CN1352697A

CN1352697A - 电化学检测核酸寡聚体杂交事件的方法

Info

Publication number: CN1352697A
Application number: CN00803149.5A
Authority: CN
Inventors: G·哈特维奇
Original assignee: FRITZ BIOCHEMICAL Co Ltd
Current assignee: FRITZ BIOCHEMICAL Co Ltd
Priority date: 1999-01-18
Filing date: 2000-01-07
Publication date: 2002-06-05
Also published as: TR200101930T2; HUP0105170A3; MXPA01007183A; JP2003521465A; EA200100672A1; HUP0105170A2; WO2000042217A3; AU2662700A; NO20013471L; NO20013471D0; ATE238436T1; ES2198282T3; WO2000042217A2; BR0007571A; IL144219A0; CZ20012503A3; SI1144685T1; DE50001859D1; EP1144685B1; EP1144685A2

Abstract

本发明涉及了一种用于电化学检测序列特异性核酸寡聚体杂交事件的方法。一端结合于导电表面且于另一游离端连接氧化还原活性单元的DNA/RNA/PNA寡聚体单链用作杂交基质(探针)。通过用待测寡核苷酸溶液(靶)处理使部分单链寡核苷酸杂交,得到导电表面和氧化还原活性单元之间电交流增加的结果,所述电交流最初不存在或几乎不存在。这样使得利用如伏安法、电流分析法或导电性测量的电化学方法可检测杂交事件。

Description

电化学检测核酸寡聚体杂交事件的方法

发明领域

本发明涉及修饰的核酸寡聚体以及电化学检测序列特异性核酸寡聚体杂交事件的方法。

发明背景

在疾病诊断、毒理学试验方法、遗传学研究和开发以及农业和制药领域，通常用采用放射自显影或光学检测的凝胶电泳方法来进行DNA和RNA序列分析。

在最重要的采用光学检测的凝胶-电泳方法-Sanger法中，含有DNA的溶液被分成4份样品。为了区分4份样品，将各样品的引物(复制的互补起始序列)用可以在不同波长下发光的荧光染料进行共价修饰。从引物开始，各样品在DNA聚合酶I的催化下进行复制。除了必需碱基A(腺嘌呤)、T(胸腺嘧啶)、C(胞嘧啶)和G(鸟嘌呤)的三磷酸脱氧核苷外，各反应混合物还含有足够的这些三磷酸核苷之一的2′，3′-二脱氧类似物作为阻断碱基(每份样品各含一种四种可能的阻断碱基之一)以在所有可能的结合位点终止复制。在将四种样品混合后，可以得到所有长度的具有阻断碱基特异性荧光的复制DNA片段，并且可以根据长度进行凝胶电泳分类并通过荧光光谱进行鉴定。

另一种光学检测方法是基于在寡核苷酸上连接荧光染料例如溴化乙锭。与染料的游离溶液相比，所述染料的荧光在与双链DNA或RNA缔合后会发生剧烈变化，因此可用于检测杂交的DNA或RNA。

在放射标记中，³²P被构建在寡核苷酸的磷酸骨架内，³²P通常被多核苷酸激酶加到5′-羟基末端。然后，优选将标记的DNA在确定的条件下在四种核苷酸类型其中之一处裂解，从而每条链平均裂解一次。因此，对于给定的碱基类型，在反应混合物中存在从³²P-标记延伸至该碱基位置的链(如果该碱基出现了多次，会相应的产生不同长度的链)。然后将四种片段混合物在四条泳道上进行凝胶电泳分离。然后，制备凝胶的放射自显影图，从该图可以直接读出序列。

几年前，开发了另一种基于光学(放射自显影)检测的DNA测序方法，即，通过寡聚体杂交进行测序(参见，例如Drmanac等，《基因组学》(Genomics)4，(1989)，114-128页，或Bains等，理论生物学(Theor.Biol.)135，(1988)，303-307页)。在该方法中，将完整的一套短寡核苷酸或核酸寡聚体(探针寡核苷酸)，例如寡核苷酸八聚体的所有65536种可能的碱基A、T、C和G的组合结合在载体材料上。结合发生在含有65536个试验位点的有序网格内，每个相当大量的定义一个试验位点的寡核苷酸组合，并且各试验位点(寡核苷酸组合)的位置是已知的。在这种杂交基质中，将寡聚体芯片、即需要测定其序列的DNA片段(靶点)用荧光染料(或³²P)标记然后在仅允许一种特定的双链形成的条件下杂交。通过该方法，靶DNA片段仅与那些其互补序列与自身序列的一部分(八聚体)精确对应的核酸寡聚体(在该例子中为八聚体)相结合。因此，通过光学(或放射自显影)检测杂交DNA片段的结合位置测定出片段中所存在的所有核酸寡聚体序列(八聚体序列)。由于相邻核酸寡聚体序列的重叠，DNA片段的连续序列可以用适宜的数学算法进行测定。该方法的优点之一是测序的微型化，从而可以在一次操作中同时获得庞大的数据量。此外，可以免除引物和DNA片段的凝胶电泳分离。在图1中用长度为13个碱基的DNA片段对该原理进行了举例说明。

在DNA/RNA测序中使用放射性标记有许多缺点，例如在处理放射性物质和接触辐射时需要复杂的、合法的安全防护、有限的空间分辨能力(最大为1mm²)，以及只有当放射性片段的辐射作用于X-线胶片足够长的时间(数小时至数天)时才能有高的灵敏度。虽然可以通过另外的硬件和软件来增加空间分辨力，并通过使用β扫描来缩短检测时间，但这两项均需要相当高的附加成本。

常用于标记DNA的某些荧光染料(例如溴化乙锭)是致突变的，与放射自显影一样，需要适当的安全防护。在几乎所有的情况下，使用光学检测均需要使用一种或多种激光系统，因此就需要有经验的人员以及适当的安全防护。实际的荧光检测需要另外的硬件，例如用于放大的光学元件，并且在改变激发波长和检测波长的情况下(例如在Sanger方法中)，还需要对照系统。因此，根据所需的激发波长和所需的检测性能，可能会需要相当高的投资成本。当通过在寡聚体芯片上杂交进行测序时，检测将更为昂贵，因此除了激发系统外，还需要高分辨率的CCD照相机(电耦合器件照相机)来进行荧光斑的二维检测。

因此，虽然存在定量的和极为敏感的DNA/RNA测序方法，但这些方法耗时、需要进行辛苦的样品制备和昂贵的设备，并且通常不能作为便携式系统。

本发明的描述

因此，本发明的目的是提供不存在现有技术的缺点的用于检测核酸寡聚体杂交体的仪器和方法。

根据本发明，通过独立权利要求1的修饰的核酸寡聚体、独立权利要求21的生产修饰的核酸寡聚体的方法、独立权利要求29的修饰的导电表面、独立权利要求44的生产修饰的导电表面的方法和独立权利要求48的电化学检测核酸寡聚体杂交事件的方法实现了该目的。

在本发明中将使用如下缩写和术语：遗传学

DNARNAPNA

脱氧核糖核酸核糖核酸肽核酸(其中的糖-磷酸酯部分被氨基酸代替了的合成DNA或RNA。如果糖-磷酸酯部分被-NH-

AGCTU碱基bp核酸核酸寡聚体寡聚体寡核苷酸oligo引物错配

(CH₂)₂-N(COCH₂-碱基)-CH₂CO-部分所代替，PNA将与DNA杂交。)腺嘌呤鸟嘌呤胞嘧啶胸腺嘧啶尿嘧啶A、G、T、C或U碱基对至少两个共价连接的核苷酸或至少两个共价连接的嘧啶(例如胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶)或嘌呤碱基(例如腺嘌呤或鸟嘌呤)。术语核酸是指任何共价连接的嘧啶或嘌呤碱基的骨架，例如DNA、cDNA或RNA的糖-磷酸酯骨架、PNA的肽骨架或类似的结构(例如磷酰胺、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯骨架)。本发明核酸的基本特点是它可以序列特异性的与天然的cDNA或RNA结合。碱基长度没有进一步指明的核酸(例如核酸八聚体：具有由8个嘧啶或嘌呤碱基彼此共价结合的骨架的核酸)。等同于核酸寡聚体。等同于寡聚体或核酸寡聚体，例如碱基长度没有进一步指明的DNA、PNA或RNA片段。寡核苷酸的缩写。寡核苷酸的起始互补片段，引物的碱基长度仅为大约4-8个碱基。它是寡核苷酸酶催化复制的起始点。为了形成Watson-Crick双链寡核苷酸结构，将两

ssds	个单链以一条链的A(或C)碱基与另一条链的T(或G)碱基(在RNA中，T由尿嘧啶代替)形成氢键的方式杂交。任何其它不能形成氢键并会使结构扭曲的碱基配对称为“错配”。单链双链
ssds		光诱导型和化学诱导型氧化还原活性部分
氧化还原活性部分电子供体	光诱导型氧化还原活性部分或化学诱导型氧化还原活性部分在本发明中，术语“电子供体”是指光诱导型或化学诱导型氧化还原活性部分的成分。电子供体是可以直接或在某些外部条件的影响下向电子受体转移电子的分子。所述外部条件之一是由光诱导型氧化还原活性部分的电子供体或受体吸收光。在用特定或任何给定的波长的光线照射时，电子供体“D”给出一个电子到电子受体“A”并至少是暂时性地形成包含氧化的供体和还原的受体的电荷分离状态D⁺A^-。另一种外部条件可以是由外部的氧化剂或还原剂将化学诱导型氧化还原活性部分的电子供体或受体氧化或还原，于是由还原剂向电子电子供体转移电子，或由电子受体向氧化剂释放电子。这些氧化剂或还原剂可以是外部的氧化还原活性物质，即它们不与氧化还原活性部分、核酸寡聚体或导电表面共价连接但通过例如加入到修饰的导电表面的溶液与其相接触，或者它们与核酸寡聚体共价连接，氧化剂或还原剂共价连接在核酸寡聚体上与氧化还原活性部分共价	光诱导型和化学诱导型氧化还原活性部分

电子受体

连接位点相隔至少两个共价连接的核苷酸或至少两个共价连接的嘧啶或嘌呤碱基的位点，优选连接在寡核苷酸上与用氧化还原活性部分修饰的位点相对的、靠近导电表面的末端。作为电子供体或受体的能力是相对的，也就是说，直接或在某些外部条件的影响下对另一个分子起电子供体作用的分子可以在不同的实验条件下对该分子起电子受体的作用，或在相同或不同的实验条件下对第三种分子起电子受体的作用。在本发明中，术语“电子受体”是指光诱导型或化学诱导型氧化还原活性部分的成分。电子受体是可以直接或在某些外部条件的影响下从电子供体获取电子的分子。所述外部条件之一是由光诱导型氧化还原活性部分的电子供体或受体吸收光。在用特定或任何给定的波长的光线照射时，电子供体“D”给出一个电子到电子受体“A”并至少是暂时性地形成包含氧化的供体和还原的受体的电荷分离状态D⁺A^-。另一种外部条件可以是由外部的氧化剂或还原剂将化学诱导型氧化还原活性部分的电子供体或受体氧化或还原，于是由还原剂向电子电子供体转移电子，或由电子受体向氧化剂释放电子。这些氧化剂或还原剂可以是外部的氧化还原活性物质，即它们不与氧化还原活性部分、核酸寡聚体或导电表面共价连接但通过例如加入到修饰的导电表面的溶液与其相接触，或者它们与核酸寡聚体共价连接，氧化剂或还原剂共价连接在核酸寡聚体上与氧化还原活性部分共价

电子供体分子电子受体分子氧化剂还原剂

连接位点相隔至少两个共价连接的核苷酸或至少两个共价连接的嘧啶或嘌呤碱基的位点，优选连接在寡核苷酸上与用氧化还原活性部分修饰的位点相对的、靠近导电表面的末端。作为电子受体或供体的能力是相对的，也就是说，直接或在某些外部条件的影响下对另一个分子起电子受体作用的分子可以在不同的实验条件下对该分子起电子供体的作用，或在相同或不同的实验条件下对第三种分子起电子供体的作用。等同于电子供体。等同于电子受体。可以通过从另一种化合物(化学物质、电子供体、电子受体)获取电子将所述的另一种化合物(化学物质、电子供体、电子受体)氧化的化合物(化学物质)。氧化剂的行为与电子受体类似，但在本发明中是指不直接属于光诱导型或化学诱导型氧化还原活性部分的外部电子受体。其中的“不直接”是指该氧化剂或者是不与核酸寡聚体结合但与其相接触的游离的氧化还原活性物质，或者该氧化剂与核酸寡聚体共价连接在核酸寡聚体上与(光诱导型)氧化还原活性部分共价连接位点相隔至少两个共价连接的核苷酸或至少两个共价连接的嘧啶或嘌呤碱基的位点。具体地讲，电极可以代表氧化剂。可以通过向另一种化合物(化学物质、电子供体、电子受体)提供电子将所述的另一种化合物(化学物质、电子供体、电子受体)还原的化合物(化学物质)。还原剂的行为与电子供体类似，但

光诱导型氧化还原活性游离的氧化还原活性物质

在本发明中是指不直接属于光诱导型或化学诱导型氧化还原活性部分的外部电子供体。其中的“不直接”是指该还原剂或者是不与核酸寡聚体结合但与其相接触的游离的氧化还原活性物质，或者该还原剂与核酸寡聚体共价连接在核酸寡聚体上与氧化还原活性部分共价连接位点相隔至少两个共价连接的核苷酸或至少两个共价连接的嘧啶或嘌呤碱基的位点。具体地讲，电极可以代表还原剂。光诱导型是指只有在用特定或任何给定波长的光线照射时才显示某些特性。例如，光诱导型氧化还原活性部分只有在用特定或任何给定波长的光线照射时才显示氧化还原活性，即，在某些外部条件下完成在光诱导型氧化还原活性部分内的电荷分离的特性，例如形成D⁺A^-态并向另一种适宜的氧化剂给出电子或从另一种适宜的还原剂获取电子。另一个例子是光诱导型活泼基团，即，只有在用特定或任何给定波长的光线照射时才变得活泼的基团。氧化还原活性是指氧化还原活性部分在某些外部条件下向适宜的氧化剂给出电子或从适宜的还原剂获取电子的性质，或氧化还原活性物质在某些外部条件下向适宜的电子受体给出电子或从适宜的电子供体获取电子的能力。不与氧化还原活性部分、核酸寡聚体或导电表面共价连接但通过例如加入到修饰的导电表面的溶液与其相接触的游离的氧化剂或还原剂，游离的氧化还原活性物质可以是例如不带电荷的分子、各种盐或氧化还原活性蛋白或酶(氧化

光诱导型氧化还原活性部分

还原酶)。游离的氧化还原活性物质的特征在于它可以再还原光诱导型氧化还原活性部分的氧化的供体(或再氧化还原的受体)，或者游离的氧化还原活性物质可以还原化学诱导型氧化还原活性部分的供体(或氧化受体)。对于含有一个或多个电子供体分子和一个或多个电子受体分子的部分的总称，该电子供体分子和/或电子受体分子可以包含在一种或多种大分子内。电子供体和电子受体可以通过一种或多种共价键或离子键、通过氢键、分子键、π-π相互作用、或通过电子对供给和接受的配位作用彼此结合在一起，共价键可以是直接或间接的键(例如通过间隔基，但不通过核酸寡聚体)。此外，包含在一种或多种大分子内的电子供体和/或电子受体可以通过与大分子的共价连接、通过包封在大分子的适宜的分子腔(结合袋)内、通过离子键、氢键、分子键、π-π相互作用、或通过大分子和电子供体分子和/或电子受体分子之间的电子对供给和接受的配位作用与大分子结合。如果光诱导型氧化还原活性部分由多个大分子组成，大分子之间也可以通过共价键、离子键、氢键、分子键、π-π相互作用、或通过电子对供给和接受的配位作用进行结合。除了含有电子供体和电子受体或电子供体、电子受体和大分子外，光诱导型氧化还原活性部分的基本特点是：(i)在适于本发明的形式(原始状态或氧化或还原状态的电子供体和电子受体)中，该部分是稳定的并且不会解离成其组成成分，(ii)该部分不包含核酸，(iii)该部分的组成包含本领

域技术人员可以确定的电子供体和电子受体或电子供体、电子受体和大分子，不用考虑各成分之间的键，因为在理论上它们还可以是单个的分子，(iv)在相同或类似的外部条件下，光诱导型氧化还原活性部分的电子供体和电子受体可以以单个分子的形式在溶液中起电子供体和电子受体的作用，也就是说，即使在游离的溶解电子供体和电子受体的情况下，电子也可以直接或在某些外部条件的影响下从溶解的电子供体转移到溶解的电子受体，这取决于导致电子在光诱导型氧化还原活性部分内转移的条件。光诱导型氧化还原活性部分可以是例如任何光诱导型氧化还原活性的蛋白/酶或任何光诱导型氧化还原活性的、连接的、至少是双分子的电子供体/电子受体复合物。在用特定或任何给定波长的光线照射时，电子供体给出一个电子到电子受体并至少是暂时性地形成包含氧化的供体和还原的受体的电荷分离状态D⁺A^-。这种在光诱导型氧化还原活性部分内的过程称为光诱导的电荷分离。给出适当选择的外部条件，例如在可以将D⁺而不是D还原的还原剂的存在下(或在可以氧化A^-而不是A的氧化剂的存在下)，光诱导型氧化还原活性部分仅在电荷分离的状态显示其氧化还原活性，也就是它向适宜的氧化剂给出电子或从适宜的还原剂获取电子的特性，因为还原剂仅向光诱导型氧化还原活性部分的氧化了的供体转移电子或者氧化剂仅从还原了的受体获取电子。具体地讲，该氧化剂或还原剂还可以是电极，例如，如果电极设置

化学诱导型氧化还原活性部分

在可以氧化A^-而不是A(或者可以还原D⁺而不是D)的电位下，光诱导型氧化还原活性部分仅在光诱导的电荷分离之后可以向电极给出电子(或从电极获取电子)。在组成和作用方式上与光诱导型氧化还原活性部分相当，但与光诱导型氧化还原活性部分的作用方式不同的是，排除了光激活作为引发氧化还原活性部分的氧化还原活性的外部条件。氧化还原活性部分可以是例如氧化还原活性蛋白/酶或任何氧化还原活性的、连接的、至少是双分子的电子供体/电子受体复合物。给出适当选择的外部条件，只有当电子从还原剂转移到电子供体“D”(其仅在还原状态“D^-”时可以向受体“A”转移电子，而氧化剂仅从该氧化还原活性部分的还原的受体“A^-”获取电子)后，换句话说，在可以氧化A^-而不是A(连续的电荷转移)的氧化剂的存在下，氧化还原活性部分才显示其氧化还原活性，例如向适宜的氧化剂给出电子的特性。具体地讲，该氧化剂还可以是电极，例如，如果电极设置在可以氧化A^-而不是A的电位下。相反，给出不同的外部条件，如果仅有氧化的受体“A⁺”可以从供体D获取电子并且还原剂仅向氧化还原活性部分的氧化了的供体“D⁺”转移电子，例如在可以还原D⁺而不是D(连续的电荷转移)的还原剂的存在下，只有当电子从电子受体“A”转移到氧化剂之后，氧化还原活性部分才显示其氧化还原活性，例如从适宜的还原剂获取电子的特性。具体地讲，该还原剂还可以是电极，例如，如果电极设置在可

光诱导型氧化还原活性蛋白/酶化学诱导型氧化还原活性蛋白/酶光诱导型氧化还原活性的、连接的、至少是双分

以还原D⁺而不是D的电位下。通常由称为“脱辅基蛋白质”(本发明优选的大分子)和辅因子(本发明含义范围内的电子供体和电子受体)的物质组成。光诱导的光激活型氧化还原活性蛋白/酶内的电荷分离由特定或任何给定波长的光线引发。因此，例如，在光合反应中心(RC)，初级电子供体P形式的辅因子和多个不同的电子受体A、包括醌辅因子Q被包埋在蛋白基质中，从而形成“多分子”部分(参见结构1)。在该情况下，通过将辅因子包封在含有多个蛋白质亚单位的蛋白质基质的适宜的腔(称为结合袋)内进行包埋。对于某些天然的RC，蛋白亚单位以及在蛋白质基质内包封辅因子均是通过非共价键实现的。在用适宜波长的光线照射时，初级供体向电子受体之一给出电子并至少是暂时地形成电荷分离的RC-状态P⁺A^-、特别是状态P⁺Q^-，包括最初的中性辅因子。在组成和作用方式上与光诱导型氧化还原活性蛋白/酶相当，但与光诱导型氧化还原活性蛋白/酶不同的是，排除了光激活作为引发氧化还原活性部分的氧化还原活性的外部条件；化学诱导型氧化还原活性蛋白/酶通常由称为脱辅基蛋白质(本发明优选的大分子)和辅因子(本发明含义范围内的电子供体和电子受体)的物质组成。氧化还原活性蛋白/酶的连续电荷转移特性通过游离的氧化还原活性物质(底物)引发。含有一种或多种电子供体分子D1、D2、D3等和至少一种或多种适宜的电子受体分子A1、A2、A3等的化合物，电子供体和电子受体之间通过

子的电子供体/电子受体复合物

一种或多种共价键或离子键、氢键、分子键、π-π相互作用、或通过电子对供给和接受的配位作用相连接。该意义的共价连接可以是直接或间接的连接(例如通过间隔基，但不是通过核酸寡聚体)。除了含有电子供体和电子受体外，光诱导型氧化还原活性的、连接的、至少是双分子的电子供体/电子受体复合物的基本特点是：(i)在适于本发明的形式(原始状态或氧化或还原状态的电子供体和电子受体)中，电子供体/电子受体复合物是稳定的并且不会解离成其组成成分，(ii)该部分不包含核酸，(iii)至少是双分子的电子供体/电子受体复合物的组成包含本领域技术人员可以确定的电子供体和电子受体，不用考虑各成分之间的键，和(iv)在相同或类似的外部条件下，光诱导型氧化还原活性的、连接的、至少是双分子的电子供体/电子受体复合物也是以单个分子的形式在溶液起电子供体和电子受体的作用，也就是说，即使在游离的溶解电子供体和电子受体的情况下，电子也可以直接或在某些外部条件的影响下从溶解的电子供体转移到溶解的电子受体，这取决于导致电子在光诱导型氧化还原活性部分内转移的条件。在适于本发明的作用方式下，光诱导型氧化还原活性的、连接的、至少是双分子的电子供体/电子受体复合物与光诱导型氧化还原活性蛋白/酶相当，也就是说，用适当波长的光线照射也会导致光诱导的电荷分离并且至少是暂时地形成电荷分离状态D⁺A^-(其中D代表D1、D2、D3等，A代表A1、A2、A3等)。在“光诱导型氧化还原

化学诱导型氧化还原活性的、连接的、至少是双分子的电子供体/电子受体复合物

活性的、连接的、至少是双分子的电子供体/电子受体复合物”的表达方式中，术语“至少是双分子的”表示该复合物是由至少一个电子供体和至少一个电子受体组成，即使供体是直接(或通过间隔基间接地)与受体共价连接。在组成和作用方式上与光诱导型氧化还原活性的、连接的、至少是双分子的电子供体/电子受体复合物，但与光诱导型氧化还原活性的、连接的、至少是双分子的电子供体/电子受体复合物不同的是，排除了光激活作为引发氧化还原活性部分的氧化还原活性的外部条件。给出适当选择的外部条件，只有当电子从还原剂转移到电子供体“D”(其仅在还原状态“D^-”时可以向受体“A”转移电子，而氧化剂仅从该氧化还原活性部分的还原的受体“A^-”获取电子)后，换句话说，在可以氧化A^-而不是A(连续的电荷转移)的氧化剂的存在下，氧化还原活性部分才显示其氧化还原活性，例如向适宜的氧化剂给出电子的特性。具体地讲，该氧化剂还可以是电极，例如，如果电极设置在可以氧化A^-而不是A的电位下。相反，给出不同的外部条件，如果仅有氧化的受体“A⁺”可以从供体D获取电子并且还原剂仅向氧化还原活性部分的氧化了的供体“D⁺”转移电子，例如在可以还原D⁺而不是D(连续的电荷转移)的还原剂的存在下，只有当电子从电子受体“A”转移到氧化剂之后，氧化还原活性部分才显示其氧化还原活性，例如从适宜的还原剂获取电子的特性。具体地讲，该还原剂还可以是电极，例如，如果电极设置在可

RCQ_A蛋白结合袋Q_A结合袋	以还原D⁺而不是D的电位下。在“氧化还原活性的、连接的、至少是双分子的电子供体/电子受体复合物”的表达方式中，术语“至少是双分子的”表示该复合物是由至少一个电子供体和至少一个电子受体组成，即使供体是直接(或通过间隔基间接地)与受体共价连接。反应中心。光诱导型氧化还原活性蛋白质/酶的实例。蛋白质/酶是称为颜料/蛋白质复合物的物质，由含有多个蛋白质亚单位的脱辅基蛋白质和多个辅因子(在RC的实例中称为颜料)组成。在细菌或植物的光合中，光驱动的电荷分离的第一步发生在所述的颜料/蛋白质复合物中。例如，类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)菌株的光合细菌的RC(参见结构1)由三个蛋白亚单位和8个辅因子(颜料)组成。辅因子，一个菌绿素二聚体P、两个细菌菌绿素单体B_A和B_B、两个菌褐藻素单体H_A和H_B和两个泛醌-50(UQ)分子Q_A和Q_B位于各自的蛋白结合袋(即P、B_A等结合袋)。醌辅因子Q_A所处的蛋白结合袋(或蛋白环境)。例如，在类球红细菌的RC中，醌辅因子Q_A是泛醌-50(参见结构1)。Q_A蛋白结合袋
RCQ_A蛋白结合袋Q_A结合袋		化学物质/基团
ZnBChlQUQ	菌绿素锌(式11，其中M＝Zn)广义的醌；在实施例3及其所涉及的段落中，Q是修饰的蒽醌或吡咯并喹啉醌(PQQ)。泛醌-50，RC辅因子和暂时的电子受体，例如在	化学物质/基团

(cyt c₂)²⁺PQQEDTA磺基-NHSEDCHEPESTris烷基链烯基链炔基

类球红细菌或绿色红假单胞菌的光合细菌的RC中。类球红细菌的细菌光合中的细胞色素c₂的还原形式，一种自由移动的血红素蛋白，可以将氧化了的初级供体P⁺还原成P；氧化还原活性物质的一个实例。吡咯并喹啉醌；相当于4，5-二氢-4，5-二氧代-1H-吡咯并-[2，3-f]-喹啉-2，7，9-三甲酸乙二胺四乙酸盐(钠盐)N-羟基磺基琥珀酰亚胺(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺N-[2-羟基乙基]哌嗪-N′-[2-乙磺酸]三羟基甲基氨基甲烷术语“烷基”是指直链或支链的饱和烃基(例如乙基、2，5-二甲基己基或异丙基等)。当“烷基”原来表示接头或间隔基时，该术语是指带有两个可用于共价连接之价键的基团(例如-CH₂CH₂-、-CH₂C(CH₃)₂CH₂CH₂C(CH₃)₂CH-或-CH₂CH₂CH-等)。优选作为取代基或侧链R的烷基是链长为1-30(彼此共价结合的原子的最长的连续链)的烷基。优选作为接头或间隔基的烷基是链长为1-20、特别是链长为1-14的烷基，此处的链长表示通过接头或间隔基连接的结构之间、也就是说两个分子之间或表面原子、表面分子或表面分子基团和另一个分子之间最短的连续连接。其中有一个或多个C-C单键被C＝C双键代替了的烷基基团。其中有一个或多个C-C单键或C＝C双键被C≡C叁

杂烷基杂链烯基杂链炔基接头间隔基(n x HS-间隔基)-oligo

键代替了的烷基或链烯基基团。其中有一个或多个C-H键或C-C单键被C-N、C＝N、C-P、C＝P、C-O、C＝O、C-S或C＝S键代替了的烷基基团。其中有一个或多个C-H键、C-C单键或C＝C双键被C-N、C＝N、C-P、C＝P、C-O、C＝O、C-S或C＝S键代替了的链烯基基团。其中有一个或多个C-H键、C-C单键、C＝C双键或C≡C叁键被C-N、C＝N、C-P、C＝P、C-O、C＝O、C-S或C＝S键代替了的链炔基基团。将两个分子连接或将一个表面原子、表面分子或表面分子基团与另一个分子连接的分子。接头通常可以以烷基、链烯基、链炔基、杂烷基、杂链烯基或杂链炔基链的形式购买到，所述的链在两个位置(可以相同或不同)用活泼基团衍生化。这些基团可在简单/已知的化学反应中与适宜的反应对象形成共价化学键。这些活泼基团也可以是光激活型的，即这些活泼基团仅被特定或任何给定波长的光线激活。优选的接头是链长为1-20、特别是链长为1-14的接头，此处的链长表示需要连接的结构之间、也就是说两个分子之间或表面原子、表面分子或表面分子基团和另一个分子之间最短的连续连接。通过活泼基团与一个或同时与两个待连接的结构共价连接的接头(参见接头)。优选的间隔基是链长为1-20、特别是1-14的间隔基，链长表示待连接结构之间最短的连续连接。有n个巯基功能基均通过间隔基与其连接核酸寡聚体，各间隔基可以有不同的链长(巯基功能基

(n x R-S-S-间隔基)oligooligo-间隔基-S-S-间隔基-oligo	与核酸寡聚体之间最短的连续连接)、特别是1至14之间的任何链长。这些间隔基本身又可以与核酸寡聚体上天然存在的或通过修饰固定在其上的各种活泼基团结合，“n”可以是1至20之间的任何整数。有n个二硫基功能基均通过间隔基与其连接核酸寡聚体，所述二硫基功能基可以被任何残基R所饱和。将二硫基功能基和核酸寡聚体连接的各间隔基可以有不同的链长(二硫基功能基与核酸寡聚体之间最短的连续连接)、特别是1至14之间的任何链长。这些间隔基本身又可以与核酸寡聚体上天然存在的或通过修饰固定在其上的各种活泼基团结合，“n”可以是1至20之间的任何整数。通过二硫键彼此连接的两个相同或不同的核酸寡聚体，所述二硫键通过任意两个间隔基与核酸寡聚体连接，两个间隔基可以具有不同的链长(二硫键与各核酸寡聚体之间最短的连续连接)、特别是1至14之间的任何链长，这些间隔基本身又可以与核酸寡聚体上天然存在的或通过修饰固定在其上的各种活泼基团结合。
(n x R-S-S-间隔基)oligooligo-间隔基-S-S-间隔基-oligo		修饰的表面/电极
云母Au-S-(CH₂)₂-ss-oligo-间隔基-UQ(RC)	白云母薄片，用于涂覆薄膜的载体材料。带有共价涂覆的衍生的12-bp单链DNA寡核苷酸(序列：TAGTCGGMGCA)单层的云母上的金膜。其中，3′-端的寡核苷酸磷酸酯末端被(HO-(CH₂)₂-S)₂酯化形成P-O-(CH₂)₂-S-S-(CH₂)₂-OH，S-S键被均裂并各产生一个Au-S-R键。寡核苷酸	修饰的表面/电极

Au-S-(CH₂)₂-ds-oligo-间隔基-UQ(RC)Au-S-(CH₂)₂-ss-oligo-间隔基-Q-ZnBChlAu-S-(CH₂)₂-ds-oligo-间隔基-Q-ZnBChl	5′-端的末端胸腺嘧啶在C-5碳上用-CH＝CH-CO-NH-CH₂-CH₂-NH₂修饰，该残基本身又通过其游离的氨基与修饰的泛醌-50的羧酸基团通过酰胺化连接。然后，UQ用剩余的RC重新构建。与同ss-ligo(序列：TAGTCGGAAGCA)互补的寡核苷酸杂交的Au-S-(CH₂)₂-ss-oligo-间隔基-UQ(RC)与Au-S-(CH₂)₂-ds-oligo-间隔基-UQ(RC)相同，但不是通过UQ连接RC，而是连接了Q-ZnBChl作为光诱导型氧化还原活性部分。与同ss-ligo(序列：TAGTCGGAAGCA)互补的寡核苷酸杂交的Au-S-(CH₂)₂-ss-oligo-间隔基-Q-ZnBChl。
		电化学
EE_oxi循环伏安法电流分析法	工作电极上的电极电位可逆电氧化或电还原的最大氧化电流时的电位电流密度(电流/cm²电极表面)记录电流-电压曲线。其中，静止工作电极的电位随时间线性改变，从不发生电氧化或电还原的电位开始，一直达到溶解或吸附在电极上的物质被氧化或被还原的电位(即，有电流流过)。在经过了氧化或还原操作(其在电流-电压曲线中产生开始增加的电流，在达到最大值后，电流开始逐渐减弱)后，将施加电位的方向逆转。然后在逆转操作中记录电氧化或电还原产物的行为。记录电流-时间曲线。其中，通过例如电位突升(potential jump)将静止工作电极的电位设置在溶	电化学

解或吸附的物质发生电氧化或电还原的电位，然后记录流过的电流随时间的变化。

本发明涉及通过化学结合氧化还原活性部分进行修饰的核酸寡聚体。氧化还原活性部分可以是光诱导型氧化还原活性部分，也可以是化学诱导型氧化还原活性部分。在光诱导的向外部氧化剂(例如电极)释放电子或从外部还原剂(例如电极)获取电子后，光诱导型氧化还原活性部分可以被游离的氧化还原活性物质再还原或再氧化，也就是说，它可以恢复到其原始状态。在向外部氧化剂给出电子后，化学诱导的氧化还原活性部分可以被外部还原剂(例如电极)还原，或在从外部还原剂获取电子后，被外部氧化剂(例如电极)氧化。

在本发明中，使用含有至少两个共价连接的核苷酸或至少两个共价连接的嘧啶(例如胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶)或嘌呤碱基(例如腺嘌呤或鸟嘌呤)的化合物、优选DNA、RNA或PNA片段作为核酸寡聚体。在本发明中，术语“核酸”是指任何共价连接的嘧啶或嘌呤碱基的骨架，例如DNA、cDNA或RNA的糖-磷酸酯骨架、PNA的肽骨架或类似的骨架结构，例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或磷酰胺骨架。本发明含义范围内的核酸的基本特点是它可以序列特异性地与天然的cDNA或RNA结合。术语“(探针)寡核苷酸”、“核酸”和“寡聚体”可以与术语“核酸寡聚体”互换使用。

本文中，术语“电子受体”或“电子受体分子”以及术语“电子供体”或“电子供体分子”是指氧化还原活性部分的成分。

本文中，“氧化还原活性部分”应理解为是指含有一个或多个电子供体分子和一个或多个电子受体分子的任何部分。该氧化还原活性部分的电子供体分子或分子部分以及电子受体分子或分子部分可以通过一种或多种共价键或离子键、通过氢键、范德华力键、π-π相互作用、或通过电子对供给和接受的配位作用彼此结合在一起，共价键可以是直接或间接的键(例如通过间隔基，但不通过核酸寡聚体)。此外，电子供体分子和/或电子受体分子可以整合到一种或多种大分子内，该整合作用可以通过包封在大分子的适宜的分子腔(结合袋)内、通过氢键、范德华力键、π-π相互作用、或通过大分子和电子供体分子和/或电子受体分子之间的电子对供给和接受的配位作用来完成。因此，在该情况下，大分子和电子供体分子以及电子受体分子形成氧化还原活性部分。如果氧化还原活性部分由多个大分子组成，大分子之间也可以通过共价键、离子键、氢键、范德华力键、π-π相互作用、或通过电子对供给和接受的配位作用进行结合。

根据本发明，上述的供体和受体分子形成氧化还原活性部分，即，它们直接或通过其它分子部分相互连接。根据本发明，对于连接氧化还原活性部分各成分的分子或分子部分的唯一限制是其不包括核酸寡聚体。根据本发明，氧化还原活性部分作为完整的部分与探针寡核苷酸结合，当然，在寡核苷酸和氧化还原活性部分之间可以形成多种化学键。排除核酸寡聚体作为连接氧化还原活性部分各成分的分子或分子部分是想要清楚地证实并不是氧化还原活性部分的各个部分连接在探针寡核苷酸的各个位点。因此，探针寡核苷酸明确不表示氧化还原活性部分的电子供体分子或分子部分和电子受体分子或分子部分之间的连接。

氧化还原活性部分可以是光诱导型氧化还原活性部分，也可以是化学诱导型氧化还原活性部分。

本文中，“光诱导型”是指光诱导型氧化还原活性部分仅在用特定或任何给定波长的光线照射时才显示氧化还原活性，也就是说在某些外部条件下向适宜的氧化剂给出电子或从适宜的还原剂获取电子的特性。在用特定或任何给定波长的光线照射时，电子供体“D”给出一个电子到电子受体“A”并至少是暂时性地形成包含氧化的供体和还原的受体的电荷分离状态D⁺A^-。这种在光诱导型氧化还原活性部分内的过程称为光诱导的电荷分离。给出适当选择的外部条件，例如在可以氧化A^-而不是A的氧化剂的存在下(或在可以将D⁺而不是D还原的还原剂的存在下)，光诱导型氧化还原活性部分仅在电荷分离状态显示其氧化还原活性，因为还原剂仅向光诱导型氧化还原活性部分的氧化了的供体转移电子或者氧化剂仅从还原了的受体获取电子。

具体地讲，上述的氧化剂或还原剂可以是电极，例如，如果将电极设置在可以氧化A^-而不是A(或者可以还原D⁺而不是D)的电位下，光诱导型氧化还原活性部分仅在光诱导的电荷分离之后可以向电极给出电子(或从电极获取电子)。此外，氧化剂或还原剂还可以是游离的氧化还原活性物质，例如，如果游离的氧化还原活性物质可以氧化A^-而不是A(或者可以还原D⁺而不是D)，光诱导型氧化还原活性部分仅在光诱导的电荷分离之后可以向游离的氧化还原活性物质给出电子(或从其获取电子)。

本文中，“化学诱导型”是指化学诱导型氧化还原活性部分仅在被外部的还原剂(或氧化剂)还原(或氧化)之后才显示氧化还原活性，也就是说在某些外部条件下向适宜的氧化剂给出电子(或从适宜的还原剂获取电子)的特性。化学诱导型氧化还原活性部分在组成和作用方式上与光诱导型氧化还原活性部分相当，但与光诱导型氧化还原活性部分的作用方式不同的是，排除了光激活作为引发氧化还原活性部分的氧化还原活性的外部条件。给出适当选择的外部条件，只有当电子从还原剂转移到电子供体“D”之后，化学诱导型氧化还原活性部分才显示其氧化还原活性，例如向适宜的氧化剂给出电子的特性。只有在还原状态“D^-”时电子供体才可以向受体“A”转移电子，而氧化剂仅从该氧化还原活性部分的还原的受体“A^-”获取电子，例如在可以氧化A^-而不是A(连续的电荷转移)的氧化剂的存在下。具体地讲，所述氧化剂还可以是电极，例如，如果电极设置在可以氧化A^-而不是A的电位下。相反，给出不同的外部条件，只有当电子从电子受体“A”转移到氧化剂之后，化学诱导型氧化还原活性部分才显示其氧化还原活性，例如从适宜的还原剂获取电子的特性。仅有在氧化状态“A⁺”时电子受体才可以从供体D获取电子并且还原剂仅向氧化还原活性部分的氧化了的供体“D⁺”转移电子，例如在可以还原D⁺而不是D(连续的电荷转移)的还原剂的存在下。具体地讲，所述还原剂还可以是电极，例如，如果电极设置在可以还原D⁺而不是D的电位下。

除了含有电子供体和电子受体或电子供体、电子受体和大分子外，光诱导型或化学诱导型氧化还原活性部分的基本特点是：(i)在适于本发明的形式(原始状态或氧化或还原状态的电子供体和电子受体)中，该部分是稳定的并且不会解离成其组成成分，(ii)该部分不包含核酸，(iii)该部分的组成包含本领域技术人员可以识别的电子供体和电子受体或电子供体、电子受体和大分子而不考虑各成分之间的键，因为在理论上电子供体和受体还可以是单个的分子，(iv)在与适于本发明的形式相同或类似的外部条件下，作为氧化还原活性部分的组成成分的电子供体和电子受体还可以以单个分子的形式在溶液中起电子供体和电子受体的作用，也就是说，即使在游离的溶解电子供体和电子受体的情况下，电子也可以直接或在某些外部条件的影响下从溶解的电子供体转移到溶解的电子受体，这取决于导致电子在氧化还原活性部分内转移的条件。在光诱导型氧化还原活性部分的电子供体和电子受体的情况下，对于游离、溶解的电子供体和电子受体的外部条件可以是由游离、溶解的电子供体和电子受体吸收光线，电子供体“D”给出一个电子到电子受体“A”并至少是暂时性地形成包含游离、溶解的氧化的供体和游离、溶解的还原的受体的电荷分离状态D⁺A^-。另一种外部条件可以是，与化学诱导型氧化还原活性部分的电子供体和电子受体一样，由还原剂向游离、溶解的电子供体转移电子或由游离、溶解的电子受体向氧化剂释放电子。

光诱导型氧化还原活性部分可以是例如任何光诱导型氧化还原活性的蛋白/酶或任何光诱导型氧化还原活性的、连接的、至少是双分子的电子供体/电子受体复合物。在“光诱导型氧化还原活性的、连接的、至少是双分子的电子供体/电子受体复合物”的表达方式中，术语“至少是双分子的”是指该复合物是由至少一个电子供体和至少一个电子受体组成，即使该供体是直接(或通过间隔基间接地)与该受体共价连接的。在用特定或任何给定波长的光线照射时，电子供体给出一个电子到电子受体之一，并至少是暂时性地形成包含氧化的供体和还原的受体的电荷分离状态D⁺A^-。这种在光诱导型氧化还原活性部分内的过程称为光诱导的电荷分离。给出适当选择的外部条件，例如在可以将D⁺而不是D还原的还原剂的存在下(或在可以氧化A^-而不是A的氧化剂的存在下)，光诱导型氧化还原活性部分仅在电荷分离的状态显示其氧化还原活性，也就是它向适宜的氧化剂给出电子或从适宜的还原剂获取电子的特性，因为还原剂仅向光诱导型氧化还原活性部分的氧化了的供体转移电子或者氧化剂仅从还原了的受体获取电子。具体地讲，该氧化剂或还原剂还可以是电极，例如，如果电极设置在可以氧化A^-而不是A(或者可以还原D⁺而不是D)的电位下，光诱导型氧化还原活性部分仅在光诱导的电荷分离之后可以向电极给出电子(或从电极获取电子)。

化学诱导型氧化还原活性部分可以是例如任何化学诱导型氧化还原活性的蛋白/酶或任何化学诱导型氧化还原活性的、连接的、至少是双分子的电子供体/电子受体复合物。在“化学诱导型氧化还原活性的、连接的、至少是双分子的电子供体/电子受体复合物”的表达方式中，术语“至少是双分子的”是指该复合物是由至少一个电子供体和至少一个电子受体组成，即使该供体是直接(或通过间隔基间接地)与该受体共价连接的。给出适当选择的外部条件，只有当被外部还原剂还原或被外部氧化剂氧化之后，化学诱导型氧化还原活性部分才显示其氧化还原活性，也就是说向适宜的氧化剂给出电子或从适宜的还原剂获取电子的特性。只有当电子从还原剂转移到电子供体“D”之后，还原了的供体“D^-”才能向受体“A”转移电子，而氧化剂仅从该氧化还原活性部分的还原的受体“A^-”获取电子。具体地讲，上述氧化剂还可以是电极，例如，如果电极设置在可以氧化A^-而不是A的电位下。相反，给出不同的外部条件，只有当电子从电子受体“A”转移到外部氧化剂之后，处于氧化状态“A⁺”的化学诱导型氧化还原活性部分的电子受体才能够从电子供体D获取电子，而还原剂仅向氧化还原活性部分的氧化了的供体“D⁺”转移电子。具体地讲，上述还原剂还可以是电极，例如，如果电极设置在可以还原D⁺而不是D的电位下。

本文中，术语“氧化剂”是指可以通过从另一种化合物(化学物质、电子供体、电子受体)获取电子将所述的另一种化合物(化学物质、电子供体、电子受体)氧化的化合物(化学物质)。氧化剂的行为与电子受体类似，但在本发明中是指不直接属于氧化还原活性部分的外部电子受体。其中的“不直接”是指该氧化剂或者是不与核酸寡聚体结合但与其相接触的游离的氧化还原活性物质，或者该氧化剂与核酸寡聚体共价连接在核酸寡聚体上，但所述位点与氧化还原活性部分共价连接位点相隔至少两个共价连接的核苷酸或至少两个共价连接的嘧啶或嘌呤碱基的位点。具体地讲，电极可以代表氧化剂。

本文中，术语“还原剂”是指可以通过向另一种化合物(化学物质、电子供体、电子受体)提供电子将所述的另一种化合物(化学物质、电子供体、电子受体)还原的化合物(化学物质)。还原剂的行为与电子供体类似，但在本发明中是指不直接属于氧化还原活性部分的外部电子供体。其中的“不直接”是指该还原剂或者是不与核酸寡聚体结合但与其相接触的游离的氧化还原活性物质，或者该还原剂与核酸寡聚体共价连接在核酸寡聚体上，但所述位点与氧化还原活性部分共价连接位点相隔至少两个共价连接的核苷酸或至少两个共价连接的嘧啶或嘌呤碱基的位点。具体地讲，电极可以代表还原剂。

本文中，术语“游离的氧化还原活性物质”是指不与氧化还原活性部分、核酸寡聚体或导电表面共价连接，但通过例如加入到修饰的导电表面的溶液与其相接触的游离的氧化剂或还原剂，游离的氧化还原活性物质可以是例如不带电荷的分子、各种盐或氧化还原活性蛋白或酶(氧化还原酶)。游离的氧化还原活性物质的特征在于它可以再还原光诱导型氧化还原活性部分的氧化的供体(或再氧化还原的受体)，或者游离的氧化还原活性物质可以还原化学诱导型氧化还原活性部分的供体(或氧化受体)。此外，氧化还原活性物质的特征还在于它在电位下是可以氧化和可以还原的，其中的满足2.0V≥≥-2.0V的条件。此处的电位是指用标准氢电极在适宜的溶剂中对游离的氧化还原活性分子测得的。对于本发明，优选1.7V≥≥-1.7V的电位范围，特别优选1.4V≥≥-1.2V的电位范围，首选0.9V≥≥-0.7V的电位范围，在该电位下可以氧化(或还原)本申请实施例的氧化还原活性物质。

修饰的核酸寡聚体直接或间接地(通过间隔基)与导电表面连接。术语“导电表面”应理解为是指任意厚度的各种导电表面，特别是金属表面、含有金属合金的表面或掺杂或非掺杂的半导体表面，所有半导体均可以以纯净物或混合物的形式使用。对于本发明，导电表面可以单独存在或涂覆在任何载体材料例如玻璃上。对于本发明，术语“电极”可以和“导电表面”互换使用。

术语“修饰的导电表面”是指通过连接用氧化还原活性部分修饰的核酸寡聚体进行修饰的导电表面。

另一方面，本发明涉及电化学测定分子结构的方法，具体地讲，本发明涉及通过序列特异性的核酸寡聚体杂交在探针溶液中电化学检测DNA/RNA/PNA片段的方法。通过电信号检测杂交事件是一种简单而且经济的方法，在使用电池的变化方法中，可以进行在位(on site)应用。

本发明还提供了测定分子结构的光寻址读出方法(photoaddressable read-out method)，该方法可以通过例如电信号在寡聚体芯片上检测杂交事件。根据本发明，“光寻址(寡聚体芯片)读出方法”是一种分子结构的检测局限在(完整寡聚体芯片的)完整系统内特定试验位点或试验位点组的方法，其中，将特定或任何给定波长的光线在空间上聚焦在(局限在)该试验位点(基团)以诱导光诱导型氧化还原活性部分的氧化还原活性。氧化还原活性部分与核酸寡聚体的结合

本发明方法的必备条件是将光诱导型氧化还原活性部分或化学诱导型氧化还原活性部分与核酸寡聚体结合。

以下是光诱导型氧化还原活性部分的一些例子：(i)光合细菌反应中心(RC)，例如具有图示结构1的类球红细菌的RC；其它光合细菌的RC，例如绿色红假单孢菌(Rhodopseudomonasviridis)或荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)的反应中心；或光合植物的反应中心，例如光系1或光系，例如光诱导型氧化还原活性蛋白/酶。(ii)具有结构通式2的cyclophanes或桥接的卟啉醌体系，光诱导型氧化还原活性的、连接的、至少是双分子的电子供体/电子受体复合物的一个实例。电子受体(结构式2中的1，4-苯醌)和电子供体(结构式2中的金属卟啉)之间的两个间隔基-桥接的共价连接(结构式2中的“--间隔基--”)可以固定在电子供体和/或电子受体上的任何位点。除了结构式2中所示的电子受体外，也可以使用通式1的黄素类、通式2的烟酰胺类或其它的醌类，例如通式3-8所示的醌类或其它有机或无机电子受体，此外，除了通式9的(金属)卟啉外，也可以使用其它电子供体例如通式10的(金属)叶绿素或通式11的(金属)菌绿素或其它有机或无机电子供体。此外，简单的共价的(间隔基)桥接的电子供体/电子受体复合物例如式9的物质和式1-8的物质之一的共价化合物、式10的物质和式1-8的物质之一的共价化合物或式11的物质和式1-8的物质之一的共价化合物也可以用作光诱导型氧化还原活性的、连接的、至少是双分子的电子供体/电子受体复合物。(iii)其中的电子供体(之一)和/或电子受体(之一)是电荷转移复合物或过渡金属复合物的光诱导型氧化还原活性的、连接的、至少是双分子的电子供体/电子受体复合物。

过渡金属复合物的例子是[Ru(bipy)₂(py)(im)]²⁺、任何其它的[Ru(II)(L1)(L2)(L3)(L4)(L5)(L6)]复合物、Cr(III)、Fe(II)、Os(II)或Co(II)复合物，其中“bipy”表示双吡啶基配体，“py”表示吡啶基配体，“im”表示咪唑配体，L1至L3表示任意配体，并且可以有多于或少于6个的配体配位在一个过渡金属上。

化学诱导型氧化还原活性部分的例子是，作为化学诱导型氧化还原活性蛋白/酶的例子，光合细菌的细胞色素-bc复合物或细胞色素-c₂复合物(一种含有蛋白基质和四个内含的铁卟啉辅因子作为电子供体和/或电子受体的复合物)，或者，作为化学诱导型氧化还原活性的、连接的、至少是双分子的电子供体/电子受体复合物的例子，如(ii)和(iii)项下所列的适当组成的cyclophanes或类似的化合物。

结构式1：由辅因子P(初级供体、菌绿素二聚体)、B_A和B_B(菌绿素单体)、H_A和H_B(菌脱镁叶绿素)、Q_A和Q_B(泛醌-50)以及包封辅因子的蛋白亚单位L、M和H(未示出)组成的反应中心。结构式2：cyclophane；M＝例如2H、Mg、Zn、Cu、Ni、Pd、Co、Cd、Mn、Fe、Sn、Pt等；R₁至R₈或间隔基彼此独立地是任何烷基、链烯基、链炔基、杂烷基、杂链烯基或杂链炔基取代基。

式1 式2

式3 式4

式5 式6

式7 式8R₁至R₈彼此独立地是H或任何烷基、链烯基、杂烷基、杂链烯基或杂链炔基取代基。

式9 式10

式11M＝2H、Mg、Zn、Cu、Ni、Pd、Co、Cd、Mn、Fe、Sn、Pt等；R₁至R₁₂彼此独立地是H或任何烷基、链烯基、链炔基、杂烷基、杂链烯基或杂链炔基取代基。

此外，根据本发明，氧化还原活性部分的一个显著特点是所述部分可以向同样共价连接在核酸寡聚体上的氧化剂给出电子，或者从同样共价连接在寡核苷酸上的另一种还原剂获取电子，该氧化剂或还原剂可以是导电表面(电极)并且该氧化还原活性部分还可以通过向该电极施加电化学可使用的电位范围内的外部电压进行电氧化/电还原。

根据本发明，氧化还原活性物质的一个显著特点是，该物质可以在光诱导型氧化还原活性部分向共价连接在寡核苷酸上的与氧化还原活性物质不同的另一种氧化剂给出电子后，将所述光诱导型氧化还原活性部分再还原，或者在光诱导型氧化还原活性部分从共价连接在寡核苷酸上的与氧化还原活性物质不同的另一种还原剂获取电子后将其再氧化，或者游离的氧化还原活性物质可以还原(或者氧化)化学诱导型氧化还原活性部分的供体(或受体)。根据本发明，任何氧化还原活性物质均可以使用，只要它可以在2.0V≥≥-2.0V的电位下被氧化和还原，并且该电位适于在所述光诱导型氧化还原活性部分向同样共价连接在核酸寡聚体上的另一种氧化剂给出电子后(或者从同样共价连接在核酸寡聚体上的另一种还原剂获取电子后)将其再还原(或再氧化)或者适于还原或氧化所述的化学诱导型氧化还原活性部分即可。此处的电位是指用标准氢电极在适宜的溶剂中对游离的、未修饰的氧化还原活性物质测得的。对于本发明，优选1.7V≥≥-1.7V的电位范围，特别优选1.4V≥≥-1.2V的电位范围，首选0.9V≥≥-0.7V的电位范围，在该电位下可以氧化(或再还原)本申请实施例的氧化还原活性物质。除了常用的有机和无机氧化还原活性分子例如六氰基高铁酸盐、二茂铁、二茂钴和醌外，还可以使用抗坏血酸(或其Na⁺盐)、[Ru(NH₃)₆]²⁺或细胞色素c₂(cyt c₂)²⁺，细胞色素c₂是一种可以自由移动的含铁蛋白，它可以将类球红细菌的RC中氧化了的初级供体P⁺还原成P，在此过程中，它本身被氧化成(cyt c₂)³⁺。

在本发明的一个优选实施方案中，光诱导型或化学诱导型氧化还原活性的、连接的、至少是双分子的电子供体/电子受体复合物以这样的方式被包含在一种或多种大分子内，即，大分子通过防止氧化还原活性的、连接的、至少是双分子的电子供体/电子受体复合物在电极的直接电氧化/电还原而起到氧化还原活性的、连接的、至少是双分子的电子供体/电子受体复合物的电绝缘的包封末端的作用，例如在电极和氧化还原活性的、连接的、至少是双分子的电子供体/电子受体复合物之间直接接触的情况下，但允许由双链核酸寡聚体介导的电子供体/电子受体复合物的间接电氧化/电还原。所述大分子可以是例如特制的环糊精，由于它可以成型成内部中空的修剪的圆锥的形状，从而可以包裹cyclophane或类似的电子供体/电子受体复合物。

根据本发明，通过将核酸寡聚体与氧化还原活性部分或它的一部分反应将氧化还原活性部分与核酸寡聚体共价连接(参见“实施本发明的方式”)。该键可以通过四种不同的方式形成：a)使用寡核苷酸骨架的游离磷酸、糖-C-3-羟基、羧酸或氨基、特别是寡核苷酸骨架两个末端的基团作为在核酸寡聚体上成键的活泼基团。游离的末端磷酸、糖-C-3-羟基、羧酸或氨基显示增加的反应性，因此很容易发生常规的反应，例如用(伯或仲)氨基或酸基团酰胺化；用(伯、仲或叔)醇或酸基团酯化；与(伯、仲或叔)硫醇或酸基团形成硫酯，或者将胺与醛缩合然后将形成的CH＝N键还原成CH₂-NH键。与氧化还原活性部分共价连接所需的偶联基团(酸、醇、硫醇或醛功能基)可以是氧化还原活性部分上天然存在的，也可以通过化学修饰氧化还原活性部分得到。氧化还原活性部分的连接可以是完全的，或是氧化还原活性的部分连接然后完成全部氧化还原活性部分连接(见下)。b)通过任意组成和链长(彼此连接的最长的连续原子链)的、特别是链长为1至14的共价连接的分子部分(间隔基)在寡核苷酸骨架或在碱基上用活泼基团对核酸寡聚体进行修饰。修饰优选在寡核苷酸骨架的一端或在末端碱基上进行。可以使用烷基、链烯基、链炔基、杂烷基、杂链烯基或杂链炔基取代基作为间隔基。用于在氧化还原活性部分和修饰的核酸寡聚体之间形成共价键的可能的简单反应是，如a)项下所述，由酸和氨基酰胺化、由酸和醇基团酯化、由酸和硫醇基团形成硫酯或者将醛与胺缩合然后将形成的CH＝N键还原成CH₂-NH键。氧化还原活性部分的连接可以是完全的，或氧化还原活性的部分连接，然后完成全部氧化还原活性部分的连接(见下)。c)如果合成核酸寡聚体，末端碱基将被氧化还原活性部分代替。氧化还原活性部分的连接可以是完全的，或氧化还原活性的部分连接，进行然后完成全部氧化还原活性部分的连接(见下)。d)如果使用连接的(至少是双分子的)电子供体/电子受体复合物作为氧化还原活性部分，在第一步共价修饰中，如本章节的b)或c)项下所述，电子受体(或供体)将与末端碱基结合或代替末端碱基与核酸寡聚体结合，然后，在电子供体(或受体)的第二步共价修饰中，如本章节的a)项下所述，在核酸寡聚体骨架的同一端与骨架的活泼基团结合或与受体(或供体)的活泼基团结合。如果使用共价连接的、三分子或更多分子的电子供体/电子受体复合物，则可以在第一步共价修饰中用电子供体/电子受体复合物的任何部分代替电子受体(或供体)，然后在第二步或其它的共价修饰中完成。

根据本发明，氧化还原活性部分与核酸寡聚体的结合可以在核酸寡聚体与导电表面结合之前或结合之后，完全发生或部分发生。因此，在用含有脱辅基蛋白质和辅因子的氧化还原活性蛋白/酶代替完整的氧化还原活性部分的情况下，也可以仅连接脱辅基蛋白质、脱辅基蛋白质和一部分辅因子或一种或多种辅因子，然后通过用剩余的部分重建来完成氧化还原活性部分的连接。如果使用连接的(至少是双分子的)电子供体/电子受体复合物作为氧化还原活性部分，在第一步共价修饰中，如本章节的b)或c)项下所述，电子受体(或供体)将与末端碱基结合或代替末端碱基与核酸寡聚体结合，然后，在电子供体(或受体)的第二步共价修饰中，如本章节的a)项下所述，在核酸寡聚体骨架的同一端与骨架的活泼基团结合。如果使用共价连接的、三分子或更多分子的电子供体/电子受体复合物，则可以在第一步共价修饰中用电子供体/电子受体复合物的任何部分代替电子受体(或供体)，然后在第二步共价修饰中完成。这些修饰可以在核酸寡聚体与导电表面结合之前和结合之后进行。

如果在一个共享表面上有多个不同的核酸寡聚体组合(试验位点)，并且氧化还原活性部分是在核酸寡聚体被固定后连接到表面上的，则最好通过适当地选择各试验位点的游离核酸寡聚体末端的活泼基团将整个表面上氧化还原活性部分与核酸寡聚体的(共价)连接标准化。

如果使用氧化还原活性蛋白/酶作为氧化还原活性部分，核酸寡聚体的共价连接可以发生在蛋白上天然存在的或通过修饰固定在蛋白上的任何活泼基团上，或者，当氧化还原活性蛋白/酶由脱辅基蛋白质和辅因子组成时，共价连接可以发生在辅因子上天然存在的或通过修饰固定在辅因子上的任何活泼基团上。对于本发明，优选在蛋白的辅因子上天然存在或通过修饰固定在辅因子上的任何活泼基团的共价连接。不想受到机械细节的束缚，如果多个辅因子，特别优选可以向同样共价连接在核酸寡聚体上的外部氧化剂给出电子或者可以从同样共价连接在核酸寡聚体上的外部还原剂剂获取电子的辅因子(参见“电流滴定检测核酸寡聚体杂合物的方法”一节)。导电表面

根据本发明，术语“导电表面”应理解为是指具有任意厚度的导电表面的任何载体，特别是含有铂、钯、金、镉、汞、镍、锌、碳、银、铜、铁、铅、铝和锰的表面。

此外，也可以使用任意厚度的任何掺杂或非掺杂的半导体表面。所有半导体均可以以纯净物或混合物的形式使用。其例子包括但不仅限于，碳、硅、锗、α锡以及任何晶体结构的卤化亚铜(I)和卤化银(I)。同样适宜的是含有14和16族元素、13和15族元素、15和16族元素的任何组成和任何结构的各种二元化合物。此外，也可以使用含有11、13和16族元素或12、13和16族元素的任何组成和任何结构的三元化合物。对周期表各族的指定参照了IUPAC在1985年所推荐的。核酸寡聚体与导电表面的结合

根据本发明，将核酸寡聚体直接或通过接头/间隔基与上述类型的导电表面的表面原子或分子连接。结合可以以三种不同的方式进行：

a)将表面以活泼分子基团易于接近的方式进行修饰。这可以通过将表面分子直接衍生化来进行，例如，通过湿法化学或电化学氧化/还原。因此，例如，可以通过湿法化学氧化在石墨电极的表面提供醛或羧酸基团。电化学可以通过例如在芳基-重氮盐的存在下还原在石墨电极表面偶联适宜的(功能基化的，即，带有活泼基团)芳基基团，或者通过在R′CO₂H的存在下氧化在石墨电极表面偶联(功能基化的)R′-基团。直接修饰半导体表面的一个例子是将硅表面衍生化成活泼的甲硅烷醇，即，在表面上带有Si-OR″基团的硅载体，R″和R′均表示任何功能基化的有机残基(例如烷基、链烯基、链炔基、杂烷基、杂链烯基或杂链炔基取代基)。或者，完整的表面可以通过共价连接双功能基接头的活泼基团进行修饰，从而在表面上形成含有各种分子并且含有活泼基团(优选在末端)的单分子层。术语“双功能基接头”是指任何链长的、特别是链长为2-14的、带有两个相同(同双功能基)或两个不同(杂双功能基)活泼分子基团的分子。

如果通过使用光刻法在表面上形成多个不同的试验位点，则同-或杂双功能基接头的活泼基团中至少有一个是光诱导型活泼基团，即，仅在受到特定或任何给定波长的光线照射时才变活泼的基团。接头以这样的方式应用，即，当接头与表面共价连接后光激活的活泼基团是可以利用的。核酸寡聚体共价连接在修饰的表面，并且被活泼基团通过任意组成和链长、特别是链长1-14的间隔基修饰，优选靠近核酸寡聚体的一端。寡核苷酸的活泼基团是可以直接(或间接)与修饰的表面反应形成共价键的基团。此外，可以在核酸寡聚体的靠近其第二个末端处结合另一个活泼基团，该活泼基团直接或通过任意组成和链长、特别是链长1-14的间隔基连接。此外，作为所述另一个活泼基团的替代物，可以将氧化还原活性部分(完整的或其一部分)连接在核酸寡聚体的第二个末端。

b)将准备涂覆于导电表面的核酸寡聚体用一种或多种活泼基团通过任意组成和链长、特别是链长为1-14的共价连接的间隔基修饰，活泼基团的位置优选靠近核酸寡聚体的一端。活泼基团是可以直接与未修饰的表面反应的基团。例如：(i)通式为(n x HS-间隔基)-oligo、(n x R-S-S-间隔基)-oligo或oligo-间隔基-S-S-间隔基-oligo的巯基-(HS-)或二硫化物-(S-S-)衍生的核酸寡聚体，它与金表面反应形成金-硫键或(ii)通过化学吸附或物理吸附连接在铂或硅表面的胺。此外，可以在核酸寡聚体的靠近其第二个末端处结合另一个活泼基团，该活泼基团直接或通过任意组成和链长、特别是链长为1-14的间隔基连接。此外，作为所述另一个活泼基团的替代物，可以将光诱导型氧化还原活性部分(完整的或其一部分)连接在寡核苷酸的第二个末端。用多个间隔基桥接的巯基或二硫化物桥((n x HS-间隔基)-oligo或(n x R-S-S-间隔基)-oligo)修饰的核酸寡聚体的优点是，从核酸一端来看，如果将巯基或二硫化物功能基与核酸寡聚体连接的间隔基具有增加或减少的链长，该核酸寡聚体可以以特定的安装角(曲面法线和双链螺旋状核酸寡聚体的螺旋轴之间的角度或曲面法线和与双链非螺旋状核酸寡聚体的碱基对垂直的轴之间的角度)涂覆于导电表面。

c)在探针核酸寡聚体上用作活泼基团的基团是寡核苷酸骨架的磷酸、糖-C-3-羟基、羧酸或氨基，特别是末端基团。磷酸、糖-C-3-羟基、羧酸或氨基显示增加的反应性，因此很容易发生常规的反应，例如用(伯或仲)氨基或酸基团酰胺化；用(伯、仲或叔)醇或酸基团酯化；与(伯、仲或叔)硫醇或酸基团形成硫酯，或者将胺与醛缩合然后将形成的CH＝N键还原成CH₂-NH键。在该情况下，与磷酸、糖-C-3-羟基、羧酸或氨基共价连接所需的偶联基团是用具有任意分子长度的(单分子)层衍生化的表面的一部分(如本节a)项下所述)，或者磷酸、糖-C-3-羟基、羧酸或氨基直接与未修饰的表面反应(如本节b)项下所述)。此外，可以在寡核苷酸的靠近其第二个末端处结合另一个活泼基团，如上所述，该活泼基团直接或通过任意组成和链长、特别是链长为1-14的间隔基连接。此外，作为所述另一个活泼基团的替代物，可以将氧化还原活性部分(完整的或其一部分)连接在核酸寡聚体的第二个末端。

核酸寡聚体与导电表面的结合可以在氧化还原活性部分与核酸寡聚体连接之前或连接之后进行。在用含有脱辅基蛋白质和辅因子的氧化还原活性蛋白/酶代替完整的氧化还原活性部分的情况下，也可以仅连接脱辅基蛋白质、脱辅基蛋白质和一部分辅因子或一种或多种辅因子，然后通过用剩余的部分重建来完成氧化还原活性部分。如果使用连接的(至少是双分子的)电子供体/电子受体复合物作为氧化还原活性部分，如“氧化还原活性部分与核酸寡聚体的结合”一节的b)或c)项下所述，电子受体(或供体)可以与末端碱基结合或代替末端碱基与核酸寡聚体结合，然后，电子供体(或受体)可与电子受体(或供体)的活泼基团共价连接，或者如“氧化还原活性部分与核酸寡聚体的结合”一节的a)项下所述，与核酸寡聚体骨架同一端的末端活泼基团结合(参见“实施本发明的方式”一节)。或者，核酸寡聚体与导电表面的结合可以在带有用于结合氧化还原活性部分的活泼基团的间隔基连接之前或连接之后进行。将已经修饰过的核酸寡聚体与导电表面结合，即，在氧化还原活性部分与核酸寡聚体连接之后或者在连接了氧化还原活性部分的片段之后，或者在连接了带有用于结合氧化还原活性部分的活泼基团的间隔基之后与表面结合，也按照本节a)至c)项下所述进行。

在产生试验位点时，当将单链核酸寡聚体与表面连接时，必需注意在各核酸寡聚体之间保留足够的距离，以提供首先是与靶核酸寡聚体杂交所需的空间，其次是连接氧化还原活性部分所需的空间。就此而言，有三种不同的进行方法(及其组合形式)：

1.)通过连接杂交的核酸寡聚体产生修饰的表面，也就是说，用杂交的探针核酸寡聚体代替单链探针寡核苷酸衍生表面。用于杂交的核酸寡聚体链是未修饰的(表面连接按照本节a)-c)项下所述)。然后，将杂交的核酸寡聚体双链是进行热去杂交(dehybridized)，由此产生在探针核酸寡聚体之间有较大距离的单链核酸寡聚体修饰的表面。

2.)通过连接单链或双链核酸寡聚体产生修饰的表面，在表面衍生化的过程中加入适宜的单功能基接头，除了单链或双链核酸寡聚体外，所述单功能基接头也与表面结合(表面连接按照本节a)-c)项下所述进行)。根据本发明，单功能基接头的链长与表面和核酸寡聚体之间的间隔基的链长相同，或者相差最多4个链原子。如果用双链核酸寡聚体进行表面衍生化，在双链核酸寡聚体和接头共同连接在表面上之后将核酸寡聚体双链热去杂交。通过同时将接头与表面连接，同样结合在表面上的单链或双链核酸寡聚体之间的距离得到增加。如果使用双链核酸寡聚体，该效果可以通过随后进行热去杂交进一步放大。

3.)通过连接已经连接了氧化还原活性部分的单链或双链寡核苷酸产生修饰的表面，氧化还原活性部分的直径大于30埃。如果使用双链寡核苷酸，在双链寡核苷酸与表面连接之后将寡核苷酸双链是热去杂交。

关于“氧化还原活性部分与核酸寡聚体的结合”以及“寡核苷酸与导电表面的结合”中的各个步骤，应当注意，在“实施本发明的方式”一节中，在一个例子中证实了可以产生相同的最终结果的各步骤的各种组合可能性(图2)。电化学检测核酸寡聚体杂合物的方法

根据电化学检测核酸寡聚体杂合物的方法，优选将多个不同序列的核酸寡聚体、最好是所有所需的核酸寡聚体的组合涂覆于寡聚体(DNA)芯片上以检测任意靶核酸寡聚体或(片段化的)靶DNA的序列，或者寻找和序列特异性地检测靶中的突变。为此，将导电表面上特定区域(试验位点)的表面原子或分子按照以上描述与具有已知但任意序列的DNA/RNA/PNA核酸寡聚体连接。但是，在最常见的实施方案中，DNA芯片还可以用单个探针寡核苷酸衍生化。优选的探针核酸寡聚体是碱基长度为3至50、优选长度为5至30、特别优选长度为8至25的核酸寡聚体(例如DNA、RNA或PNA片段)。根据本发明，氧化还原活性部分按照以下描述与探针核酸寡聚体结合。

探针核酸寡聚体用氧化还原活性部分的修饰可以是完全的或者是在氧化还原活性部分的组成成分上、在寡核苷酸探针与导电表面结合之前或结合之后进行。在“实施本发明的方式”一节中借助图2以氧化还原活性部分与电极通过探针寡核苷酸结合为例对各步骤的各种组合可能性(反应顺序)进行了说明。

不论各自的反应顺序如何，均会产生具有通式结构elec-间隔基-ss-oligo-间隔基-部分的表面杂合物，其中“部分”表示光诱导型或化学诱导型氧化还原活性部分。当然，也可以产生没有间隔基或仅有一个间隔基(elec-ss-oligo-间隔基-部分或elec-间隔基-ss-oligo-部分)的桥。在图2的例子中，所述的部分是光诱导型氧化还原活性部分，即类球红细菌菌株的光合细菌的反应中心(RC)，一种由脱辅基蛋白质和辅因子组成的光诱导型氧化还原活性蛋白。在图2、3和4的例子中，RC通过其位于称为RC的QA蛋白结合袋内的辅因子泛醌-50(UQ)与核酸寡聚体共价连接。RC与QA结合袋内的辅因子泛醌-50形成1∶1复合物，泛醌-50与核酸寡聚体以所述的方式共价结合。在图5和6的例子中，所述部分是光诱导型氧化还原活性的、连接的、至少是双分子的电子供体/电子受体复合物，即共价连接的锌-菌绿素醌复合物，其与核酸寡聚体通过醌(复合物的电子受体分子)共价连接(通过间隔基)。

在通式结构elec-间隔基-ss-oligo-间隔基-部分中，(导电)表面与通过的单链寡核苷酸桥接的氧化还原活性部分(“部分”)之间的电化学通讯很弱或者不存在。

在下一步中，将试验位点与待测试的核酸寡聚体溶液(靶)相接触。只有当溶液中含有与结合在导电表面的探针核酸寡聚体互补、或者在至少广域内互补的核酸寡聚体链时，才会导致杂交。探针和靶核酸寡聚体之间的杂交导致表面和氧化还原活性部分之间导电性的增加，因为后者现在是通过由双链组成的核酸寡聚体桥接。图3以elec-间隔基-ss-oligo-间隔基-UQ(RC)为例对其进行了图示说明。在图4中详细示出了elec-间隔基-ds-oligo-间隔基-UQ(RC)内电子转移步骤的顺序，而图5以elec-间隔基-ss-oligo-间隔基-Q-ZnBChl为例进行了图示说明，图6详细描述了elec-间隔基-ds-oligo-间隔基-Q-ZnBChl内电子转移步骤的顺序。

由于探针核酸寡聚体和与其互补的核酸寡聚体链(靶)杂交的结果，(导电)表面和光诱导型氧化还原活性部分之间的电传导发生了改变。因此，可以通过电化学方法例如循环伏安法、电流分析法或导电性的测量来检测序列特异性的杂交事件。

在循环伏安法中，静止工作电极的电位随时间线性改变。从不发生电氧化或电还原的电位开始，改变电位直至氧化还原活性的物质被氧化或被还原(即，有电流流过)。在经过了氧化或还原操作(其在电流-电压曲线中产生开始增加的电流，然后达到最大电流(峰值)，最后电流逐渐减弱)后，将施加电位的方向逆转。然后在逆转操作中记录电氧化或电还原产物的行为。

另一种电学检测方法是电流分析法，该方法采用适宜的恒定电极电位，从而使氧化还原活性部分可以被电氧化(电还原)，但氧化还原活性部分向其原始状态的再还原(再氧化)不是向循环伏安法那样通过改变电极电位来实现的，而是通过向靶溶液中加入适宜的还原剂(氧化剂)-“氧化还原活性物质”来实现的，从而闭合了整个体系的电流回路。只要有还原剂(氧化剂)存在，或者只要消耗了的还原剂(氧化剂)在反电极上被再还原(再氧化)，就会有可以通过电流分析进行测定的并且与杂交事件的数量成比例的电流流过。

将以葡萄糖氧化酶作为光诱导型氧化还原活性部分或氧化还原活性部分的例子对电流分析检测的原理进行更详细的解释。葡萄糖氧化酶是一种由脱辅基蛋白质和一个辅因子(黄素腺嘌呤二核苷酸)组成的氧化还原活性酶。一端与电极共价连接的探针寡核苷酸可以在另一个游离的末端用完整的葡萄糖氧化酶的酶催化部分功能基化，例如将酶的黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)辅因子与探针寡核苷酸共价连接，然后将其用葡萄糖氧化酶脱辅基蛋白质(GOx)重建。所形成的通式为elec-间隔基-ss-oligo-间隔基-FAD(GOx)的表面杂合物在电极和FAD之间显示很小的导电性或者没有导电性。在与“ss-oligo”-互补靶寡核苷酸杂交的情况下，导电性显著增加。在向靶寡核苷酸溶液中加入葡萄糖底物后，葡萄糖氧化酶(FAD(GOx))的FAD被还原成葡萄糖氧化酶(FADH₂(GOx))的FADH₂，葡萄糖被氧化成葡萄糖酸。如果向电极施加适宜的外加电位从而使FADH₂(GOx)通过杂交的寡核苷酸向电极给出电子，由此使FADH₂(GOx)被再氧化成FAD(GOx)(但在该电位下，葡萄糖或葡萄糖酸均不能被电氧化或被电还原)，只要FAD(GOx)被游离的葡萄糖还原、即直至所有的葡萄糖均被消耗掉，或者，在向反电极施加可以将葡萄糖酸还原成葡萄糖的电位的情况下，只要葡萄糖酸在反电极上被还原，就会有电流在elec-间隔基-ds-oligo-间隔基-FAD(GOx)体系内流动。该电流可以通过电流分析进行测定并且与杂交事件的数量成比例。

但是，适用于本发明的光诱导型或化学诱导型氧化还原活性部分具有至少一个电子供体和至少一个电子受体，而不是一个电子供体或电子受体。

对于本发明，在化学诱导型氧化还原活性部分的情况下，在电子供体和电子受体之间插入了至少一个电荷转移步骤。可以还原D(或氧化A)的游离的氧化还原活性物质可以引发从D^-至A的电子转移形成A^-(或从D向A⁺转移电子形成D⁺)，从而可以将电极设置在可以氧化(或还原)A^-(或D⁺)而不是A(或D)的电位。其优点是该电极具有可以显著抑制游离的氧化还原活性物质与电极直接反应的电位，并且可以检测氧化还原活性部分和电极之间的初始电子转移。

如果氧化还原活性部分是光诱导型氧化还原活性部分，则该部分的氧化还原活性仅由特定的或任何给定波长的光线所引发。根据本发明，可以利用该特性使电化学检测仅在光线照射到具有通式结构elec-间隔基-ds-oligo-间隔基-部分的表面杂合物(带有杂交的靶的表面杂合物)上时才被引发，并且持续最多是光线照射所持续的时间。因此，特别是在电流分析检测的情况下，如果使用光诱导型氧化还原活性部分，在某些外部条件下，只有当光线照射在表面杂合物上时才会流过(相当长时间)的电流。所述外部条件是，例如存在适于还原(或氧化)光诱导型氧化还原活性部分的光诱导形成的氧化的供体D⁺(或还原的受体A^-)的还原剂(或氧化剂)的存在下，以及向电极施加可以氧化(或还原)光诱导型氧化还原活性部分的光诱导形成的还原的受体A^-(或氧化的供体D⁺)但不会氧化(或还原)未还原的受体A(或未氧化的供体D)的电位。在“实施本发明的方式”一节中，用带有光诱导型氧化还原活性部分的各种elec-间隔基-ss-oligo-间隔基-部分的例子对其进行了更详细的解释。通过该方式，可以通过将光线限制在寡聚体芯片上的某些试验位点或试验位点组将利用光诱导型氧化还原活性部分的检测在空间上局限在这些试验位点或试验位点组。根据本发明，可将寡聚体芯片的各种试验位点(核酸寡聚体组合)涂覆于一个共享的、连续的、导电表面。如果精确地将特定的试验位点或试验位点组用光照射，可以通过向(完整的)表面施加适宜的外部电位来方便地定位并电流分析检测该试验位点或试验位点组。因此，无需将各试验位点涂覆在彼此电绝缘的并且可以在施加电位和读出电流上进行单独控制的单个(微)电极上。此外，如果将具有通式结构elec-间隔基-ss-oligo-间隔基-部分的表面杂合物与光诱导型氧化还原活性部分和电流分析检测一起使用，在寡聚体芯片上检测单个的序列特异性杂交事件的读出过程可以通过如下方法优化：首先通过用适当聚焦的光线粗略地扫描试验位点读出试验位点，然后逐渐增加有杂交事件的网格内的分辨能力，例如，对于有65536个试验位点的八聚体芯片，例如读出64个分别有1024个试验位点的组，然后通过电流分析测定证实显示杂交事件的试验位点组可以在例如各有32个试验位点的32个试验组检测，然后，在再次显示杂交事件的试验位点组中，对试验位点单个进行分析。通过该方式，可以用很少的实验将单个的杂交事件迅速指定在特定的探针寡聚体上。

附图概述

以下将参照例举的实施方案结合附图对本发明进行更详细的解释，其中：图1 显示了通过在芯片上杂交对寡核苷酸测序的简图；图2 显示了用于生产表面杂合物elec-间隔基-ss-oligo-间隔基-

UQ(RC)的各种反应顺序。该表面杂合物中的光诱导型氧化还

原活性部分是光合细菌类球红细菌的反应中心(RC)。该光诱

导型氧化还原活性蛋白由脱辅基蛋白质和辅因子组成。RC通

过其位于称为Q_A蛋白结合袋内的辅因子泛醌-50(UQ)与寡核苷

酸通过间隔基共价连接；图3 以图2中的表面杂合物elec-间隔基-ss-oligo-间隔基-UQ(RC)为

例显示了光诱导的电流分析测定方法的简图(hv：用光线照射；

P：RC的初级供体；UQ：RC的Q_A蛋白结合袋内的泛醌-50电子

受体；Red/Ox：加入到靶溶液中的游离的氧化还原活性物质的

还原或氧化的形式，例如cyt c₂ ²⁺、抗坏血酸钠或Fe(CN)₆ ²⁺，其

可以将氧化形式的P⁺再还原成其原始中性状态P；E_ox：可以通

过向电极转移电子将UQ^-氧化成UQ的电极电位；“hv on”：

光照射的开始；“hv off”光照射结束)；图4 显示了含有金作为固体载体材料、含有巯基乙醇作为电极和

寡核苷酸之间的间隔基(-S-CH₂CH₂-间隔基)、含有

-CH₂-CH＝CH-CO-NH-CH₂-CH₂-NH-作为电子受体PQQ和寡核苷酸

之间的间隔基的图3的表面杂合物Au-S(CH₂)2_-ds-oligo-间隔

基-Q-ZnBChl的详图，以及光诱导的电子转移步骤的顺序的

图。RC的脱辅基蛋白质仅以壳体(实心线)的形式示出(参见结

构1)。详细给出了杂交状态的示范性序列5′-

TAGTCGGAAGCA-3′的12-bp探针寡核苷酸；图5以表面杂合物elec-间隔基-ss-oligo-间隔基-Q-ZnBChl为例显示

了光诱导的电流分析测定方法的简图(hv：用光线照射；

ZnBChl：电子供体分子锌-菌绿素；Q：电子受体分子醌，例如

修饰的蒽醌或PQQ；Red/Ox：加入到靶溶液中的游离的氧化还

原活性物质的还原或氧化的形式，例如Fe(CN)₆ ²⁺，其可以将氧

化形式的电子供体ZnBChl⁺还原成其原始状态ZnBChl；E_ox：

可以通过向电极转移电子将Q^-氧化成Q的电极电位；“hv

on”：光照射的开始；“hv off”光照射结束)；图6 显示了含有金作为固体载体材料、含有巯基乙醇作为电极和

寡核苷酸之间的间隔基(-S-CH₂CH₂-间隔基)、含有

-CH₂-CH＝CH-CO-NH-CH₂-CH₂-NH-作为电子受体PQQ和寡核苷酸

之间的间隔基的图5的表面杂合物Au-S(CH₂)₂-ds-oligo-间隔

基-Q-ZnBChl的详图，以及光诱导的电子转移步骤的顺序的

图。详细给出了杂交状态的示范性序列5′-

TAGTCGGAAGCA-3′的12-bp探针寡核苷酸。

实施本发明的方式

在图4中举例说明了示范性的试验位点和具有通式结构elec-间隔基-ds-oligo-间隔基-部分的杂交的靶Au-S(CH₂)₂-ds-oligo-间隔基-UQ(RC)的形成单元。对于本发明，“形成单元”是指最小的试验位点重复单元。在图4的例子中，表面是金电极。金电极与探针寡核苷酸之间的连接是由接头(HO-(CH₂)₂-S)₂形成的，它被3′-端的末端磷酸基团酯化形成P-O-(CH₂)₂-S-S-(CH₂)₂-OH，在将金表面上的S-S键均裂后各产生一个Au-S键，通过该键将2-羟基-巯基乙醇和巯基乙醇-桥接的寡核苷酸共同吸附在表面上。图4的例子中的光诱导型氧化还原活性部分是光合细菌类球红细菌的反应中心(RC)，一种由脱辅基蛋白质和辅因子组成的光诱导型氧化还原活性蛋白。在本申请的实施例中，RC通过其位于称为Q_A蛋白结合袋内的辅因子泛醌-50(UQ)与寡核苷酸共价连接，其中，游离的UQ首先提供活泼的羧酸基团(参见实施例1)，然后通过该羧酸基团与探针寡核苷酸共价连接(将连接在5′胸腺嘧啶C-5位的-CH＝CH-CO-NH-CH₂-CH₂-NH₂接头的末端氨基功能基酰胺化然后脱水)，最后，将其余的RC(脱辅基蛋白质和除UQ之外的所有辅因子)重建到UQ上。

如上所述，探针寡核苷酸的修饰可以用完整的氧化还原活性部分或其成分进行，可以在探针寡核苷酸与导电表面结合之前或结合之后进行。以下将借助图2以表面杂合物Au-S(CH₂)₂-ss-oligo-间隔基-UQ(RC)或其更概括的形式elec-间隔基-ss-oligo-间隔基-UQ(RC)为例对可以产生相同的试验位点形成单元的各步骤的各种组合可能性进行说明。

可以通过简单的操作(Gunner，M.R.，Robertson，D.E.，Dutton，P.L.，1986，《物理化学杂志》(Journal of Physical Chemistry)，Vol.90，3783-3795页)使反应中心在Q_A或Q_B结合袋游离两个泛醌辅因子，从而产生与其余的RC(脱辅基蛋白质，包括除Q_A或Q_B结合袋中的泛醌之外的所有辅因子)分离的泛醌。探针寡核苷酸在其末端通过间隔基与(相同或不同的)活泼基团连接。在反应顺序“1”中，在单功能基接头的存在下(参见“寡核苷酸与导电表面的结合”一节中的a)-c)点2.)点)，将修饰的探针寡核苷酸和单功能基接头一起与电极共价连接，确保加入足够的适宜链长的单功能基基团以在各探针寡核苷酸之间提供足够的空间，以允许与靶寡核苷酸的杂交并允许与氧化还原活性部分的连接。然后，将事先形成了适宜的活泼偶联基团的UQ与探针寡核苷酸的间隔基桥接的活泼基团连接。连接按照“氧化还原活性部分与核酸寡聚体的结合”一节中a)或b)项下的描述进行。在该反应顺序“1”的最后的步骤中，将剩余的RC(脱辅基蛋白质以及除UQ之外的所有辅因子)重建到UQ上。在另一种形式中(反应顺序“2”)，将(用间隔基和活泼基团)修饰的探针寡核苷酸首先共价连接到没有游离单功能基接头(间隔基)的电极上，形成寡核苷酸的平面连接。然后，将游离的单功能基接头(间隔基)与电极共价连接。另一种可能性(反应顺序“3”)将(用间隔基和活泼基团)修饰的探针寡核苷酸首先用UQ修饰，然后将其在游离单功能基接头(间隔基)的存在下与电极共价连接，然后将其用剩余的RC重建。最后，在反应顺序“4”中，可以将(用间隔基和活泼基团)修饰的探针寡核苷酸首先用UQ修饰，然后将其用剩余的RC重建，然后将其与电极共价连接。与RC的情况一样，当氧化还原活性部分的直径明显比杂交的ds-寡核苷酸(大于30埃)时，可以无需在电极上共价连接适宜的游离单功能基接头(间隔基)；否则，可以在适宜的游离单功能基接头的存在下在电极上连接结构-间隔基-ss-间隔基-UQ(RC)。

在图2的例子中，RC通过其位于称为RC的QA蛋白结合袋内的辅因子泛醌-50(UQ)与寡核苷酸共价连接。或者，除了QA结合袋内的UQ辅因子外，RC的其它辅因子或脱辅基蛋白质也可以与探针寡核苷酸共价连接，图2中的反应顺序“1”、“2”、“3”或“4”的任何组合均可采用，只要它们可以产生相同的最终产物即可(参见图2)，并且在任何反应步骤中，均可以用与互补的、未修饰的(靶)寡核苷酸杂交的探针寡核苷酸代替单链的探针寡核苷酸。探针寡核苷酸还可以直接(也就是说不通过间隔基桥接)与电极和氧化还原活性部分连接，如“核酸寡聚体与导电表面的结合”一节中c)项下或者“氧化还原活性部分与核酸寡聚体的结合”一节中a)项下所述。

在通式结构elec-间隔基-ss-oligo-间隔基-部分中，导电表面与通过单链寡核苷酸桥接的氧化还原部分之间的电传导很弱或者不存在。如果在探针和靶之间发生了杂交，将试验位点用待测试的寡核苷酸溶液处理将会导致表面和通过双链寡核苷酸桥接的氧化还原活性部分之间导电性的增加。对于作为例子的试验位点Au-S(CH₂)₂-ds-oligo-间隔基-UQ(RC)(带有12个碱基对的探针寡核苷酸)的形成单元，在图3中用电流分析测定进行了图示说明。

通过用适宜波长的光线照射RC可以将辅因子P(也称为初级供体)电子激发，造成光诱导的RC的辅因子内的电荷分离，电子从受激的初级供体P^*转移到Q_A结合袋内的UQ。如果在电极上施加适宜的电位使电子从还原的泛醌(UQ^-)向电极转移，在探针寡核苷酸未与靶寡核苷酸增加的情况下，仍然不会有电流流动，因为Au-S(CH₂)₂-ss-oligo-间隔基-UQ(RC)内的ss-寡核苷酸的导电性非常弱或者不存在。但是，在杂交状态(Au-S(CH₂)₂-ds-oligo-间隔基-UQ(RC))，导电性非常高，电子可以从UQ^-向电极转移(形成UQ)，并且，在可以将P⁺还原成P的适宜氧化还原活性物质的存在下，电路闭合，当RC再吸收光线时可以开始新的循环。这可以在电流分析中表现为电极和光诱导型氧化还原活性部分之间的明显的电流(图3)。因此，可以通过电流分析用光诱导检测靶与探针寡核苷酸之间的序列特异性的杂交。在图4中举例说明了通过光照射以及在可以将P⁺还原成P的氧化还原活性物质的存在下在表面杂合物Au-S(CH₂)₂-ds-oligo-间隔基-UQ(RC)激发的各电子转移步骤。给定适宜的外部条件和适宜的连接(例如RC与靠近初级供体的探针寡核苷酸的连接)，表面杂合物Au-S(CH₂)₂-ds-oligo-间隔基-UQ(RC)也可以逆转，从而在光线照射后，P⁺被电极还原，Q^-被适宜的氧化剂氧化。

图5举例说明了通式结构为elec-间隔基-ss-oligo-间隔基-部分的另一个试验位点，Au-S(CH₂)₂-ss-oligo-间隔基-Q-ZnBChl。通过将ZnBChl用适宜波长的光线照射，ZnBChl被电子激发并且发生光诱导的电荷分离，电子从受激的ZnBChl^*转移到醌Q。如果在电极上施加适宜的电位使电子从还原的醌(Q^-)向电极转移，在探针寡核苷酸未与靶寡核苷酸增加的情况下，仍然不会有电流流动，因为Au-S(CH₂)₂-ss-oligo-间隔基-Q-ZnBChl内的ss-寡核苷酸的导电性非常弱或者不存在。但是，在杂交状态(Au-S(CH₂)₂-ds-oligo-间隔基-Q-ZnBChl)，导电性非常高，电子可以从Q^-向电极转移(形成Q)，并且，在可以将ZnBChl⁺还原成ZnBChl的适宜氧化还原活性物质的存在下，电路闭合，当ZnBChl再吸收光线时可以开始新的循环。这可以在电流分析中表现为电极和光诱导型氧化还原活性部分之间的明显的电流(图5)。因此，可以通过电流分析用光诱导检测靶与探针寡核苷酸之间的序列特异性的杂交。给定适宜的外部条件和适宜的连接(例如Au-S(CH₂)₂-ds-oligo-间隔基-ZnBChl-Q)，表面杂合物Au-S(CH₂)₂-ds-oligo-间隔基-Q-ZnBChl也可以逆转，从而在光线照射后，ZnBChl⁺被电极还原，Q^-被适宜的氧化剂氧化。

由于光诱导型氧化还原活性部分的氧化还原活性-即使在适宜的电极电位下-仅在用适宜波长的光线照射时才被激发，并且最多仅维持光线照射所持续的时间，根据本发明，可以利用该条件通过将光线局限在寡聚体芯片上的特定试验位点或试验位点组在空间上分辨该试验位点或试验位点组。根据本发明，这样做的优点是，可以将寡聚体芯片的各试验位点(核酸寡聚体的组合)涂覆在共享的、连续的导电表面上，并且，如果精确地仅对特定的试验位点或试验位点组用光照射，将可以简单地通过向(完整的)表面施加适宜的外部电位对特定的试验位点或特定的试验位点组进行定位和电流测定。因此，无需将各试验位点涂覆在彼此电绝缘的并且可以在施加电位和电流选择上进行单独控制的单个(微)电极上。

此外，可以通过循环伏安法特征的改变来识别有缺陷的碱基配对(碱基对错配)。错配表现为在循环伏安法的导电表面和光诱导型氧化还原活性部分之间可逆的电子转移中，电还原和电再氧化(当电位的施加方向相反时电还原的逆转)或电氧化和电再还原的电流最大值之间有较大的电位差。这一事实对电流检测有非常重要的影响，因为在电流检测中，可以在良好杂合寡核苷酸靶提供明显电流的电位下检测到电流，但有缺陷的配对的寡核苷酸靶则不能。实施例1：用间隔基桥接的活泼羧酸基团修饰泛醌-50。将泛醌-50(UQ-50)的2-甲氧基通过用HBr进行醚裂解(一种常规方法)修饰成2-羟基(或者，可以按照Moore，H.W.和Folkers，K.，美国化学会杂志(Journal of the American Chemical Society)，1966，88，564-570页或Daves，G.等，美国化学会杂志，1968，90，5587-5593页的方法产生2-OH-UQ-50)。然后，在采用等摩尔量Cl-CH₂-CH₂-CO₂H的常规方法中，将2-OH-UQ-50转变成2-(CH-CH₂-CO₂H)-UQ-50并将其进行色谱纯化。

或者，在一种常规方法中，可将UQ50的5-OH-6-烷基-1，4-苯醌类似物(按照Catlin等，美国化学会杂志，1968，90，3572-3574的方法生产)用等摩尔量的Cl-CH₂-CH₂-CO₂H修饰成5-(CH₂-CH₂-CO₂H)-UQ-50-类似物。实施例2：生产寡核苷酸电极Au-S(CH₂)₂-ss-oligo-间隔基UQ(RC)。Au-S(CH₂)₂-ss-oligo-间隔基UQ(RC)分4个步骤进行生产，即，产生导电表面，将表面用寡核苷酸探针在适宜的单功能基接头的存在下衍生化(保温步骤)，共价连接修饰的泛醌-50(氧化还原步骤)和重建剩余的RC(重建步骤)。

云母(白云母薄片)上约100nm厚的金薄膜形成了共价连接双链寡核苷酸的载体材料。为此，将新劈开的云母用氩离子等离子体在放电室内纯化并通过放电涂覆一层厚度约为100nm的金(99.99％)。然后，用30％H₂O₂/70％H₂SO₄除去金薄膜表面的杂质(有机积聚物的氧化)并在乙醇中浸泡约20分钟以驱散表面上吸附的所有的氧。将表面用双蒸水洗涤后，将预先制备的1×10^-4M的(修饰的)双链寡核苷酸溶液涂覆在水平固定的表面上，从而使整个金表面被湿润(保温步骤，见下)。

为了进行保温，使用序列为5′-TAGTCGGAAGCA-3′的双重修饰的12个碱基对的单链寡核苷酸，将其用(HO-(CH₂)₂-S)₂在3′-末端的磷酸酯基团进行酯化形成P-O-(CH₂)₂-S-S-(CH₂)₂-OH。在5′-末端，将寡核苷酸的末端胸腺嘧啶碱基在C-5碳上用-CH＝CH-CO-NH-CH₂-CH₂-NH₂修饰。将约10^-4至10^-1M的2-羟基-巯基乙醇(或具有适宜链长的另一种巯基或二硫化物接头)加入到2×10^-4M上述寡核苷酸的HEPES缓冲液(0.1M的水溶液，pH 7.5，加入0.7MTEATFB，参见缩写)溶液中，将试验位点的金表面完全湿润并保温2-24小时。在该反应时间内，寡核苷酸的二硫化物间隔基P-O-(CH₂)₂-S-S-(CH₂)₂-OH被均裂。在该过程中，间隔基与表面的金原子形成Au-S共价键，从而引起ss-寡核苷酸和裂解的2-羟基-巯基乙醇的1∶1共吸附。在保温溶液中存在的游离2-羟基-巯基乙醇也通过形成Au-S键被共吸附(保温步骤)。

将用含有ss-寡核苷酸和2-羟基-巯基乙醇的单层修饰的金电极用双蒸水洗涤然后用3×10^-3M醌2-(CH₂-CH₂-CO₂H)-UQ-50、10^-2MEDC和10^-2M磺基-NHS的HEPES缓冲液(0.1M水溶液，pH＝7.5)溶液润湿。反应约1-4小时后，-CH＝CH-CO-NH-CH₂-CH₂-NH₂间隔基和2-(CH₂-CH₂-CO₂H)-UQ-50形成共价键(间隔基的氨基和2-(CH₂-CH₂-CO₂H)-UQ-50的C-2-酸功能基之间的酰胺化，氧化还原步骤)。

然后，将修饰的金电极用双蒸水洗涤并与大约5×10^-5M泛醌-50-游离RC在10mM Tris(pH＝8，加有0.7M TEATFB)中的溶液一起在约4℃下保温约12小时将剩余的RC重建到与寡核苷酸连接的UQ-50上(重建步骤)。

或者，为了在相同的条件下将2-(CH₂-CH₂-CO₂H)-UQ-50与探针寡核苷酸，也可以使用5-(CH₂-CH₂-CO₂H)-UQ-50-类似物(实施例1)或带有活泼羧酸基团的式1-8的另一种醌，因为泛醌-50-游离RC也可以重建到这些物质上。实施例3：生产寡核苷酸电极Au-S(CH₂)₂-ss-oligo-间隔基-Q-ZnBChl。Au-S(CH₂)₂-ss-oligo-间隔基-Q-ZnBChl分5个步骤进行生产，即，产生导电表面，在适宜单功能基接头的存在下将表面用探针寡核苷酸衍生化(与互补的链杂交)(保温步骤)，共价连接电子受体(受体步骤)，共价连接电子供体(供体步骤)和将双链寡核苷酸热去杂交(去杂交步骤)。

按照实施例1的描述生产用于共价连接双链寡核苷酸的载体材料，约100nm厚的在云母(白云母薄片)上的金薄膜。

为了进行保温，使用序列为5′-TAGTCGGAAGCA-3′的双重修饰的12个碱基对的单链寡核苷酸，将其用(HO-(CH₂)₂-S)₂在3′-末端的磷酸酯基团进行酯化形成P-O-(CH₂)₂-S-S-(CH₂)-OH。在5′-末端，将寡核苷酸的末端胸腺嘧啶碱基在C-5碳上用-CH＝CH-CO-NH-CH₂-CH₂-NH₂修饰。将2×10^-4M上述寡核苷酸在杂交缓冲液(10mM Tris，1mM EDTA，pH 7.5，加有0.7M TEATFB，参见缩写)中的溶液与2×10^-4M(未修饰的)互补链在杂交缓冲液中的溶液在室温下杂交约2小时(杂交步骤)。杂交后，向1×10^-4M双链寡核苷酸溶液中加入约10^-4至10^-1M的2-羟基-巯基乙醇(或具有适宜链长的另一种巯基或二硫化物接头)并将试验位点的金表面完全湿润并保温2-24小时。在该反应时间内，寡核苷酸的二硫化物间隔基P-O-(CH₂)₂-S-S-(CH₂)₂-OH被均裂。在该过程中，间隔基与表面的金原子形成Au-S共价键，从而引起ss-寡核苷酸和裂解的2-羟基-巯基乙醇的1∶1共吸附。在保温溶液中存在的游离2-羟基-巯基乙醇也通过形成Au-S键被共吸附(保温步骤)。

将用含有ds-寡核苷酸和2-羟基-巯基乙醇的单层修饰的金电极用双蒸水洗涤然后用3×10^-3M醌PQQ、10^-2M EDC和10^-2M磺基-NHS的HEPES缓冲液溶液润湿。反应约1-4小时后，-CH＝CH-CO-NH-CH₂-CH₂-NH₂间隔基和PQQ形成共价键(间隔基的氨基和PQQ的C-7-羧酸功能基之间的酰胺化，氧化还原步骤)。

然后，将修饰的金电极用双蒸水洗涤并用约3×10^-3M供体ZnBChl(游离酸)、1.5×10^-1M EDC、2.5×10^-3M一水合肼(NH₂-NH₂xH₂O)和1×10^-1M咪唑的水溶液湿润。于23℃反应约16小时后，与寡核苷酸结合的PQQ的C-1-羧酸功能基通过肼与ZnBChl的游离羧酸基团结合(肼的氨基与PQQ的C-1-羧酸基团或ZnBChl的游离羧酸基团之间的酰胺化，供体步骤)。然后，将双链在大于40℃的温度下热去杂交然后再次用双蒸水冲洗(去杂交步骤)。通过与三氟乙酸一起保温从Zn-BChl(按照Hartwich等，美国化学会杂志，1998，120，3684-3693页生产)制得ZnBChl(游离酸)。

或者，例如，还可以通过按照常规方法进行酯化将ZnBChl(游离酸)与探针寡核苷酸的5′-末端糖的3-OH结合，或者将预先共价连接的电子供体/电子受体复合物与探针寡核苷酸按照供体步骤中的描述通过游离的羧酸基团例如供体进行连接。在相同的反应条件下，还可在受体步骤中用蒽醌-2，6-二磺酸二钠盐代替PQQ。如果将PNA寡核苷酸和例如-NH-(CH₂)₂-N(COCH₂-碱基)-CH₂CO-用作寡核苷酸结构单元，根据“光诱导型氧化还原活性部分与核酸寡聚体的结合”一节中的d)，有另一种将ZnBChl-PQQ部分与核酸寡聚体(PNA寡核苷酸)连接的方法。在该情况下，在PNA寡核苷酸合成的过程中，代替常规PNA合成反应中的N-末端碱基，将PQQ通过其吡咯的氮进行连接。然后，通过与供体步骤中所述类似的方式，通过将用PQQ修饰的PNA寡核苷酸与3×10³M ZnBChl(游离酸)、1.5×10^-1M EDC 10^-2和2×10^-1M磺基-NHS一起在HEPES缓冲液中保温将Zn-BChl与肽骨架的氨基末端连接(骨架的氨基和Zn-BChl(游离酸)的羧酸基团之间的酰胺化)。

Claims

1.一种通过共价连接氧化还原活性部分进行修饰的核酸寡聚体，其特征在于所述氧化还原活性部分含有一个或多个电子供体分子和一个或多个电子受体分子。

2.权利要求1所述的修饰的核酸寡聚体，其特征在于所述氧化还原活性部分含有至少一种氧化还原活性的、连接的、至少是双分子的电子供体/电子受体复合物，氧化还原活性部分的电子供体分子和/或电子受体分子中至少有两个通过一个或多个键相互连接。

3.权利要求2所述的修饰的核酸寡聚体，其特征在于氧化还原活性部分的电子供体分子和/或电子受体分子中至少有两个通过一个或多个共价键相互连接。

4.权利要求1所述的修饰的核酸寡聚体，其特征在于所述氧化还原活性部分含有至少一种氧化还原活性的、连接的、至少是双分子的电子供体/电子受体复合物，至少有两个电子供体分子和/或电子受体分子通过一个或多个任意组成和链长的直链或支链分子部分共价连接。

5.权利要求4所述的修饰的核酸寡聚体，其中的直链或支链的分子部分的链长为1-20个原子，特别是1-14个原子。

6.前述权利要求任意一项所述的修饰的核酸寡聚体，其特征在于，含有一个或多个电子供体分子和一个或多个电子受体分子的氧化还原活性部分还含有一种或多种大分子。

7.前述权利要求任意一项所述的修饰的核酸寡聚体，其中的氧化还原活性部分是光合微生物的天然或修饰的反应中心，特别是光合细菌的天然或修饰的反应中心。

8.权利要求1至6中任意一项所述的修饰的核酸寡聚体，其特征在于所述的一种或多种电子供体和/或电子受体分子是颜料、特别是黄素类、(金属)卟啉类、(金属)叶绿素类或(金属)菌绿素类或其衍生物。

9.权利要求1至6中任意一项所述的修饰的核酸寡聚体，其特征在于一种或多种电子供体和/或电子受体分子是烟酰胺类或醌类，特别是吡咯并-喹啉醌类(PQQ)、1，2-苯醌类、1，4-苯醌类、1，2-萘醌类、1，4-萘醌类或9，10-蒽醌类或其衍生物。

10.权利要求1至6中任意一项所述的修饰的核酸寡聚体，其特征在于一种或多种电子供体和/或电子受体分子是电荷转移复合物。

11.权利要求10所述的修饰的核酸寡聚体，其中的电荷转移复合物是过渡金属复合物，特别是Ru(II)、Cr(III)、Fe(II)、Os(II)或Co(II)复合物。

12.前述权利要求任意一项所述的修饰的核酸寡聚体，其中，修饰的核酸寡聚体可以序列特异性地结合单链DNA、RNA和/或PNA。

13.权利要求12所述的修饰的核酸寡聚体，其中，修饰的核酸寡聚体是脱氧核糖核酸寡聚体、核糖核酸寡聚体、肽核酸寡聚体或具有结构类似的骨架的核酸寡聚体。

14.前述权利要求任意一项所述的修饰的核酸寡聚体，其中，氧化还原活性部分与核酸寡聚体骨架的磷酸、羧酸或氨基之一共价结合，或者与糖共价结合，特别是与糖的羟基共价结合。

15.权利要求1至13中任意一项所述的修饰的核酸寡聚体，其中，氧化还原活性部分与核酸寡聚体的修饰的碱基之巯基、羟基、羧酸或氨基共价连接。

16.权利要求15所述的修饰的核酸寡聚体，其特征在于，碱基的活泼的巯基、羟基、羧酸或氨基通过具有任意组成和链长的直链或支链分子部分与碱基共价连接，巯基、羟基、羧酸或氨基与碱基之间最短的连续连接是链长为1-20个原子、特别是1-14个原子的直链或支链的分子部分。

17.权利要求14至16中任意一项所述的修饰的核酸寡聚体，其中的氧化还原活性部分与核酸寡聚体骨架的一端相连接或与末端修饰的碱基相连接。

18.前述权利要求任意一项所述的修饰的核酸寡聚体，其特征在于所述的氧化还原活性部分是光诱导型氧化还原活性部分。

19.权利要求1至17中任意一项所述的修饰的核酸寡聚体，其特征在于所述的氧化还原活性部分是化学诱导型氧化还原活性部分。

20.前述权利要求任意一项所述的修饰的核酸寡聚体，其特征在于有多个氧化还原活性部分与核酸寡聚体相连接。

21.一种生产前述权利要求任意一项所定义的修饰的核酸寡聚体的方法，其中，将氧化还原活性部分与核酸寡聚体共价连接。

22.权利要求21所述的生产修饰的核酸寡聚体的方法，其中，通过共价连接一种或多种电子供体分子将氧化还原活性部分与核酸寡聚体连接。

23.权利要求21所述的生产修饰的核酸寡聚体的方法，其中，通过共价连接一种或多种电子受体分子将氧化还原活性部分与核酸寡聚体连接。

24.权利要求21所述的生产修饰的核酸寡聚体的方法，其中，通过共价连接一种或多种大分子或者通过共价连接一种或多种蛋白质将氧化还原活性部分与核酸寡聚体连接。

25.权利要求22至24所述的生产修饰的核酸寡聚体的方法，其中，通过加入一种或多种电子受体分子、一种或多种电子供体分子、一种或多种大分子和/或一种或多种蛋白质完成氧化还原活性部分。

26.权利要求21至25所述的生产修饰的核酸寡聚体的方法，其中，通过一种或多种与氧化还原活性部分的胺或酸基团的酰胺化、通过一种或多种与氧化还原活性部分的醇或酸基团的酯化、通过与氧化还原活性部分的硫醇或酸基团形成硫酯，或者，通过将核酸寡聚体的一个或多个氨基与氧化还原活性部分的醛基缩合然后将形成的碳-氮双键还原，将核酸寡聚体与氧化还原活性部分结合。

27.权利要求21至26所述的生产修饰的核酸寡聚体的方法，其中，将一种或多种任意组成和链长的直链或支链分子部分与氧化还原活性部分共价连接，并且所述直链或支链的分子部分带有用于和核酸寡聚体共价连接的活泼的胺、羟基、巯基、酸或醛基。

28.权利要求27所述的生产修饰的核酸寡聚体的方法，其中，核酸寡聚体和氧化还原活性部分之间最短的连续连接是链长为1-20个原子、特别是1-14个原子的直链或支链的分子部分。

29.一种修饰的导电表面，其特征在于有一种或多种 1至20任意一项所述的修饰的核酸寡聚体连接在导电表面上。

30.权利要求29所述的修饰的导电表面，其中的表面由金属或金属合金组成，特别是选自铂、钯、金、镉、汞、镍、锌、碳、银、铜、铁、铅、铝、锰的金属及其混合物。

31.权利要求29所述的修饰的导电表面，其中的表面由半导体组成，特别是选自碳、硅、锗和α-锡的半导体。

32.权利要求29所述的修饰的导电表面，其中的表面由14和16族元素的二元化合物、13和15族元素的二元化合物、15和16族元素的二元化合物或11和17族元素的二元化合物组成，特别是卤化亚铜(I)或卤化银(I)。

33.权利要求29所述的修饰的导电表面，其中的表面由11、13和16族元素的三元化合物或12、13和16族元素的三元化合物组成。

34.权利要求29至33中任意一项所述的修饰的导电表面，其中修饰的核酸寡聚体与导电表面的连接是共价连接或通过化学吸附或物理吸附进行的。

35.权利要求29至34中任意一项所述的修饰的导电表面，其中核酸寡聚体骨架的磷酸、羧酸或氨基之一或糖基团、特别是糖的羟基与导电表面共价连接或通过化学吸附或物理吸附进行连接。

36.权利要求29至34中任意一项所述的修饰的导电表面，其特征在于，核酸寡聚体的修饰的碱基的巯基、羟基、羧酸或氨基与导电表面共价连接或通过化学吸附或物理吸附进行连接。

37.权利要求35或36所述的修饰的导电表面，其中修饰的核酸寡聚体通过在核酸寡聚体骨架末端的基团或通过末端修饰的碱基的基团与导电表面结合。

38.权利要求29至37中任意一项所述的修饰的导电表面，其中任意组成和链长的直链或支链的分子部分与导电表面共价连接或通过化学吸附或物理吸附进行连接，并且修饰的核酸寡聚体与这些分子部分共价连接。

39.权利要求38所述的修饰的导电表面，其中导电表面和核酸寡聚体之间最短的连续连接是链长为1-20个原子、特别是1-12个原子的直链或支链的分子部分。

40.权利要求38或39所述的修饰的导电表面，其中，直链或支链的分子部分与核酸寡聚体骨架的磷酸、羧酸或氨基之一或糖基团、特别是糖的羟基相连接，或者与核酸寡聚体的修饰的碱基的巯基、羟基、羧酸或氨基相连接。

41.权利要求40所述的修饰的导电表面，其中，直链或支链的分子部分与核酸寡聚体骨架末端的磷酸、糖-羟基、羧酸或氨基结合，或者与末端修饰的碱基的巯基、羟基、羧酸或氨基结合。

42.权利要求29至41中任意一项所述的修饰的导电表面，其特征在于，主要有一种类型的修饰的核酸寡聚体连接在导电表面上空间限定的区域。

43.权利要求29至41中任意一项所述的修饰的导电表面，其特征在于，仅有一种类型的修饰的核酸寡聚体各自连接在导电表面上空间限定的区域。

44.权利要求29至43所定义的修饰的导电表面，其特征在于，有一种或多种修饰的核酸寡聚体涂覆在导电表面。

45.生产权利要求29至43所定义的修饰的导电表面的方法，其特征在于将一种或多种核酸寡聚体涂覆在导电表面，然后，用权利要求21至28的方法进行核酸寡聚体的修饰。

46.权利要求44或45所述的生产修饰的导电表面的方法，其中将核酸寡聚体或修饰的核酸寡聚体与各自的互补核酸寡聚体链杂交，然后以双链杂合物的形式涂覆在导电表面。

47.权利要求44或45所述的生产修饰的导电表面的方法，其中，将核酸寡聚体或修饰的核酸寡聚体在同样可以连接到导电表面的其它化合物的存在下涂覆在导电表面。

48.一种电化学检测寡聚体杂交事件的方法，其特征在于，将权利要求29至43所定义的一种或多种修饰的导电表面与核酸寡聚体接触，然后检测氧化还原活性部分和各导电表面之间所发生的电传导。

49.权利要求48的方法，其中的检测通过循环伏安法、电流分析法或导电性测量来进行。

50.权利要求48或49的方法，其特征在于，电化学检测是由光诱导的电荷分离引发的，所述电荷分离是在通过核酸寡聚体与导电表面连接的光诱导型氧化还原活性部分内。

51.权利要求50的方法，其中，用于光诱导的电荷分离的光线照射局限在带有一种或多种修饰的核酸寡聚体类型的导电表面的一个区域内，所述电荷分离是在通过核酸寡聚体与导电表面连接的光诱导型氧化还原活性部分内。

52.权利要求50或51的方法，其中，通过用特定或任何给定波长的光线照射所形成的光诱导型氧化还原活性部分的氧化的电子供体分子或还原的电子受体分子被不与核酸寡聚体结合但与其相接触的适宜的游离氧化还原活性物质再还原或再氧化，即，氧化的电子供体分子或还原的电子受体分子被恢复至其在进行光线照射以前的最初状态。

53.权利要求48或49所述的电化学检测方法，其特征在于，通过可以完成化学诱导的向氧化还原活性部分转移电荷的游离氧化还原活性物质促进电化学检测。

54.权利要求52或53的方法，其中，不与核酸寡聚体结合但与其相接触的游离氧化还原活性物质可以在电位下被选择性地氧化和还原，其中，在用标准氢电极测量时，满足2.0V≥≥-2.0V的条件。

55.权利要求52至54中任意一项所述的方法，其中，不与核酸寡聚体结合但与其相接触的游离氧化还原活性物质是游离的醌、游离的六氰基高铁酸盐(II)复合物、游离的抗坏血酸钠、游离的Ru(II)六胺复合物或游离的氧化还原活性的蛋白质、特别是游离的细胞色素。