcctggt cccctctccc aacgagaagc tggccagagg tctgctcatg ctggccgagc 540

tgtcttgcaa gggctctctg gccactggcg agtactccaa gcagaccatt gagcttgccc 600

gatccgaccc cgagtttgtg gttggcttca ttgcccagaa ccgacctaag ggcgactctg 660

aggactggct tattctgacc cccggggtgg gtcttgacga caagggtgac gctctcggac 720

agcagtaccg aactgttgag gatgtcatgt ctaccggaac ggatatcata attgtcggcc 780

gaggtctgta cggccagaac cgagatccta ttgaggaggc caagcgatac cagaaggctg 840

gctgggaggc ttaccagaag attaactgtt agaggttaga ctatggatat gtaatttaac 900

tgtgtatata gagagcgtgc aagtatggag cgcttgttca gcttgtatga tggtcagacg 960

acctgtctga tcgagtatgt atgatactgc acaacctgtg tatccgcatg atctgtccaa 1020

tggggcatgt tgttgtgttt ctcgatacgg agatgctggg tacaagtagc taatacgatt 1080

gaactactta tacttatatg aggcttgaag aaagctgact tgtgtatgac ttattctcaa 1140

ctacatcccc agtcacaata ccaccactgc actaccacta cacc 1184

Claims (2)

1.一种基于非同源末端连接机制的解脂耶氏酵母基因组整合的方法，其特征是包括如下步骤：

(1)将解脂耶氏酵母内源基因DL4和XRCC4，外源智人基因PAXX以rDNA位点整合的方式整合到解脂耶氏酵母ATCC201249菌株的基因组rDNA位点，得到解脂耶氏酵母非同源重组修复机制增强的重组菌株YNH01；

所述DL4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述PAXX基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述XRCC4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

(2)将待转入基因表达盒与启动子截短到11bp的URA3营养标签U11相连接，得到连接片段；将所述连接片段转化到所述重组菌株YNH01，得到高压力筛选标签菌株；

所述启动子截短到11bp的URA3营养标签U11核苷酸序列如SEQ ID NO.49所示；

(3)将所述连接片段再次转化到高压力筛选标签菌株，得到经过两轮转化的重组菌株；

(4)将所述连接片段再次转化到经过两轮转化的重组菌株，得到转入的基因高表达的菌株。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述待转入基因表达盒为绿色荧光蛋白GFP基因表达盒或番茄红素合成基因CrtE、CrtB和CrtI表达盒；

所述绿色荧光蛋白GFP基因表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

所述CrtE基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

所述CrtB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示

所述CrtI基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

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