JP6829761B2 - 遺伝子編集モジュールおよび遺伝子送達アプローチを解析および最適化するための方法 - Google Patents

Description

本発明は、改変された細胞株または生物の作製のための遺伝子編集の分野におけるものである。より正確には、ゲノム組込み事象の判定のための方法が本明細書において報告される。

発明の背景
生体系および生物を操作する技術は、基礎科学、医学、およびバイオテクノロジーに不可欠である（Ran, et al. 2013）。ここ数年間で、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）（Miller, et al. 2007；Sander, et al. 2011；Wood, et al. 2011）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）（Hockemeyer, et al. 2011；Sanjana, et al. 2012；Wood, et al. 2011；Zhang, et al. 2011）、およびRNAガイドCRISPR/Cas9ヌクレアーゼシステム（Cho, et al. 2013；Cong, et al. 2013；Makarova, et al. 2011；Ran, et al. 2013）を含めた、いくつかのゲノム編集技術が生まれている。CRISPR/Cas9ヌクレアーゼシステムは、標的DNA配列に相補的である20個のヌクレオチドを含有する小さなRNAによってガイドされる（Fu, et al. 2014）。TALENおよびZFNとは対照的に、CRISPR/Cas9システムは、多様な細胞タイプおよび生物に対するハイスループットでかつ多重化された遺伝子編集を設計するのがより容易であり、そのような遺伝子編集に有効であり、よく適していると言われる（Ran, et al. 2013）。さらには、遺伝子編集技術は、トランスジェニック動物（キイロショウジョウバエ（drosophila melanogaster）、ゼブラフィッシュ、マウス、ラット、およびウサギ）の作製のための、細胞株、初代細胞（体性幹細胞および多能性幹細胞）、および受精卵母細胞などにおける、遺伝学が動機となったツールに不可欠である（McMahon, et al. 2012；Urnov, et al. 2010）。治療的ゲノム編集の最初の適用は、HIV患者の自己CD4 T細胞におけるCCR5であり、それは臨床に入った（Gori, et al. 2015；Tebas, et al. 2014）。この適用を超えて、遺伝子編集は、前臨床レベルにおけるならびに第1相臨床試験における多種多様の疾患において適用が成功している（Cox, et al. 2015；Holt, et al. 2010；Li, et al. 2011；Perez, et al. 2008；Tebas, et al. 2014；Yin, et al. 2014）。ゲノム編集に基づく療法を達成するメカニズムは、有害な変異の修正または不活性化、保護的変異の導入、治療用導入遺伝子の付加、およびウイルスDNAの破壊である（Cox, et al. 2015）。それゆえ、CRISPR/Cas9技術を用いるものを含めた遺伝子編集アプローチは、種々の疾患に対する全く新しいクラスの治療法を生じさせ得る。

治療的適用のために（ならびに、R＆Dにおける有効な使用法のために）、遺伝子編集技術およびモジュールの特徴付けおよび比較は不可欠である。これは、それらの効率および特異性の解析および比較、ならびに標的細胞への送達の最適化を含む。送達の最適化および特異性の査定は、遺伝子編集技術の安全でかつ有効な臨床への移行にとって重大である（Gori, et al. 2015）。例えば、CRISPR/Cas9システムにおいて、オフターゲット活性を低下させかつ特異性を増加させることが非常に望ましい（Zhang, et al. 2015）。オフターゲット変異は、高頻度に、かつ意図される標的変異および挿入よりもはるかに高い割合で生じ得る。これは、ゲノム不安定性と、その他の点では正常な遺伝子の機能性のかく乱因子とを誘導し得る（Cho, et al. 2014；Fu, et al. 2013；Mali, et al. 2013a；Pattanayak, et al. 2013；Zhang, et al. 2015）。目標は、オンターゲット切断効率を失うことなくオフターゲット活性の低下を促す、CRISPR/Cas9システムの様々な構成要素を最適化することである（Zhang, et al. 2015）。

CRISPR/Cas9に由来する適用の開発および最適化のための1つの必要条件は、ヘテロ接合型の遺伝子不活性化事象およびホモ接合型の遺伝子不活性化事象、ならびに非特異的組込み事象および標的組込み事象についての確実でかつ堅牢な検出および的確な判定である。表現型の挿入（例えば、薬物耐性）もしくは欠如（遺伝子不活性化）によってもたらされる表現型の判定、または遺伝子解析/シーケンシングアプローチなどの既存の方法は、ホモ接合型の不活性化とヘテロ接合型の不活性化を区別しないことが多い。また、既存の技術は、個々の細胞の遺伝子組成に対処することは滅多にない、または堅牢な統計解析を支える多数の個々の遺伝子編集された細胞に基づくわけではない。

Picco, G., et al.は、安定に形質導入されたヒト細胞のインビトロおよびインビボ選択のためのジフテリア毒素耐性マーカーを開示した（Scientif. Rep. 5 (2015) 1-11）。Stahl, S., et al.は、ジフタミドの喪失が、NF-[κ]Bおよびデスレセプター経路をあらかじめ活性化し、MCF7細胞を腫瘍壊死因子に対して高感受性にすることを開示した（補足情報を含む）（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 112 (2015) 10732-10737+6p）。

US 2016/058889は、CRISPR/Cas9媒介性遺伝子編集（Myo編集）が、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）のモデルであるmdxマウスにおけるジストロフィン遺伝子変異を修正することにおいて有効であることを開示した。WO 2016/109840は、cas/CRISPRシステムを用いた高効率ゲノム編集のための細胞株、そのような細胞株を作製する方法、およびそのような細胞株を用いて生物のゲノムに変異を作製する方法を開示した。Pradeep, G.K., et al.は、伸長因子-2上のジフタミド修飾が、哺乳動物細胞をリシンに対して耐性にすることを開示した（Cell. Microbiol. 10 (2008) 1687-1694）。

WO 2007/143858は、Dph2遺伝子欠失変異体およびその使用を開示した。

Carette, J.E., et al.は、ヒト細胞における単数体遺伝子スクリーニングが、病原体によって用いられる宿主因子を同定することを開示した（Science 326 (2009) 1231-1235）。Roy, V., et al.は、ジフタミド形成を妨げるドミナント・ネガティブアプローチが、シュードモナス（pseudomonas）外毒素Aおよびジフテリア毒素に対する耐性を付与することを開示した（PLOS ONE 5 (2010) 1-7）。

毒素と組み合わせた遺伝子不活性化と、任意で抗生物質による選択とを組み合わせることに基づき、遺伝子編集アプローチを定量化するおよび最適化する堅牢でかつ簡便な方法が本明細書において報告される。方法は、多数の個々の細胞に対する遺伝子編集効率を判定するだけでなく、すなわちハイスループットのアプローチまたは使用に適切であるだけでなく、ホモ接合型の組込み事象とヘテロ接合型の組込み事象を区別する、ならびに部位特異的および非特異的な遺伝子破壊および/または組込み事象を区別することも可能にする。方法の簡便性および堅牢性は、種々の遺伝子編集モジュールの効率および特異性についての解析および直接比較を可能にして、適切な細胞クローンを同定し、かつ研究および開発ならびに療法における適用のための所望の特性をもたらす組込み事象を同定する。

なかでも、CRISPR/Cas媒介性遺伝子変更の定量化のための堅牢な方法が本明細書において報告される。方法を用いて、例えば、遺伝子編集事象の効率を判定すること、部位特異的および非（部位）特異的な遺伝子破壊および配列組込み事象の違いを判定することが可能である。ゆえに、本明細書において報告される方法は、CRISR/Cas媒介性遺伝子不活性化および組込み事象の定量化および/または最適化に用いられ得る。

本明細書において報告される1つの局面は、哺乳動物細胞のゲノム内への核酸の導入を判定するための方法であって、該哺乳動物細胞は、DPH1、DPH2、DPH4、および/またはDPH5遺伝子の、1つの態様では1つまたは複数の、別の態様では2つの転写的に活性なアレルを含み、該方法は、
−導入すべき核酸とDPH遺伝子の遺伝子編集に必要なエレメントとを含む1種または複数種のプラスミドを、哺乳動物細胞にトランスフェクトする工程、
−トランスフェクトされた細胞をDPH遺伝子転写感受性毒素の存在下で培養する工程、
−トランスフェクトされた細胞が毒素の存在下で生存可能である場合、哺乳動物細胞のゲノム内への核酸の導入を判定する工程
を含む。

本明細書において報告される方法の1つの態様において、DPH遺伝子転写感受性毒素は、シュードモナス外毒素、ジフテリア毒素、およびコリックス毒素からなる群より選択される。

本明細書において報告される方法の1つの態様において、該方法は、
−導入すべき核酸と、選択マーカーに対する耐性を付与する核酸と、DPH遺伝子の遺伝子編集に必要なエレメントとを含む1種または複数種のプラスミドを、哺乳動物細胞にトランスフェクトする工程、
−トランスフェクトされた細胞を選択圧の非存在下で培養する工程、
−培養物を少なくとも2つのアリコートに分ける、または培養物から少なくとも2つのサンプルを採取する工程、および
−第一のアリコートまたはサンプルを、DPH遺伝子転写感受性毒素の存在下で培養し、かつ第二のアリコートまたはサンプルを、対応する選択マーカーの存在下で培養する工程
を含む。

本明細書において報告される方法を用いて、遺伝子編集効率を判定し得る。統計学に基づいてこの解析を行うために、多数の個々の細胞が加工されかつ個々に解析される必要がある。

本明細書において報告される方法の1つの態様において、哺乳動物細胞は大量の哺乳動物細胞であり、かつ該方法は、毒素および/または選択マーカーの存在下で細胞を培養する工程の直前に、
−トランスフェクトされた大量の細胞からの細胞を、単一細胞として付着させる工程
を含む。

本明細書において報告される方法の1つの態様において、大量の哺乳動物細胞は1000〜10,000,000個の細胞である。

同じトランスフェクションから得られた大量の細胞についてのこの解析は、遺伝子編集工程の効率および特異性の判定を可能にする。

本明細書において報告される方法の1つの態様において、方法は、遺伝子編集の効率を判定するための、遺伝子編集の特異性を判定するための、または遺伝子編集の効率および特異性を判定するためのものである。

この解析は、トランスフェクション結果の統計解析を実施する可能性により、ホモ接合型の遺伝子改変とヘテロ接合型の遺伝子改変を区別する、ならびに部位特異的および非（部位）特異的な遺伝子破壊および組込み事象を区別することをさらに可能にする。

本明細書において報告される方法の1つの態様において、方法は、ホモ接合型およびヘテロ接合型の遺伝子改変を判定するための、または部位特異的および非（部位）特異的な遺伝子破壊および組込みを判定するためのものである。

ホモ接合型DPH遺伝子不活性化は、毒素耐性を引き起こす。この場合、DPH遺伝子の全アレルが細胞において不活性化される。

本明細書において報告される方法の1つの態様において、トランスフェクトされた細胞が選択マーカーの存在下で生存可能である場合、核酸の導入は、哺乳動物細胞のゲノム内への核酸の少なくとも単一導入である。

毒素感受性は、ホモ接合型およびヘテロ接合型の標的遺伝子改変ならびに非改変を区別する。ゆえに、トランスフェクトされた細胞が毒素に感受性であるが選択マーカーにはそうでない場合には、トランスフェクションは、ヘテロ接合型のまたは非特異的な遺伝子組込みをもたらした。

本明細書において報告される方法の1つの態様において、トランスフェクトされた細胞が毒素の存在下で生存不可能であるが選択マーカーの存在下で生存可能である場合、核酸の導入は、哺乳動物細胞のゲノム内への1つの核酸導入である。

本明細書において報告される方法の1つの態様において、トランスフェクトされた細胞が毒素の存在下で生存可能である場合、核酸の導入は、哺乳動物細胞のゲノムにおける核酸ノックアウト（完全な機能不活性化）である。

選択マーカーに対する耐性は、核酸の組込みの現れである。それが毒素耐性を欠く場合には、組込みは、ゲノムにおけるDPH遺伝子のものとは異なる箇所で起こった。トランスフェクトされた細胞が毒素に対して同時に耐性である場合には、核酸の組込みは、この理論によって拘束されることなく、DPH遺伝子において起こり、その不活性化をもたらした。

本明細書において報告される方法の1つの態様において、DPH遺伝子不活性化および核酸組込み事象は、毒素および選択マーカーの存在下での培養と、任意で高解像度融解（HRM）PCRとを組み合わせることによって定量化される。

毒素耐性、選択マーカー耐性、または二重耐性の頻度を比較することによって、組込みと不活性化を伴う組込みが区別され得る。第一のケースでは、それは非（部位）特異的組込みであり（核酸は組込まれたが、標的遺伝子は不活性化されていない）、一方で第二のケースでは、それは、この理論によって拘束されることなく、部位特異的組込みである（核酸が組込まれ、かつ標的遺伝子が不活性化されている）。ホモ接合型遺伝子不活性化は、毒素耐性をもたらし；標的核酸組込みは、毒素ならびに選択マーカー耐性をもたらし；非標的組込み事象は、選択マーカー耐性のみをもたらす。

毒素耐性、選択マーカー耐性、および二重耐性の頻度を比較することによって、遺伝子編集過程の特異性および効率の判定もなされ得る。ゆえに、本明細書において報告される方法を用いて、異なる遺伝子編集手法を評価しかつランク付けすることが可能である、または同じように、同じ/1つの遺伝子編集手法において用いられる種々のエレメントを評価しかつランク付けすることが可能である。

ゆえに、本明細書において報告される方法の堅牢な読み取り、すなわち毒素または選択マーカー耐性コロニーの数、を適用して、遺伝子改変効率および改変のタイプに対する、例えばCRISPR/Cas遺伝子編集手法におけるガイドRNAの配列長など、方法の変動要素の影響を評価し得る。

本明細書において報告される方法の1つの態様において、該方法は、異なる遺伝子編集手法を評価するための/それらの効率を比較するためのものであり、かつ
−導入すべき核酸と、選択マーカーに対する耐性を付与する核酸と、DPH遺伝子を編集するための第一の遺伝子編集手法に必要なエレメントとを含む1種または複数種のプラスミドを、哺乳動物細胞にトランスフェクトする工程、
−トランスフェクトされた細胞を選択圧の非存在下で培養する工程、
−培養物を少なくとも2つのアリコートに分ける、または培養物から少なくとも2つのサンプルを採取する工程、
−第一のアリコートまたはサンプルを、DPH遺伝子発現依存性毒素の存在下で培養し、かつ第二のアリコートまたはサンプルを、対応する選択マーカーの存在下で培養する工程、
−試験すべきすべての遺伝子編集手法に対してこれらの工程を繰り返す工程、および
−毒素耐性、選択マーカー耐性、または二重耐性の頻度に基づき、異なる遺伝子編集手法をランク付けする工程
を含む。

ジフテリア毒素は、eEF2上のジフタミドをADPリボシル化し、それによってeEF2を不活性化する。これは、タンパク質合成を不可逆的に失速させ、細胞を殺傷する。ジフタミドは、例えばジフタミド生合成遺伝子1、2、4、および5（DPH1、DPH2、DPH4、およびDPH5）などのジフタミド合成遺伝子によって生成される、規定されたヒスチジン修飾体である。これらの遺伝子の不活性化は、毒素標的の合成を停止させ、細胞をシュードモナス外毒素Aおよびジフテリア毒素に対して耐性にする（Stahl et al. 2015）。

標的遺伝子の全アレルの不活性化の頻度は、毒素耐性コロニーをカウントすることによって迅速でかつ堅牢な様式で検出され得る。

本明細書において報告される方法の1つの態様において、細胞における標的遺伝子の全アレルの（インビトロ）不活性化の頻度は、毒素耐性コロニーをカウントすることによって検出される。

標的遺伝子の一方のアレルのみが改変されている細胞は、培養細胞に対して直接実施されるHRM-PCRアッセイによって同定され得る。CRISPR/Cas標的部位の改変は、野生型遺伝子に由来するフラグメントのものと比較して、それぞれのDPH遺伝子に由来するPCRフラグメントの融解温度を変更する。これは、HRMプロファイルにおける二相融解曲線によって反映される。

本明細書において報告される方法の1つの態様において、細胞における標的遺伝子の一方のアレルの（インビトロ）不活性化は、HRM-PCRによって二相融解曲線の存在により検出される。

本明細書において報告される方法の1つの態様において、HRM-PCRは、培養細胞に対して直接実施される。

CRISPR/Cas9媒介性遺伝子不活性化事象は、細胞における両（全）アレル上で同一であることは滅多にないため、完全な遺伝子不活性化を有する多くの細胞も、二相HRMプロファイルを示すと考えられる。これらは、それらの毒素耐性表現型によって、単一アレル遺伝子変更と区別され得る。

本明細書において報告される方法の1つの態様において、CRISPR/Cas9による標的遺伝子の全アレルの不活性化の頻度は、HRM-PCRによって決定される二相融解曲線と組み合わせて、毒素耐性コロニーをカウントすることによって検出される。

ゆえに、ハイスループットのオンセルHRM-PCRと毒素選択（コロニーカウント）アッセイとの組み合わせは、ヘテロ接合型およびホモ接合型のDPH遺伝子特異的改変事象の定量化を可能にする。

適用されるCRISPR/Cas9プラスミドの組込みカセットによってコードされる、例示的に用いられるピューロマイシン-N-アセチル-トランスフェラーゼ（PAC）は、ピューロマイシン（PM、選択マーカー）を不活性化し、それゆえ細胞をPM耐性にする。これは一般的原理であるため、それは、トランスフェクト陽性細胞の選択に一般に用いられる任意の抗生物質とともに働く。

ゆえに、毒素耐性、例えばシュードモナス外毒素（PE）およびジフテリア毒素（DT）耐性は、特異的でかつホモ接合型の標的遺伝子不活性化により生じる。

選択マーカー、例えばPM耐性は、組込みの箇所とは無関係の、任意の組込み事象に対する特徴である。

部位特異的対非（部位）特異的な組込みの頻度は、標的遺伝子特異的ガイドRNAに曝露された選択マーカー（例えば、PM）耐性細胞の数と、スクランブル非特異的ガイドRNAに曝露された細胞の数とを比較することによって対処され得る。

本明細書において報告される方法の1つの態様において、DPH遺伝子特異的CRISPR/Cas9モジュールをコードするプラスミドを哺乳動物細胞内にトランスフェクトし、トランスフェクトされた細胞を、その後HRM-PCRならびにコロニーカウントアッセイ（毒素（DT）および選択マーカー（PM）耐性細胞を検出するための）に供した。該方法は、部位特異的組込み対非部位特異的組込みの頻度を判定するためのものである。

DPH遺伝子不活性化は、合致するガイドRNA配列への絶対的な依存性を示し、スクランブルガイドRNAは、いかなるDT耐性コロニーも生み出さなかった。これは、CRISPRR/Cas9/DPHガイド媒介性のPAC遺伝子組込みが、DPH遺伝子における選好性を有して生じるが、絶対的な特異性を有して生じるわけではないことを表す。

本明細書において報告される方法の1つの態様において、DPH遺伝子は、DPH1遺伝子、DPH2遺伝子、DPH4遺伝子、およびDPH5遺伝子からなる群より選択される。

DPH1遺伝子、DPH2遺伝子、DPH4遺伝子、およびDPH5遺伝子のいずれかの両アレルの不活性化は、絶対的な毒素耐性を付与する。

本明細書において報告される方法の1つの態様において、方法は、毒素耐性コロニーの数、抗生物質耐性コロニーの数、ならびに毒素および抗生物質耐性コロニーの数を決定する工程を含み、組込み事象（抗生物質耐性コロニーの数）と不活性化事象（毒素耐性コロニーの数）の比率は、手法の特異性である/特異性を反映する。

本明細書において報告される方法の1つの態様において、方法は、核酸のCRISPR/Cas9標的組込みのためのガイドRNAを選択するためのものであり、方法は、大量の異なるガイドRNAを提供する工程、および組込み事象（抗生物質耐性コロニーの数）と不活性化事象（毒素耐性コロニーの数）の最も高い比率を有するガイドRNAを選択する工程を含む。

毒素耐性コロニーの頻度は、標的遺伝子特異的なホモ接合型遺伝子不活性化を反映する。同時に、抗生物質耐性および毒素-抗生物質二重耐性コロニーの数を査定して、カセット組込みをモニターした。組込み事象（抗生物質耐性）と不活性化事象（毒素耐性）の比率を「特異性指標」として用いて、特異的組込みが、最少の遺伝子不活性化事象と同時に生じる条件を同定し得る。そのような条件は、多数の非生産的な標的遺伝子損傷を与えることなく標的組込みを所望した場合に好まれ得る。

低い値（例えば、毒素耐性コロニーに対する、少ない抗生物質耐性コロニー）は、同時に生じる不活性化事象に対する、非効率的な組込みを反映する。高い値（より多くの抗生物質耐性コロニーおよび/または相対的に減少した数の毒素耐性コロニー）は、CRISPR/Cas9により影響を受けた標的遺伝子における非特異的切断を反映する。

より短いガイドRNAは、組込み効率を向上させる（より高い総数の抗生物質耐性コロニー）だけでなく、生産的な遺伝子編集と非生産的な遺伝子編集の比率も向上させる（挿入なしの毒素耐性コロニーの低下）。

本明細書において報告される方法の1つの態様において、遺伝子編集手法は、CRISPR/Cas、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、およびTALENからなる群より選択される。

遺伝子編集モジュールおよびパラメーターは、DPH遺伝子改変によって最適化され得、その後、他の遺伝子の遺伝子編集効率または特異性を最適化するために変形され得る。

ゆえに、最も効率的な遺伝子不活性化を目指す場合には20merが選定であり得、過度の破壊的編集なしでの組込みを望む場合には16〜18merが好ましくあり得る。

組込み効率を増加させるために、以前に処理された細胞へのCRISPR/Casモジュールの再適用を目指す場合、遺伝子不活性化はガイドRNA標的配列を変更するため、最も適切なガイドRNAを判定する本明細書において報告される方法が用いられ得る。ゆえに、変更されていない遺伝子のみが元のCRISPR/Cas9構成要素によって改変され得るが、一方で改変された遺伝子（組込みなし）は、同じガイドRNAを用いた最初に適用されたアプローチの影響を受けにくい。

本明細書において報告される1つの局面は、CRISPR/Cas9または ZFNまたはTALENまたは他の遺伝子編集モジュール（の変異型または変種）を同定/選択するための方法であって、該方法は、
−1つまたは複数の遺伝子編集モジュールの大量の変種を提供する/調製する工程、
−本明細書において報告される方法を用いて、組込み事象（抗生物質耐性コロニーの数）および不活性化事象（毒素耐性コロニーの数）の効率および/または組込み事象（抗生物質耐性コロニーの数）と不活性化事象（毒素耐性コロニーの数）の最も高い比率を判定する工程、ならびに
−最も高い効率および/または最も高い比率を有する変種を同定する/選択する工程
を含む。

本明細書において報告される1つの局面は、遺伝子編集モジュール/手法の効率または特異性を改変する（増大または低下させる）化合物または化合物組み合わせを選択するための方法であって、該方法は、
−1種もしくは複数種の化合物または1組もしくは複数組の化合物組み合わせを提供する工程、
−該化合物または化合物組み合わせの非存在下で、本明細書において報告される方法を用いて、組込み事象（抗生物質耐性コロニーの数）および不活性化事象（毒素耐性コロニーの数）の効率および/または組込み事象（抗生物質耐性コロニーの数）と不活性化事象（毒素耐性コロニーの数）の比率を、任意で判定する工程、
−該化合物または化合物組み合わせの存在下で、本明細書において報告される方法を用いて、組込み事象（抗生物質耐性コロニーの数）および不活性化事象（毒素耐性コロニーの数）の効率および/または組込み事象（抗生物質耐性コロニーの数）と不活性化事象（毒素耐性コロニーの数）の比率を、該化合物または化合物組み合わせのそれぞれに対して別個に/個々に判定する工程、
−該化合物または化合物組み合わせの非存在下で実施された本明細書において報告される方法による効率および/または比率とは異なる効率および/または比率を有する少なくとも1種の化合物または少なくとも1組の化合物組み合わせを同定する/選択する工程
を含む。

本明細書において報告される1つの局面は、増殖阻害または毒性を最小限に抑えつつ遺伝子編集手法の効率または特異性を増大させる化合物濃度およびその添加の時点を決定するための方法であって、該方法は、
−1種もしくは複数種の化合物または1組もしくは複数組の化合物組み合わせを提供する工程、
−該化合物または化合物組み合わせの非存在下で、本明細書において報告される方法を用いて、組込み事象（抗生物質耐性コロニーの数）および不活性化事象（毒素耐性コロニーの数）の効率および/または組込み事象（抗生物質耐性コロニーの数）と不活性化事象（毒素耐性コロニーの数）の比率を、任意で判定する工程、
−異なる濃度および/または異なる添加の時点における該化合物または化合物組み合わせの存在下で、本明細書において報告される方法を用いて、組込み事象（抗生物質耐性コロニーの数）および不活性化事象（毒素耐性コロニーの数）の効率および/または組込み事象（抗生物質耐性コロニーの数）と不活性化事象（毒素耐性コロニーの数）の比率を、該化合物または化合物組み合わせのそれぞれに対して別個に/個々に判定する工程、
−該化合物または化合物組み合わせの非存在下で実施された本明細書において報告される方法によるものよりも高い効率および/または高い比率を有する濃度および/または添加の時点を、少なくとも1種の化合物または少なくとも1組の化合物組み合わせのそれぞれに対して同定する/選択する工程
を含む。

前に報告される方法の1つの態様は、最も高い効率および/または最も高い比率を有する化合物を同定する/選択する工程である。
[本発明1001]
哺乳動物細胞のゲノム内への核酸の導入を判定するための方法であって、該哺乳動物細胞は、DPH1、DPH2、DPH4、および/またはDPH5遺伝子の1つまたは2つの転写的に活性なアレルを含み、該方法は、
−導入すべき核酸とDPH遺伝子の遺伝子編集に必要なエレメントとを含む1種または複数種のプラスミドを、哺乳動物細胞にトランスフェクトする工程、
−トランスフェクトされた細胞をDPH遺伝子転写感受性毒素の存在下で培養する工程、
−トランスフェクトされた細胞が該毒素の存在下で生存可能である場合、哺乳動物細胞のゲノム内への核酸の導入を判定する工程
を含む、前記方法。
[本発明1002]
DPH遺伝子転写感受性毒素が、シュードモナス（pseudomonas）外毒素およびジフテリア毒素からなる群より選択される、本発明1001の方法。
[本発明1003]
−導入すべき核酸と、選択マーカーに対する耐性を付与する核酸と、DPH遺伝子の遺伝子編集に必要なエレメントとを含む1種または複数種のプラスミドを、哺乳動物細胞にトランスフェクトする工程、
−トランスフェクトされた細胞を選択圧の非存在下で培養する工程、
−培養物を少なくとも2つのアリコートに分ける、または培養物から少なくとも2つのサンプルを採取する工程、および
−第一のアリコートまたはサンプルを、DPH遺伝子転写感受性毒素の存在下で培養し、かつ第二のアリコートまたはサンプルを、対応する選択マーカーの存在下で培養する工程
を含む、本発明1001〜1002のいずれかの方法。
[本発明1004]
哺乳動物細胞が大量の哺乳動物細胞であり、かつ前記方法が、前記毒素および/または前記選択マーカーの存在下で細胞を培養する工程の直前に、
−トランスフェクトされた大量の細胞からの細胞を、単一細胞として付着させる工程
を含む、本発明1001〜1003のいずれかの方法。
[本発明1005]
大量の哺乳動物細胞が、1000〜10,000,000個の細胞である、本発明1004の方法。
[本発明1006]
遺伝子編集の効率を判定するための、または遺伝子編集の特異性を判定するための、または遺伝子編集の効率および特異性を判定するための、本発明1001〜1005のいずれかの方法。
[本発明1007]
ホモ接合型およびヘテロ接合型の遺伝子改変を判定するための、または部位特異的および非特異的な遺伝子破壊および組込みを判定するための、本発明1001〜1006のいずれかの方法。
[本発明1008]
トランスフェクトされた細胞が前記毒素の存在下で生存可能である場合、核酸の導入は、哺乳動物細胞のゲノム内へのホモ接合型核酸導入である、本発明1001〜1007のいずれかの方法。
[本発明1009]
トランスフェクトされた細胞が前記毒素の存在下で生存不可能であるが前記選択マーカーの存在下で生存可能である場合、核酸の導入は、哺乳動物細胞のゲノム内へのヘテロ接合型核酸導入である、本発明1001〜1008のいずれかの方法。
[本発明1010]
DPH遺伝子不活性化および核酸組込み事象が、毒素および選択マーカーによる選択と、任意で高解像度融解（HRM）PCRとの組み合わせによって定量化される、本発明1001〜1009のいずれかの方法。
[本発明1011]
前記方法が、異なる遺伝子編集手法を評価するためのものであり、かつ
−導入すべき核酸と、選択マーカーに対する耐性を付与する核酸と、DPH遺伝子を編集するための第一の遺伝子手法に必要なエレメントとを含む1種または複数種のプラスミドを、哺乳動物細胞にトランスフェクトする工程、
−トランスフェクトされた細胞を選択圧の非存在下で培養する工程、
−培養物を少なくとも2つのアリコートに分ける、または培養物から少なくとも2つのサンプルを採取する工程、
−第一のアリコートまたはサンプルを、DPH遺伝子転写感受性毒素の存在下で培養し、かつ第二のアリコートまたはサンプルを、対応する選択マーカーの存在下で培養する工程、
−試験すべきすべての遺伝子編集手法に対してこれらの工程を繰り返す工程、および
−毒素耐性、選択マーカー耐性、または二重耐性の頻度に基づき、異なる遺伝子編集手法をランク付けする工程
を含む、本発明1001〜1010のいずれかの方法。
[本発明1012]
標的遺伝子の全アレルの不活性化の頻度が、毒素耐性コロニーをカウントすることによって検出される、本発明1001〜1011のいずれかの方法。
[本発明1013]
標的遺伝子の一方のアレルの不活性化が、HRM-PCRによって二相融解曲線の存在により検出される、本発明1001〜1012のいずれかの方法。
[本発明1014]
HRM-PCRが、培養細胞に対して直接実施される、本発明1013の方法。
[本発明1015]
CRISPR/Cas9による標的遺伝子の全アレルの不活性化の頻度が、HRM-PCRによって決定される二相融解曲線と組み合わせて、毒素耐性コロニーをカウントすることによって検出される、本発明1001〜1014のいずれかの方法。
[本発明1016]
DPH遺伝子が、DPH1遺伝子、DPH2遺伝子、DPH4遺伝子、およびDPH5遺伝子からなる群より選択される、本発明1001〜1015のいずれかの方法。
[本発明1017]
前記方法が、毒素耐性コロニーの数、抗生物質耐性コロニーの数、ならびに毒素および抗生物質耐性コロニーの数を決定する工程を含み、ここで、組込み事象（抗生物質耐性コロニーの数）と不活性化事象（毒素耐性コロニーの数）の比率は、前記手法の特異性を反映する、本発明1001〜1016のいずれかの方法。
[本発明1018]
前記方法が、核酸のCRISPR/Cas9標的組込みのためのガイドRNAを選択するためのものであり、大量の異なるガイドRNAを提供する工程、および組込み事象（抗生物質耐性コロニーの数）と不活性化事象（毒素耐性コロニーの数）の最も高い比率を有するガイドRNAを選択する工程を含む、本発明1001〜1017のいずれかの方法。
[本発明1019]
遺伝子編集手法が、CRISPR/Cas、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、およびTALENからなる群より選択される、本発明1001〜1018のいずれかの方法。
[本発明1020]
CRISPR/Cas9または ZFNまたはTALENまたは他の遺伝子編集モジュール（の変異型または変種）を同定/選択するための方法であって、
−1つまたは複数の遺伝子編集モジュールの大量の変種を提供する/調製する工程、
−本発明1001〜1019のいずれかの方法を用いて、組込み事象（抗生物質耐性コロニーの数）および不活性化事象（毒素耐性コロニーの数）の効率および/または組込み事象（抗生物質耐性コロニーの数）と不活性化事象（毒素耐性コロニーの数）の最も高い比率を判定する工程、ならびに
−最も高い効率および/または最も高い比率を有する変種を同定する/選択する工程
を含む、前記方法。
[本発明1021]
遺伝子編集モジュール/手法の効率または特異性を改変する（増大または低下させる）化合物または化合物組み合わせを選択するための方法であって、
−1種もしくは複数種の化合物または1組もしくは複数組の化合物組み合わせを提供する工程、
−該化合物または化合物組み合わせの非存在下で、本発明1001〜1019のいずれかの方法を用いて、組込み事象（抗生物質耐性コロニーの数）および不活性化事象（毒素耐性コロニーの数）の効率および/または組込み事象（抗生物質耐性コロニーの数）と不活性化事象（毒素耐性コロニーの数）の比率を、任意で判定する工程、
−該化合物または化合物組み合わせの存在下で、本発明1001〜1019のいずれかの方法を用いて、組込み事象（抗生物質耐性コロニーの数）および不活性化事象（毒素耐性コロニーの数）の効率および/または組込み事象（抗生物質耐性コロニーの数）と不活性化事象（毒素耐性コロニーの数）の比率を、該化合物または化合物組み合わせのそれぞれに対して別個に/個々に判定する工程、
−該化合物または化合物組み合わせの非存在下で実施された本明細書において報告される方法による効率および/または比率とは異なる効率および/または比率を有する少なくとも1種の化合物または少なくとも1組の化合物組み合わせを同定する/選択する工程
を含む、前記方法。
[本発明1022]
増殖阻害または毒性を最小限に抑えつつ遺伝子編集手法の効率または特異性を増大させる化合物濃度およびその添加の時点を決定するための方法であって、
−1種もしくは複数種の化合物または1組もしくは複数組の化合物組み合わせを提供する工程、
−該化合物または化合物組み合わせの非存在下で、本発明1001〜1019のいずれかの方法を用いて、組込み事象（抗生物質耐性コロニーの数）および不活性化事象（毒素耐性コロニーの数）の効率および/または組込み事象（抗生物質耐性コロニーの数）と不活性化事象（毒素耐性コロニーの数）の比率を、任意で判定する工程、
−異なる濃度および/または異なる添加の時点における該化合物または化合物組み合わせの存在下で、本発明1001〜1019のいずれかの方法を用いて、組込み事象（抗生物質耐性コロニーの数）および不活性化事象（毒素耐性コロニーの数）の効率および/または組込み事象（抗生物質耐性コロニーの数）と不活性化事象（毒素耐性コロニーの数）の比率を、該化合物または化合物組み合わせのそれぞれに対して別個に/個々に判定する工程、
−該化合物または化合物組み合わせの非存在下で実施された本明細書において報告される方法によるものよりも高い効率および/または高い比率を有する濃度および/または添加の時点を、少なくとも1種の化合物または少なくとも1組の化合物組み合わせのそれぞれに対して同定する/選択する工程
を含む、前記方法。
[本発明1023]
同定する/選択する工程が、最も高い効率および/または最も高い比率を有する化合物についてである、本発明1021〜1022のいずれかの方法。

発明の詳細な説明
定義
本明細書においておよび添付の特許請求の範囲において使用するとき、「1つの（a）」、「1つの（an）」、および「その（the）」という単数形は、文脈で別様に明確に述べられていない限り、複数形の指示対象（reference）を含むことに留意すべきである。ゆえに、例えば、「1つの細胞（a cell）」への言及は、複数のそのような細胞および当業者に公知のその同等物などを含む。同様に、「1つの（a）」（または「1つの（an）」）、「1つまたは複数の」、および「少なくとも1つの」という用語は、本明細書において互換可能に用いられ得る。

「含む（comprising）」、「含む（including）」、および「有する（having）」という用語は、互換可能に用いられ得、「からなる（consisting）」という用語を含むことにも留意すべきである。

当業者にとって、例えばポリペプチドのアミノ酸配列を、このアミノ酸配列をコードする対応する核酸配列に変換するための手順および方法は周知である。したがって、核酸は、個々のヌクレオチドからなるその核酸配列によって、および同じように、それによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列によって特徴付けされる。

「約」という用語は、その後に続く数値の±20％の範囲を意味する。1つの態様において、約という用語は、その後に続く数値の±10％の範囲を意味する。1つの態様において、約という用語は、その後に続く数値の±5％の範囲を意味する。

シュードモナス外毒素A（PE）、ジフテリア毒素（DT）、コリックス毒素（CT）、および関連毒素は、真核生物翻訳伸長因子A（eEF2）のジフタミド残基をADPリボシル化する細菌タンパク質である。NADを補基質として用いて、ADPは、eEF2のジフタミドに移される。これにより、eEF2の機能性が不活性化される。ADPリボシル化されたeEF2を有する細胞は、それらのタンパク質合成を失速させ、それによって死滅する。PE、DT、CT、および関連毒素は、eEF2をADPリボシル化するためにeEF2上のジフタミドの存在を要する。ジフタミドを有しないeEF2は、これらの毒素によってADPリボシル化され得ない。

「細胞」、「細胞株」、および「細胞クローン」という用語は互換可能に用いられ、そのような細胞の子孫を含めて、外因性核酸が導入されている細胞を指す。「細胞」には、初代形質転換細胞および継代の数に関係なくそれに由来する子孫を含む、「形質転換体」および「形質転換細胞」が含まれる。子孫は、核酸内容が親細胞と完全には同一でない可能性があり、変異を含有し得る。元の形質転換細胞においてスクリーニングされるまたは選択される同じ機能または生物学的活性を有する変異体子孫は、この中に含まれる。

「単離された」核酸とは、その天然環境の構成要素から分離されている核酸分子を指す。単離された核酸には、該核酸分子を通常含有する細胞に含有される核酸分子が含まれるが、該核酸分子は、染色体外に、またはその天然染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。

「プラスミド」とは、宿主細胞における含まれた構造遺伝子の発現のためのすべての必要なエレメントを提供する核酸である。典型的に、発現プラスミドは、複製の起点および選択マーカーを含む、例えば大腸菌（E. coli）に対する原核生物プラスミド増幅単位、真核生物選択マーカー、ならびにそれぞれがプロモーター、構造遺伝子、およびポリアデニル化シグナルを含む転写ターミネーターを含む関心対象の構造遺伝子の発現のための1種または複数種の発現カセットを含む。遺伝子発現は、通常プロモーターの制御下に置かれ、そのような構造遺伝子は、プロモーターに「機能的に連結されている」と言われる。同様に、調節エレメントがコアプロモーターの活性を調節する場合、調節エレメントおよびコアプロモーターは機能的に連結している。「プラスミド」という用語には、例えばシャトルプラスミドおよび発現プラスミド、ならびにトランスフェクションプラスミドが含まれる。

「選択マーカー」とは、選択マーカーを所持する細胞が、対応する選択剤の存在下で、それに従ってまたはそれに逆らって特異的に選択されるのを可能にする核酸である。典型的に、選択マーカーは、薬物に対する耐性を付与する、または宿主細胞における代謝もしくは異化欠陥を補う。選択マーカーは、陽性、陰性、または二機能性であり得る。有用な陽性選択マーカーは、抗生物質耐性遺伝子である。この選択マーカーは、それを形質転換された宿主細胞が、対応する選択剤、例えば抗生物質の存在下で、陽性に選択されるのを可能にする。非形質転換宿主細胞は、選択条件下で、すなわち選択剤の存在下で、培養下にて増殖し得ないまたは生存し得ない。陽性選択マーカーは、該マーカーを所持する細胞の選択を可能にし、一方で陰性選択マーカーは、該マーカーを所持する細胞が選択的に除外されるのを可能にする。真核細胞とともに用いられる選択マーカーには、例えばハイグロマイシン（hyg）、ネオマイシン（neo）、およびG418選択マーカーなど、例えばアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（APH）に対する遺伝子、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）、チミジンキナーゼ（tk）、グルタミンシンテターゼ（GS）、アスパラギンシンテターゼ、トリプトファンシンテターゼ（インドール選択剤）、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（ヒスチジノールD選択剤）に対する遺伝子、ならびにピューロマイシン、ブレオマイシン、フレオマイシン、クロラムフェニコール、ゼオシン、およびミコフェノール酸に対する耐性を付与する核酸が含まれる。さらなるマーカー遺伝子は、例えばWO 92/08796およびWO 94/28143に記載されている。

詳細な説明
遺伝子編集を最適化するための必要条件は、ヘテロ接合型の遺伝子不活性化事象およびホモ接合型の遺伝子不活性化事象、ならびに非特異的組込み事象および標的組込み事象についての確実でかつ堅牢な検出および区別である。表現型の挿入（例えば、薬物耐性）もしくは欠如（遺伝子不活性化）によって引き起こされる表現型の判定、またはシーケンシングアプローチなどの既存の方法は、ホモ接合型の不活性化とヘテロ接合型の不活性化を区別しないことが多い。さらに、既存の技術は、個々の細胞の遺伝子組成に対処することは滅多にない、または堅牢な統計解析を可能にする多数の個々の遺伝子編集された細胞に基づくわけではない。

部位特異的ヌクレアーゼによって創出されるオフターゲット効果は、細胞に有害であり得、包括的に予測しかつモニターすることが困難であり得る。しかしながら、複雑なゲノムは、意図されるDNA標的と同一であるまたは高度に相同である配列の多数のコピーをしばしば含有しており、オフターゲット活性および細胞毒性につながる（Gaj, T., et al., Trends Biotechnol. 31 (2013) 397-405）。

遺伝子編集事象を特徴付けする簡便でかつ堅牢なアプローチが本明細書において報告される。DPH遺伝子不活性化、毒素処理、および（抗生物質）選択マーカーによる選択の組み合わせは、非常に多数の個々の細胞に対する遺伝子編集効力の判定を可能にする。方法を用いて、ホモ接合型の遺伝子不活性化とヘテロ接合型の遺伝子不活性化、ならびに部位特異的組込みと非部位特異的組込みを区別することが可能である。本明細書において報告される方法の簡便性および堅牢性は、なかでも、遺伝子編集の手順およびモジュールの最適化において、ならびに遺伝子編集調節因子の同定および比較において用いられ得る。

例えばCRISPR/Cas9媒介性またはジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）媒介性のホモ接合型およびヘテロ接合型の遺伝子不活性化ならびにカセット組込み事象の効力および特異性は、毒素（例えば、ジフテリア毒素（DT））および（抗生物質）選択マーカー（例えば、ピューロマイシン（PM））による選択ならびに高解像度融解（HRM）PCRの組み合わせによって、本明細書において報告される方法を用いて定量化された。

全体的な遺伝子不活性化頻度は、HRM-PCRによって検出され得、ホモ接合型DPH1またはDPH2遺伝子不活性化は、毒素耐性（例えば、ジフテリア毒素耐性（DTr））を引き起こし、それゆえホモ接合型DPH改変とヘテロ接合型DPH改変は、毒素感受性によって区別され得る。選択マーカー耐性（例えば、ピューロマイシン耐性（PMr））は、発現カセット組込みによって引き起こされる。

標的遺伝子特異的なコロニーカウントは、1回の実験あたり10⁴〜10⁵個の個々の細胞におけるホモまたはヘテロ接合型不活性化事象と組込み事象を区別し得、1回の実験において、不活性化された遺伝子を持つ何百個もの個々のクローンが査定される。

ホモ接合型不活性化（DTr）は、標的カセット組込み（DTrおよびPMr）または非標的組込み（スクランブルRNA（scRNA）を用いたPMr）よりも、約30〜50倍高い頻度で生じることが見い出された。

組込みなしのヘテロ接合型遺伝子不活性化は、組込みよりも100倍を上回ってより高頻度に生じることが見い出された。

組込みを上回る遺伝子不活性化への選好性は、標的配列、遺伝子、または染色体位置とは無関係である。

コロニーカウントは、ガイドRNA（gRNA）長、遺伝子編集のための酵素の選定、または非相同末端結合（NHEJ）もしくは相同組み換え（HR）の調節因子を含めた変動要素に対処し得ることが見い出された。

本明細書において報告される方法を用いて、20merのgRNAが不活性化に最も有効であり、一方で16〜18merのgRNAが最も高い組込み効力を提供することが見い出された。

本明細書において報告される方法を用いて、非改変型CRISPR/Cas9は、遺伝子不活性化ならびに組込みに関して、ZFN編集の2倍効率的であり、操作された高忠実度CRISPR/Cas9よりも5倍効率的であることが見い出された。不活性化事象と、非標的組込み事象と、標的組込み事象の比率は、種々の酵素に対して同程度であることが見い出された。

本明細書において報告される方法は、編集の効率および特異性に対するNHEJまたはHR調節の効果に対処するのにも適切である。

ゆえに、上記のものを査定するための方法は有益である。

ジフタミド修飾
Stahl, S., et al.（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 112 (2015) 10732-10737）は、真核生物翻訳伸長因子2（eEF2）が高度に保存されたタンパク質であり、タンパク質生合成に不可欠であることを報告した。ヒトeEF2のHis715における（または、他の種における対応する箇所における）ジフタミド修飾は、すべての真核生物においておよび古細菌対応物において保存されている。それは、いくつかの遺伝子によってコードされるタンパク質によって生成される。ジフタミド生合成タンパク質1（DPH1）、DPH2、DPH3、およびDPH4（DNAJC24）によってコードされるタンパク質は、3-アミノ-3-カルボキシプロピル（ACP）基をeEF2に付着させる。この中間体は、メチル-トランスフェラーゼDPH5によってジフチンに変換され、それはその後、DPH6およびDPH7によってジフタミドにアミド化される。

ジフタミド修飾されたeEF2は、シュードモナス外毒素A（PE）およびジフテリア毒素（DT）を含めたADPリボシル化毒素の標的である。これらの細菌タンパク質は、細胞に入り、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD）を基質として用いてジフタミドのADPリボシル化を触媒する。これは、eEF2を不活性化し、タンパク質合成を止め、細胞を殺傷する。

Stahl et al.では、不活性化DPH遺伝子を有するMCF7細胞を作製するために、遺伝子特異的ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）が適用された。

したがって、ZFNをコードするプラスミドを、MCF7細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後、ZFN結合、二本鎖断裂、およびミス修復を可能にするために、表現型選択または遺伝子解析のいずれかによって、変異細胞が同定された。表現型選択に関しては、細胞を致死用量のPE（100nM）に曝露して、毒素の基質であるeEF2を有するすべての細胞を殺傷した。さらなる48時間の後、死細胞を除去し、培養物を毒素含有培地中で増殖させた。この手順は、DPH1、DPH2、DPH4、およびDPH5に対するZFNがトランスフェクトされた細胞のコロニーを生み出した。モックがトランスフェクトされた細胞における毒素選択下で、またはDPH3、DPH6、およびDPH7を標的にするZFNを用いて、コロニーは得られなかった。

毒素選択なしでMCF7変異体を同定するために、各トランスフェクションからの単一細胞が、高解像度融解（HRM）解析遺伝子に供された。この技法は、解析対象の遺伝子の2種の異なるアレルを含有する細胞を同定する。というのもそれらは二相のまたは変わった形状の融解曲線を生み出すためである。二相HRMプロファイルを有する候補クローンの解析により、異なるDPHアレル配列の存在が裏付けられた。このアプローチは、全DPH遺伝子に対する、不活性化された一方の遺伝子コピーおよびもう一方の機能的な野生型コピーを有するクローンを与えた。

野生型細胞では、ジフタミド修飾されたeEF2のみが、非修飾eEF2またはジフチンまたはACP修飾の証拠なしに検出可能である。DPH1、DPH2、DPH4、ならびにDPH5遺伝子の完全な不活性化を有する細胞は、ジフタミド修飾されたeEF2を含有しなかった。ゆえに、これらの遺伝子はジフタミド合成に不可欠であり、他の遺伝子はそれらの不活性化を補い得ない。DPH1、DPH2、またはDPH4の完全な不活性化は、非修飾eEF2のみが検出可能であり他の修飾形態は検出不能である細胞を生み出した。DPH5の完全な不活性化は、ACP中間体を生み出した（この中間体を有するeEF2は、先行するウェスタンブロットにおいて適用された抗体によって認識されない）。DPH1〜DPH7の、一方の不活性化されたコピーおよび一方の機能的コピーを有する細胞における主なeEF2種は、ジフタミド修飾されたeEF2である。

親MCF7のeEF2、および7種すべてのヘテロ接合体不活性化MCF7誘導体（DPH1〜7）のeEF2は、PEによってADPリボシル化される。対照的に、完全に不活性化されたDPH1またはDPH2またはDPH4またはDPH5遺伝子を有する細胞由来のeEF2は、ADPリボシル化を受けない。ジフタミドを有するeEF2のみが、ADPリボシル化毒素の基質として働き、修飾を有しない（DPH1、DPH2、DPH4）または部分的な修飾を有する（DPH5におけるACP）eEF2はそうでない。

通常の増殖条件下で、すべてのヘテロ接合型クローンの増殖に対するDPH不活性化の影響は観察されなかった。加えて、DPH1、DPH2、またはDPH4の完全な不活性化は、細胞の増殖または生存率の有意な低下を引き起こさなかった。DPH1、DPH2、およびDPH4の完全な不活性化を有する細胞は、非修飾eEF2のみを持つ。ゆえに、非修飾eEF2単独での独占的な存在は、MCF7の増殖を阻害しない。増殖率の低下は、完全に不活性化されたDPH5を有するすべてのクローンに対して観察された。

DPH1、DPH2、DPH4、またはDPH5の完全な不活性化を有する細胞は、TNF感受性の増加を示す。NF-κBおよびデスレセプターシグナル伝達経路（発生に関与しかつ必要であることが知られる）は、ジフタミド欠損細胞においてあらかじめ活性化されている。それにもかかわらずこれらの細胞は生存可能である、というのも経路誘導は、付加的な刺激なしではアポトーシスを誘導するのに十分な閾値を通過しないためである。あらかじめの感受性化は、これらのあらかじめ誘導された経路の引き金を引くと表現型の上で関連するようになる：（標的遺伝子ノックアウトとは無関係の）全ジフタミド合成欠損細胞は、TNF誘導性アポトーシスに高感受性であった。この知見は、ジフタミドの有無が、NF-κBまたはデスレセプター経路に影響を及ぼすことを表す。

DPH遺伝子は、NM_001383.3（DPH1）、NC_000001.11（DPH2）、NC_000003.12（DPH3）、NM_181706.4（DPH4）、BC053857.1（DPH5）、NM_080650.3（DPH6）、およびNC_000009.12（DPH7）で寄託されるヌクレオチド配列を有する。変異クローンは、致死用量のシュードモナス外毒素Aへの曝露後に生存クローンを単離することによって、またはPCRに基づくHRM解析によって得られた。

ゆえに、本明細書において報告される方法の1つの態様において、毒素選択に関しては、細胞を、トランスフェクションの48時間後に100nM PEで処理し、さらに増殖させて毒素耐性コロニーを生み出し、これらのコロニーを単離し、単一細胞から再クローン化した；および遺伝子スクリーニングに関しては、遺伝子特異的PCRフラグメントを生成し、HRM（二相融解曲線によって、変異含有クローンを印付けする）に供した。

1つの態様において、平底96ウェルプレートに10,000個の細胞を播種し、かつ加湿された5％CO₂中37℃でインキュベートし、播種の24時間後に細胞を毒素に曝露し、細胞増殖を判定し、ならびに細胞増殖アッセイ（例えば、メーカーの指示に従った、CellTiterGlo 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay、Promega、増殖（DNA複製）は、毒素曝露の72時間後に、BrdU取り込みアッセイ（Roche Diagnostics, Mannheim FRG）によって対処される）を実施することによって、親MCF-7および変異MCF-7の増殖を査定する。

定義（Gaj, T., et al., Trends Biotechnol. 31 (2013) 397-405から採用）：
CRISPR/Cas（CRISPR関連）システム：クラスター化した規則的にスペーサーが入った短い回文型リピート（clustered regulatory interspaced short palindromic repeat）は、複数の短いダイレクトリピートを含有し、細菌および古細菌に獲得免疫を提供する遺伝子座である。CRISPRシステムは、侵入する外来DNAの配列特異的サイレンシングをcrRNAおよびtracrRNAに頼る。3つのタイプのCRISPR/Casシステムが存在し：II型システムにおいて、Cas9は、crRNA-tracrRNA標的認識があるとDNAを切断するRNAガイドDNAエンドヌクレアーゼとして働く。

crRNA：CRISPR RNAはtracrRNAと塩基対合して2-RNA構造を形成し、それがCas9エンドヌクレアーゼを切断のための相補的DNA部位にガイドする。

PAM：プロトスペーサー隣接モチーフは、crRNA上に存在する短いヌクレオチドモチーフであり、DNA切断のためにCas9によって特異的に認識されおよび必要とされる。

tracrRNA：トランス活性化キメラRNAは、crRNAプロセシングを促進し、Cas9によるRNAガイド切断を活性化するために必要なノンコーディングRNAである。

DSB：ZFN、TALEN、およびCRISPR/Cas9作用の産物である二本鎖断裂は、両DNA鎖が切断された場合に生じるDNA損傷の形態である。

HR：相同性修復（homology-directed repair）は、DSB修復のための鋳型依存性経路である。部位特異的ヌクレアーゼとともに相同性含有ドナー鋳型を供給することによって、HDRは、標的遺伝子座においてドナー分子を忠実に挿入する。このアプローチは、単一または複数の導入遺伝子の挿入、ならびに単一ヌクレオチド置換を可能にする。

NHEJ：非相同末端結合は、2つの断裂した末端を一緒にライゲートするまたは結び合わせるDSB修復経路である。NHEJは、修復に相同的鋳型を用いず、ゆえに典型的に、断裂の部位における小さな挿入および欠失の導入につながり、遺伝子機能をノックアウトするフレームシフトをしばしば誘導する。

TALEN：転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼは、FokI切断ドメインとTALEタンパク質に由来するDNA結合ドメインとの融合体である。TALEは、それぞれが単一塩基対を認識する複数の33〜35アミノ酸リピートドメインを含有する。ZFNと同様に、TALENは標的DSBを誘導し、それによりDNA損傷応答経路が活性化され、カスタム変更が可能となる。

ZFN：ジンクフィンガーヌクレアーゼは、FokI制限エンドヌクレアーゼ由来の非特異的DNA切断ドメインとジンクフィンガータンパク質との融合体である。ZFN二量体は標的DNA DSBを誘導し、それによりDNA損傷応答経路が刺激される。設計されたジンクフィンガードメインの結合特異性により、ZFNは特異的ゲノム部位に向かう。

ZFNickase：ジンクフィンガーニッカーゼは、2つのFokI切断ドメインの一方に不活性化変異を含有するZFNである。ZFNickaseは、一本鎖のみのDNA断裂を作り、変異原性NHEJ経路を活性化せずにHDRを誘導する。

遺伝子編集手法
多種多様の細胞タイプおよび生物における事実上任意の遺伝子の操作を可能にするアプローチが、過去数十年の間に進化している。「ゲノム編集」と一般に称されるこのコア技術は、非特異的DNA切断モジュールに融合した配列特異的DNA結合ドメインから構成される操作されたヌクレアーゼの使用に基づく。これらのキメラヌクレアーゼは、エラーを起こしやすい非相同末端結合（NHEJ）および相同性修復（HDR）を含めた細胞DNA修復メカニズムを刺激する標的DNA二本鎖断裂（DSB）を誘導することによって、効率的でかつ正確な遺伝子改変を可能にする。このアプローチの汎用性は、DNA結合ドメインのプログラム可能性によって促される。

これらの方法の汎用性は、事実上任意の配列を認識するようにDNA結合ドメインをカスタマイズし得る能力から生まれる。

ゆえに、遺伝子変更を実行し得る能力は、設計されたタンパク質のDNA結合特異性および親和性に大きく依存する（Gaj, T., et al., Trends Biotechnol. 31 (2013) 397-405）。

非特異的な非標的突然変異誘発、および標的遺伝子改変または遺伝子置き換え、という2つのタイプの遺伝子特異的操作が構想され得る。

不特定の突然変異誘発剤を1つの遺伝子に標的指向させる。標的突然変異誘発の結果は、限局的な配列変更である。

標的遺伝子置き換えは、元の遺伝子コピーと外因性の遺伝子コピーの間の相同組み換えによって、限局的な配列変化をもたらす。標的遺伝子置き換えにおいて、目標は、既存の配列を実験室で設計されたもので置き換えることである。後者は、より微細でもありより広域でもある変更の導入を可能にする。指向性の遺伝子変化を加えることは、しばしば「遺伝子標的指向化」と呼ばれる（Carroll, D., Genetics, 188 (20111) 773-782）。

ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）ならびにCRISPR/Casは、生物学的研究の境界を再定義しつつある強力なクラスのツールである。これらのキメラヌクレアーゼは、非特異的DNA切断ドメインに連結したプログラム可能な配列特異的DNA結合モジュールから構成される。ZFNおよびTALENは、特異的ゲノム位置において、エラーを起こしやすい非相同末端結合または相同性修復を刺激するDNA二本鎖断裂を誘導することによって、広範な遺伝子改変を可能にする。クラスター化した規則的にスペーサーが入った短い回文型リピート（CRISPR）/Casに基づくRNAガイドDNAエンドヌクレアーゼは、DNAの配列特異的改変をcrRNAおよびtracrRNAに頼る。3つのタイプのCRISPR/Casシステムが存在し、II型システムにおいて、Cas9は、crRNA-tracrRNA標的認識があるとDNAを切断するRNAガイドDNAエンドヌクレアーゼとして働く。

部位特異的ヌクレアーゼを、遺伝子座特異的相同アームを持するドナープラスミドとともに共送達することによって、単一または複数の導入遺伝子が、内因性遺伝子座に効率的に組込まれ得る。HRを促すことにおけるそれらの役割に加えて、部位特異的ヌクレアーゼは、ヌル表現型を有する細胞株および生物の迅速な作製も可能にする；ヌクレアーゼ誘導性DSBのNHEJ媒介性修復は、標的部位における小さな挿入または欠失の導入につながり、フレームシフト変異による遺伝子機能のノックアウトをもたらす。部位特異的ヌクレアーゼは、大きな染色体セグメントの欠失も誘導し得る。この方法は、大きな染色体逆位および転座を支持することが示されている。最後に、ドナーDNAのヌクレアーゼ媒介性切断を染色体標的と同調させることによって、大きな導入遺伝子（最高14kb）が、NHEJ媒介性ライゲーションを介して、様々な内因性遺伝子座に導入されている（Gaj, T., et al., Trends Biotechnol. 31 (2013) 397-405）。

ヌクレアーゼ誘導性DSBのNHEJ媒介性修復は、断裂の部位に起源がある可変長の挿入/欠失（インデル）変異の効率的な導入につながる。ゆえに、遺伝子コード配列内に導入されたDSBのNHEJ媒介性修復は、遺伝子機能のノックアウトにつながり得るフレームシフト変異をしばしば産出する。

二本鎖DNA「ドナー鋳型」が供給される場合、ヌクレアーゼ誘導性DSBのHRを用いて、断裂の部位にまたはその近くに最高7.6kbの正確なヌクレオチド置換または挿入を導入し得る。最近の研究により、オリゴヌクレオチドをZFNとともに用いて、正確な変更、小さな挿入、および大きな欠失を導入し得ることも示されている。ZFNは、NHEJまたはHR媒介性遺伝子変更を導入するために用いられている（Joung, J.K. and Sander, J.D., Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 14 (2013) 49-55）。

典型的に、ヌクレアーゼコード遺伝子は、プラスミドDNA、ウイルスベクター、またはインビトロ転写mRNAによって細胞内に送達される。エレクトロポレーションまたはカチオン性脂質に基づく試薬によるプラスミドDNAまたはmRNAのトランスフェクションは有害であり得、ある特定の細胞タイプに制限され得る。ウイルスベクターも、それらは複雑であり、産生するのが困難であり、潜在的に免疫原性であり、および付加的な調節的障壁を伴うため、限定を与える。インテグラーゼ欠損レンチウイルスベクター（IDLV）は、トランスフェクション耐性の細胞タイプ内にZFNを送達するための魅力的な代替手段である。AAVは、ZFN媒介性HRの効率を増大させるためにおよびインビボにおけるZFN媒介性遺伝子修正を推進するために用いられている、ZFN送達のための有望なベクターである。アデノウイルスベクターは、全長TALEN遺伝子を収容し得およびそれをヒト細胞内に送達し得るが、TALEN配列を持つレンチウイルスプラスミドベクターは、形質導入後に再編成しやすい傾向がある（Gaj, T., et al., Trends Biotechnol. 31 (2013) 397-405）。

ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）
FokIエンドヌクレアーゼの非特異的切断ドメイン（N）とジンクフィンガータンパク質（ZFP）とを結び付けたジンクフィンガーヌクレアーゼは、ゲノムに部位特異的二本鎖断裂（DSB）をもたらす一般的なやり方を与える。

ジンクフィンガー（ZF）モチーフのモジュール構造、およびZFドメインによるモジュール認識により、それらは、人工DNA結合タンパク質を設計するための汎用的DNA認識モチーフとなる。各ZFモチーフは、およそ30アミノ酸からなり、ββa構造に折り畳まれ、それは、保存されたCys2His2残基による亜鉛イオンのキレート化によって安定化される。ZFモチーフは、DNA二重らせんの主溝内にa-ヘリックスを挿入することによってDNAに結合する。各フィンガーは、DNA基質内のトリプレットに主として結合する。各ZFモチーフのa-ヘリックスの開始場所に対して−1、＋1、＋2、＋3、＋4、＋5、および＋6の箇所における主要なアミノ酸残基は、DNA部位との配列特異的相互作用のほとんどに寄与する。残りのアミノ酸をコンセンサス骨格として維持しながら、これらのアミノ酸を変化させて、種々のトリプレット配列特異性を有するZFモチーフを作製し得る。より長いDNA配列への結合は、これらのZFモチーフのいくつかを直列に連結させてZFPを形成することによって達成される。非特異的FokI切断ドメイン（N）、転写活性化因子ドメイン（A）、転写リプレッサードメイン（R）、およびメチラーゼ（M）のような他の機能性をZFPに融合させて、それぞれZFN、ジンクフィンガー転写活性化因子（ZFA）、ジンクフィンガー転写リプレッサー（ZFR）、およびジンクフィンガーメチラーゼ（ZFM）を形成し得るため、設計されたZFPは強力なプラットフォーム技術を提供する。

細菌性IIS型制限エンドヌクレアーゼであるFokI制限酵素は、二重鎖DNAにおける非回文型ペンタデオキシリボヌクレオチド5'-GGATG-3'：5'-CATCC-3'を認識し、認識部位の9/13nt下流で切断する。Durai et al.は、FokI認識ドメインを、より長いDNA配列を認識する他の天然に存在するDNA結合タンパク質、または他の設計されたDNA結合モチーフと取り換えて、キメラヌクレアーゼを創出することが可能であることを示唆した（Durai, S., et al., Nucl. Acids Res. 33 (2005) 5978-5990）。

FokIヌクレアーゼは二量体として機能し、したがって各標的部位に対して2つのジンクフィンガーアレイが設計されなければならない。初期のZFNは、同じ単量体ZFNの望ましくない二量体を形成し得る野生型ホモ二量体FokIドメインを用いた。必須のヘテロ二量体FokIドメインの使用は、望ましくないホモ二量体種の形成を低下させ、したがって特異性を向上させている（Joung, J.K. and Sander, J.D., Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 14 (2013) 49-55）。ゆえに、ZFN標的部位は、FokI切断ドメインによって認識される5〜7bpのスペーサー配列によって分離した2つのジンクフィンガー結合部位からなる（Gaj, T., et al., Trends Biotechnol. 31 (2013) 397-405）。

ワンハイブリッド遺伝子選択システムのためのプラスミド：レポーター遺伝子であるクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）またはGFPのいずれかは、pDBシリーズプラスミド上の弱いlac誘導体プロモーター（Pwk）から下流に位置する。ZFによる結合のための9bp標的部位は、転写の開始場所からの特異的距離に位置する。pAシリーズのプラスミドで、ZFに対する遺伝子を、アミノ酸リンカーをコードする配列を介して、RNAポリメラーゼのa-サブユニットのフラグメント（rpoA[1〜248]）に融合させる。レポータープラスミドにおける9bp部位へのrpoA[1〜248]-ZF融合体の結合は、他のRNAポリメラーゼサブユニットを導いて、レポーター遺伝子の転写を刺激する（Durai, S., et al., Nucl. Acids Res. 33 (2005) 5978-5990）。

転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）
FokIヌクレアーゼへの、植物病原性キサントモナス（Xanthomonas）種の転写活性化因子様（TAL）エフェクターの融合体であるTALENは、対になってDNAに結合しかつ切断する。結合特異性は、TALエフェクターにおける多形アミノ酸リピートのカスタマイズ可能なアレイによって決定される。

TALエフェクターは、核に入り、宿主遺伝子プロモーターにおけるエフェクター特異的配列に結合し、転写を活性化する。それらの標的特異性は、直列の33〜35アミノ酸リピート、それに続く20アミノ酸の単一の短縮リピートの中央部ドメインによって決定される。天然に存在する認識部位は、Tが一様に先行し、それがTALエフェクター活性に必要とされる（Cermak, T., et al., Nucl. Acids Res. 39 (2011) e82）。

TALE特異性は、反復可変二残基（RVD）として知られる2個の超可変アミノ酸によって決定される。ジンクフィンガーのように、モジュール式TALEリピートは一緒に連結して、連続したDNA配列を認識する（Gaj, T., et al., Trends Biotechnol. 31 (2013) 397-405）。

ゲノム編集のために、TALエフェクターをFokIヌクレアーゼの触媒ドメインに融合させて、インビボで標的DNA二本鎖断裂（DSB）を創出し得る。FokIは二量体として切断するため、これらのTALエフェクターヌクレアーゼ（TALEN）は対になって機能し、スペーサーを横断して反対側の標的に結合し、その上にFokIドメインが一緒になって断裂を創出する。DSBは、小さな挿入または欠失をしばしばもたらし遺伝子破壊に利用され得る非相同末端結合（NHEJ）、および遺伝子挿入または置き換えに用いられ得る相同組み換え（HR）という2つの高度に保存された過程の一方によって、ほぼすべての細胞において修復される。

TALENまたはTALエフェクター構築物の会合は、2つの工程：（i）1〜10リピートの中間アレイへのリピートモジュールの会合、および（ii）最終構築物を作るための、骨格内への中間アレイの接合、を伴う（Cermak, T., et al., Nucl. Acids Res. 39 (2011) e82）。

TALEN標的部位は、変動する長さ（12〜20bp）のスペーサー配列によって分離した2つのTALE結合部位からなる（Gaj, T., et al., Trends Biotechnol. 31 (2013) 397-405）。

典型的なヘテロ二量体標的部位（すなわち、天然のDNA配列に典型的に存在するであろうものなど）に対して、対になったTALEN構築物を標的細胞内に一緒に形質転換する。

関心対象のヒト遺伝子を標的にするTALENの対の一方を、適切な制限エンドヌクレアーゼを用いて哺乳動物発現ベクター内にサブクローニングする。これらの酵素は、TALENの対全体を切除し、コード配列をプロモーターの制御下に置く。結果として生じたプラスミドは、メーカーのプロトコールに従い、LipofectAmine 2000（Invitrogen）を用いたトランスフェクションによってHEK293T細胞内に導入された。細胞は、トランスフェクションの72時間後に回収された（Cermak, T., et al., Nucl. Acids Res. 39 (2011) e82）。

クラスター化した規則的にスペーサーが入った短い回文型リピート/CRISPR関連タンパク質9（CRISPR/Cas9）
天然に存在するCRISPR/Cas II型システムは、真核細胞のための強力な遺伝子編集ツールに発展している。特に、crRNAおよびtracrRNAを単一ガイドRNA（sgRNA）に統合し得るという実証は、この発展への道を開いた。Cas9は、遺伝子編集ツールの重要な特質である、DNAにおける単一二本鎖断裂をもたらす。方法は、真核細胞におけるDNA修復経路を活用して、遺伝子変更を加える2つのやり方を提供する。第一のものは非相同末端結合（NHEJ）に頼り、それは切られた末端を結び合わせるが、該過程において数個の塩基をしばしば欠失させ、それにより遺伝子産物の機能が損なれ得る、またはそれを不活性化するフレームシフトを引き起こす。第二のものでは、相同性修復（HDR）を用いて、標的との相同性を有するDNAの別の一片を用いて、損傷したアレルを修復する。組み換えにより挿入され得るDNAエレメントを提供することによって、配列における任意のタイプの挿入、欠失、または変化が達成され得る。主な限定は、標的に隣接したPAMの必要性である。Cas9が意図されない標的と相互作用する場合のオフターゲット効果は、予測および防止のためのストラテジーを要する懸案事項である（Rath, D., et al., Biochim. 117 (2015) 119-128）。

II型CRISPR/Casシステムにおいて、「スペーサー」と称される外来DNAの短いセグメントは、CRISPRゲノム遺伝子座内に組込まれ、転写され、短いCRISPR RNA（crRNA）にプロセシングされる。これらのcrRNAはトランス活性化crRNA（tracrRNA）にアニールし、Casタンパク質による病原性DNAの配列特異的な切断およびサイレンシングを指揮する。最近の研究により、Cas9タンパク質による標的認識は、crRNA内の「シード」配列、およびcrRNA結合領域の上流にある、保存されたジヌクレオチド含有プロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）配列を要することが示されている。CRISPR/Casシステムは、Cas9エンドヌクレアーゼおよび必要なcrRNA構成要素を発現するプラスミドの共送達によって、ヒト細胞へと直接移動可能であることが示されている（Gaj, T., et al., Trends Biotechnol. 31 (2013) 397-405）。

ホモおよびヘテロ接合体を判定するためのわずかなアンプリコンについての高解像度融解法
Liew, M., et al.（Clinical Chemistry 50 (2004) 1156-1164）は、ホモおよびヘテロ接合体を判定するためのわずかなアンプリコンについての高解像度融解法を報告した。ヘテロ二重鎖は融解曲線の形状を変更するため、ヘテロ接合体は容易に同定された。未知のサンプルに15％の公知のホモ接合遺伝子型を加えることにより、3つすべての遺伝子型の融解曲線分離が可能となる。

ヘテロ二重鎖検出色素LCGreen Iの存在下における短いPCR産物の融解解析を用いて、SNPを遺伝子型判定した。

ヘテロ接合体は、標準的技法を用いてさえ、第二の低温融解転移の存在によって同定され得るが、遺伝子型区別は、高解像度法を用いるとはるかに容易である。

PCRを、臨床実験室において一般に用いられる試薬を用いてLightCyclerで実施した。10μLの反応混合物は、10〜50ngのゲノムDNA、3mM MgCl₂、1×LightCycler FastStart DNA Master Hybridization Probesマスターミックス、1×LCGreen I、0.5μM順方向および逆方向プライマー、ならびに0.01U/μL大腸菌（Escherichia coli）ウラシルN-グリコシラーゼ（UNG；Roche）からなった。PCRを、UNGによるコンタミネーション制御のための50℃で10分間の保持、およびポリメラーゼの活性化のための95℃で10分間の保持で始動した。急速な熱サイクルを、20℃/sのプログラムされた転移速度で、85℃とアニーリング温度との間で実施した。

サイクルの直後に、融解解析をLightCyclerで実施した。まず、94℃に加熱し、40℃に冷却し、再度65℃に加熱し（すべて20℃/sで）、次いで蛍光の連続的捕捉とともに85℃まで0.05℃/sで融解することによって、20個のサンプルを一度に解析した。LightCyclerソフトウェアを用いて、微分融解曲線を算出した。

高解像度融解を用いる場合、増幅サンプルを、LightCyclerで94℃に加熱し、40℃に急冷した。次いで、LightCyclerキャピラリーをHR-1高解像度機器に移し、0.3℃/sで加熱した。サンプルを、1〜2分間のターンアラウンドタイムを有して65〜85℃で解析した。高解像度融解データを、HR-1ソフトウェアで解析した。ほとんどの場合において、蛍光対温度のプロットを正規化した。LightCyclerデータとの直接比較に関しては、微分プロットを正規化なしで用いた。データをエクスポートした後、すべての曲線をMicrosoft Excelを用いてプロットした。

本明細書において報告される方法
遺伝子編集技術は、細胞（細胞株）または生物という遺伝子改変ツールの作製に必要とされる。ルーチン的適用に適切であるために、該技術は、高い特異性および高い効率、しかし同時に低レベルの非標的遺伝子改変、すなわち副反応を有する必要がある。

遺伝子編集の特異性、遺伝子編集の効率、および/または遺伝子編集手法/遺伝子編集モジュールの非標的遺伝子編集のレベルを判定し、それによってそれらを比較する/ランク付けするためのハイスループット法が本明細書において報告される。

例えばCRISPR/Casなどの遺伝子編集手法/遺伝子編集モジュール媒介性遺伝子変更の定量化のための堅牢なハイスループット法が本明細書において報告される。該方法は、遺伝子編集手法/遺伝子編集モジュールの効率、部位特異的および非（部位）特異的な遺伝子破壊および配列組込み事象の区別（例えば、CRISPR/Cas媒介性の遺伝子不活性化および組込み事象の定量化）に適切である。

本明細書において報告される方法の1つの態様において、遺伝子編集手法/モジュール/技術は、CRISPR/Cas、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、およびtalonヌクレアーゼからなる群より選択される。

本明細書において報告される方法の1つの態様において、毒素は、ジフテリアA鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、外毒素A鎖（シュードモナス・エルギノーサ（aeruginosa）由来）、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデシンA鎖、α-サルシン、シナアブラギリ（Aleurites fordii）タンパク質、ジアンチン（dianthin）タンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Phytolaca americana）タンパク質（PAPI、PAPII、およびPAP-S）、ツルレイシ（momordica charantia）阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ（sapaonaria officinalis）阻害剤、ゲロニン、ミトギリン（mitogellin）、レストリクトシン、フェノマイシン（phenomycin）、エノマイシン（enomycin）、およびトリコテセン（tricothecenes）を含むがそれらに限定されない、酵素的に活性な毒素またはそのフラグメントである。

例示的な態様
本明細書において報告される方法を、例示的な配列および標的を用いて以下に例示する。これは、本発明の限定として扱われるものではない。それは、大量の代替手段、すなわち具体的な態様の1つとして、および本明細書において報告される方法が機能することの証拠として単に提供されるにすぎない。

本明細書において報告される方法の1つの態様において、本明細書において報告される遺伝子編集アプローチを定量化するおよび最適化する堅牢でかつ簡便な方法は、ジフテリア毒素および/またはピューロマイシン選択と組み合わせて、DPH遺伝子不活性化、好ましい態様ではDPH1またはDPH2遺伝子不活性化、の組み合わせを採用する。この方法を用いて、多数の個々の細胞に対する、すなわちハイスループットで、遺伝子編集効率を判定することだけでなく、ホモ接合型の遺伝子とヘテロ接合型の遺伝子を、ならびに部位特異的および非（部位）特異的な遺伝子破壊および組込み事象を区別することも可能である。

CRISPR/Cas媒介性のホモ接合型およびヘテロ接合型DPH遺伝子不活性化ならびにカセット組込み事象を、ジフテリア毒素（DT）およびピューロマイシン（PM）選択ならびに高解像度融解（HRM）PCRの組み合わせによって定量化した。DPH遺伝子不活性化は、高解像度融解HRM-PCRによって検出され得、ホモ接合型DPH遺伝子不活性化は毒素耐性を引き起こす。ゆえに、毒素感受性は、ホモ接合型の標的遺伝子改変とヘテロ接合型の標的遺伝子改変を区別する。PM耐性は、CRISPR/Casカセットの組込みを検出する。DT耐性、PM耐性、または二重耐性のクローン/コロニーの頻度を比較すると、ホモ接合型遺伝子不活性化（DT耐性）は、標的カセット組込み（DTならびにPM耐性）または非標的組込み事象（PM耐性）よりも、およそ30〜50倍高い頻度で生じることが観察された。カセット組込みなしのヘテロ接合型標的遺伝子不活性化（HRM-PCRによって検出可能）は、カセット組込みよりもさらに高い（＞100倍）頻度で生じた。カセット組込みを上回る遺伝子不活性化への選好性およびより高い出現率は、CRISPR/Cas9標的配列、染色体位置、または標的遺伝子とは無関係である。本明細書において報告される方法の堅牢な読み取り（DTまたはPM耐性コロニーの数）を適用して、遺伝子改変効率および改変のタイプに対する、ガイドRNAの配列長などのCRISPR/Cas9変動要素の影響を評価し得る。本明細書において提示される結果は、CRISPR/Cas9に由来する療法が、標的組込み事象を要する適用に対してよりも、遺伝子不活性化アプローチに対してより適切であり得ることも暗示している。

例示的な結果
ジフテリア毒素耐性アッセイおよびHRM-PCRは、ホモ接合型およびヘテロ接合型のDPH1遺伝子不活性化を定量化しかつ区別する
ジフテリア毒素（DT）は、ジフタミドをADPリボシル化し、それによって真核生物翻訳伸長因子2（eEF2）を不活性化する。これは、タンパク質合成を不可逆的に失速させ、細胞を殺傷する（Weidle et al.）。ジフタミドは、ジフタミド合成遺伝子によりコードされる酵素、それらの中でもDPH1による、eEF2上に置かれたヒスチジン修飾体である。MCF7細胞におけるDPH1の完全な不活性化は、毒素標的ジフタミドの合成を妨げる。これは、細胞をDTに対して耐性にする（Stahl et al.）。その結果、DPH1の全コピーの不活性化は、「DT耐性」（DTr）という表現型を生み出す。この表現型の頻度は、毒素耐性コロニーをカウントすることによって堅牢な様式で検出され得る（図3を参照されたい）。

残る1つの機能的DPH1アレルの存在で毒素感受性に十分であるため、DTr細胞は、全DPH1アレルの機能的ノックアウトを持つ。一方のアレルのみが改変されている細胞は、オンセルHRM-PCRアッセイによって同定され得る（図4）。標的部位の改変は、野生型フラグメントのものと比較してDPH1-PCRフラグメントの融解温度を変更し、二相HRMプロファイルを生み出す。CRISPR-Cas9媒介性遺伝子不活性化は独立した事象であり、それゆえ両アレルで同一であることは滅多にないため、完全な遺伝子不活性化を有するほとんどの細胞も、二相HRMプロファイルを示すと考えられる。これらは、それらの毒素耐性表現型によって、単一アレル変更と区別され得る。

ゆえに、1つの態様にあるように、（ハイスループット）HRM-PCRとDTrコロニーカウントアッセイとの組み合わせは、ヘテロ接合型およびホモ接合型の不活性化事象を定量化しかつ区別する。

選択マーカー耐性は、特異的および非特異的な組込み事象を検出しかつ区別する
本実施例において用いられるCRISPR/Cas9ドナープラスミドの組込みカセットによってコードされるピューロマイシン-N-アセチル-トランスフェラーゼ（PAC）は、ピューロマイシン（PM）を不活性化し、改変細胞をPM耐性にする（Vara et al.）。ゆえに、PAC組込みは、DTrコロニーに関して記載されるのと同じ様式で、PM耐性アッセイによって検出されおよび定量化される（選択剤としてDTの代わりにPMを適用する、図3B）。特異的でかつホモ接合型の標的遺伝子不活性化からのみ生じるDTrとは対照的に、PMrは、組込みの箇所とは無関係に生じる。部位特異的対非（部位）特異的な組込みの頻度は、1つの態様にあるように、二重耐性コロニー（DTr＋PMr）とPMrコロニーとを比較することによって対処される。

CRISPR/Cas9により与えられたDPH1不活性化および標的組込み事象の比較
標的特異的な不活性化、組込み、および非標的組込みの頻度を比較するために、DPH1特異的CRISPR/Cas9モジュールをコードするプラスミド（配列に関しては、図1を参照されたい）を、MCF7細胞内にトランスフェクトした。その後、これらをHRM-PCRに、ならびにDT耐性およびPM耐性を検出するコロニーカウントアッセイに供した。これらのアッセイの結果は図5に要約されており、個々のデータセットは以下の表に示されている。図5Aは、全DPH1アレルの機能喪失を表すDPH1遺伝子の完全な不活性化が、全てのトランスフェクト細胞の約6％の頻度で生じたことを示している（40％のトランスフェクション効率を考慮すると全細胞の2.5％、下記の最初の表を参照されたい）。DPH1不活性化は、合致するgRNA配列への絶対的な依存性を示し、スクランブル対照RNA（scRNA）は、いかなるDTrコロニーも生み出さなかった。HRMにより同定されたクローンの頻度とDTrコロニーの出現率との比較が、図5Bに示されている。これらの解析により、単一アレル遺伝子不活性化（HRMにより裏付けられる毒素感受性）は、両アレルの不活性化（DTr細胞）の2倍の頻度で生じることが明らかになった。

（表）トランスフェクトされた細胞のコロニーカウント数および表現型頻度

「TF eff.」：トランスフェクション効率は、GFPレポータープラスミドによるMCF7のトランスフェクションがあった場合の蛍光細胞の頻度をモニターするFACS解析によって判定された。全細胞中のGFP陽性細胞の相対数が％で列挙されている。^*これらのアッセイの1つは、異常に高いGFP陽性および異常なFACSパターンを呈した。全アッセイ間の平均トランスフェクション効率は30〜40％であった。「HRM」：高解像度融点PCR陽性細胞は、野生型細胞と比較して、明らかに分岐する（二相の）融解曲線パターンを呈するものとして定義される。「K.O.」は、機能的DPH1またはDPH2遺伝子コピーを所持せず、それゆえDTに対して耐性である細胞の頻度を表す。「Int.」は、PAC発現カセットを持ち、それゆえPMに対して耐性である細胞の頻度を表す。「A〜D」は、独立した実験の個々のサンプルを表す。

（表）標的遺伝子不活性化およびカセット組込みに対するgRNA長の影響

「TF eff.」：トランスフェクション効率は、GFPレポータープラスミドによるMCF7のトランスフェクションがあった場合の蛍光細胞の頻度をモニターするFACS解析によって判定された。全細胞中のGFP陽性細胞の相対数が％で列挙されている。機能的DPH1遺伝子コピーを所持しない細胞は、DTに対して耐性である。PAC発現カセットを持つ細胞は、それゆえPMに対して耐性である。「A〜D」は、独立した（四つ組の）実験の個々のサンプルを表す。

図6は、DTrおよびPMrコロニーの頻度の比較（2つの異なる実験、実験1：A〜C、実験2：D〜F）を示しており：両DPH1アレルの不活性化は、PM耐性を媒介するPAC発現カセットの組込みよりも30〜50倍高い効力で生じた（図6Cおよび6E、PAC組込みの箇所または接合状態は判定され得ない）。DPH1特異的gRNAと比較して、scRNAは、その他の点では同一の条件下で、2倍少ないPMrコロニーを生み出した。ゆえに、Cas9/DPH1-gRNA媒介性組込みは、DPH1遺伝子における選好性を有して生じるが、絶対的な特異性を有して生じるわけではない。ゆえに、そのような効果は、本明細書において報告される方法を用いて裏付けられ得る。DPH1遺伝子における選好的組込みに従って、DPH1ガイドRNAを用いて得られた多くのPMrコロニーはDT耐性であった（図6Aおよび6D）。scRNAを用いて得られたPMrコロニーのいずれも、DTに対して耐性でなかった。ゆえに、Cas9媒介性遺伝子不活性化（両アレル上を含む）は、非常に特異的に、かつ標的PAC組込みよりもはるかに高い頻度で生じる（図6Cおよび6E）。ゆえに、そのような効果は、本明細書において報告される方法を用いて裏付けられ得る。標的組込みは、より低い頻度で生じるだけでなく、gRNAによって規定される箇所に対してより特異性が低くもある。

遺伝子編集の定量化は、別の標的遺伝子DPH2を用いて同等の様式で働く
上記で概説される同一のアプローチを、異なる遺伝子DPH2遺伝子とも用いた。つまり、DPH2遺伝子のCas9誘導性改変を実施した。これを行って、本明細書において報告される方法の一般的適用性を示した。

DPH2は、異なる染色体上の異なる配列を有する異なる酵素をコードするが、また、ジフタミド合成に不可欠である。DPH2欠損は、DPH1欠損と同じ様式で、細胞をDTに対して耐性にする（Stahl et al.）。

DPH2編集、それに続くDT耐性およびPM耐性の査定の結果が図6Fに示されている：DPH1に関する本発明者らの観察結果と一致して、ホモ接合型DPH2不活性化事象は、同じ桁内の変化を有して、PAC発現カセットの組込みよりも高い頻度で観察された（PAC発現カセットの組込みよりも、DPH2の約90倍高い不活性化）。不活性化は、同族gRNAの存在にきっちりと依存しており、一方でカセット組込みは、部位選好性を有するが、標的遺伝子に対する絶対的な特異性を有するわけではなかった（scRNAを用いたDPH2ガイドの頻度と比較して）。

ゆえに、DPH1改変を特徴付けするために開発されたアッセイ原理を適用して、DPH2改変も解析し得る。

2種の異なる遺伝子DPH1およびDPH2の使用に関する結果は、このアッセイシステムが他の遺伝子に変形可能であるという証明を提供する。

Cas9遺伝子操作モジュールの比較および最適化−gRNA長
上記で示されるように、本明細書において報告される方法は、遺伝子改変モジュールの組成の一般的効果に対処し得る。

図8は、種々の長さのCas9 gRNAの遺伝子不活性化ならびに組込みの効力および特異性がどのように査定され得および比較され得るかを示している。適用された全ｇRNAは、DPH1内の同じ配列区域を標的にしたが、14〜26塩基で長さが変動した（図8D、gRNA詳細は図1に）。DTrコロニー数を記録して、標的遺伝子特異的なホモ接合型不活性化を反映させた。同時に、PMrおよびDTr-PMr二重耐性の数を査定して、カセット組込みをモニターした。

gRNA長は遺伝子不活性化の効力に影響することが、本明細書において報告される方法を用いて示され得る。

20merは、最大のDPH1不活性化効力を付与することが示された。相補的区域を18もしくは16塩基に短くする、またはそれを最高26塩基に伸ばすことによって、20merよりも減少した効力でではあるが、有意な特異的遺伝子不活性化の機能性が保たれることが本明細書において報告される方法を用いて判定された。

gRNAを16塩基未満（14mer）に低下させることにより、DPH1を不活性化する機能性は、検出レベルよりも下に減少した。組込み効力（PMr事象をカウントすることによって査定される）も、gRNA長によって影響された。16mer未満（14mer）のガイドRNAは、スクランブル対照バックグラウンドレベルを超えない、ほんのわずかなPMrコロニーを生み出した。16mer、18mer、20mer、22mer、24mer、および26merに対して標的組込みが観察され、16〜18merで挿入効力の最適に達した。

ゆえに、より大きなオリゴヌクレオチドで効力増大は達成されず、実際、より大きなサイズは、特異的挿入事象を有意に低下させることが本明細書において報告される方法を用いて示された。

組込み事象（PMr）と不活性化事象（DTr）の比率を「特異性指標」として算出して、報告される方法を用いて、特異的組込みが最少の遺伝子不活性化事象とともに生じる条件を同定し得る。

そのような条件は、過度の非生産的な標的遺伝子損傷を与えることなく標的組込みを所望する場合に好まれ得る。低い値（例えば、DTrコロニーに対して少ないPMr）は、同時に生じる不活性化事象に対する、非効率的な組込みを反映する。高い値（より多くのPMrおよび/または相対的に減少した数のDTrコロニー）は、Cas9標的遺伝子におけるより効率的な組込みを反映する。

図8Eは、gRNAの長さに依存した、算出された特異性因子を示している。16〜18merに対して、不活性化あたり最も高い挿入の値が見い出され、20塩基またはそれを上回る数を含有するガイドRNAに対して、明確な低下が見い出されることが、本明細書において報告される方法を用いて示された。これは、20merが、標的遺伝子不活性化に対してかなり効率的であることを示している（以前に公開された観察結果と一致している、例えばCho et al. 2013、Bauer et al.、Jinek et al. 2012および2013、Mali et al. 2013を参照されたい）。さらにより短いガイドRNAは、組込みに対してより効率的であるように見える。より短いガイドRNAは、組込み効力を向上させる（より高い総数のPMrコロニー）だけでなく、生産的な遺伝子編集と非生産的な遺伝子編集の比率も向上させる（より少ない、挿入なしのDTrコロニー）。

種々の遺伝子編集アプローチの効力および特異性−酵素
本明細書において報告される方法を用いて、RNAガイドCas9ならびにZFN媒介性遺伝子編集の種々の変種についての遺伝子不活性化および組込み事象、効力および特異性を比較した。

したがって、gRNAの長さおよび組成を一定にし（DPH1 20mer）、3種の異なる編集酵素を適用した。
（i）「SpCAS9」は、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）由来のCas9ヌクレアーゼを指定し、それは現在の標準的適用と見なされ得る（例えば、Ran et al. 2013、Fu et al. 2014を参照されたい）；
（ii）SpCas9-HF1は、非特異的DNA結合の低下、オフターゲット活性の低下を有し、それゆえ提案されるより高い忠実度および特異性を有する、SpCas9の操作された変種である（Kleinstiver et al.）；
（iii）設計されたジンクフィンガー媒介性タンパク質-核酸相互作用によって標的配列を認識する、ZFN媒介性編集モジュール（Miller et al. 2011、Urnov et al.）。

gRNA解析に関してと同じ様式で、DTrコロニーを記録して標的遺伝子不活性化を反映させ、PMrコロニーを記録してカセット組込みをモニターした（図8F；下記の表）。

（表）種々の遺伝子編集物質がトランスフェクトされたMCF-7細胞のコロニーカウント数および表現型頻度

MCF-7細胞に、種々のゲノム編集システム（SpCas9、SpCas9、ZFN）をコードするプラスミドをトランスフェクトした。SpCas9構築物は、前に記載されるとおりであった。SpCas9-HFは、Kleinstiver et al.（Kleinstiver et al. 2016）に従って、N497A/R661A/Q695A/Q926A置換を含む。並行して、gRNAを並行してscRNAによって置き換えて、非特異的活性に対処した。DPH1特異的ZFNを、Sigma Aldrichから得た（CompoZr（登録商標））。3^*106個の細胞の初回細胞プールのトランスフェクションに対するプラスミドDNA（編集物質およびドナー）の総量は、以前の実験に関して記載されるとおりであった。トランスフェクション効率（TF eff.（％））を定量化するために、GFPレポータープラスミドを別としてトランスフェクトした。GFP陽性細胞を、トランスフェクションの24時間後にFACSによってカウントした。規定数の細胞を播種し（播種細胞数）、その後DT、PM、またはDT＋PMで72時間処理した。

本明細書において報告される方法を用いて判定される遺伝子不活性化およびカセット組込みの全体的効率を比較すると、以下のことが見い出された。
遺伝子不活性化およびカセット組込みの最も高い値が、CRISPR/SpCas9に対して決定された。
CRISPR/SpCas9-HFは、標的遺伝子不活性化事象を、CRISPR/SpCas9と比較して、20％未満のDTrコロニーの数に減らした。PMr（組込み）およびDT-PM二重耐性コロニーの頻度（標的遺伝子不活性化を伴う組込み）も低下した。
ZFNモジュールは、その他の点では同一の条件下で、DTrコロニーの数を、CRISPR/SpCas9を用いて観察された事象の60％未満に低下させた。ゆえに、ZFN標的不活性化の効力は、SpCAS9と比較して約2倍低下し、操作されたSpCas9-HF1のものより約2〜3倍優れていた。PMrコロニー頻度は、CRISPR/SpCas9とZFNとの間で有意に異ならなかった。二重耐性コロニー（同時の遺伝子不活性化を伴うカセット組込み）は、CRISPR/SpCas9と比較して、ZFNを用いていくらか（30％）低下した。

DTr（標的遺伝子不活性化）コロニー対DT＋PM二重耐性（標的部位組込み）コロニーの比率の算出は、全体的効力を除外して考える。CRISPR/SpCas9、CRISPR/Cas9-HF、ならびにZFNは、1つのホモ接合型遺伝子不活性化事象あたり、同レベル（約4×10^-3）の標的組込み事象を生み出した。

ゆえに、本明細書において報告される方法を用いて、編集システムの全体的効力は変動するが、標的遺伝子不活性化のバックグラウンドを上回るカセット組込みの「特異性」は、すべてのアプローチに対して有意に異ならないように見えることが示され得た。

遺伝子編集の効力および特異性に対するDNA修復調節因子の影響
本明細書において報告される方法（DPH遺伝子編集があった場合のDTrおよびPMr細胞を判定するコロニーアッセイを含む）を用いて、DNA修復を調節する化合物の影響にも対処し得る。

相同組み換え（HR）の活性化因子および非相同末端結合（NHEJ）の阻害剤は、遺伝子編集事象を調節し、組込み効力を増加させることが記載されている（Song et al.、Ma et al.）。

編集の効力および特異性に対するDNA修復調節因子の効果を判定するための本明細書において報告される方法の有用性を実証するために、本明細書において報告される方法に従って実施されるCRISPR/SpCas9/DPH1gRNA（20mer）編集アッセイにそのような化合物を補充し、影響を定量化した。

DNAリガーゼIV阻害剤SCR7を、遺伝子編集モジュールのトランスフェクションの4時間前（「早期添加」）またはトランスフェクションの18時間後（「後期添加」）のいずれかに適用し、トランスフェクションの72時間後まで続けた。同じ様式で、RAD51調節因子RS-1（RAD51刺激化合物1）を添加して、HRを刺激した。両化合物を、MCF7細胞の増殖または生存率に影響を有しない用量で適用した：Scr7に関して1μM、およびRS-1に関して8μM、ならびに両方を組み合わせる場合には1μM＋8μM（SCR7＋RS1）。未処理対照（化合物なし）と比較して、RS-1の添加は、scRNAを用いて得られるコロニーの数に影響を及ぼすことなく、PMrコロニーの数を約2倍増加させると判定された（下記の表を参照されたい）。

（表）遺伝子編集の間に、SCR7および/またはRS-1に曝露されたMCF-7の表現型

SpCas9媒介性DPH1編集のためのプラスミドがトランスフェクトされた細胞を、規定数（播種細胞数）で播種した。DT/PM選択を、トランスフェクションの72時間後に開始した。値（w、x、y、z）は、四つ組の個々の実験において得られたコロニーを表す。化合物（RS-1、SCR7、およびRS-1＋SCR7）添加の時点の影響。処理サンプル対化合物なしについての、DT耐性コロニーに対するPM耐性の有意差は、^*p＜0.05、^**p＜0.01、^***p＜0.001で表されている。

全体的な組込み効力に対する効果を定量化するために、DTrコロニー（遺伝子不活性化）に対するPMrコロニー（遺伝子組込み）のパーセンテージを、本明細書において報告される方法を用いて決定した（図10も参照されたい）。

本明細書において報告される方法の結果に基づき、RS-1の添加は、早期の時点において有意により高い組込み効率につながるが、しかしながらそれは、後期添加（編集の始動の18時間後）があった場合の組込み効率には影響を及ぼさなかった。ゆえに、RS1媒介性HR刺激に対して適当な（早期の）時点を選定することが、生産的な編集に重要である。これは、HRが標的カセット組込みのための推進剤であることを裏付ける。

本明細書において報告される方法の結果に基づき、同程度まで、SCR7の早期適用は、組込みの相対数を有意に増加させることも見い出された（図10および上記の表）。これは、SCR7投与があった場合の生産的な遺伝子編集の増強という以前の観察結果を裏付ける（Ma et al.を参照されたい）。

本明細書において報告される方法の結果に基づき、両化合物を組み合わせると、DTrに対するPMrの比率は、6.5％（SCR7のみ）または6.9％（RS-1のみ）と比較して8.1％であることがさらに見い出された。しかしながら、この差/増加は有意性がなく（RS-1単独に対してp＝0.39）、それは以前の観察結果と一致している（Pinder et al.、Gutscher et al.）。

遺伝子編集の向上を可能にする条件もしくは構成要素、または条件-構成要素組み合わせを同定するハイスループット技術の適用
本明細書において報告される方法は、DTまたはシュードモナス外毒素Aまたはコリックス毒素などの致死性eEF2不活性化毒素に対する感受性を付与する、細胞遺伝子の、編集に基づく不活性化に基づく。これらのアッセイの読み取りは、そのようなADPリボシル化毒素に対して耐性がある細胞の「コロニーカウント」である。

死対生存の読み取りは非常に堅牢であり、細胞に基づくコロニーカウントアプローチは、ハイスループット適合性である。したがって、アッセイ設定と高度に平行し、自動（ロボット工学）プラットフォームで作動するように、アッセイ原理を適応させ得る。細胞に基づくアッセイにおける表現型同定のための自動ハイスループットプラットフォームは、様々な形式で利用可能であり、当分野において周知である。

記載されるDPH編集に基づくアッセイ原理のハイスループット/自動適用は、遺伝子編集に対する、特に効率および特異性に対する、多数の異なる条件またはパラメーターまたは添加物/調節因子の影響を測定する。条件またはパラメーターまたは添加物/調節因子は、合成または天然化合物のコレクションまたはライブラリーを（例示的には、これらに制約を課さずに）包含することにおいて対処される。これにより、遺伝子編集の効率または特異性を増大させる化合物および条件が同定される。そのような化合物および条件は、DNAの組み換えおよび修復、核酸結合、タンパク質と核酸との相互作用、または核酸の再編成、代謝、合成、もしくは修復に関与するタンパク質との相互作用に直接的または間接的に影響する物質および化合物クラスに特に由来する、あるいはそれと構造または機能の点で類似している。

展望
ゲノム編集は、科学的適用に最も重要な技術として浮上している。しかしながら、その全潜在性は、現在適用されている編集アプローチの効力および特異性の問題によって依然として限定されている。本明細書において報告される方法は、編集により与えられた遺伝子不活性化および挿入の効力および特異性についての簡便でかつ堅牢な定量化および比較を可能にする。それは、多数の個々の細胞に基づき、ヘテロ接合型の遺伝子不活性化事象およびホモ接合型の遺伝子不活性化事象、ならびに非特異的組込み事象対標的組込み事象についての的確な判定を可能にする。この方法によってもたらされた学習およびパラメーターは、遺伝子編集の科学を向上させ得るだけでなく、遺伝子編集を発展させるおよび最適化するために特に重要でもあり得る。

本明細書において報告される方法のコア原理は、DTなどの致死性eEF2不活性化毒素に対する感受性を付与する、細胞遺伝子の、編集に基づく不活性化を含む。毒素標的は、DPH遺伝子によりコードされるタンパク質（例えば、DPH1またはDPH2）によってeEF2上に置かれたジフタミドである。これらの遺伝子のいずれかの機能性の完全な喪失（両アレル）は、それによりジフタミド合成が妨げられるため、「絶対的な」毒素耐性をもたらす。ゆえに、毒素耐性は、両標的遺伝子のホモ接合型機能不活性化を特異的に表す。一方の標的アレルのみが不活性化されている細胞は、依然として毒素感受性である。組込み事象は、組込みカセット上の耐性付与遺伝子によって別個に査定され得る。DPH遺伝子の不活性化による毒素耐性は、いかなるバックグラウンドもなく、どれだけ毒素が適用されても、「絶対的」である。これは、方法の堅牢性および簡便性の主要な因子であり：ホモ接合型標的遺伝子不活性化事象の頻度は、毒素耐性コロニーをカウントすることによって、挿入事象の頻度は、PM耐性コロニーをカウントすることによって、および二重事象の頻度は、両方に耐性であるコロニーをカウントすることによって、査定され得る。その結果、方法は、多数の個々の細胞に対する個々の編集事象についての簡便でかつ堅牢な査定を可能にする。さらには（および、多くの既存のツールとは対照的に、例えばFu et al. 2014、Doench et al.、Maruyama et al.、Shalem, et al.を参照されたい）、ホモ接合型およびヘテロ接合型の遺伝子不活性化および組込み事象が区別され得る。ゆえに、簡便なコロニーカウントは、生産的な遺伝子編集（組込み）および破壊的な遺伝子編集（組込みなしの不活性化）の効力および生産的な遺伝子編集（組込み）と破壊的な遺伝子編集（組込みなしの不活性化）の比率を反映する。

方法は、2種の異なるDPH遺伝子に対する編集事象（コロニー頻度）を比較した結果によって証拠立てられた「一般化可能な」結果を与える。DPH1およびDPH2は、異なる酵素をコードし、その両方とも独立してジフタミド合成に不可欠である。結果は、両遺伝子に関する匹敵する効力、特異性、および破壊/組込み比率を示した。異なる染色体上の異なる遺伝子上の異なる標的配列にもかかわらず匹敵する読み取りは、この方法を適用することによって判定される法則、依存性、およびパラメーターが、他の遺伝子の編集を最適化するために変形可能であることを示している。

遺伝子編集効率を特徴付けする、区別する、および最適化する堅牢な方法としてのDPH遺伝子不活性化の適用は、CRISPR/Casモジュールに制限されるわけではない。それは、同一の読み取りパラメーターを用いた同じ様式で、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはTALENなどの他の遺伝子編集原理に適用され得る（Carroll 2011；Christian, et al. 2010；Gaj, et al. 2013；Miller, et al. 2011；Urnov, et al. 2010）。異なるDPH標的遺伝子（異なる染色体上に位置する）に対する類似した全体的な遺伝子不活性化および組込みの頻度についての観察結果は、このアプローチに由来する「法則」、依存性、および最適化パラメーターが一般化可能（すなわち、他の遺伝子に変形可能）であることも表す。ゆえに遺伝子編集モジュールおよびパラメーターは、DPH遺伝子改変によって最適化され得、その後、他の遺伝子の遺伝子編集効率または特異性を最適化するために変形され得る。

本明細書において報告される方法を用いて、20merのガイドRNAがCRISPR/Cas媒介性遺伝子標的指向化に有効であるという以前の観察結果（Cho, et al. 2013；Jinek, et al. 2012；Jinek, et al. 2013；Mali, et al. 2013b）が再確認され得た。最も高い全体的な遺伝子不活性化および組込みの頻度は、20merを用いて観察された。他の多くの評価法（Doench, et al. 2014；Fu, et al. 2014；Maruyama, et al. 2015；Shalem, et al. 2014）とは対照的に、本明細書において報告される方法では、全体的頻度が査定されるだけでなく、ホモ接合型およびヘテロ接合型の遺伝子不活性化（ならびに非（部位）特異的な組込み）事象も、多数の個々の細胞に対する迅速で簡便でかつ堅牢な様式で区別され得る（図9を参照されたい）。これにより、生産的な遺伝子編集事象（カセット組込み）および破壊的な遺伝子編集事象（組込みなしの遺伝子不活性化）の頻度および生産的な遺伝子編集事象（カセット組込み）と破壊的な遺伝子編集事象（組込みなしの遺伝子不活性化）の比率を比較することが可能となった。

これらの解析は、（最も高い全体的な不活性化頻度は、20merを用いて達成されたにもかかわらず、）生産的と破壊的の「最善の」比率は、16〜18merのガイドRNAを用いて観察されたという興味深い観察結果につながる。ゆえに、依然として現在のgRNA「標準」として見なされ得る20mer（Haeussler, et al. 2016；Liao, et al. 2015；Muller, et al. 2016）は、最も効率的な遺伝子不活性化を目指す場合の選定であり得る。他方で、本明細書において提示される結果は、過度の破壊的編集なしでの組込みを望む場合には16〜18merが編集事象に好ましくあり得ることを表す。

Fu et al.（Fu, et al. 2014）が、遺伝子不活性化実験において20merよりも短いサイズのgRNAを評価し、オフターゲット効果の低下を有して20merに匹敵する不活性化効力を観察したことに留意することは興味深い。彼らの解析は、単一アレルGFP遺伝子不活性化に基づき、その結果、（1細胞あたり1つの標的遺伝子だけ）2倍体細胞におけるホモ接合型およびヘテロ接合型不活性化事象に対処し得なかったまたはそれらを区別し得なかった。Fu et al.は、挿入事象も定量化し得ずおよび比較し得なかった。データ（多数の細胞、および正常染色体によりコードされるヒト遺伝子の不活性化に基づく）は、20merが、より短いガイドよりも遺伝子不活性化のより効率的な誘導因子であることを表す。しかしながら、より短いガイドは、挿入のより効率的な仲介因子であった。

低い非生産的遺伝子破壊を伴う最適な組込み効率は、「反復アプローチ」にとって、すなわち、組込み効率を増加させるために、以前に処理された細胞へのCRISPR/Casモジュールの再適用を目指す場合、特に重要であり得る。遺伝子不活性化はガイドRNA標的配列を変更するため、変更されていない遺伝子のみが元のCRISPR/Cas構成要素によって改変され得るが、一方で改変された遺伝子（組込みなし）は、反復アプローチの影響を受けにくい。

ヘテロ接合型の遺伝子不活性化事象およびホモ接合型の遺伝子不活性化事象、ならびに非特異的組込み事象および標的組込み事象についての的確な判定は、CRISPR/Cas由来の療法の開発および最適化に特に重要である。本明細書において提示される結果は、遺伝子不活性化が、標的組込みよりもはるかに高い（＞100倍）頻度で生じたことを実証する。ホモ接合型不活性化（両アレルが影響を受けた）でさえ、標的組込みよりも依然として30〜50倍高い頻度で生じた。遺伝子不活性化はガイドRNA特異性への「絶対的な」依存性を示し、一方で組込みは、標的部位における選好的な組込みを示したが、「特異的な」組込みと呼ばれる程度ではなかった（2倍増加した頻度の標的遺伝子対非標的遺伝子の組込み）。それが理由で、現在利用可能なCRISPR/Cas由来の遺伝子編集技術は、規定の組込み事象を要する適用に関しては具体的に評価される必要がある。

引用文献：

gRNAの組成：DPH1を標的にするgRNAの配列、サイズ、および的確なゲノム遺伝子座；的確な染色体箇所は括弧内に表されている；ドナープラスミド上の組込みカセットの、LHR：左相同領域およびRHR：右相同領域。対応するmRNA配列は、RefSeq:NM_001383である。 gRNAの組成：DPH2を標的にするgRNAの配列、サイズ、および的確なゲノム遺伝子座；的確な染色体箇所は括弧内に表されている；ドナープラスミド上の組込みカセットの、LHR：左相同領域およびRHR：右相同領域。対応するmRNA配列は、RefSeq:NM_001039589、NM_001384である。 MCF7細胞、およびヘテロ接合型（wt/k.o.）またはホモ接合型（k.o./k.o.）の不活性化されたDPH1遺伝子を含有するMCF7を、種々の濃度のジフテリア毒素に48時間曝露した。細胞生存率を、以前に記載されるように（Mayer, et al. 2015；Stahl, et al. 2015）、生存率アッセイによって査定した。 MCF7細胞に、ジフテリア毒素（DT）感受性遺伝子DPH1の不活性化のための、ならびにピューロマイシン（PM）耐性を付与するPAC発現カセットの組込みのためのCRISPR/Cas9モジュールをコードするプラスミドをトランスフェクトした。（AおよびB）トランスフェクションの48時間後、細胞を、DPH1機能性を含有する細胞にとって致死性である濃度のDTに曝露した。この毒素選択は、全DPH1遺伝子コピーが不活性化されている生存コロニーを生み出す（Aにおける上のコロニー）。機能的DPH1遺伝子を保つコロニーは、該毒素によって殺傷される（Aにおけるコロニーフラグメント）。コロニーは染色することによって可視化され得、それらの数は、（B）に描かれるコロニーカウントとして定量化され得る。DT耐性コロニーは、対照ガイドに曝露された細胞においていかなる非特異的バックグラウンドもなく、DPH1遺伝子特異的ガイドRNAで細胞を処理した際にのみ現れることに留意されたい。（C）トランスフェクションの48時間後、細胞を、PAC発現カセットを所持しない細胞にとって致死性である濃度のPMに曝露した。その結果、PM選択は、少なくとも1つのPAC発現カセットを所持する生存コロニーを生み出す。コロニーは染色することによって可視化され得、それらの数は、（C）に描かれるコロニーカウントとして定量化され得る。PM耐性コロニーは、DPH1遺伝子内への特異的組込みのためのガイドRNAで細胞を処理した際により多い数で現れるが、非特異的組込み事象を表す、対照ガイドに曝露された細胞においてもバックグラウンドを示すことに留意されたい。 MCF7wt細胞、一方のDPH1野生型アレルおよび一方の不活性化アレルを有するMCF7wtko細胞、ならびに不活性化された両DPH1遺伝子を有するMCF7koko細胞を、HRM PCRに供した。HRMに供されたPCRフラグメントは、DPH1遺伝子におけるCRISPR/Cas標的領域に及ぶ。DPH1遺伝子において改変を所持する細胞は、変更されたアレルの存在を表す、それらの融解曲線の差によって野生型細胞と区別され得ることに留意されたい。ホモ接合型およびヘテロ接合型改変は、非改変野生型細胞と区別され得る。方法は、一方のアレルのみで改変されている細胞（ヘテロ接合型、毒素感受性）と両アレルが不活性化されている細胞（ホモ接合型、毒素耐性）とを区別しない。毒素感受性細胞は、一方の野生型アレル（毒素感受性を付与された）および一方の変異したアレル（逸れた融点）を有する細胞を表す二相融解曲線を有する。 DPH1特異的CRISPR/CasモジュールがトランスフェクトされたMCF7細胞を、DT選択に、またはHRM-PCR、それに続くDT選択に供した。（A）DT選択は、合致するDPH1ガイドRNAを用いてのみ耐性コロニーを生み出し、未処理細胞においてまたはスクランブルガイドRNAを受けた細胞においてコロニーは現れない。（B）HRM-PCRは、一方または両方のアレルでそれらのDPH1遺伝子において改変される細胞の頻度を明らかにした。後続のDT感受性アッセイは、単一アレルヒット（毒素感受性およびHRM陽性）の頻度が、両アレルの不活性化（HRM陽性および毒素耐性）の2倍高いことを示した。 DPH1特異的CRISPR/CasモジュールがトランスフェクトされたMCF7細胞を、PM選択および/またはDT選択に供した。トランスフェクション対照は、DTrもPMrコロニーも示さない。（A）PM選択は、スクランブルガイドRNAと比較して、DPH1ガイドRNAを用いて2倍高い頻度で耐性コロニーを生み出す。未処理細胞においてコロニーは現れない。 DPH1特異的CRISPR/CasモジュールがトランスフェクトされたMCF7細胞を、PM選択および/またはDT選択に供した。トランスフェクション対照は、DTrもPMrコロニーも示さない。（B）PM選択とDT選択との組み合わせは、DPH1遺伝子が完全に不活性化されている細胞にPACカセットが組込まれる頻度を定量化する。DPH1ガイドRNAは、PM-DT二重耐性を有するクローンを生み出す。スクランブルガイドRNAは、PM耐性のみでDT耐性でないクローンを生み出す。 DPH1特異的CRISPR/CasモジュールがトランスフェクトされたMCF7細胞を、PM選択および/またはDT選択に供した。トランスフェクション対照は、DTrもPMrコロニーも示さない。（C）DT耐性（両DPH1遺伝子が不活性化されている）コロニーの頻度およびPM耐性（DPH1遺伝子におけるまたは別の部位におけるPAC組込み）の頻度の比較。 DPH1特異的CRISPR/CasモジュールがトランスフェクトされたMCF7細胞を、PM選択および/またはDT選択に供した。トランスフェクション対照は、DTrもPMrコロニーも示さない。（D）平均値＋SEMが示されている（n＝4、^***p＜0.001）。PM選択は、scRNAと比較して、DPH1 gRNAを用いて2倍高い頻度で耐性コロニーを生み出す。PM選択とDT選択とを組み合わせることにより、不活性化された両DPH1アレルを有する細胞にPACカセットが組込まれる頻度が明らかになる。DPH1 gRNAは、PM-DT二重耐性を有するクローンを生み出す。scRNAは、PMrのみでDTrでないコロニーを生み出す。 DPH1特異的CRISPR/CasモジュールがトランスフェクトされたMCF7細胞を、PM選択および/またはDT選択に供した。トランスフェクション対照は、DTrもPMrコロニーも示さない。（E）平均値＋SEMが示されている（n＝4、^***p＜0.001）。DTr（両DPH1遺伝子が不活性化されている）コロニーおよびPMrコロニー（DPH1におけるまたは別の部位におけるPAC組込み）の頻度の比較。 DPH1特異的CRISPR/CasモジュールがトランスフェクトされたMCF7細胞を、PM選択および/またはDT選択に供した。トランスフェクション対照は、DTrもPMrコロニーも示さない。（F）平均値＋SEMが示されている（n＝4、^***p＜0.001）。DPH2特異的gRNAがトランスフェクトされたMCF7細胞を、PMおよび/またはDT選択に供した。 DPH2特異的CRISPR/CasモジュールがトランスフェクトされたMCF7細胞を、PM選択および/またはDT選択に供した。DPH1に関して観察されたのと同じ様式で、DT耐性コロニーの頻度は、PM耐性コロニーのものよりもはるかに高い。ゆえに、両アレルの不活性化は、PACカセットの組込みよりも有意により効率的である。 遺伝子編集の最適化：効力および特異性に対するgRNA長および編集酵素の影響。（A）種々の長さのガイドRNA（gRNA）とともに、DPH1特異的CRISPR/CasモジュールがトランスフェクトされたMCF7細胞を、PMおよびDT選択に供する。読み取りは、絶対的な遺伝子不活性化およびカセット組込み頻度の判定、ならびにガイドRNA非依存性の非特異的組込み事象の判定を可能にする。 遺伝子編集の最適化：効力および特異性に対するgRNA長および編集酵素の影響。（B）DT耐性およびPM耐性の頻度間の正規化された比率は、所望のカセット組込みが、組込みに関連しない遺伝子不活性化の事象の低下とともに生じる条件を同定する。破壊的な遺伝子編集の最大効率は20merを用いて達成され、一方で最大組込み効率は16〜18merを用いて観察されることにも留意されたい。 遺伝子編集の最適化：効力および特異性に対するgRNA長および編集酵素の影響。（C）標的遺伝子における生産的組込み（PMならびにDTに対して耐性である細胞）の最大効率は、18merのガイドを用いて観察される。 遺伝子編集の最適化：効力および特異性に対するgRNA長および編集酵素の影響。（D）平均値＋SEMが示されている（n＝4、ΛΛ/ΦΦ/ΨΨP＜0.01、ΛΛΛ/ΦΦΦ/ΨΨΨP＜0.001）。種々の長さのgRNAとともに、DPH1特異的Cas9モジュールがトランスフェクトされたMCF-7細胞を、PMおよびDT選択に供する。gRNA長は、遺伝子不活性化および組込み頻度に影響を及ぼす。すべてのscRNA/gRNA値を、それぞれの選択群の最大値と比較した。 遺伝子編集の最適化：効力および特異性に対するgRNA長および編集酵素の影響。（E）平均値＋SEMが示されている（n＝4、ΛΛ/ΦΦ/ΨΨP＜0.01、ΛΛΛ/ΦΦΦ/ΨΨΨP＜0.001）。種々の酵素とともに、DPH1特異的Cas9モジュールがトランスフェクトされたMCF-7細胞を、PMおよびDT選択に供する。20mer gRNA（CRISPR/Cas9）または設計されたZFNを用いたDPH1編集アプローチにおける、DTr、PMr、またはDTr＋PMrコロニーの総数。 遺伝子編集の最適化：効力および特異性に対するgRNA長および編集酵素の影響。（F）平均値＋SEMが示されている（n＝4、ΛΛ/ΦΦ/ΨΨP＜0.01、ΛΛΛ/ΦΦΦ/ΨΨΨP＜0.001）。種々の酵素とともに、DPH1特異的Cas9モジュールがトランスフェクトされたMCF-7細胞を、PMおよびDT選択に供する。総組込み事象対総不活性化事象の比率（PMr/DTr）、および部位特異的組込み事象/総標的遺伝子不活性化事象の比率（(DTr＋PMr)/DTr）。 ヒトDPH1遺伝子を標的にする20merガイドRNAを用いて観察された、特異的および非特異的なCRISPR/Cas媒介性遺伝子編集事象の頻度。 遺伝子編集に対するDNA修復調節剤の影響。MCF-7細胞に、20mer gRNA、SpCas9、およびPACをコードするプラスミドをトランスフェクトした。HR調節剤RS-1（8μM）およびNHEJ調節SCR7（1μM）を、トランスフェクションの4時間前または18時間後のいずれかに添加した。DTおよび/またはPM選択を、トランスフェクションの72時間後に開始した。DTrコロニー（切断）に対するPMrコロニー（組込み）のパーセンテージが示されている。平均値＋SEMが示されている（n＝4）。未処理（付加的な作用物質なし）対照に対して、Φ．Λp＝0.05、ΦΦ，ΛΛp＝0.01、ΦΦΦΛΛΛp＝0.001。

以下の実施例、図、および配列は、本発明についての理解を補助するために提供され、その真の範囲は添付の特許請求の範囲に示される。本発明の精神から逸脱することなく、示される手順に改変が加えられ得ることが理解される。

実施例1
MCF7細胞の培養、および遺伝子編集物質をコードするプラスミドのトランスフェクション
MCF7細胞（Brooks, et al. 1973）をもともとATCCから得（その後、社内細胞バンクにおいて増殖させた）、10％FCS、2mM L-グルタミン、およびペニシリン/ストレプトマイシンを補充したRPMI 1641培地中で37℃および85％湿度で維持した。遺伝子編集モジュールを持つプラスミドのトランスフェクションに関しては、3,000,000個の細胞を直径10cmの培養ディッシュに播種し、37℃および加湿された5％CO2で培養した。播種の24時間後、メーカーのプロトコールに従い、しかし6:1のN/P比で、JetPEI（Polyplus）を用いて合計20μgのDNAを細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション効率を、改変eGFP発現プラスミド（Zhang, et al. 1996）がトランスフェクトされた細胞のフローサイトメトリー（FACS Calibur、BD biosciences）によって24時間後に判定した。

Dph1（gRNA標的配列：RefSeq:NM_001383に由来する

）およびDph2（gRNA標的配列：RefSeq:NM_001039589、NM_001384に由来する

）、ならびにスクランブル対照（gRNA配列：

）に対する、CRISPR/Cas9遺伝子編集物質（すなわち、ノックアウトおよび組込みシステム）をコードするプラスミドを、OriGeneから得た。このシステムは、U6プロモーターの制御下で約100ntのgRNAならびにCMVプロモーターの制御下でCas9ヌクレアーゼを発現する1種のプラスミドと、標的遺伝子（Dph1またはDph2）に対する相同アームが隣接したプロモーターなしGFP/PM発現カセットを有するドナープラスミドとを含む。種々のサイズの付加的なDph1 gRNA配列変種（OriGene）は、

であった（図1Aを参照されたい）。

実施例2
CRISPR/Cas9媒介性ホモ接合型DPH1およびDPH2遺伝子ノックアウトの同定および定量化
DPH1またはDPH2の全染色体コピーが不活性化されているMCF7細胞は、ジフテリア毒素に対して耐性である（Stahl, et al. 2015）。ゆえに、CRISPR/Casにより与えられた遺伝子不活性化があった場合の毒素耐性細胞/コロニーの出現率および頻度は、全遺伝子コピーの不活性化の効率についての測定を提供する。したがって、MCF/細胞に、（i）トランスフェクション対照としてのGFP発現プラスミド、（ii）CRISPR/Cas9 Dph1またはDph2ノックアウト/組込みシステム、および（iii）Cas9非依存性組込み頻度を判定するための、スクランブルgRNAを含有するノックアウト/組込み物質を、実施例1に記載されるようにトランスフェクトした。トランスフェクション効率の判定後、細胞を6ウェルプレートに播種した。DTによるホモ接合型ノックアウト事象の定量化に関しては、20000個の細胞を播種し、PMによる組込み事象の定量化または両事象の定量化に関しては、40000個の細胞を播種した。細胞播種の3日後に、RPMI培地を、DTもしくはPMまたは両毒素を含有するRPMI培地と交換した。すべての死細胞がプレートから除去され、活発に増殖するコロニーが顕微鏡検査により検出され得るまで、培地の交換を2〜3日ごとに繰り返した。その後（毒素曝露の開始の12日〜14日後）、細胞をPBSで3回洗浄し、その後に氷冷メチレンブルー（50％EtOH中0.2％）で染色した。その後にメチレンブルー溶液を除去し、プレートを流水下で慎重に洗浄した。最後に、5mm格子ホイルを用いて、細胞コロニーを顕微鏡下でカウントした。これらの解析の結果は、以下の表に要約されている。

（表）トランスフェクトされたMCF-7細胞のコロニーカウント数および表現型頻度
「TF eff.」：トランスフェクション効率は、GFPレポータープラスミドによるMCF7のトランスフェクションがあった場合の蛍光細胞の頻度をモニターするFACS解析によって判定された。全細胞中のGFP陽性細胞の相対数が％で列挙されている。全アッセイ間の平均トランスフェクション効率は30〜40％であった。「HRM」：高解像度融点PCR陽性細胞は、野生型細胞と比較して、明らかに分岐する（二相の）融解曲線パターンを呈するものとして定義される。「K.O.」は、機能的DPH1またはDPH2遺伝子コピーを所持せず、それゆえDTに対して耐性である細胞の頻度を表す。「Int.」は、PAC発現カセットを持ち、それゆえPMに対して耐性である細胞の頻度を表す。「A〜D」は、独立した（四つ組の）実験の個々のサンプルを表す。

実施例3
CRISPR/Cas9媒介性ヘテロ接合型DPH1およびDPH2遺伝子ノックアウトの検出
dph1またはdph2の一方のアレルのみが改変されている細胞は、毒素耐性でない。それらの事象を同定しかつ定量化するために、高解像度融解（HRM）PCRを、Stahl et al（Stahl, et al. 2015）によって記載されるのと同様の様式で適用した：トランスフェクションの24時間後、単一細胞をFACS（FACSAria、BD biosciences）によって96ウェルプレートに付着させ、コンフルエントまで増殖させた。細胞をPBSで洗浄し、1ウェルあたり40μLの細胞溶解バッファー（Roche）の添加により溶解した。750rpmでのプレートシェーカー（Titramax 1000、Heidolph）上でRTにて15分間のインキュベーション後、細胞溶解物をPCRグレードのH2Oで1:5希釈した。5μLの細胞溶解物を、High resolution melting（HRM）マスターミックス（Roche）と、およびgRNA標的配列に及ぶプライマーと混合した。PCRおよびHRMを、メーカーのプロトコールに従い、LC480 II（Roche）で実施した。編集された標的遺伝子を有するクローンを、MCF7-WT細胞と比較してそれらの変更された融解曲線によって同定した。

二相融解曲線を有する細胞は、細胞生存率アッセイにより、依然として1つの野生型アレルを所有し得る、または不活性化された両アレルを有し得る。したがって、そのようなクローンを拡張し（毒素またはピューロマイシン選択なしで）、細胞生存率解析に供してヘテロ接合型（毒素感受性）およびホモ接合型（耐性）のノックアウト細胞を区別した。これらのアッセイを、加湿された5％CO2条件において37℃で、10.000個の細胞を含有する平底96ウェルプレートにて実施した。播種の24時間後、細胞を毒素に72時間曝露した。生存細胞の代謝活性を、メーカーの仕様に従って実施されるCellTiterGlo（登録商標）Luminescent Viability Assay（Promega）によって査定した。これらの解析の結果は、上記の表に要約されている。

実施例4
カセット組込み事象の検出
標的組込みのためのCRISPR/Casモジュールは、一過性発現を回避するために、プロモーターなしのピューロマイシン（PM）耐性遺伝子発現カセットを含有する。ゆえに、ゲノム内への組み換え配列の組込みの検出を、PMに対する細胞の感受性を判定することによって検出した。500ng/μL PMの濃度（野生型MCF7細胞を定量的に除外する）を適用して、安定に組込まれた発現カセットを有するMCF7細胞を選択した。PM耐性コロニーを、DT選択に関して上記で記載されるのと同じ手順で選択し、毒素耐性コロニーに関して上記で記載されるのと同じ様式で、可視化しかつ定量化した（選択の開始の12〜14日後）。非標的ガイド配列を用いて得られたPM耐性コロニーの数（スクランブルgRNA、図1）は、非特異的組込みバックグラウンドを反映する。PM耐性であるが毒素感受性である、標的遺伝子gRNAを用いて得られたコロニー（非特異的バックグラウンドを上回る）の増加は、一方の標的アレルだけへの組込みを反映し、他方のdph1またはdph2アレルは影響を受けないまま残る。DT耐性でもあるPM耐性コロニーは、発現カセットが少なくとも標的アレル内に組込まれており、他方のアレルは不活性化されている、またはさらに別の組込み事象を伴って不活性化されている。これらの解析の結果は、表1に要約されている。

実施例5
ジフテリア毒素耐性アッセイおよびHRM-PCRの組み合わせは、ホモ接合型およびヘテロ接合型のdph1遺伝子不活性化事象を区別しかつ定量化する
ジフテリア毒素（DT）は、真核生物翻訳伸長因子2（eEF2）上のジフタミドをADPリボシル化し、それによってeEF2を不活性化する。これは、タンパク質合成を不可逆的に失速させ、細胞を殺傷する。ジフタミドは、ジフタミド合成遺伝子、それらの中でもジフタミド生合成1遺伝子＝DPH1によりeEF2によって置かれる、規定されたヒスチジンである。MCF7細胞における全DPH1アレルの完全な不活性化（例えば、遺伝子編集による）は、毒素標的ジフタミドの合成を妨げる。これは、細胞をシュードモナス外毒素A（PE）およびDTに対して耐性にする（Stahl et al.）。その結果、DPH1の全機能的コピーの不活性化は、「DT耐性」という表現型を生み出す（図3）。この表現型の頻度は、実施例2〜4に記載されるように、毒素耐性コロニーをカウントすることによって迅速でかつ堅牢な様式で検出され得る（上記の表における結果および図3）。

残る1つの機能的DPH1アレルだけの存在で毒素感受性に十分であるため（図1および2）、耐性表現型は、それらの全DPH1アレル（alleele）のノックアウトを持つ細胞を特異的に規定する。一方のアレルのみが改変されている細胞は、培養細胞に対して直接実施されるHRM-PCRアッセイによって同定され得る（実施例3に記載される）。CRISPR/Cas標的部位の改変は、野生型フラグメントのものと比較してdph1遺伝子由来PCRフラグメントの融解温度を変更する。これは、HRMプロファイルにおける二相融解曲線によって反映される（図4に例示的に示される）。CRISPR-Cas9媒介性遺伝子不活性化事象は、両アレルで同一であることは滅多にないため、完全な遺伝子不活性化を有する多くの細胞も、二相HRMプロファイルを示すと考えられる。これらは、それらの毒素耐性表現型によって、単一アレル遺伝子変更と区別され得る。

ゆえに、ハイスループットのオンセルHRM-PCRと毒素選択（コロニーカウント）アッセイとの組み合わせは、ヘテロ接合型およびホモ接合型のDPH11遺伝子特異的改変事象の定量化を可能にする。

実施例6
ピューロマイシン耐性アッセイは、遺伝子特異的および非特異的な組込み事象の頻度を検出しかつ区別する
適用されるCRISPR/Cas9プラスミドの組込みカセットによってコードされるピューロマイシン-N-アセチル-トランスフェラーゼ（PAC）は、PMを不活性化し、それゆえ細胞をPM耐性にする（Vara, et al. 1986）。ゆえに、PAC発現カセットの組込みは、DT耐性コロニーに関して上記で記載されるのと同じ様式で、PM耐性アッセイによって検出され得および定量化され得る（選択剤としてDTの代わりにPMを適用する、図3）。特異的でかつホモ接合型の標的遺伝子不活性化からのみ生じるDT耐性とは対照的に、PM耐性は、組込みの箇所とは無関係に、任意の組込み事象を印付けする。部位特異的組込み対非特異的組込みの頻度は、標的遺伝子特異的ガイドRNAに曝露されたPM耐性細胞の数と、スクランブル非特異的ガイドに曝露された細胞の数とを比較することによって対処され得る（図3を参照されたい）。

実施例7
CRISPR-Cas9により与えられたDPH1遺伝子不活性化および標的組込み事象の比較
標的特異的な不活性化、組込み、および非標的組込みの頻度を比較するために、DPH1特異的CRISPR-Cas9モジュールをコードするプラスミド（実施例1、図1）を、MCF7細胞内にトランスフェクトした。その後、これらをHRM-PCRに、ならびにDT耐性およびPM耐性を検出するコロニーカウントアッセイに供した。これらのアッセイの結果は図5に要約されており、個々のデータセットは上記の表1で入手可能である。

図5Aは、全DPH1アレルの機能喪失を表すDPH1遺伝子の完全な不活性化が、全てのトランスフェクト細胞のおよそ6％の頻度で生じたことを示している（40％のトランスフェクション効率を考慮すると全細胞の2.5％、表1）。DPH1遺伝子不活性化は、合致するガイドRNA配列への絶対的な依存性を示し、スクランブルガイドは、いかなるDT耐性コロニーも生み出さなかった。DPH1遺伝子上のHRM「ヒット」の頻度とDT耐性コロニーの出現率との比較が、図5Bに示されている。これらの解析により、単一アレル遺伝子不活性化（毒素感受性HRMヒット）は、両アレルの不活性化（DT耐性細胞）の2倍の頻度で生じることが明らかになった。

図6は、PM耐性コロニーの頻度、ならびにDT耐性コロニーおよびPM耐性コロニーの頻度の比較を示している。これらの結果は、両DPH1アレルの同時不活性化が、PM耐性を媒介するPAC発現カセットの組込みよりも30〜50倍高い効率で生じることを表した（図6A、PAC組込みの箇所または接合状態の差はなし）。DPH1特異的ガイドRNAの適用と比較して、スクランブルガイドは、（その他の点では同一の条件下で）2倍少ないPM耐性コロニーを生み出した。これは、CRISPR/Cas9/DPH1ガイド媒介性PAC遺伝子組込みが、DPH1遺伝子における選好性を有して生じるが、絶対的な特異性を有して生じるわけではないことを表す。DPH1標的部位における選好的組込みに従って、DPH1ガイドを用いて得られた多くのPM耐性コロニーは毒素耐性であった（図6B）。スクランブルガイドを用いて得られたPM耐性コロニーのいずれも、DT耐性でなかった。

これらの結果は、CRISPR/Cas9媒介性標的遺伝子不活性化（両アレル上で同時にでさえ）は、非常に特異的に、かつ標的組込みよりもはるかに高い頻度で生じることを示している（図6C）。標的組込みは、より低い頻度で生じるだけでなく、ガイドRNAによって規定される箇所に対してより特異性が低くもある。

実施例8
CRISPR/Cas9遺伝子編集のためのアッセイ/定量化アプローチの適用性および結果は、他の標的遺伝子に変形され得る
本明細書において提示される結果（標的遺伝子不活性化と組込みとの間の観察された大きな差を含む）は、CRISPR-Cas9媒介性遺伝子編集の一般的特質またはDPH1遺伝子の特殊性であるのか？この問いに対処するために、同一の実験アプローチを、DPH2遺伝子のCRISPR-Cas9誘導性改変に対して適用した。DPH2は、DPH1とは異なる染色体上に配置され、異なる配列を有し、異なる酵素をコードする。しかし、DPH2もジフタミド合成に不可欠であり、DPH2欠損は、DPH1欠損と同じ様式で、細胞をDTに対して耐性にする（Stahl et al.）。それによって、本明細書において報告され、DPH1調節を同定しかつ区別するために開発された検出および定量化の原理は、DPH2のCRISPR/Cas9媒介性変更の解析に対しても適用され得る。

DPH2遺伝子編集、それに続くDT耐性およびPM耐性の査定の結果が図7に挙げられている：DPH1に関する観察結果と一致して、ホモ接合型DPH2遺伝子不活性化事象は、PAC発現カセットの組込みよりもおよそ40倍高い頻度で観察された。DPH2不活性化は、同族ガイドRNAの存在にきっちりと依存しており、一方でカセット組込みは、部位選好性を有するが、標的遺伝子に対する絶対的な特異性を有するわけではなかった（スクランブルガイドRNAを用いたDPH2ガイドの頻度と比較して）。DPH1およびDPH2遺伝子編集結果の著しい類似性（両者は異なる染色体上の異なる遺伝子であるにもかかわらず）は、このアッセイシステムを用いて得られた学習および法則が他の適切な遺伝子に変形可能であることを明確に示し、本明細書において報告される方法が一般的に適用可能であるという合理的根拠を提供する。

実施例9
本明細書において報告される方法の適用：遺伝子操作モジュールの比較および最適化
DPH1およびDPH2遺伝子編集実験の結果は、両者が異なる染色体上の異なる遺伝子であるにもかかわらず、高度に匹敵した。したがって、このシステムを用いて得られた「法則」および学習が、他の遺伝子に一般化され得ると推測することは合理的である。ゆえに、本明細書において報告される方法は、遺伝子改変モジュールの組成の一般的効果に対処する解析に対して適用され得る。

したがって、本明細書において報告される方法を、遺伝子操作モジュールの比較および最適化のために適用した。図8は、種々の長さのCRISPR/CasガイドRNAの遺伝子不活性化ならびに組込みの効率および特異性がどのように査定され得、遺伝子不活性化および/または組込みについてのそれらの効率および特異性に関してどのように比較され得るかを示している。適用された全ガイドRNAは、DPH1内の同じ配列区域を標的にしたが、14〜26塩基で長さが変動した（図1はガイドRNAを詳細に記載している）。DT耐性コロニーの頻度を記録して、標的遺伝子特異的なホモ接合型遺伝子不活性化を反映させた。同時に、PM耐性およびDT-PM二重耐性コロニーの数を査定して、カセット組込みをモニターした。

予想どおり、ガイドRNA長は遺伝子不活性化の効率に影響し、20merは最大のDPH1不活性化効率を付与する。相補的区域を18もしくは16塩基に短くする、またはそれを最高26塩基に伸ばすことにより、20merよりも減少した効率でではあるが、有意な特異的遺伝子不活性化の機能性が保たれた。ガイドRNA区域を16塩基未満（14mer）に低下させることにより、DPH1を不活性化する機能性は、検出レベルよりも下に減少した。

組込み効率（PM耐性事象をカウントすることによって査定される、図5Bを比較しかつ参照されたい）も、ガイドRNA長によって影響された。16mer未満（14mer）のガイドは、スクランブル対照バックグラウンドレベルを超えない、ほんのわずかなPM耐性コロニーを生み出した。16mer、18mer、20mer、22mer、24mer、および26merに対して、バックグラウンドを明確に上回る標的組込みが観察され、16〜18merで挿入効率の最適に達した。より大きなオリゴマー核酸で効率増大は達成されず、実際、より大きなサイズ（20merを含む）は、特異的挿入事象を有意に低下させた。

組込み事象（PM-r）と不活性化事象（DT-r）の比率を「特異性指標」として算出して、特異的組込みが最少の遺伝子不活性化事象とともに生じる条件を同定し得ることが見い出された。そのような条件は、過剰な非生産的な標的遺伝子損傷を与えることなく標的組込みを所望する場合に好まれ得る。

低い値（例えば、DT-rコロニーに対する、少ないPM-rコロニー）は、同時に生じる不活性化事象に対する、非効率的な組込みを反映する。高い値（より多くのPM-rコロニーおよび/または相対的に減少した数のDT-rコロニー）は、CRISPR/Casにより影響を受けた標的遺伝子におけるより効率的な組込みを反映する。

図8Bは、ガイドRNAの長さに依存した、算出された特異性因子を示している。16〜18merに対して、最も高い「不活性化あたりの挿入」値であること、および20塩基またはそれを上回る数を含有するガイドRNAに対して、顕著な低下があることが観察された。これは、20merが、標的遺伝子不活性化に対してかなり効率的であり（ガイドRNAを詳細に記載する、以前の観察結果と一致している）、さらにより短いガイドは、特異的組込みに対してより効率的であるように見えることを表す。より短いガイドは、組込み効率を向上させる（より高い総数のPM-rコロニー）だけでなく、生産的な遺伝子編集と非生産的な遺伝子編集の比率も向上させる（挿入なしのDT-rコロニーの低下）。

実施例10
種々の遺伝子編集アプローチの効率および特異性の比較
RNAガイドCas9ならびにZFN媒介性遺伝子編集の種々の変種についての遺伝子不活性化および組込み事象、効率および特異性を比較するために、gRNAの長さおよび組成を一定にした（20mer、DPH1を標的にする）。変動要素として、3種の異なる編集酵素を適用した。
（i）「SpCAS9」は、ストレプトコッカス・ピオゲネス由来のCas9ヌクレアーゼを指定し、それは現在の標準的適用と見なされ得る（Ran, Hsu et al. 2013、Fu, Sander et al. 2014）；
（ii）SpCas9-HF1は、非特異的DNA結合の低下、オフターゲット活性の低下を有し、それゆえ提案されるより高い忠実度および特異性を有する、SpCas9の操作された変種である（Kleinstiver, Pattanayak et al. 2016）；
（iii）設計されたジンクフィンガーモチーフによって、すなわち核酸ハイブリダイゼーションに対立するものとしてのタンパク質-核酸相互作用を介して、標的配列を認識する、ZFN媒介性遺伝子編集モジュール（Miller, Holmes et al. 2007、Urnov, Rebar et al. 2010）。

gRNA長解析に関して以前の実施例に記載されるのと同じ様式で、DT耐性コロニーの頻度を記録して、標的遺伝子特異的でかつホモ接合型の遺伝子不活性化を反映させた。PM耐性およびDT-PM二重耐性コロニーを査定して、カセット組込みをモニターした。

遺伝子不活性化およびカセット組込みの全体的効力を比較すると、不活性化ならびに組込みの最も高い値は、CRISPR/SpCas9を用いて観察された。CRISPR/SpCas9-HFに関して、標的遺伝子不活性化事象は、CRISPR/SpCas9と比較してより低く、20％未満のDT耐性コロニーの数であった。PM耐性コロニー（組込み）およびDT-PM二重耐性コロニー（同時の標的遺伝子不活性化を伴うカセット組込み）の数も強力に低下した。ZFNモジュールの適用は、その他の点では同一の条件下で、CRISPR/SpCas9を用いて観察された事象の60％未満への、DT耐性コロニー（ホモ接合型遺伝子破壊を有する）の数の低下をもたらした。ゆえに、標的遺伝子不活性化の効率は、SpCAS9と比較しておよそ2倍低く、操作されたSpCas9-HF1のものよりおよそ2〜3倍増加した。PM耐性コロニー（組込み）の数は、CRISPR/SpCas9とZFNとの間で有意に異ならなかった。DT-PM二重耐性コロニー（同時の遺伝子不活性化を伴うカセット組込み）の頻度は、CRISPR/SpCas9と比較して、ZFNを用いていくらか（30％）低下した。

全体的効率を除外して考える、DT耐性（標的遺伝子不活性化）コロニー対DT＋PM二重耐性（標的部位組込み）コロニーの比率の算出は、CRISPR/SpCas9ならびにCRISPR/Cas9-HFならびにZFNシステムが、1つのホモ接合型の/完全な遺伝子不活性化事象あたり、同レベル（およそ4×10^-3）の標的組込み事象を生み出すことを示した。ゆえに、本編集システムを用いて、全体的な遺伝子改変効力は変動するものの、標的遺伝子不活性化のバックグラウンドを上回るカセット組込みの「特異性」は、3つすべての評価されたアプローチに対して有意に異ならないと判定された。

ゆえに、その結果、本明細書において報告される方法を適用して、さらなる編集システムまたは編集事象を支持する添加物を評価して、向上した編集モジュールおよび/または条件を同定し得る。

（表）種々の遺伝子編集物質がトランスフェクトされたMCF-7細胞のコロニーカウント数および表現型頻度
MCF-7細胞に、種々のゲノム編集システム（SpCas9、SpCas9、ZFN）をコードするプラスミドをトランスフェクトした。SpCas9構築物を、上記で記載されるように適用した。SpCas9-HFは、Kleinstiver, Pattanayak et al. 2016に従って、N497A/R661A/Q695A/Q926A置換を含む。並行して、gRNAを並行してscRNAによって置き換えて、非特異的活性に対処した。DPH1特異的ZFNを、Sigma Aldrichから得た（CompoZr（登録商標））。3×10⁶個の細胞の初回細胞プールのトランスフェクションに対するプラスミドDNA（編集物質およびドナー）の総量は、以前の実験に関して記載されるとおりであった。トランスフェクション効率（TF eff.（％））を定量化するために、GFPレポータープラスミドを別としてトランスフェクトした。GFP陽性細胞を、トランスフェクションの24時間後にFACSによってカウントした。規定数の細胞を播種し（播種細胞数）、その後DT、PM、またはDT＋PMで72時間処理した。

実施例11
遺伝子編集の効率および特異性に対するDNA修復調節因子の影響
DPH遺伝子編集があった場合のDT耐性およびPM耐性細胞を判定するコロニーアッセイを含む本明細書において報告される方法を用いて、DNA修復メカニズムを調節する化合物の影響にも対処し得る。非相同末端結合（NHEJ）過程の阻害剤は、例えば、遺伝子編集事象を調節することが記載されている（Ma, Y, et al. 2016）。同じ様式で、相同組み換え（HR）の活性化因子は、標的カセット組込みの効率を増加させ得る（Song, J, et al, 2016）。

遺伝子編集の効率および特異性に対するDNA修復調節因子の影響を評価しかつ定量化するために、CRISPR/SpCAS9、およびDPH1を標的にする20mer gRNAを、DNA修復メカニズムを調節する化合物と組み合わせた。阻害剤Scr7を、遺伝子編集モジュールのトランスフェクションの4時間前またはトランスフェクションの18時間後のいずれかに、トランスフェクションの72時間後まで適用して、DNAリガーゼIVを阻害した。同じ様式で、RAD51調節因子（RS-1（RAD51刺激化合物1））を添加して、HRを刺激した。両化合物を、MCF7細胞の増殖または生存率に影響を有しない用量で適用した：Scr7に関して1μM、およびRS-1に関して8μM、ならびに両方を組み合わせる場合には1μM＋8μM（Scr7＋RS1）。その後、DT耐性、PM耐性、および二重耐性コロニーの頻度を記録して、これら種々の条件下での標的遺伝子不活性化およびカセット組込み事象の効率および特異性を反映させた。

トランスフェクションの4時間前の、72時間後までのScr7の添加によるNHEJの調節は、DT耐性コロニー（標的遺伝子不活性化の頻度を反映する）の数に対して検出可能な影響を有しないことが示され得た。トランスフェクションの4時間前のSCR7およびRS-1の共適用、ならびにトランスフェクション後18時間〜72時間のScr7の適用は、対照トランスフェクションと比較して、DT耐性コロニーの数のわずかな（しかし有意な）低下につながることも示され得た。ゆえに、DNAリガーゼIV媒介性NHEJは、CRISPR/SpCAS9により与えられた標的遺伝子不活性化にある程度影響を及ぼし得ることが示され得た。DT耐性コロニーの総数に対するその限定された影響にもかかわらず、トランスフェクションの4時間前の、72時間後までのSCR7の適用は、PM耐性コロニーの頻度を有意に刺激することが示され得た（およそ2倍、下記の表）。これは、SCR7がカセット組込み事象を増加させることを暗示し、SCR7の投与があった場合の生産的な遺伝子編集の増強という以前の観察結果を裏付ける（Ma Y et al 2016）。ゆえに、これらの結果は、本明細書において報告される方法を用いてそのような影響を判定し得るという証明を提供する。

トランスフェクションの4時間前の、72時間後までのHR刺激因子RS-1の添加による組み換えの調節は、スクランブルガイドを用いて得られるコロニーの数に影響を及ぼすことなく、PM耐性コロニーの数をおよそ2倍増加させることが示され得た（下記の表）。RS-1は、それが編集の始動後18時間〜72時間に適用された場合、カセット組込みの効率に影響を及ぼさないことも示され得た。ゆえに、これらの結果は、本明細書において報告される方法を用いてそのような影響を判定し得るという証明を提供する。

遺伝子編集においてリガーゼIV（NHEJ）阻害およびHR刺激を組み合わせることにより（トランスフェクションの4時間前に、72時間後までScr7ならびにRS-1を添加することにより）、DT耐性細胞の出現率が低下し、かつPM耐性細胞の頻度がさらに増大することが示され得た（下記の表）。このアプローチは、他のすべてのアプローチと比較して、PM耐性コロニー対DT耐性コロニーの最も高い比率ももたらすことが示され得た。ゆえに、これらの結果は、本明細書において報告される方法を用いてそのような影響を判定し得るという証明を提供する。

これらの実験から、本明細書において報告される方法を用いて、遺伝子編集アプローチの結果に影響を及ぼす化合物、化合物組み合わせ、化合物適用のタイミング、ならびに潜在的メカニズムの影響を判定し得ると結論付けることができる。ゆえに、本明細書において報告される方法は、したがって、所望の遺伝子編集効果を増大させかつ非所望の「副作用」を低下させる化合物または条件を同定するのに有用である。

（表）遺伝子編集の間に、SCR7および/またはRS-1に曝露されたMCF-7細胞のコロニーカウント数および表現型頻度
MCF-7細胞に、前に記載されるように、SpCas9媒介性編集のためのプラスミドをトランスフェクトした。同等数の細胞を播種し（播種細胞数）、編集の始動の72時間後にDTまたはPMで処理した。
（A）Scr7（1μMの最終濃度）、RS-1（8μMの最終濃度）、またはScr7＋RS1（それぞれ1uM＋8uM）を、トランスフェクションの4時間前に添加した。
（B）化合物により調節されるSpCas9-gRNA媒介性遺伝子編集に対する、RS1およびScr7の適用の時間（トランスフェクションの4時間前対18後）の影響。（^*）差は有意である、p＜0.008。

実施例12
ZFN媒介性DPH1遺伝子編集の同定および定量化
DPH1の全染色体コピーが不活性化されているMCF7細胞はDT耐性である。ゆえに、ZFNにより与えられた遺伝子不活性化および/またはカセット組込みがあった場合のDTrコロニーの出現率および頻度は、全遺伝子コピーの不活性化の効力についての測定を提供する。ZFN認識配列

は、NM_001383.3（DPH1-wt）に由来し、Sigma Aldrichから得た。この箇所に対するPAC組込みカセットをOriGeneから得た。MCF7細胞に、（i）GFP発現プラスミド、（ii）DPH1を標的にするZFNをコードするプラスミド、および（iii）DPH1を標的にするPAC組込みカセットを、上記で記載されるようにトランスフェクトした。トランスフェクション効率の判定後、細胞を6ウェルプレートに播種した。ホモ接合型ノックアウト事象（DTr）の定量化に関しては、20,000個の細胞を播種し、組込み事象（PMr）または二重耐性の定量化に関しては、40,000個の細胞を播種した。播種の3日後に、RPMI培地を、DTもしくはPMまたはその両方を含有するRPMIに交換した。培地を2〜3日ごとに変えた。毒素曝露の開始の12日〜14日後、細胞をPBSで3回洗浄し、氷冷メチレンブルー（50％EtOH中0.2％）で染色し、その後に流水下での洗浄、および5mm格子ホイルを用いてコロニー数をカウントする顕微鏡判定が続いた。

実施例13
CRISPR/Cas9媒介性編集に対するHRおよびNHEJ調節因子の影響の定量化
遺伝子編集の間に、RAD51刺激化合物1（RS-1）を適用して、相同組み換え（HR）を調節した。RS-1（Sigma Aldrich）をDMSO中に溶解して10mg/mlのストック溶液を作製し、それを細胞への適用直前にRPMI培地中に希釈した。生存率（Promega CTG）アッセイにより、MCF7に対して増殖阻害効果または毒性効果を与えない用量として、8μM RS-1の最終濃度が同定された（生存率：1μM-100％；3.7μM-100％；11μM-97％；33μM-61％）。

遺伝子編集の間に、DNAリガーゼIV阻害剤SCR7を適用して、非相同末端結合（NHEJ）を調節した。SCR7（Sigma）をDMSO中に溶解して10mg/mlのストック溶液を作製し、それを細胞への適用直前にRPMI培地中に希釈した。生存率（Promega CTG）アッセイにより、MCF7に対して増殖阻害効果または毒性効果を与えない用量として、1μMの最終濃度が同定された（生存率：0.37μM-100％；1.1μM-100％；3.3μM-97％；10μM-88％）。

「早期曝露」設定において、SCR7（1μM最終濃度）またはRS-1（8μM最終濃度）またはSCR7＋RS-1（1μM＋8μM最終濃度）を、遺伝子編集モジュールのトランスフェクションの4時間前にMCF7細胞に添加した。「後期曝露」に関しては、SCR7（8μM最終濃度）またはRS-1（1μM最終濃度）を、トランスフェクションの18時間後にMCF7細胞に添加した。両設定において、細胞を、トランスフェクションの96時間後まで調節因子に曝露し、すなわち「早期曝露」は合計100時間、「後期曝露」は合計78時間の処理からなった。

DNA修復調節因子の効果を判定するシステムは、DPH1 20mer gRNAとともにCRISPR/SpCas9モジュールからなり、以前の実施例に記載されるようにMCF7細胞にトランスフェクトされ、後続のDTおよびPM選択に供された。DTr、PMr、および二重耐性コロニーの頻度を記録して、遺伝子不活性化およびカセット組込み事象を反映させた。

実施例14
統計学
2つの処理間の単一比較のために、対応のない両側スチューデントのt検定を実施した。多重比較を、一元配置ANOVA、それに続くテューキーの正当に異なる有意性（honestly different significance）（HDS）事後検定によって統計的に解析した。有意差を、＜0.05のp値によって規定した。スチューデントのt検定によって判定される有意性のレベルは、p＜0.05、p＜0.01、およびp＜0.001に対応する1つ、2つ、または3つの星印によってグラフ中に表される。同じように、テューキーのHDS検定によって判定される有意性のレベルは、Λ、Φ、またはΨによって表される。

Claims (20)

1. 哺乳動物細胞のゲノム内への核酸の導入を判定するための方法であって、該哺乳動物細胞は、DPH1、DPH2、DPH4、および/またはDPH5遺伝子の1つまたは2つの転写的に活性なアレルを含み、該方法は、
   −導入すべき核酸と、抗生物質選択マーカーに対する耐性を付与する核酸と、DPH1、DPH2、DPH4、および/またはDPH5遺伝子の遺伝子編集に必要なエレメントとを含む1種のプラスミドを、哺乳動物細胞にトランスフェクトする工程、
   −トランスフェクトされた細胞をシュードモナス（pseudomonas）外毒素Aおよびジフテリア毒素からなる群より選択されるDPH遺伝子転写感受性毒素の存在下で培養する工程、
   −毒素耐性コロニーの数、抗生物質耐性コロニーの数、ならびに毒素および抗生物質耐性コロニーの数を決定する工程、
   −トランスフェクトされた細胞が該毒素の存在下で生存可能である場合、哺乳動物細胞のゲノム内への核酸の導入を判定する工程
   を含み、
   組込み事象（抗生物質耐性コロニーの数）と不活性化事象（毒素耐性コロニーの数）の比率の低い値は、同時に生じる不活性化事象に対する、非効率的な組込みを示し、当該比率の高い値は、標的部位におけるより効率的な組込みを示す、前記方法。
2. −導入すべき核酸と、抗生物質選択マーカーに対する耐性を付与する核酸と、DPH1、DPH2、DPH4、および/またはDPH5遺伝子の遺伝子編集に必要なエレメントとを含む1種のプラスミドを、哺乳動物細胞にトランスフェクトする工程、
   −トランスフェクトされた細胞を選択圧の非存在下で培養する工程、
   −培養物を少なくとも2つのアリコートに分ける、または培養物から少なくとも2つのサンプルを採取する工程、および
   −第一のアリコートまたはサンプルをシュードモナス（pseudomonas）外毒素Aおよびジフテリア毒素からなる群より選択されるDPH遺伝子転写感受性毒素の存在下で培養し、かつ第二のアリコートまたはサンプルを、対応する抗生物質選択マーカーの存在下で培養する工程
   を含む、請求項1記載の方法。
3. 哺乳動物細胞が大量の哺乳動物細胞であり、かつ前記方法が、前記毒素および/または前記抗生物質選択マーカーの存在下で細胞を培養する工程の直前に、
   −トランスフェクトされた大量の細胞からの細胞を、単一細胞として付着させる工程
   を含む、請求項1または2記載の方法。
4. 大量の哺乳動物細胞が、1000〜10,000,000個の細胞である、請求項3記載の方法。
5. 遺伝子編集の効率を判定するための、または遺伝子編集の特異性を判定するための、または遺伝子編集の効率および特異性を判定するための、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
6. ホモ接合型およびヘテロ接合型の遺伝子改変を判定するための、または部位特異的および非特異的な遺伝子破壊および組込みを判定するための、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
7. トランスフェクトされた細胞が前記毒素の存在下で生存可能である場合、核酸の導入は、哺乳動物細胞のゲノム内へのホモ接合型核酸導入であると示される、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
8. トランスフェクトされた細胞が前記毒素の存在下で生存不可能であるが前記抗生物質選択マーカーの存在下で生存可能である場合、核酸の導入は、哺乳動物細胞のゲノム内へのヘテロ接合型核酸導入であると示される、請求項1〜7のいずれか一項記載の方法。
9. DPH遺伝子不活性化および核酸組込み事象が、前記毒素および前記抗生物質選択マーカーによる選択と、任意で高解像度融解（HRM）PCRとの組み合わせによって定量化される、請求項1〜8のいずれか一項記載の方法。
10. 前記方法が、異なる遺伝子編集手法を評価するためのものであり、かつ
    −導入すべき核酸と、抗生物質選択マーカーに対する耐性を付与する核酸と、DPH1、DPH2、DPH4、および/またはDPH5遺伝子を編集するための第一の遺伝子手法に必要なエレメントとを含む1種のプラスミドを、哺乳動物細胞にトランスフェクトする工程、
    −トランスフェクトされた細胞を選択圧の非存在下で培養する工程、
    −培養物を少なくとも2つのアリコートに分ける、または培養物から少なくとも2つのサンプルを採取する工程、
    −第一のアリコートまたはサンプルを、シュードモナス（pseudomonas）外毒素Aおよびジフテリア毒素からなる群より選択されるDPH遺伝子転写感受性毒素の存在下で培養し、かつ第二のアリコートまたはサンプルを、対応する抗生物質選択マーカーの存在下で培養する工程、
    −試験すべきすべての遺伝子編集手法に対してこれらの工程を繰り返す工程、および
    −毒素耐性、抗生物質選択マーカー耐性、または二重耐性の頻度に基づき、異なる遺伝子編集手法をランク付けする工程
    を含む、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
11. 標的遺伝子の全アレルの不活性化の頻度が、毒素耐性コロニーをカウントすることによって検出される、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法。
12. 標的遺伝子の一方のアレルの不活性化が、HRM-PCRによって二相融解曲線の存在により検出される、請求項1〜11のいずれか一項記載の方法。
13. HRM-PCRが、培養細胞に対して直接実施される、請求項12記載の方法。
14. CRISPR/Cas9による標的遺伝子の全アレルの不活性化の頻度が、HRM-PCRによって決定される二相融解曲線と組み合わせて、毒素耐性コロニーをカウントすることによって検出される、請求項1〜13のいずれか一項記載の方法。
15. 前記方法が、核酸のCRISPR/Cas9標的組込みのためのガイドRNAを選択するためのものであり、大量の異なるガイドRNAを提供する工程、および組込み事象（抗生物質耐性コロニーの数）と不活性化事象（毒素耐性コロニーの数）の最も高い比率を有するガイドRNAを選択する工程を含む、請求項1〜14のいずれか一項記載の方法。
16. 遺伝子編集手法が、CRISPR/Cas、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、およびTALENからなる群より選択される、請求項1〜15のいずれか一項記載の方法。
17. CRISPR/Cas9または ZFNまたはTALENまたは他の遺伝子編集モジュールまたはこれらの変異型または変種を同定/選択するための方法であって、
    −1つまたは複数の遺伝子編集モジュールの大量の変種を提供する/調製する工程、
    −請求項1〜16のいずれか一項記載の方法を用いて、組込み事象（抗生物質耐性コロニーの数）および不活性化事象（毒素耐性コロニーの数）の効率および/または組込み事象（抗生物質耐性コロニーの数）と不活性化事象（毒素耐性コロニーの数）の最も高い比率を判定する工程、ならびに
    −最も高い効率および/または最も高い比率を有する変種を同定する/選択する工程
    を含む、前記方法。
18. 遺伝子編集モジュール/手法の効率または特異性を改変する、増大させるまたは低下させる化合物または化合物組み合わせを選択するための方法であって、
    −1種もしくは複数種の化合物または1組もしくは複数組の化合物組み合わせを提供する工程、
    −該化合物または化合物組み合わせの非存在下で、請求項1〜16のいずれか一項記載の方法を用いて、組込み事象（抗生物質耐性コロニーの数）および不活性化事象（毒素耐性コロニーの数）の効率および/または組込み事象（抗生物質耐性コロニーの数）と不活性化事象（毒素耐性コロニーの数）の比率を、任意で判定する工程、
    −該化合物または化合物組み合わせの存在下で、請求項1〜16のいずれか一項記載の方法を用いて、組込み事象（抗生物質耐性コロニーの数）および不活性化事象（毒素耐性コロニーの数）の効率および/または組込み事象（抗生物質耐性コロニーの数）と不活性化事象（毒素耐性コロニーの数）の比率を、該化合物または化合物組み合わせのそれぞれに対して別個に/個々に判定する工程、
    −該化合物または化合物組み合わせの非存在下で実施された請求項1〜16のいずれか一項記載の方法による効率および/または比率とは異なる効率および/または比率を有する少なくとも1種の化合物または少なくとも1組の化合物組み合わせを同定する/選択する工程
    を含む、前記方法。
19. 増殖阻害または毒性を最小限に抑えつつ遺伝子編集手法の効率または特異性を増大させる化合物濃度およびその添加の時点を決定するための方法であって、
    −1種もしくは複数種の化合物または1組もしくは複数組の化合物組み合わせを提供する工程、
    −該化合物または化合物組み合わせの非存在下で、請求項1〜16のいずれか一項記載の方法を用いて、組込み事象（抗生物質耐性コロニーの数）および不活性化事象（毒素耐性コロニーの数）の効率および/または組込み事象（抗生物質耐性コロニーの数）と不活性化事象（毒素耐性コロニーの数）の比率を、任意で判定する工程、
    −異なる濃度および/または異なる添加の時点における該化合物または化合物組み合わせの存在下で、請求項1〜16のいずれか一項記載の方法を用いて、組込み事象（抗生物質耐性コロニーの数）および不活性化事象（毒素耐性コロニーの数）の効率および/または組込み事象（抗生物質耐性コロニーの数）と不活性化事象（毒素耐性コロニーの数）の比率を、該化合物または化合物組み合わせのそれぞれに対して別個に/個々に判定する工程、
    −該化合物または化合物組み合わせの非存在下で実施された請求項1〜16のいずれか一項記載の方法によるものよりも高い効率および/または高い比率を有する濃度および/または添加の時点を、少なくとも1種の化合物または少なくとも1組の化合物組み合わせのそれぞれに対して同定する/選択する工程
    を含む、前記方法。
20. 同定する/選択する工程が、最も高い効率および/または最も高い比率を有する化合物についてである、請求項18〜19のいずれか一項記載の方法。

Images