JP6925003B2 - 非相同末端連結欠損細胞及びその利用 - Google Patents
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Description
また、本発明は、化合物の共存下及び非共存下において、動物培養細胞にマーカー遺伝子を含むDNA構築物を導入し、該細胞のゲノムへのDNA構築物のランダムな挿入を生じさせる工程;マーカー遺伝子の発現を指標として、化合物共存下でのDNA構築物の挿入頻度、及び化合物非共存下でのDNA構築物の挿入頻度を調べる工程; 化合物共存下の挿入頻度が化合物非共存下の挿入頻度よりも低下した化合物を、ポリメラーゼθ阻害剤候補化合物として選択する工程を含む、ポリメラーゼθ阻害剤のスクリーニング方法であって、前記動物培養細胞は、DNAリガーゼIV及びXRCC4から選択される少なくとも1種の非相同末端連結関連遺伝子の機能が阻害されている細胞である、方法を提供する。
さらに、本発明は、DNA二本鎖切断処理を施した動物培養細胞を化合物の共存下及び非共存下で培養し、細胞の生存率を調べる工程;化合物共存下の細胞生存率が化合物非共存下の細胞生存率よりも低下した化合物を、ポリメラーゼθ阻害剤候補化合物として選択する工程を含む、ポリメラーゼθ阻害剤のスクリーニング方法であって、前記動物培養細胞は、DNAリガーゼIV及びXRCC4から選択される少なくとも1種の非相同末端連結関連遺伝子の機能が阻害されている細胞である、方法を提供する。
さらに、本発明は、DNAリガーゼIV及びXRCC4から選択される少なくとも1種の非相同末端連結関連遺伝子の機能が阻害され、かつ、ポリメラーゼθ遺伝子がホモで破壊されている動物培養細胞にターゲティングベクターを導入し、該細胞内で相同組換えを生じさせることを含む、ゲノムが改変された動物培養細胞の製造方法を提供する。
DNAリガーゼIV(LIG4)(Gene ID: 3981, Accession No. NM_206937)
Ku70/XRCC6(Gene ID: 2547, Accession No. NM_001469)
Ku80/XRCC5(Gene ID: 7520, Accession No. NM_021141)
DNA-PKcs(Gene ID: 5591, Accession No. NM_006904)
Artemis(Gene ID: 64421, Accession No. NM_001289079)
XLF(Gene ID: 79840, Accession No. NM_024782)
XRCC4(Gene ID: 7518, Accession No. NM_001318012)
PAXX(Gene ID: 286257, Accession No. NM_183241)
DNAポリメラーゼλ(Gene ID: 27343, Accession No. NM_001174084)
DNAポリメラーゼμ(Gene ID: 27434, Accession No. NM_013284)
53BP1(Gene ID: 7158, Accession No. NM_005657)
PNKP(Gene ID: 11284, Accession No. NM_007254)
PALF(Gene ID: 200558, Accession No. NM_173545)
TDP1(Gene ID: 55775, Accession No. NM_018319)
TDP2(Gene ID: 51567, Accession No. NM_016614)
Aprataxin(Gene ID: 54840, Accession No. NM_001195249)
WRN(Gene ID: 7486, Accession No. NM_000553)
NHEJの機能が阻害された動物培養細胞を利用して、ポリメラーゼθを特異的に阻害するポリメラーゼθ阻害剤をスクリーニングすることができる。ポリメラーゼθ阻害剤のスクリーニング方法としては、ランダム挿入頻度の低下を指標として化合物を選択する方法(第1のスクリーニング方法)と、エトポシド等によるDNA二本鎖切断(double-strand break; DSB)処理に対する感受性を指標として化合物を選択する方法(第2のスクリーニング方法)の二つの態様がある。以下、第1及び第2のスクリーニング方法の各工程をより詳細に説明する。
使用する細胞は、変異又は遺伝的改変によりNHEJの機能が阻害された動物培養細胞である。NHEJの機能の阻害、NHEJ関連遺伝子の具体例、該動物培養細胞の作製方法等は上述した通りである。当該スクリーニング方法においては、とりわけ、LIG4遺伝子の全てのアレルが破壊され、かつ、POLθ遺伝子の一部のアレルが破壊されたゲノムを有する動物培養細胞を特に好ましく用いることができる。
使用する細胞は、第1のスクリーニング方法と同様に、変異又は遺伝的改変によりNHEJの機能が阻害された動物培養細胞である。第2の方法においても、LIG4遺伝子の全てのアレルが破壊された動物培養細胞の他、LIG4遺伝子の全てのアレルが破壊され、かつ、POLθ遺伝子の一部のアレルが破壊された動物培養細胞も好ましく用いることができる。
NHEJの機能及びPOLθの機能が阻害された条件下では、相同組換えによらないランダム挿入が大幅に抑制され、ターゲティング効率が飛躍的に高まる。下記実施例では、280万個に及ぶ細胞でターゲティングベクターによる部位特異的遺伝子導入実験を行なった結果、NHEJ欠損かつPOLθ欠損の二重欠損細胞におけるターゲティングの効率が100%となることが確認されている。従って、NHEJの機能及びPOLθの機能が阻害された条件下において、相同組換えによる遺伝子導入を行なうことで、標的部位に所望の遺伝子が挿入されたゲノム改変細胞を極めて高い効率で取得することができる。以下、当該ゲノム改変方法(ゲノムが改変された動物培養細胞の製造方法)の各工程をより詳細に説明する。
ヒトPOLQ遺伝子破壊用ターゲティングベクターに使用する2つの相同領域(3.0-kbの5'相同領域(配列番号26)、5.3-kbの3'相同領域(配列番号27))は、Nalm-6細胞から抽出したゲノムDNAを鋳型としたPCRにより増幅して得た。PCRのポリメラーゼにはTks Gflex(商品名) DNA polymerase (タカラバイオ、日本国大津)を使用した。使用したプライマーを下記表2に示す。5'相同領域の増幅にはPOLQ 5’ Fw及びPOLQ 5’ Rvを、3'相同領域の増幅にはPOLQ 3’ Fw及びPOLQ 3’ Rvを用いた。MultiSite Gateway system (Life Technologies、米国MD州Rockville)を用いて、2Aペプチドに結合したハイグロマイシン耐性遺伝子(HygR)又はピューロマイシン耐性遺伝子(PuroR)(文献1)を5'相同領域及び3'相同領域の間に配置し、エクソントラッピング(プロモーターレス)ターゲティングベクターpPOLQ 2A-Hyg及びpPOLQ 2A-Puroを得た(図1)。これらのプラスミドは、Qiagen Plasmid Plus Midi Kit (Qiagen K.K., 日本国東京) を用いて精製し、I-SceI (New England Biolabs, 米国MA州Ipswich)で切断してリニア化してからトランスフェクションに用いた。
ヒトpre-B細胞株Nalm-6及びその派生細胞は、5%CO2インキュベーター内で37℃で培養した(文献2)。Nalm-6細胞のトランスフェクションは既報(文献3、4)に従って行なった。簡潔に記載すると、4×106個の細胞を4μgのリニア化プラスミドとともにエレクトロポレーションに付し、24時間培養した後、0.3 mg/mlハイグロマイシンB (和光純薬工業、日本国大阪)、0.15〜0.4μg/mlピューロマイシン (和光純薬工業) 又は1.0 mg/ml G418 (和光純薬工業)を含む寒天培地に90 mm培養皿あたり0.5〜1×106個の細胞密度で再播種した。
(1) LIG4-/-細胞株の作製
LIG4ホモ欠損(LIG4-/-)のNalm-6細胞は、既報(文献5)の通りに下記の手順で作製した。Nalm-6細胞より抽出したゲノムDNAを鋳型とし、下記表3に示すプライマーを用いたPCRにより(ポリメラーゼはタカラバイオのExTaq(商品名) DNAポリメラーゼを使用)、LIG4遺伝子破壊用ターゲティングベクターの5'相同領域(2.2kb)及び3'相同領域(2.0kb)を調製した。5'相同領域(配列番号28)の増幅にはattB4配列を含むL4-1及びattB1配列を含むL4-2を、3'相同領域(配列番号29)の増幅にはattB2配列を含むL4-3及びattB3配列を含むL4-4を用いた。
薬剤耐性遺伝子を除去したLIG4-/-細胞にターゲティングベクターpPOLQ 2A-Hygをトランスフェクトし、ハイグロマイシン耐性コロニーを単離、増殖させてPOLQのヘテロ欠損株LIG4-/-POLQ+/-を作製した。遺伝子ターゲティングの成否は、POLQ 5’ ext及びUniversal primer 2Aを用いたPCRにより確認した。
細胞増殖速度の解析は文献2に記載の通りに行なった。すなわち、4×104細胞/mlの密度の細胞を24穴プレートのウェルに播種し、24時間ごとに細胞数を計測して細胞増殖速度を評価した。
二本鎖切断(double-strand break; DSB)誘発剤エトポシドに対する感受性の解析は、既報(文献6)に従って実施した。簡潔に記載すると、細胞を2×104個/mlの密度で24穴プレートに植え込み、エトポシドを0〜10nMの濃度で添加した。72時間培養後、CellTiter-Glo Luminescent Viability Assay kit(プロメガ)を用いて細胞数を測定し、生存率を算出した。
G418耐性遺伝子を発現する公知のpPGKneoプラスミドを非ターゲティングベクターとして使用し、既報(文献7)に従い下記の手順でインテグレーションアッセイを行なった。
インテグレーション頻度=G418耐性コロニー数/G418非含有培地でのコロニー数
遺伝子ターゲティングアッセイは、G418耐性遺伝子を発現するpPGKneoプラスミドを使用し、X染色体上のHPRT遺伝子座(HPRT遺伝子の破壊は6-チオグアニン耐性をもたらす)を利用して、文献4、7の記載に従い下記の通りに実施した。
遺伝子ターゲティング効率(Gene-targeting efficiency, %)=目的部位へのNeoRの挿入が生じたクローン数/遺伝子ターゲティングの成否の解析に付したクローン数×100
野生型のNalm-6細胞(WT)、並びに上記で作製したLIG4-/-POLQ+/+細胞、LIG4-/-POLQ+/-細胞及びLIG4-/-POLQ-/-細胞において、siRNAによりPOLQ遺伝子をノックダウンし、インテグレーションアッセイを行ないランダム挿入の頻度の変化を調べた。
マーカー遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子Nluc(トゲオキヒオドシエビ由来のルシフェラーゼNanoLuc(商標)、プロメガ社)を使用し、CMVプロモーターの下流にNlucを連結したpCMV-Nlucと、プロモーターを有しないpSA-2A-Nluc-2A-Hyg(以下、pSA-2A-Nlucと略記する)の2種類の非ターゲティングベクターを構築した(図6左)。また、薬剤選択用プラスミドとして、PGKプロモーターの下流にピューロマイシン耐性遺伝子を連結したpEpi-Puroを構築した(図6右)。
文献1: Saito et al. (2015) Construction and applications of exon-trapping gene-targeting vectors with a novel strategy for negative selection. BMC Res. Notes 8: 278
文献2: So et al. (2004) Genetic interactions between BLM and DNA ligase IV in human cells. J. Biol. Chem. 279: 55433-55442
文献3: Adachi et al. (2008) Highly proficient gene targeting by homologous recombination in the human pre-B cell line Nalm-6. Methods Mol. Biol. 435: 17-29
文献4: Iiizumi et al. (2008) Impact of non-homologous end-joining deficiency on random and targeted DNA integration: implications for gene targeting. Nucleic Acids Res. 36: 6333-6342
文献5: Iiizumi et al. (2006) Simple one-week method to construct gene-targeting vectors: application to production of human knockout cell lines. Biotechniques 41: 311-316
文献6: Kurosawa et al. (2013) DNA ligase IV and Artemis act cooperatively to suppress homologous recombination in human cells: Implications for DNA double-strand break repair. PLoS One 8: e72253
文献7: Ishii et al. (2014) Analysis of the role of homology arms in gene-targeting vectors in human cells. PLoS One 9: e108236
Claims (20)
- DNAリガーゼIV及びXRCC4から選択される少なくとも1種の非相同末端連結関連遺伝子の機能が阻害され、かつ、ポリメラーゼθ遺伝子がホモで破壊されている動物培養細胞を含む、相同組換え実験用、ゲノム改変実験用、又は遺伝子ターゲティング実験用の細胞。
- 前記非相同末端連結関連遺伝子がDNAリガーゼIVである、請求項1記載の細胞。
- 前記動物培養細胞は、前記非相同末端連結関連遺伝子がホモで破壊されている、請求項1又は2記載の細胞。
- 前記動物培養細胞が哺乳動物培養細胞である、請求項1ないし3のいずれか1項に記載の細胞。
- 前記哺乳動物培養細胞がヒト培養細胞である、請求項4記載の細胞。
- DNAリガーゼIV及びXRCC4から選択される少なくとも1種の非相同末端連結関連遺伝子の機能が阻害されている動物培養細胞を含む、ポリメラーゼθ阻害剤のスクリーニングのためのツール。
- 前記非相同末端連結関連遺伝子がDNAリガーゼIVである、請求項6記載のツール。
- 前記動物培養細胞は、前記非相同末端連結関連遺伝子がホモで破壊されている、請求項6又は7記載のツール。
- 前記動物培養細胞は、ポリメラーゼθ遺伝子がノックダウン又はヘテロで破壊されている、請求項6ないし8のいずれか1項に記載のツール。
- 化合物の共存下及び非共存下において、動物培養細胞にマーカー遺伝子を含むDNA構築物を導入し、該細胞のゲノムへのDNA構築物のランダムな挿入を生じさせる工程、
マーカー遺伝子の発現を指標として、化合物共存下でのDNA構築物の挿入頻度、及び化合物非共存下でのDNA構築物の挿入頻度を調べる工程、
化合物共存下の挿入頻度が化合物非共存下の挿入頻度よりも低下した化合物を、ポリメラーゼθ阻害剤候補化合物として選択する工程
を含む、ポリメラーゼθ阻害剤のスクリーニング方法であって、前記動物培養細胞は、DNAリガーゼIV及びXRCC4から選択される少なくとも1種の非相同末端連結関連遺伝子の機能が阻害されている細胞である、方法。 - 前記マーカー遺伝子が薬剤耐性遺伝子である、請求項10記載の方法。
- 前記マーカー遺伝子がルシフェラーゼ遺伝子である、請求項10記載の方法。
- DNA二本鎖切断処理を施した動物培養細胞を化合物の共存下及び非共存下で培養し、細胞の生存率を調べる工程、
化合物共存下の細胞生存率が化合物非共存下の細胞生存率よりも低下した化合物を、ポリメラーゼθ阻害剤候補化合物として選択する工程
を含む、ポリメラーゼθ阻害剤のスクリーニング方法であって、前記動物培養細胞は、DNAリガーゼIV及びXRCC4から選択される少なくとも1種の非相同末端連結関連遺伝子の機能が阻害されている細胞である、方法。 - DNA二本鎖切断誘発処理が、電離放射線照射、又はDNA二本鎖切断誘発剤による処理である、請求項13記載の方法。
- DNA二本鎖切断誘発剤が、トポイソメラーゼ2阻害剤、及び放射線類似作用物質から選択される薬剤である、請求項14記載の方法。
- DNA二本鎖切断誘発剤が、エトポシド、ブレオマイシン、及びネオカルチノスタチンから選択される薬剤である、請求項15記載の方法。
- 前記動物培養細胞は、ポリメラーゼθ遺伝子がノックダウン又はヘテロで破壊されている、請求項10ないし16のいずれか1項に記載の方法。
- 前記非相同末端連結関連遺伝子がDNAリガーゼIVである、請求項10ないし17のいずれか1項に記載の方法。
- DNAリガーゼIV及びXRCC4から選択される少なくとも1種の非相同末端連結関連遺伝子の機能が阻害され、かつ、ポリメラーゼθ遺伝子がホモで破壊されている動物培養細胞にターゲティングベクターを導入し、該細胞内で相同組換えを生じさせることを含む、ゲノムが改変された動物培養細胞の製造方法。
- 前記非相同末端連結関連遺伝子がDNAリガーゼIVである、請求項19記載の方法。
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