JP6829761B2 - 遺伝子編集モジュールおよび遺伝子送達アプローチを解析および最適化するための方法 - Google Patents
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Description
生体系および生物を操作する技術は、基礎科学、医学、およびバイオテクノロジーに不可欠である(Ran, et al. 2013)。ここ数年間で、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)(Miller, et al. 2007;Sander, et al. 2011;Wood, et al. 2011)、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)(Hockemeyer, et al. 2011;Sanjana, et al. 2012;Wood, et al. 2011;Zhang, et al. 2011)、およびRNAガイドCRISPR/Cas9ヌクレアーゼシステム(Cho, et al. 2013;Cong, et al. 2013;Makarova, et al. 2011;Ran, et al. 2013)を含めた、いくつかのゲノム編集技術が生まれている。CRISPR/Cas9ヌクレアーゼシステムは、標的DNA配列に相補的である20個のヌクレオチドを含有する小さなRNAによってガイドされる(Fu, et al. 2014)。TALENおよびZFNとは対照的に、CRISPR/Cas9システムは、多様な細胞タイプおよび生物に対するハイスループットでかつ多重化された遺伝子編集を設計するのがより容易であり、そのような遺伝子編集に有効であり、よく適していると言われる(Ran, et al. 2013)。さらには、遺伝子編集技術は、トランスジェニック動物(キイロショウジョウバエ(drosophila melanogaster)、ゼブラフィッシュ、マウス、ラット、およびウサギ)の作製のための、細胞株、初代細胞(体性幹細胞および多能性幹細胞)、および受精卵母細胞などにおける、遺伝学が動機となったツールに不可欠である(McMahon, et al. 2012;Urnov, et al. 2010)。治療的ゲノム編集の最初の適用は、HIV患者の自己CD4 T細胞におけるCCR5であり、それは臨床に入った(Gori, et al. 2015;Tebas, et al. 2014)。この適用を超えて、遺伝子編集は、前臨床レベルにおけるならびに第1相臨床試験における多種多様の疾患において適用が成功している(Cox, et al. 2015;Holt, et al. 2010;Li, et al. 2011;Perez, et al. 2008;Tebas, et al. 2014;Yin, et al. 2014)。ゲノム編集に基づく療法を達成するメカニズムは、有害な変異の修正または不活性化、保護的変異の導入、治療用導入遺伝子の付加、およびウイルスDNAの破壊である(Cox, et al. 2015)。それゆえ、CRISPR/Cas9技術を用いるものを含めた遺伝子編集アプローチは、種々の疾患に対する全く新しいクラスの治療法を生じさせ得る。
−導入すべき核酸とDPH遺伝子の遺伝子編集に必要なエレメントとを含む1種または複数種のプラスミドを、哺乳動物細胞にトランスフェクトする工程、
−トランスフェクトされた細胞をDPH遺伝子転写感受性毒素の存在下で培養する工程、
−トランスフェクトされた細胞が毒素の存在下で生存可能である場合、哺乳動物細胞のゲノム内への核酸の導入を判定する工程
を含む。
−導入すべき核酸と、選択マーカーに対する耐性を付与する核酸と、DPH遺伝子の遺伝子編集に必要なエレメントとを含む1種または複数種のプラスミドを、哺乳動物細胞にトランスフェクトする工程、
−トランスフェクトされた細胞を選択圧の非存在下で培養する工程、
−培養物を少なくとも2つのアリコートに分ける、または培養物から少なくとも2つのサンプルを採取する工程、および
−第一のアリコートまたはサンプルを、DPH遺伝子転写感受性毒素の存在下で培養し、かつ第二のアリコートまたはサンプルを、対応する選択マーカーの存在下で培養する工程
を含む。
−トランスフェクトされた大量の細胞からの細胞を、単一細胞として付着させる工程
を含む。
−導入すべき核酸と、選択マーカーに対する耐性を付与する核酸と、DPH遺伝子を編集するための第一の遺伝子編集手法に必要なエレメントとを含む1種または複数種のプラスミドを、哺乳動物細胞にトランスフェクトする工程、
−トランスフェクトされた細胞を選択圧の非存在下で培養する工程、
−培養物を少なくとも2つのアリコートに分ける、または培養物から少なくとも2つのサンプルを採取する工程、
−第一のアリコートまたはサンプルを、DPH遺伝子発現依存性毒素の存在下で培養し、かつ第二のアリコートまたはサンプルを、対応する選択マーカーの存在下で培養する工程、
−試験すべきすべての遺伝子編集手法に対してこれらの工程を繰り返す工程、および
−毒素耐性、選択マーカー耐性、または二重耐性の頻度に基づき、異なる遺伝子編集手法をランク付けする工程
を含む。
−1つまたは複数の遺伝子編集モジュールの大量の変種を提供する/調製する工程、
−本明細書において報告される方法を用いて、組込み事象(抗生物質耐性コロニーの数)および不活性化事象(毒素耐性コロニーの数)の効率および/または組込み事象(抗生物質耐性コロニーの数)と不活性化事象(毒素耐性コロニーの数)の最も高い比率を判定する工程、ならびに
−最も高い効率および/または最も高い比率を有する変種を同定する/選択する工程
を含む。
−1種もしくは複数種の化合物または1組もしくは複数組の化合物組み合わせを提供する工程、
−該化合物または化合物組み合わせの非存在下で、本明細書において報告される方法を用いて、組込み事象(抗生物質耐性コロニーの数)および不活性化事象(毒素耐性コロニーの数)の効率および/または組込み事象(抗生物質耐性コロニーの数)と不活性化事象(毒素耐性コロニーの数)の比率を、任意で判定する工程、
−該化合物または化合物組み合わせの存在下で、本明細書において報告される方法を用いて、組込み事象(抗生物質耐性コロニーの数)および不活性化事象(毒素耐性コロニーの数)の効率および/または組込み事象(抗生物質耐性コロニーの数)と不活性化事象(毒素耐性コロニーの数)の比率を、該化合物または化合物組み合わせのそれぞれに対して別個に/個々に判定する工程、
−該化合物または化合物組み合わせの非存在下で実施された本明細書において報告される方法による効率および/または比率とは異なる効率および/または比率を有する少なくとも1種の化合物または少なくとも1組の化合物組み合わせを同定する/選択する工程
を含む。
−1種もしくは複数種の化合物または1組もしくは複数組の化合物組み合わせを提供する工程、
−該化合物または化合物組み合わせの非存在下で、本明細書において報告される方法を用いて、組込み事象(抗生物質耐性コロニーの数)および不活性化事象(毒素耐性コロニーの数)の効率および/または組込み事象(抗生物質耐性コロニーの数)と不活性化事象(毒素耐性コロニーの数)の比率を、任意で判定する工程、
−異なる濃度および/または異なる添加の時点における該化合物または化合物組み合わせの存在下で、本明細書において報告される方法を用いて、組込み事象(抗生物質耐性コロニーの数)および不活性化事象(毒素耐性コロニーの数)の効率および/または組込み事象(抗生物質耐性コロニーの数)と不活性化事象(毒素耐性コロニーの数)の比率を、該化合物または化合物組み合わせのそれぞれに対して別個に/個々に判定する工程、
−該化合物または化合物組み合わせの非存在下で実施された本明細書において報告される方法によるものよりも高い効率および/または高い比率を有する濃度および/または添加の時点を、少なくとも1種の化合物または少なくとも1組の化合物組み合わせのそれぞれに対して同定する/選択する工程
を含む。
[本発明1001]
哺乳動物細胞のゲノム内への核酸の導入を判定するための方法であって、該哺乳動物細胞は、DPH1、DPH2、DPH4、および/またはDPH5遺伝子の1つまたは2つの転写的に活性なアレルを含み、該方法は、
−導入すべき核酸とDPH遺伝子の遺伝子編集に必要なエレメントとを含む1種または複数種のプラスミドを、哺乳動物細胞にトランスフェクトする工程、
−トランスフェクトされた細胞をDPH遺伝子転写感受性毒素の存在下で培養する工程、
−トランスフェクトされた細胞が該毒素の存在下で生存可能である場合、哺乳動物細胞のゲノム内への核酸の導入を判定する工程
を含む、前記方法。
[本発明1002]
DPH遺伝子転写感受性毒素が、シュードモナス(pseudomonas)外毒素およびジフテリア毒素からなる群より選択される、本発明1001の方法。
[本発明1003]
−導入すべき核酸と、選択マーカーに対する耐性を付与する核酸と、DPH遺伝子の遺伝子編集に必要なエレメントとを含む1種または複数種のプラスミドを、哺乳動物細胞にトランスフェクトする工程、
−トランスフェクトされた細胞を選択圧の非存在下で培養する工程、
−培養物を少なくとも2つのアリコートに分ける、または培養物から少なくとも2つのサンプルを採取する工程、および
−第一のアリコートまたはサンプルを、DPH遺伝子転写感受性毒素の存在下で培養し、かつ第二のアリコートまたはサンプルを、対応する選択マーカーの存在下で培養する工程
を含む、本発明1001〜1002のいずれかの方法。
[本発明1004]
哺乳動物細胞が大量の哺乳動物細胞であり、かつ前記方法が、前記毒素および/または前記選択マーカーの存在下で細胞を培養する工程の直前に、
−トランスフェクトされた大量の細胞からの細胞を、単一細胞として付着させる工程
を含む、本発明1001〜1003のいずれかの方法。
[本発明1005]
大量の哺乳動物細胞が、1000〜10,000,000個の細胞である、本発明1004の方法。
[本発明1006]
遺伝子編集の効率を判定するための、または遺伝子編集の特異性を判定するための、または遺伝子編集の効率および特異性を判定するための、本発明1001〜1005のいずれかの方法。
[本発明1007]
ホモ接合型およびヘテロ接合型の遺伝子改変を判定するための、または部位特異的および非特異的な遺伝子破壊および組込みを判定するための、本発明1001〜1006のいずれかの方法。
[本発明1008]
トランスフェクトされた細胞が前記毒素の存在下で生存可能である場合、核酸の導入は、哺乳動物細胞のゲノム内へのホモ接合型核酸導入である、本発明1001〜1007のいずれかの方法。
[本発明1009]
トランスフェクトされた細胞が前記毒素の存在下で生存不可能であるが前記選択マーカーの存在下で生存可能である場合、核酸の導入は、哺乳動物細胞のゲノム内へのヘテロ接合型核酸導入である、本発明1001〜1008のいずれかの方法。
[本発明1010]
DPH遺伝子不活性化および核酸組込み事象が、毒素および選択マーカーによる選択と、任意で高解像度融解(HRM)PCRとの組み合わせによって定量化される、本発明1001〜1009のいずれかの方法。
[本発明1011]
前記方法が、異なる遺伝子編集手法を評価するためのものであり、かつ
−導入すべき核酸と、選択マーカーに対する耐性を付与する核酸と、DPH遺伝子を編集するための第一の遺伝子手法に必要なエレメントとを含む1種または複数種のプラスミドを、哺乳動物細胞にトランスフェクトする工程、
−トランスフェクトされた細胞を選択圧の非存在下で培養する工程、
−培養物を少なくとも2つのアリコートに分ける、または培養物から少なくとも2つのサンプルを採取する工程、
−第一のアリコートまたはサンプルを、DPH遺伝子転写感受性毒素の存在下で培養し、かつ第二のアリコートまたはサンプルを、対応する選択マーカーの存在下で培養する工程、
−試験すべきすべての遺伝子編集手法に対してこれらの工程を繰り返す工程、および
−毒素耐性、選択マーカー耐性、または二重耐性の頻度に基づき、異なる遺伝子編集手法をランク付けする工程
を含む、本発明1001〜1010のいずれかの方法。
[本発明1012]
標的遺伝子の全アレルの不活性化の頻度が、毒素耐性コロニーをカウントすることによって検出される、本発明1001〜1011のいずれかの方法。
[本発明1013]
標的遺伝子の一方のアレルの不活性化が、HRM-PCRによって二相融解曲線の存在により検出される、本発明1001〜1012のいずれかの方法。
[本発明1014]
HRM-PCRが、培養細胞に対して直接実施される、本発明1013の方法。
[本発明1015]
CRISPR/Cas9による標的遺伝子の全アレルの不活性化の頻度が、HRM-PCRによって決定される二相融解曲線と組み合わせて、毒素耐性コロニーをカウントすることによって検出される、本発明1001〜1014のいずれかの方法。
[本発明1016]
DPH遺伝子が、DPH1遺伝子、DPH2遺伝子、DPH4遺伝子、およびDPH5遺伝子からなる群より選択される、本発明1001〜1015のいずれかの方法。
[本発明1017]
前記方法が、毒素耐性コロニーの数、抗生物質耐性コロニーの数、ならびに毒素および抗生物質耐性コロニーの数を決定する工程を含み、ここで、組込み事象(抗生物質耐性コロニーの数)と不活性化事象(毒素耐性コロニーの数)の比率は、前記手法の特異性を反映する、本発明1001〜1016のいずれかの方法。
[本発明1018]
前記方法が、核酸のCRISPR/Cas9標的組込みのためのガイドRNAを選択するためのものであり、大量の異なるガイドRNAを提供する工程、および組込み事象(抗生物質耐性コロニーの数)と不活性化事象(毒素耐性コロニーの数)の最も高い比率を有するガイドRNAを選択する工程を含む、本発明1001〜1017のいずれかの方法。
[本発明1019]
遺伝子編集手法が、CRISPR/Cas、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、およびTALENからなる群より選択される、本発明1001〜1018のいずれかの方法。
[本発明1020]
CRISPR/Cas9または ZFNまたはTALENまたは他の遺伝子編集モジュール(の変異型または変種)を同定/選択するための方法であって、
−1つまたは複数の遺伝子編集モジュールの大量の変種を提供する/調製する工程、
−本発明1001〜1019のいずれかの方法を用いて、組込み事象(抗生物質耐性コロニーの数)および不活性化事象(毒素耐性コロニーの数)の効率および/または組込み事象(抗生物質耐性コロニーの数)と不活性化事象(毒素耐性コロニーの数)の最も高い比率を判定する工程、ならびに
−最も高い効率および/または最も高い比率を有する変種を同定する/選択する工程
を含む、前記方法。
[本発明1021]
遺伝子編集モジュール/手法の効率または特異性を改変する(増大または低下させる)化合物または化合物組み合わせを選択するための方法であって、
−1種もしくは複数種の化合物または1組もしくは複数組の化合物組み合わせを提供する工程、
−該化合物または化合物組み合わせの非存在下で、本発明1001〜1019のいずれかの方法を用いて、組込み事象(抗生物質耐性コロニーの数)および不活性化事象(毒素耐性コロニーの数)の効率および/または組込み事象(抗生物質耐性コロニーの数)と不活性化事象(毒素耐性コロニーの数)の比率を、任意で判定する工程、
−該化合物または化合物組み合わせの存在下で、本発明1001〜1019のいずれかの方法を用いて、組込み事象(抗生物質耐性コロニーの数)および不活性化事象(毒素耐性コロニーの数)の効率および/または組込み事象(抗生物質耐性コロニーの数)と不活性化事象(毒素耐性コロニーの数)の比率を、該化合物または化合物組み合わせのそれぞれに対して別個に/個々に判定する工程、
−該化合物または化合物組み合わせの非存在下で実施された本明細書において報告される方法による効率および/または比率とは異なる効率および/または比率を有する少なくとも1種の化合物または少なくとも1組の化合物組み合わせを同定する/選択する工程
を含む、前記方法。
[本発明1022]
増殖阻害または毒性を最小限に抑えつつ遺伝子編集手法の効率または特異性を増大させる化合物濃度およびその添加の時点を決定するための方法であって、
−1種もしくは複数種の化合物または1組もしくは複数組の化合物組み合わせを提供する工程、
−該化合物または化合物組み合わせの非存在下で、本発明1001〜1019のいずれかの方法を用いて、組込み事象(抗生物質耐性コロニーの数)および不活性化事象(毒素耐性コロニーの数)の効率および/または組込み事象(抗生物質耐性コロニーの数)と不活性化事象(毒素耐性コロニーの数)の比率を、任意で判定する工程、
−異なる濃度および/または異なる添加の時点における該化合物または化合物組み合わせの存在下で、本発明1001〜1019のいずれかの方法を用いて、組込み事象(抗生物質耐性コロニーの数)および不活性化事象(毒素耐性コロニーの数)の効率および/または組込み事象(抗生物質耐性コロニーの数)と不活性化事象(毒素耐性コロニーの数)の比率を、該化合物または化合物組み合わせのそれぞれに対して別個に/個々に判定する工程、
−該化合物または化合物組み合わせの非存在下で実施された本明細書において報告される方法によるものよりも高い効率および/または高い比率を有する濃度および/または添加の時点を、少なくとも1種の化合物または少なくとも1組の化合物組み合わせのそれぞれに対して同定する/選択する工程
を含む、前記方法。
[本発明1023]
同定する/選択する工程が、最も高い効率および/または最も高い比率を有する化合物についてである、本発明1021〜1022のいずれかの方法。
定義
本明細書においておよび添付の特許請求の範囲において使用するとき、「1つの(a)」、「1つの(an)」、および「その(the)」という単数形は、文脈で別様に明確に述べられていない限り、複数形の指示対象(reference)を含むことに留意すべきである。ゆえに、例えば、「1つの細胞(a cell)」への言及は、複数のそのような細胞および当業者に公知のその同等物などを含む。同様に、「1つの(a)」(または「1つの(an)」)、「1つまたは複数の」、および「少なくとも1つの」という用語は、本明細書において互換可能に用いられ得る。
遺伝子編集を最適化するための必要条件は、ヘテロ接合型の遺伝子不活性化事象およびホモ接合型の遺伝子不活性化事象、ならびに非特異的組込み事象および標的組込み事象についての確実でかつ堅牢な検出および区別である。表現型の挿入(例えば、薬物耐性)もしくは欠如(遺伝子不活性化)によって引き起こされる表現型の判定、またはシーケンシングアプローチなどの既存の方法は、ホモ接合型の不活性化とヘテロ接合型の不活性化を区別しないことが多い。さらに、既存の技術は、個々の細胞の遺伝子組成に対処することは滅多にない、または堅牢な統計解析を可能にする多数の個々の遺伝子編集された細胞に基づくわけではない。
Stahl, S., et al.(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 112 (2015) 10732-10737)は、真核生物翻訳伸長因子2(eEF2)が高度に保存されたタンパク質であり、タンパク質生合成に不可欠であることを報告した。ヒトeEF2のHis715における(または、他の種における対応する箇所における)ジフタミド修飾は、すべての真核生物においておよび古細菌対応物において保存されている。それは、いくつかの遺伝子によってコードされるタンパク質によって生成される。ジフタミド生合成タンパク質1(DPH1)、DPH2、DPH3、およびDPH4(DNAJC24)によってコードされるタンパク質は、3-アミノ-3-カルボキシプロピル(ACP)基をeEF2に付着させる。この中間体は、メチル-トランスフェラーゼDPH5によってジフチンに変換され、それはその後、DPH6およびDPH7によってジフタミドにアミド化される。
CRISPR/Cas(CRISPR関連)システム:クラスター化した規則的にスペーサーが入った短い回文型リピート(clustered regulatory interspaced short palindromic repeat)は、複数の短いダイレクトリピートを含有し、細菌および古細菌に獲得免疫を提供する遺伝子座である。CRISPRシステムは、侵入する外来DNAの配列特異的サイレンシングをcrRNAおよびtracrRNAに頼る。3つのタイプのCRISPR/Casシステムが存在し:II型システムにおいて、Cas9は、crRNA-tracrRNA標的認識があるとDNAを切断するRNAガイドDNAエンドヌクレアーゼとして働く。
多種多様の細胞タイプおよび生物における事実上任意の遺伝子の操作を可能にするアプローチが、過去数十年の間に進化している。「ゲノム編集」と一般に称されるこのコア技術は、非特異的DNA切断モジュールに融合した配列特異的DNA結合ドメインから構成される操作されたヌクレアーゼの使用に基づく。これらのキメラヌクレアーゼは、エラーを起こしやすい非相同末端結合(NHEJ)および相同性修復(HDR)を含めた細胞DNA修復メカニズムを刺激する標的DNA二本鎖断裂(DSB)を誘導することによって、効率的でかつ正確な遺伝子改変を可能にする。このアプローチの汎用性は、DNA結合ドメインのプログラム可能性によって促される。
FokIエンドヌクレアーゼの非特異的切断ドメイン(N)とジンクフィンガータンパク質(ZFP)とを結び付けたジンクフィンガーヌクレアーゼは、ゲノムに部位特異的二本鎖断裂(DSB)をもたらす一般的なやり方を与える。
FokIヌクレアーゼへの、植物病原性キサントモナス(Xanthomonas)種の転写活性化因子様(TAL)エフェクターの融合体であるTALENは、対になってDNAに結合しかつ切断する。結合特異性は、TALエフェクターにおける多形アミノ酸リピートのカスタマイズ可能なアレイによって決定される。
天然に存在するCRISPR/Cas II型システムは、真核細胞のための強力な遺伝子編集ツールに発展している。特に、crRNAおよびtracrRNAを単一ガイドRNA(sgRNA)に統合し得るという実証は、この発展への道を開いた。Cas9は、遺伝子編集ツールの重要な特質である、DNAにおける単一二本鎖断裂をもたらす。方法は、真核細胞におけるDNA修復経路を活用して、遺伝子変更を加える2つのやり方を提供する。第一のものは非相同末端結合(NHEJ)に頼り、それは切られた末端を結び合わせるが、該過程において数個の塩基をしばしば欠失させ、それにより遺伝子産物の機能が損なれ得る、またはそれを不活性化するフレームシフトを引き起こす。第二のものでは、相同性修復(HDR)を用いて、標的との相同性を有するDNAの別の一片を用いて、損傷したアレルを修復する。組み換えにより挿入され得るDNAエレメントを提供することによって、配列における任意のタイプの挿入、欠失、または変化が達成され得る。主な限定は、標的に隣接したPAMの必要性である。Cas9が意図されない標的と相互作用する場合のオフターゲット効果は、予測および防止のためのストラテジーを要する懸案事項である(Rath, D., et al., Biochim. 117 (2015) 119-128)。
Liew, M., et al.(Clinical Chemistry 50 (2004) 1156-1164)は、ホモおよびヘテロ接合体を判定するためのわずかなアンプリコンについての高解像度融解法を報告した。ヘテロ二重鎖は融解曲線の形状を変更するため、ヘテロ接合体は容易に同定された。未知のサンプルに15%の公知のホモ接合遺伝子型を加えることにより、3つすべての遺伝子型の融解曲線分離が可能となる。
遺伝子編集技術は、細胞(細胞株)または生物という遺伝子改変ツールの作製に必要とされる。ルーチン的適用に適切であるために、該技術は、高い特異性および高い効率、しかし同時に低レベルの非標的遺伝子改変、すなわち副反応を有する必要がある。
本明細書において報告される方法を、例示的な配列および標的を用いて以下に例示する。これは、本発明の限定として扱われるものではない。それは、大量の代替手段、すなわち具体的な態様の1つとして、および本明細書において報告される方法が機能することの証拠として単に提供されるにすぎない。
ジフテリア毒素耐性アッセイおよびHRM-PCRは、ホモ接合型およびヘテロ接合型のDPH1遺伝子不活性化を定量化しかつ区別する
ジフテリア毒素(DT)は、ジフタミドをADPリボシル化し、それによって真核生物翻訳伸長因子2(eEF2)を不活性化する。これは、タンパク質合成を不可逆的に失速させ、細胞を殺傷する(Weidle et al.)。ジフタミドは、ジフタミド合成遺伝子によりコードされる酵素、それらの中でもDPH1による、eEF2上に置かれたヒスチジン修飾体である。MCF7細胞におけるDPH1の完全な不活性化は、毒素標的ジフタミドの合成を妨げる。これは、細胞をDTに対して耐性にする(Stahl et al.)。その結果、DPH1の全コピーの不活性化は、「DT耐性」(DTr)という表現型を生み出す。この表現型の頻度は、毒素耐性コロニーをカウントすることによって堅牢な様式で検出され得る(図3を参照されたい)。
本実施例において用いられるCRISPR/Cas9ドナープラスミドの組込みカセットによってコードされるピューロマイシン-N-アセチル-トランスフェラーゼ(PAC)は、ピューロマイシン(PM)を不活性化し、改変細胞をPM耐性にする(Vara et al.)。ゆえに、PAC組込みは、DTrコロニーに関して記載されるのと同じ様式で、PM耐性アッセイによって検出されおよび定量化される(選択剤としてDTの代わりにPMを適用する、図3B)。特異的でかつホモ接合型の標的遺伝子不活性化からのみ生じるDTrとは対照的に、PMrは、組込みの箇所とは無関係に生じる。部位特異的対非(部位)特異的な組込みの頻度は、1つの態様にあるように、二重耐性コロニー(DTr+PMr)とPMrコロニーとを比較することによって対処される。
標的特異的な不活性化、組込み、および非標的組込みの頻度を比較するために、DPH1特異的CRISPR/Cas9モジュールをコードするプラスミド(配列に関しては、図1を参照されたい)を、MCF7細胞内にトランスフェクトした。その後、これらをHRM-PCRに、ならびにDT耐性およびPM耐性を検出するコロニーカウントアッセイに供した。これらのアッセイの結果は図5に要約されており、個々のデータセットは以下の表に示されている。図5Aは、全DPH1アレルの機能喪失を表すDPH1遺伝子の完全な不活性化が、全てのトランスフェクト細胞の約6%の頻度で生じたことを示している(40%のトランスフェクション効率を考慮すると全細胞の2.5%、下記の最初の表を参照されたい)。DPH1不活性化は、合致するgRNA配列への絶対的な依存性を示し、スクランブル対照RNA(scRNA)は、いかなるDTrコロニーも生み出さなかった。HRMにより同定されたクローンの頻度とDTrコロニーの出現率との比較が、図5Bに示されている。これらの解析により、単一アレル遺伝子不活性化(HRMにより裏付けられる毒素感受性)は、両アレルの不活性化(DTr細胞)の2倍の頻度で生じることが明らかになった。
「TF eff.」:トランスフェクション効率は、GFPレポータープラスミドによるMCF7のトランスフェクションがあった場合の蛍光細胞の頻度をモニターするFACS解析によって判定された。全細胞中のGFP陽性細胞の相対数が%で列挙されている。*これらのアッセイの1つは、異常に高いGFP陽性および異常なFACSパターンを呈した。全アッセイ間の平均トランスフェクション効率は30〜40%であった。「HRM」:高解像度融点PCR陽性細胞は、野生型細胞と比較して、明らかに分岐する(二相の)融解曲線パターンを呈するものとして定義される。「K.O.」は、機能的DPH1またはDPH2遺伝子コピーを所持せず、それゆえDTに対して耐性である細胞の頻度を表す。「Int.」は、PAC発現カセットを持ち、それゆえPMに対して耐性である細胞の頻度を表す。「A〜D」は、独立した実験の個々のサンプルを表す。
「TF eff.」:トランスフェクション効率は、GFPレポータープラスミドによるMCF7のトランスフェクションがあった場合の蛍光細胞の頻度をモニターするFACS解析によって判定された。全細胞中のGFP陽性細胞の相対数が%で列挙されている。機能的DPH1遺伝子コピーを所持しない細胞は、DTに対して耐性である。PAC発現カセットを持つ細胞は、それゆえPMに対して耐性である。「A〜D」は、独立した(四つ組の)実験の個々のサンプルを表す。
上記で概説される同一のアプローチを、異なる遺伝子DPH2遺伝子とも用いた。つまり、DPH2遺伝子のCas9誘導性改変を実施した。これを行って、本明細書において報告される方法の一般的適用性を示した。
上記で示されるように、本明細書において報告される方法は、遺伝子改変モジュールの組成の一般的効果に対処し得る。
本明細書において報告される方法を用いて、RNAガイドCas9ならびにZFN媒介性遺伝子編集の種々の変種についての遺伝子不活性化および組込み事象、効力および特異性を比較した。
(i)「SpCAS9」は、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)由来のCas9ヌクレアーゼを指定し、それは現在の標準的適用と見なされ得る(例えば、Ran et al. 2013、Fu et al. 2014を参照されたい);
(ii)SpCas9-HF1は、非特異的DNA結合の低下、オフターゲット活性の低下を有し、それゆえ提案されるより高い忠実度および特異性を有する、SpCas9の操作された変種である(Kleinstiver et al.);
(iii)設計されたジンクフィンガー媒介性タンパク質-核酸相互作用によって標的配列を認識する、ZFN媒介性編集モジュール(Miller et al. 2011、Urnov et al.)。
MCF-7細胞に、種々のゲノム編集システム(SpCas9、SpCas9、ZFN)をコードするプラスミドをトランスフェクトした。SpCas9構築物は、前に記載されるとおりであった。SpCas9-HFは、Kleinstiver et al.(Kleinstiver et al. 2016)に従って、N497A/R661A/Q695A/Q926A置換を含む。並行して、gRNAを並行してscRNAによって置き換えて、非特異的活性に対処した。DPH1特異的ZFNを、Sigma Aldrichから得た(CompoZr(登録商標))。3*106個の細胞の初回細胞プールのトランスフェクションに対するプラスミドDNA(編集物質およびドナー)の総量は、以前の実験に関して記載されるとおりであった。トランスフェクション効率(TF eff.(%))を定量化するために、GFPレポータープラスミドを別としてトランスフェクトした。GFP陽性細胞を、トランスフェクションの24時間後にFACSによってカウントした。規定数の細胞を播種し(播種細胞数)、その後DT、PM、またはDT+PMで72時間処理した。
遺伝子不活性化およびカセット組込みの最も高い値が、CRISPR/SpCas9に対して決定された。
CRISPR/SpCas9-HFは、標的遺伝子不活性化事象を、CRISPR/SpCas9と比較して、20%未満のDTrコロニーの数に減らした。PMr(組込み)およびDT-PM二重耐性コロニーの頻度(標的遺伝子不活性化を伴う組込み)も低下した。
ZFNモジュールは、その他の点では同一の条件下で、DTrコロニーの数を、CRISPR/SpCas9を用いて観察された事象の60%未満に低下させた。ゆえに、ZFN標的不活性化の効力は、SpCAS9と比較して約2倍低下し、操作されたSpCas9-HF1のものより約2〜3倍優れていた。PMrコロニー頻度は、CRISPR/SpCas9とZFNとの間で有意に異ならなかった。二重耐性コロニー(同時の遺伝子不活性化を伴うカセット組込み)は、CRISPR/SpCas9と比較して、ZFNを用いていくらか(30%)低下した。
本明細書において報告される方法(DPH遺伝子編集があった場合のDTrおよびPMr細胞を判定するコロニーアッセイを含む)を用いて、DNA修復を調節する化合物の影響にも対処し得る。
SpCas9媒介性DPH1編集のためのプラスミドがトランスフェクトされた細胞を、規定数(播種細胞数)で播種した。DT/PM選択を、トランスフェクションの72時間後に開始した。値(w、x、y、z)は、四つ組の個々の実験において得られたコロニーを表す。化合物(RS-1、SCR7、およびRS-1+SCR7)添加の時点の影響。処理サンプル対化合物なしについての、DT耐性コロニーに対するPM耐性の有意差は、*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001で表されている。
本明細書において報告される方法は、DTまたはシュードモナス外毒素Aまたはコリックス毒素などの致死性eEF2不活性化毒素に対する感受性を付与する、細胞遺伝子の、編集に基づく不活性化に基づく。これらのアッセイの読み取りは、そのようなADPリボシル化毒素に対して耐性がある細胞の「コロニーカウント」である。
ゲノム編集は、科学的適用に最も重要な技術として浮上している。しかしながら、その全潜在性は、現在適用されている編集アプローチの効力および特異性の問題によって依然として限定されている。本明細書において報告される方法は、編集により与えられた遺伝子不活性化および挿入の効力および特異性についての簡便でかつ堅牢な定量化および比較を可能にする。それは、多数の個々の細胞に基づき、ヘテロ接合型の遺伝子不活性化事象およびホモ接合型の遺伝子不活性化事象、ならびに非特異的組込み事象対標的組込み事象についての的確な判定を可能にする。この方法によってもたらされた学習およびパラメーターは、遺伝子編集の科学を向上させ得るだけでなく、遺伝子編集を発展させるおよび最適化するために特に重要でもあり得る。
MCF7細胞の培養、および遺伝子編集物質をコードするプラスミドのトランスフェクション
MCF7細胞(Brooks, et al. 1973)をもともとATCCから得(その後、社内細胞バンクにおいて増殖させた)、10%FCS、2mM L-グルタミン、およびペニシリン/ストレプトマイシンを補充したRPMI 1641培地中で37℃および85%湿度で維持した。遺伝子編集モジュールを持つプラスミドのトランスフェクションに関しては、3,000,000個の細胞を直径10cmの培養ディッシュに播種し、37℃および加湿された5%CO2で培養した。播種の24時間後、メーカーのプロトコールに従い、しかし6:1のN/P比で、JetPEI(Polyplus)を用いて合計20μgのDNAを細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション効率を、改変eGFP発現プラスミド(Zhang, et al. 1996)がトランスフェクトされた細胞のフローサイトメトリー(FACS Calibur、BD biosciences)によって24時間後に判定した。
)およびDph2(gRNA標的配列:RefSeq:NM_001039589、NM_001384に由来する
)、ならびにスクランブル対照(gRNA配列:
)に対する、CRISPR/Cas9遺伝子編集物質(すなわち、ノックアウトおよび組込みシステム)をコードするプラスミドを、OriGeneから得た。このシステムは、U6プロモーターの制御下で約100ntのgRNAならびにCMVプロモーターの制御下でCas9ヌクレアーゼを発現する1種のプラスミドと、標的遺伝子(Dph1またはDph2)に対する相同アームが隣接したプロモーターなしGFP/PM発現カセットを有するドナープラスミドとを含む。種々のサイズの付加的なDph1 gRNA配列変種(OriGene)は、
であった(図1Aを参照されたい)。
CRISPR/Cas9媒介性ホモ接合型DPH1およびDPH2遺伝子ノックアウトの同定および定量化
DPH1またはDPH2の全染色体コピーが不活性化されているMCF7細胞は、ジフテリア毒素に対して耐性である(Stahl, et al. 2015)。ゆえに、CRISPR/Casにより与えられた遺伝子不活性化があった場合の毒素耐性細胞/コロニーの出現率および頻度は、全遺伝子コピーの不活性化の効率についての測定を提供する。したがって、MCF/細胞に、(i)トランスフェクション対照としてのGFP発現プラスミド、(ii)CRISPR/Cas9 Dph1またはDph2ノックアウト/組込みシステム、および(iii)Cas9非依存性組込み頻度を判定するための、スクランブルgRNAを含有するノックアウト/組込み物質を、実施例1に記載されるようにトランスフェクトした。トランスフェクション効率の判定後、細胞を6ウェルプレートに播種した。DTによるホモ接合型ノックアウト事象の定量化に関しては、20000個の細胞を播種し、PMによる組込み事象の定量化または両事象の定量化に関しては、40000個の細胞を播種した。細胞播種の3日後に、RPMI培地を、DTもしくはPMまたは両毒素を含有するRPMI培地と交換した。すべての死細胞がプレートから除去され、活発に増殖するコロニーが顕微鏡検査により検出され得るまで、培地の交換を2〜3日ごとに繰り返した。その後(毒素曝露の開始の12日〜14日後)、細胞をPBSで3回洗浄し、その後に氷冷メチレンブルー(50%EtOH中0.2%)で染色した。その後にメチレンブルー溶液を除去し、プレートを流水下で慎重に洗浄した。最後に、5mm格子ホイルを用いて、細胞コロニーを顕微鏡下でカウントした。これらの解析の結果は、以下の表に要約されている。
「TF eff.」:トランスフェクション効率は、GFPレポータープラスミドによるMCF7のトランスフェクションがあった場合の蛍光細胞の頻度をモニターするFACS解析によって判定された。全細胞中のGFP陽性細胞の相対数が%で列挙されている。全アッセイ間の平均トランスフェクション効率は30〜40%であった。「HRM」:高解像度融点PCR陽性細胞は、野生型細胞と比較して、明らかに分岐する(二相の)融解曲線パターンを呈するものとして定義される。「K.O.」は、機能的DPH1またはDPH2遺伝子コピーを所持せず、それゆえDTに対して耐性である細胞の頻度を表す。「Int.」は、PAC発現カセットを持ち、それゆえPMに対して耐性である細胞の頻度を表す。「A〜D」は、独立した(四つ組の)実験の個々のサンプルを表す。
CRISPR/Cas9媒介性ヘテロ接合型DPH1およびDPH2遺伝子ノックアウトの検出
dph1またはdph2の一方のアレルのみが改変されている細胞は、毒素耐性でない。それらの事象を同定しかつ定量化するために、高解像度融解(HRM)PCRを、Stahl et al(Stahl, et al. 2015)によって記載されるのと同様の様式で適用した:トランスフェクションの24時間後、単一細胞をFACS(FACSAria、BD biosciences)によって96ウェルプレートに付着させ、コンフルエントまで増殖させた。細胞をPBSで洗浄し、1ウェルあたり40μLの細胞溶解バッファー(Roche)の添加により溶解した。750rpmでのプレートシェーカー(Titramax 1000、Heidolph)上でRTにて15分間のインキュベーション後、細胞溶解物をPCRグレードのH2Oで1:5希釈した。5μLの細胞溶解物を、High resolution melting(HRM)マスターミックス(Roche)と、およびgRNA標的配列に及ぶプライマーと混合した。PCRおよびHRMを、メーカーのプロトコールに従い、LC480 II(Roche)で実施した。編集された標的遺伝子を有するクローンを、MCF7-WT細胞と比較してそれらの変更された融解曲線によって同定した。
カセット組込み事象の検出
標的組込みのためのCRISPR/Casモジュールは、一過性発現を回避するために、プロモーターなしのピューロマイシン(PM)耐性遺伝子発現カセットを含有する。ゆえに、ゲノム内への組み換え配列の組込みの検出を、PMに対する細胞の感受性を判定することによって検出した。500ng/μL PMの濃度(野生型MCF7細胞を定量的に除外する)を適用して、安定に組込まれた発現カセットを有するMCF7細胞を選択した。PM耐性コロニーを、DT選択に関して上記で記載されるのと同じ手順で選択し、毒素耐性コロニーに関して上記で記載されるのと同じ様式で、可視化しかつ定量化した(選択の開始の12〜14日後)。非標的ガイド配列を用いて得られたPM耐性コロニーの数(スクランブルgRNA、図1)は、非特異的組込みバックグラウンドを反映する。PM耐性であるが毒素感受性である、標的遺伝子gRNAを用いて得られたコロニー(非特異的バックグラウンドを上回る)の増加は、一方の標的アレルだけへの組込みを反映し、他方のdph1またはdph2アレルは影響を受けないまま残る。DT耐性でもあるPM耐性コロニーは、発現カセットが少なくとも標的アレル内に組込まれており、他方のアレルは不活性化されている、またはさらに別の組込み事象を伴って不活性化されている。これらの解析の結果は、表1に要約されている。
ジフテリア毒素耐性アッセイおよびHRM-PCRの組み合わせは、ホモ接合型およびヘテロ接合型のdph1遺伝子不活性化事象を区別しかつ定量化する
ジフテリア毒素(DT)は、真核生物翻訳伸長因子2(eEF2)上のジフタミドをADPリボシル化し、それによってeEF2を不活性化する。これは、タンパク質合成を不可逆的に失速させ、細胞を殺傷する。ジフタミドは、ジフタミド合成遺伝子、それらの中でもジフタミド生合成1遺伝子=DPH1によりeEF2によって置かれる、規定されたヒスチジンである。MCF7細胞における全DPH1アレルの完全な不活性化(例えば、遺伝子編集による)は、毒素標的ジフタミドの合成を妨げる。これは、細胞をシュードモナス外毒素A(PE)およびDTに対して耐性にする(Stahl et al.)。その結果、DPH1の全機能的コピーの不活性化は、「DT耐性」という表現型を生み出す(図3)。この表現型の頻度は、実施例2〜4に記載されるように、毒素耐性コロニーをカウントすることによって迅速でかつ堅牢な様式で検出され得る(上記の表における結果および図3)。
ピューロマイシン耐性アッセイは、遺伝子特異的および非特異的な組込み事象の頻度を検出しかつ区別する
適用されるCRISPR/Cas9プラスミドの組込みカセットによってコードされるピューロマイシン-N-アセチル-トランスフェラーゼ(PAC)は、PMを不活性化し、それゆえ細胞をPM耐性にする(Vara, et al. 1986)。ゆえに、PAC発現カセットの組込みは、DT耐性コロニーに関して上記で記載されるのと同じ様式で、PM耐性アッセイによって検出され得および定量化され得る(選択剤としてDTの代わりにPMを適用する、図3)。特異的でかつホモ接合型の標的遺伝子不活性化からのみ生じるDT耐性とは対照的に、PM耐性は、組込みの箇所とは無関係に、任意の組込み事象を印付けする。部位特異的組込み対非特異的組込みの頻度は、標的遺伝子特異的ガイドRNAに曝露されたPM耐性細胞の数と、スクランブル非特異的ガイドに曝露された細胞の数とを比較することによって対処され得る(図3を参照されたい)。
CRISPR-Cas9により与えられたDPH1遺伝子不活性化および標的組込み事象の比較
標的特異的な不活性化、組込み、および非標的組込みの頻度を比較するために、DPH1特異的CRISPR-Cas9モジュールをコードするプラスミド(実施例1、図1)を、MCF7細胞内にトランスフェクトした。その後、これらをHRM-PCRに、ならびにDT耐性およびPM耐性を検出するコロニーカウントアッセイに供した。これらのアッセイの結果は図5に要約されており、個々のデータセットは上記の表1で入手可能である。
CRISPR/Cas9遺伝子編集のためのアッセイ/定量化アプローチの適用性および結果は、他の標的遺伝子に変形され得る
本明細書において提示される結果(標的遺伝子不活性化と組込みとの間の観察された大きな差を含む)は、CRISPR-Cas9媒介性遺伝子編集の一般的特質またはDPH1遺伝子の特殊性であるのか?この問いに対処するために、同一の実験アプローチを、DPH2遺伝子のCRISPR-Cas9誘導性改変に対して適用した。DPH2は、DPH1とは異なる染色体上に配置され、異なる配列を有し、異なる酵素をコードする。しかし、DPH2もジフタミド合成に不可欠であり、DPH2欠損は、DPH1欠損と同じ様式で、細胞をDTに対して耐性にする(Stahl et al.)。それによって、本明細書において報告され、DPH1調節を同定しかつ区別するために開発された検出および定量化の原理は、DPH2のCRISPR/Cas9媒介性変更の解析に対しても適用され得る。
本明細書において報告される方法の適用:遺伝子操作モジュールの比較および最適化
DPH1およびDPH2遺伝子編集実験の結果は、両者が異なる染色体上の異なる遺伝子であるにもかかわらず、高度に匹敵した。したがって、このシステムを用いて得られた「法則」および学習が、他の遺伝子に一般化され得ると推測することは合理的である。ゆえに、本明細書において報告される方法は、遺伝子改変モジュールの組成の一般的効果に対処する解析に対して適用され得る。
種々の遺伝子編集アプローチの効率および特異性の比較
RNAガイドCas9ならびにZFN媒介性遺伝子編集の種々の変種についての遺伝子不活性化および組込み事象、効率および特異性を比較するために、gRNAの長さおよび組成を一定にした(20mer、DPH1を標的にする)。変動要素として、3種の異なる編集酵素を適用した。
(i)「SpCAS9」は、ストレプトコッカス・ピオゲネス由来のCas9ヌクレアーゼを指定し、それは現在の標準的適用と見なされ得る(Ran, Hsu et al. 2013、Fu, Sander et al. 2014);
(ii)SpCas9-HF1は、非特異的DNA結合の低下、オフターゲット活性の低下を有し、それゆえ提案されるより高い忠実度および特異性を有する、SpCas9の操作された変種である(Kleinstiver, Pattanayak et al. 2016);
(iii)設計されたジンクフィンガーモチーフによって、すなわち核酸ハイブリダイゼーションに対立するものとしてのタンパク質-核酸相互作用を介して、標的配列を認識する、ZFN媒介性遺伝子編集モジュール(Miller, Holmes et al. 2007、Urnov, Rebar et al. 2010)。
MCF-7細胞に、種々のゲノム編集システム(SpCas9、SpCas9、ZFN)をコードするプラスミドをトランスフェクトした。SpCas9構築物を、上記で記載されるように適用した。SpCas9-HFは、Kleinstiver, Pattanayak et al. 2016に従って、N497A/R661A/Q695A/Q926A置換を含む。並行して、gRNAを並行してscRNAによって置き換えて、非特異的活性に対処した。DPH1特異的ZFNを、Sigma Aldrichから得た(CompoZr(登録商標))。3×106個の細胞の初回細胞プールのトランスフェクションに対するプラスミドDNA(編集物質およびドナー)の総量は、以前の実験に関して記載されるとおりであった。トランスフェクション効率(TF eff.(%))を定量化するために、GFPレポータープラスミドを別としてトランスフェクトした。GFP陽性細胞を、トランスフェクションの24時間後にFACSによってカウントした。規定数の細胞を播種し(播種細胞数)、その後DT、PM、またはDT+PMで72時間処理した。
遺伝子編集の効率および特異性に対するDNA修復調節因子の影響
DPH遺伝子編集があった場合のDT耐性およびPM耐性細胞を判定するコロニーアッセイを含む本明細書において報告される方法を用いて、DNA修復メカニズムを調節する化合物の影響にも対処し得る。非相同末端結合(NHEJ)過程の阻害剤は、例えば、遺伝子編集事象を調節することが記載されている(Ma, Y, et al. 2016)。同じ様式で、相同組み換え(HR)の活性化因子は、標的カセット組込みの効率を増加させ得る(Song, J, et al, 2016)。
MCF-7細胞に、前に記載されるように、SpCas9媒介性編集のためのプラスミドをトランスフェクトした。同等数の細胞を播種し(播種細胞数)、編集の始動の72時間後にDTまたはPMで処理した。
(A)Scr7(1μMの最終濃度)、RS-1(8μMの最終濃度)、またはScr7+RS1(それぞれ1uM+8uM)を、トランスフェクションの4時間前に添加した。
(B)化合物により調節されるSpCas9-gRNA媒介性遺伝子編集に対する、RS1およびScr7の適用の時間(トランスフェクションの4時間前対18後)の影響。(*)差は有意である、p<0.008。
ZFN媒介性DPH1遺伝子編集の同定および定量化
DPH1の全染色体コピーが不活性化されているMCF7細胞はDT耐性である。ゆえに、ZFNにより与えられた遺伝子不活性化および/またはカセット組込みがあった場合のDTrコロニーの出現率および頻度は、全遺伝子コピーの不活性化の効力についての測定を提供する。ZFN認識配列
は、NM_001383.3(DPH1-wt)に由来し、Sigma Aldrichから得た。この箇所に対するPAC組込みカセットをOriGeneから得た。MCF7細胞に、(i)GFP発現プラスミド、(ii)DPH1を標的にするZFNをコードするプラスミド、および(iii)DPH1を標的にするPAC組込みカセットを、上記で記載されるようにトランスフェクトした。トランスフェクション効率の判定後、細胞を6ウェルプレートに播種した。ホモ接合型ノックアウト事象(DTr)の定量化に関しては、20,000個の細胞を播種し、組込み事象(PMr)または二重耐性の定量化に関しては、40,000個の細胞を播種した。播種の3日後に、RPMI培地を、DTもしくはPMまたはその両方を含有するRPMIに交換した。培地を2〜3日ごとに変えた。毒素曝露の開始の12日〜14日後、細胞をPBSで3回洗浄し、氷冷メチレンブルー(50%EtOH中0.2%)で染色し、その後に流水下での洗浄、および5mm格子ホイルを用いてコロニー数をカウントする顕微鏡判定が続いた。
CRISPR/Cas9媒介性編集に対するHRおよびNHEJ調節因子の影響の定量化
遺伝子編集の間に、RAD51刺激化合物1(RS-1)を適用して、相同組み換え(HR)を調節した。RS-1(Sigma Aldrich)をDMSO中に溶解して10mg/mlのストック溶液を作製し、それを細胞への適用直前にRPMI培地中に希釈した。生存率(Promega CTG)アッセイにより、MCF7に対して増殖阻害効果または毒性効果を与えない用量として、8μM RS-1の最終濃度が同定された(生存率:1μM-100%;3.7μM-100%;11μM-97%;33μM-61%)。
統計学
2つの処理間の単一比較のために、対応のない両側スチューデントのt検定を実施した。多重比較を、一元配置ANOVA、それに続くテューキーの正当に異なる有意性(honestly different significance)(HDS)事後検定によって統計的に解析した。有意差を、<0.05のp値によって規定した。スチューデントのt検定によって判定される有意性のレベルは、p<0.05、p<0.01、およびp<0.001に対応する1つ、2つ、または3つの星印によってグラフ中に表される。同じように、テューキーのHDS検定によって判定される有意性のレベルは、Λ、Φ、またはΨによって表される。
Claims (20)
- 哺乳動物細胞のゲノム内への核酸の導入を判定するための方法であって、該哺乳動物細胞は、DPH1、DPH2、DPH4、および/またはDPH5遺伝子の1つまたは2つの転写的に活性なアレルを含み、該方法は、
−導入すべき核酸と、抗生物質選択マーカーに対する耐性を付与する核酸と、DPH1、DPH2、DPH4、および/またはDPH5遺伝子の遺伝子編集に必要なエレメントとを含む1種のプラスミドを、哺乳動物細胞にトランスフェクトする工程、
−トランスフェクトされた細胞をシュードモナス(pseudomonas)外毒素Aおよびジフテリア毒素からなる群より選択されるDPH遺伝子転写感受性毒素の存在下で培養する工程、
−毒素耐性コロニーの数、抗生物質耐性コロニーの数、ならびに毒素および抗生物質耐性コロニーの数を決定する工程、
−トランスフェクトされた細胞が該毒素の存在下で生存可能である場合、哺乳動物細胞のゲノム内への核酸の導入を判定する工程
を含み、
組込み事象(抗生物質耐性コロニーの数)と不活性化事象(毒素耐性コロニーの数)の比率の低い値は、同時に生じる不活性化事象に対する、非効率的な組込みを示し、当該比率の高い値は、標的部位におけるより効率的な組込みを示す、前記方法。 - −導入すべき核酸と、抗生物質選択マーカーに対する耐性を付与する核酸と、DPH1、DPH2、DPH4、および/またはDPH5遺伝子の遺伝子編集に必要なエレメントとを含む1種のプラスミドを、哺乳動物細胞にトランスフェクトする工程、
−トランスフェクトされた細胞を選択圧の非存在下で培養する工程、
−培養物を少なくとも2つのアリコートに分ける、または培養物から少なくとも2つのサンプルを採取する工程、および
−第一のアリコートまたはサンプルをシュードモナス(pseudomonas)外毒素Aおよびジフテリア毒素からなる群より選択されるDPH遺伝子転写感受性毒素の存在下で培養し、かつ第二のアリコートまたはサンプルを、対応する抗生物質選択マーカーの存在下で培養する工程
を含む、請求項1記載の方法。 - 哺乳動物細胞が大量の哺乳動物細胞であり、かつ前記方法が、前記毒素および/または前記抗生物質選択マーカーの存在下で細胞を培養する工程の直前に、
−トランスフェクトされた大量の細胞からの細胞を、単一細胞として付着させる工程
を含む、請求項1または2記載の方法。 - 大量の哺乳動物細胞が、1000〜10,000,000個の細胞である、請求項3記載の方法。
- 遺伝子編集の効率を判定するための、または遺伝子編集の特異性を判定するための、または遺伝子編集の効率および特異性を判定するための、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
- ホモ接合型およびヘテロ接合型の遺伝子改変を判定するための、または部位特異的および非特異的な遺伝子破壊および組込みを判定するための、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
- トランスフェクトされた細胞が前記毒素の存在下で生存可能である場合、核酸の導入は、哺乳動物細胞のゲノム内へのホモ接合型核酸導入であると示される、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
- トランスフェクトされた細胞が前記毒素の存在下で生存不可能であるが前記抗生物質選択マーカーの存在下で生存可能である場合、核酸の導入は、哺乳動物細胞のゲノム内へのヘテロ接合型核酸導入であると示される、請求項1〜7のいずれか一項記載の方法。
- DPH遺伝子不活性化および核酸組込み事象が、前記毒素および前記抗生物質選択マーカーによる選択と、任意で高解像度融解(HRM)PCRとの組み合わせによって定量化される、請求項1〜8のいずれか一項記載の方法。
- 前記方法が、異なる遺伝子編集手法を評価するためのものであり、かつ
−導入すべき核酸と、抗生物質選択マーカーに対する耐性を付与する核酸と、DPH1、DPH2、DPH4、および/またはDPH5遺伝子を編集するための第一の遺伝子手法に必要なエレメントとを含む1種のプラスミドを、哺乳動物細胞にトランスフェクトする工程、
−トランスフェクトされた細胞を選択圧の非存在下で培養する工程、
−培養物を少なくとも2つのアリコートに分ける、または培養物から少なくとも2つのサンプルを採取する工程、
−第一のアリコートまたはサンプルを、シュードモナス(pseudomonas)外毒素Aおよびジフテリア毒素からなる群より選択されるDPH遺伝子転写感受性毒素の存在下で培養し、かつ第二のアリコートまたはサンプルを、対応する抗生物質選択マーカーの存在下で培養する工程、
−試験すべきすべての遺伝子編集手法に対してこれらの工程を繰り返す工程、および
−毒素耐性、抗生物質選択マーカー耐性、または二重耐性の頻度に基づき、異なる遺伝子編集手法をランク付けする工程
を含む、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。 - 標的遺伝子の全アレルの不活性化の頻度が、毒素耐性コロニーをカウントすることによって検出される、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法。
- 標的遺伝子の一方のアレルの不活性化が、HRM-PCRによって二相融解曲線の存在により検出される、請求項1〜11のいずれか一項記載の方法。
- HRM-PCRが、培養細胞に対して直接実施される、請求項12記載の方法。
- CRISPR/Cas9による標的遺伝子の全アレルの不活性化の頻度が、HRM-PCRによって決定される二相融解曲線と組み合わせて、毒素耐性コロニーをカウントすることによって検出される、請求項1〜13のいずれか一項記載の方法。
- 前記方法が、核酸のCRISPR/Cas9標的組込みのためのガイドRNAを選択するためのものであり、大量の異なるガイドRNAを提供する工程、および組込み事象(抗生物質耐性コロニーの数)と不活性化事象(毒素耐性コロニーの数)の最も高い比率を有するガイドRNAを選択する工程を含む、請求項1〜14のいずれか一項記載の方法。
- 遺伝子編集手法が、CRISPR/Cas、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、およびTALENからなる群より選択される、請求項1〜15のいずれか一項記載の方法。
- CRISPR/Cas9または ZFNまたはTALENまたは他の遺伝子編集モジュールまたはこれらの変異型または変種を同定/選択するための方法であって、
−1つまたは複数の遺伝子編集モジュールの大量の変種を提供する/調製する工程、
−請求項1〜16のいずれか一項記載の方法を用いて、組込み事象(抗生物質耐性コロニーの数)および不活性化事象(毒素耐性コロニーの数)の効率および/または組込み事象(抗生物質耐性コロニーの数)と不活性化事象(毒素耐性コロニーの数)の最も高い比率を判定する工程、ならびに
−最も高い効率および/または最も高い比率を有する変種を同定する/選択する工程
を含む、前記方法。 - 遺伝子編集モジュール/手法の効率または特異性を改変する、増大させるまたは低下させる化合物または化合物組み合わせを選択するための方法であって、
−1種もしくは複数種の化合物または1組もしくは複数組の化合物組み合わせを提供する工程、
−該化合物または化合物組み合わせの非存在下で、請求項1〜16のいずれか一項記載の方法を用いて、組込み事象(抗生物質耐性コロニーの数)および不活性化事象(毒素耐性コロニーの数)の効率および/または組込み事象(抗生物質耐性コロニーの数)と不活性化事象(毒素耐性コロニーの数)の比率を、任意で判定する工程、
−該化合物または化合物組み合わせの存在下で、請求項1〜16のいずれか一項記載の方法を用いて、組込み事象(抗生物質耐性コロニーの数)および不活性化事象(毒素耐性コロニーの数)の効率および/または組込み事象(抗生物質耐性コロニーの数)と不活性化事象(毒素耐性コロニーの数)の比率を、該化合物または化合物組み合わせのそれぞれに対して別個に/個々に判定する工程、
−該化合物または化合物組み合わせの非存在下で実施された請求項1〜16のいずれか一項記載の方法による効率および/または比率とは異なる効率および/または比率を有する少なくとも1種の化合物または少なくとも1組の化合物組み合わせを同定する/選択する工程
を含む、前記方法。 - 増殖阻害または毒性を最小限に抑えつつ遺伝子編集手法の効率または特異性を増大させる化合物濃度およびその添加の時点を決定するための方法であって、
−1種もしくは複数種の化合物または1組もしくは複数組の化合物組み合わせを提供する工程、
−該化合物または化合物組み合わせの非存在下で、請求項1〜16のいずれか一項記載の方法を用いて、組込み事象(抗生物質耐性コロニーの数)および不活性化事象(毒素耐性コロニーの数)の効率および/または組込み事象(抗生物質耐性コロニーの数)と不活性化事象(毒素耐性コロニーの数)の比率を、任意で判定する工程、
−異なる濃度および/または異なる添加の時点における該化合物または化合物組み合わせの存在下で、請求項1〜16のいずれか一項記載の方法を用いて、組込み事象(抗生物質耐性コロニーの数)および不活性化事象(毒素耐性コロニーの数)の効率および/または組込み事象(抗生物質耐性コロニーの数)と不活性化事象(毒素耐性コロニーの数)の比率を、該化合物または化合物組み合わせのそれぞれに対して別個に/個々に判定する工程、
−該化合物または化合物組み合わせの非存在下で実施された請求項1〜16のいずれか一項記載の方法によるものよりも高い効率および/または高い比率を有する濃度および/または添加の時点を、少なくとも1種の化合物または少なくとも1組の化合物組み合わせのそれぞれに対して同定する/選択する工程
を含む、前記方法。 - 同定する/選択する工程が、最も高い効率および/または最も高い比率を有する化合物についてである、請求項18〜19のいずれか一項記載の方法。
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