EA003929B1 - Модифицированный олигомер нуклеиновой кислоты, способ его получения, модифицированная проводящая поверхность, способ ее получения и способ электрохимического определения событий гибридизации олигомеров нуклеиновой кислоты - Google Patents

Abstract

Данное изобретение относится к модифицированному олигомеру нуклеиновой кислоты, способу его получения, модифицированной проводящей поверхности, способу ее получения и способу электрохимического определения событий последовательность-специфической гибридизации олигомеров нуклеиновой кислоты. Одиночные цепи олигомеров ДНК/РНК/ПНК, которые одним концом связываются с проводящей поверхностью, а другим концом - с веществом, обладающим окислительно-восстановительной активностью, используют в качестве гибридизационного матрикса (зонда). Одноцепочечные олигонуклеотиды гибридизуют путем обработки раствором олигонуклеотида (мишени), подлежащего тестированию, в результате изменяется электрическая связь между проводящей поверхностью и веществом, обладающим окислительно-восстановительной активностью, которая первоначально либо отсутствовала, либо была слабой. Это позволяет детектировать событие гибридизации с использованием электрохимических способов, таких как циклическая вольтамметрия, амперометрия или измерение проводимости.

Description

Данное изобретение направлено на модифицированный олигомер нуклеиновой кислоты, а также на способ электрохимического определения событий последовательность-специфической гибридизации олигомеров нуклеиновой кислоты.

Предпосылки изобретения

Обычно, для анализа последовательности ДНК и РНК используются гель-электрофоретические способы с авторадиографической или оптической детекцией, например, при диагностике заболевания, в процессе токсикологического анализа, в генетических исследованиях и разработках, а также в аграрной и фармакологической областях.

В наиболее важном гель-электрофоретическом способе с оптической детекцией, способе Сэнгера, раствор, содержащий ДНК, делят на четыре пробы. Для того чтобы различать эти четыре пробы, праймер (комплементарную последовательность для инициирования репликации) для каждой пробы ковалентно модифицируют флюоресцентным красителем, который дает излучение с определенной длиной волны. Начиная с праймера, каждая проба ферментативно реплицируется с помощью ДНК-полимеразы I. Кроме необходимых дезоксирибонуклеозид-трифосфатов оснований А (аденин), Т (тимин), С (цитозин) и О (гуанин), каждая реакционная смесь содержит также достаточное количество 2',3'-дидезокси-аналога одного из этих нуклеозидтрифосфатов в качестве блокирующего основания (одно для каждого из четырех возможных блокирующих оснований на пробу) для того, чтобы терминировать репликацию во всех возможных сайтах связывания. После объединения этих четырех проб все длины реплицированных фрагментов ДНК, имеющих блокирующее основание и специфическую флюоресцентную метку, могут быть разделены гельэлектрофоретически в соответствии с их длиной и охарактеризованы посредством флюоресцентной спектроскопии.

Другой способ оптической детекции основан на присоединении к олигонуклеотидам флюоресцентных красителей типа бромистого этидия. По сравнению с раствором свободного красителя, флюоресценция таких красителей резко изменяется при связывании с двухцепочечной ДНК или РНК, и поэтому может быть использована для определения гибридизованных ДНК или РНК.

При радиоактивном мечении ³²Р встраивается в фосфатный скелет олигонуклеотидов, причем ³²Р обычно добавляется к 5'-гидроксильному концу с помощью полинуклеотидкиназы. После этого меченую ДНК предпочтительно разрезают, при определенных условиях, по одному из четырех типов нуклеотидов так, что в среднем получают одно расщепление на цепь. Таким образом, для данного типа основа ния в реакционной смеси присутствуют цепи, простирающиеся от ³²Р-метки до местоположения этого основания (если имеют место многократные появления этого основания, то соответственно будут получаться цепи разной длины). Затем четыре смеси фрагментов разделяют гельэлектрофоретически на четырех дорожках. После этого получают авторадиограмму геля, из которой можно непосредственно прочитать нуклеотидную последовательность.

Несколько лет назад был разработан еще один способ секвенирования ДНК на основе оптической (или авторадиографической) детекции, а именно, секвенирование посредством гибридизации олигомеров (сравни, например, Эл напас и соавт., Оепопнск 4, 1989, рр. 114-128 или Вашк и соавт., Тйеот. ΒίοΙ. 135, 1988, рр. 303-307). В этом способе полный набор коротких олигонуклеотидов, или олигомеров нуклеиновой кислоты (олигонуклеотидных зондов), например, все 65 536 возможных комбинаций оснований А, Т, С и О олигонуклеотидного октамера связываются с подложкой. Присоединение происходит в упорядоченной сетке (решетке), состоящей из 65 536 тест-сайтов, с каждым из которых связывается довольно большое количество олигонуклеотидной комбинации, определяющей один тест-сайт, и положение каждого индивидуального тест-сайта (олигонуклеотидной комбинации) известно. На таком гибридизационном матриксе, олигомерном чипе, фрагмент ДНК, последовательность которой нужно определить (мишень), метят флуоресцентным красителем (или ³²Р) и гибридизуют в условиях, которые позволяют образовывать только одну специфическую двойную цепь. Таким образом, фрагмент ДНК-мишени связывается только с теми олигомерами нуклеиновой кислоты (в этом примере с октамерами), чья комплементарная последовательность точно соответствует части (октамеру) его собственной последовательности. Таким образом, все последовательности олигомеров нуклеиновой кислоты (октамерные последовательности), присутствующие в этом фрагменте, определяются посредством оптической (или авторадиографической) детекции местоположения связывания гибридизованного фрагмента ДНК. Вследствие перекрывания соседних последовательностей олигомеров нуклеиновой кислоты, может быть определена непрерывная последовательность этого фрагмента ДНК с использованием соответствующих математических алгоритмов. Одно из преимуществ этого способа заключаются в миниатюризации секвенирования и, таким образом, в огромном количестве данных, которые могут быть получены одновременно в результате одной операции. Кроме того, можно обойтись без праймера и гель-электрофоретического разделения фрагментов ДНК. Принцип этого способа демонстрируется с помощью примера на фиг. 1 для фрагмента ДНК длиной 13 оснований.

Использование радиоактивных меток при секвенировании ДНК/РНК связано с несколькими неудобствами, такими как сложность, законно требуемые меры предосторожности при работе с радиоактивными материалами, радиоактивная экспозиция, ограниченная пространственная разрешающая способность (максимум 1 мм²) и чувствительность, которая является высокой только тогда, когда радиация от радиоактивных фрагментов воздействует на рентгеновскую пленку соответственно в течение длительного времени (от нескольких часов до нескольких дней). Хотя пространственное разрешение может быть увеличено при помощи дополнительного системного и программного обеспечения, и время детекции может быть уменьшено при помощи β-сканеров, оба этих улучшения влекут за собой значительные дополнительные затраты.

Некоторые из флюоресцентных красителей, которые обычно используются для мечения ДНК (например, бромистый этидий), являются мутагенами и требуют соблюдения соответствующих мер предосторожности, так же как и использование авторадиографии. Почти во всех случаях использование оптической детекции (определения) требует использования одной или нескольких лазерных систем и, следовательно, квалифицированного персонала и соответствующих мер безопасности. Современное определение флюоресценции требует дополнительного системного обеспечения, а именно, оптических компонентов для усиления и, в случае изменяющегося возбуждения и неизвестных длин волн, как в способе Сэнгера, системы управления. Таким образом, зависимость от возбуждения требуемых длин волн и от желаемых параметров определения может привести к значительным денежным затратам. При секвенировании путем гибридизации на олигомерном чипе, определение является даже более дорогостоящим, поскольку кроме системы возбуждения, требуются высокоразрешающие ССЭ-камеры (сйагде соир1еб бс\зес сатегак, устройство для регистрации связанных зарядов) для двумерного определения флюоресцентных пятен.

Таким образом, хотя существуют количественные и высокочувствительные способы секвенирования ДНК/РНК, эти способы занимают много времени, требуют тщательного приготовления пробы и дорогостоящего оборудования и являются, как правило, недоступными (непригодными) в качестве портативных систем.

Описание изобретения

Целью данного изобретения является создание прибора для определения гибридов олигомеров нуклеиновой кислоты и способа, который не имеет недостатков способов, применяемых для этой цели.

В соответствии с данным изобретением эта цель решается с помощью модифицированного олигонуклеотида в соответствии с независимым п.1, с помощью способа получения модифицированного олигонуклеотида в соответствии с независимым п.21, с помощью модифицированной проводящей поверхности в соответствии с независимым п.29, с помощью способа получения модифицированной проводящей поверхности в соответствии с независимым п.44, и способа электрохимического определения событий гибридизации олигомеров нуклеиновой кислоты в соответствии с независимым п.48.

Следующие сокращения и термины будут использоваться в контексте данного изобретения:

Генетика

ДНК - Дезоксирибонуклеиновая кислота

РНК - Рибонуклеиновая кислота

ПНК - Пептидная нуклеиновая кислота (синтетическая ДНК или РНК, в которой сахарофосфатная группировка заменяется аминокислотой. Если сахарофосфатная группировка заменяется на -НН-(СН₂)₂-Н(СОСН₂-основание)СН₂СО-группировку, то ПНК будет гибридизоваться с ДНК.)

А - Аденин

С - Гуанин

С - Цитозин

Т - Тимин и - Урацил

Основание - А, С, Т, С или и

п.о. - Пара оснований

Нуклеиновая кислота - По меньшей мере, два ковалентно связанных нуклеотида или, по меньшей мере, два ковалентно связанных пиримидиновых (например, цитозин, тимин или урацил) или пуриновых основания (например, аденин или гуанин). Термин нуклеиновая кислота относится к любому скелету ковалентно связанных пиримидиновых или пуриновых оснований, как, например, к сахарофосфатному скелету ДНК, кДНК или РНК, к пептидному скелету ПНК или к аналогичным структурам (например, фосфоамидному, тиофосфатному или дитиофосфатному скелету). Основным свойством нуклеиновой кислоты, в соответствии с данным изобретением, является то, что она может последовательность-специфически связываться с нативной кДНК или РНК.

Олигомер нуклеиновой кислоты - Нуклеиновая кислота основной длины, которая в дальнейшем не определяется (например, октамер нуклеиновой кислоты: нуклеиновая кислота, имеющая любой скелет, в котором 8 пиримидиновых или пуриновых оснований ковалентно связаны друг с другом).

Олигомер - Эквивалентен олигомеру нуклеиновой кислоты.

Олигонуклеотид - Эквивалентен олигомеру или олигомеру нуклеиновой кислоты, напри мер фрагменту ДНК, ПНК или РНК основной длины, который в дальнейшем не определяется.

Олиго - Сокращение для олигонуклеотида.

Праймер - Начальный комплементарный фрагмент олигонуклеотида с основной длиной праймера приблизительно 4-8 оснований. Служит в качестве начальной точки для ферментативной репликации олигонуклеотида.

Ошибочное спаривание - При образовании двухцепочечной олигонуклеотидной структуры Уотсона-Крика две одиночные цепи гибридизуются таким образом, что основание А (или С) одной цепи образует водородные связи с основанием Т (или С) другой цепи (в РНК основание Т заменяется на урацил). При спаривании любых других оснований водородные связи не образуются, что приводит к искажению структуры, и такое спаривание обозначается как ошибочное.

- Одиночная цепь

- Двойная цепь

Фотоиндуцибельные и химически индуцибельные группировки, обладающие окислительно-восстановительной активностью

Группировка, обладающая окислительновосстановительной активностью - Фотоиндуцибельная группировка, обладающая окислительно-восстановительной активностью, или химически индуцибельная группировка, обладающая окислительно-восстановительной активностью.

Электронный донор - В контексте данного изобретения термин электронный донор относится к компоненту фотоиндуцибельной или химически индуцибельной группировки, обладающей окислительно-восстановительной активностью. Электронным донором является молекула, которая может переносить электрон на электронный акцептор, непосредственно или под влиянием определенных внешних условий. Одним таким внешним условием является поглощение света электронным донором или акцептором фотоиндуцибельной группировки, обладающей окислительно-восстановительной активностью. При облучении светом с определенной или любой данной длиной волны, электронный донор Ό отдает электрон на определенный/неопределенный электронный акцептор А, и образуется структура с разделенными зарядами Ό⁺Α^-, по меньшей мере, временно включающее окисленный донор и восстановленный акцептор. Другим таким внешним условием может быть окисление или восстановление электронного донора или акцептора химически индуцибельной группировки, обладающей окислительно-восстановительной активностью, внешним окисляющим или восстанавливающим агентом, как, например, перенос электрона на электронный донор восстанавливающим агентом или высвобождение электрона электронным акцептором на окисляющий агент. Эти окисляющие или восстанавливающие агенты могут быть внешними веществами, обладающими окислительно-восстановительной ак тивностью, т.е. они не связаны ковалентно, но находятся в контакте с группировкой, обладающей окислительно-восстановительной активностью, с олигомером нуклеиновой кислоты или с проводящей поверхностью, например, через раствор, добавленный к модифицированной проводящей поверхности, или они ковалентно связаны с олигомером нуклеиновой кислоты, причем окисляющий или восстанавливающий агент ковалентно присоединены к олигомеру нуклеиновой кислоты в сайте, который расположен, по меньшей мере, на расстоянии двух ковалентно связанных нуклеотидов или, по меньшей мере, двух ковалентно связанных пиримидиновых или пуриновых оснований от сайта ковалентного присоединения группировки, обладающей окислительно-восстановительной активностью, предпочтительно, на конце олигонуклеотида, противоположном модификации группировкой, обладающей окислительно-восстановительной активностью, около проводящей поверхности. Способность вести себя в качестве электронного донора или акцептора является относительной, то есть молекула, которая ведет себя как электронный донор по отношению к другой молекуле, непосредственно или под влиянием определенных внешних условий, может вести себя и как электронный акцептор по отношению к этой молекуле при других экспериментальных условиях, или по отношению к третьей молекуле при тех же или других экспериментальных условиях.

Электронный акцептор - В контексте данного изобретения термин электронный акцептор относится к компоненту фотоиндуцибельной или химически индуцибельной группировки, обладающей окислительно-восстановительной активностью. Электронным акцептором является молекула, которая может принимать электрон от электронного донора, непосредственно или под влиянием определенных внешних условий. Одним таким внешним условием является поглощение света электронным донором или акцептором фотоиндуцибельной группировки, обладающей окислительно-восстановительной активностью.

При облучении светом с определенной или любой данной длиной волны, электронный донор Ό отдает электрон на определенный/неопределенный электронный акцептор А, и образуется структура с разделенными зарядами Э'А^-. по меньшей мере, временно включающее окисленный донор и восстановленный акцептор. Другим таким внешним условием может быть окисление или восстановление электронного донора или акцептора химически индуцибельной группировки, обладающей окислительно-восстановительной активностью, внешним окисляющим или восстанавливающим агентом, как например, перенос электрона на электронный донор восстанавливающим агентом или высвобождение электрона электронным акцептором на окисляющий агент. Эти окис7 ляющие или восстанавливающие агенты могут быть внешними веществами, обладающими окислительно-восстановительной активностью, т.е. они не связаны ковалентно, но находятся в контакте с группировками, обладающими окислительно-восстановительной активностью, с олигомером нуклеиновой кислоты или с проводящей поверхностью, например, через раствор, добавленный к модифицированной проводящей поверхности, или они ковалентно связаны с олигомером нуклеиновой кислоты, причем окисляющий или восстанавливающий агент ковалентно присоединены к олигомеру нуклеиновой кислоты в сайте, который расположен, по меньшей мере, на расстоянии двух ковалентно связанных нуклеотидов или, по меньшей мере, двух ковалентно связанных пиримидиновых или пуриновых оснований от сайта ковалентного присоединения группировки, обладающей окислительно-восстановительной активностью, предпочтительно, на конце олигонуклеотида, противоположном модификации группировкой, обладающей окислительно-восстановительной активностью, около проводящей поверхности. Способность вести себя в качестве электронного акцептора или донора является относительной, то есть молекула, которая ведет себя как электронный акцептор по отношению к другой молекуле, непосредственно или под влиянием определенных внешних условий, может вести себя и как электронный донор по отношению к этой молекуле при других экспериментальных условиях, или по отношению к третьей молекуле при тех же или других экспериментальных условиях.

Электронодонорная молекула - Эквивалентна электронному донору.

Электроноакцепторная молекула - Эквивалентна электронному акцептору.

Окисляющий агент - Химическое соединение (химическое вещество), которое окисляет другое химическое соединение (химическое вещество, электронный донор, электронный акцептор), принимая электроны от этого другого химического соединения (химического вещества, электронного донора, электронного акцептора). Окисляющий агент ведет себя аналогично электронному акцептору, но используется в контексте данного изобретения для обозначения внешнего электронного акцептора, непосредственно не связанного с фотоиндуцибельной или химически индуцибельной группировкой, обладающей окислительно-восстановительной активностью. В этом контексте непосредственно не означает, что окисляющий агент является либо свободным веществом, обладающим окислительно-восстановительной активностью, которое не связано, но находится в контакте с олигомером нуклеиновой кислоты, либо таким окисляющим агентом, который ковалентно присоединен к олигомеру нуклеиновой кислоты, но в сайте олигомера нуклеиновой кислоты, кото рый расположен, по меньшей мере, на расстоянии двух ковалентно связанных нуклеотидов или, по меньшей мере, двух ковалентно связанных пиримидиновых или пуриновых оснований от сайта ковалентного присоединения (фотоиндуцибельной) группировки, обладающей окислительно-восстановительной активностью. В частности, электрод может представлять окисляющий агент.

Восстанавливающий агент - Химическое соединение (химическое вещество), которое восстанавливает другое химическое соединение (химическое вещество, электронный донор, электронный акцептор), отдавая электроны этому другому химическому соединению (химическому веществу, электронному донору, электронному акцептору). Восстанавливающий агент ведет себя аналогично электронному донору, но используется в контексте данного изобретения для обозначения внешнего электронного донора, непосредственно не связанного с фотоиндуцибельной или химически индуцибельной группировкой, обладающей окислительно-восстановительной активностью. В этом контексте непосредственно не означает, что восстанавливающий агент является либо свободным веществом, обладающим окислительновосстановительной активностью, которое не связано, но находится в контакте с олигомером нуклеиновой кислоты, либо таким восстанавливающим агентом, который ковалентно присоединен к олигомеру нуклеиновой кислоты, но в сайте олигомера нуклеиновой кислоты, который расположен, по меньшей мере, на расстоянии двух ковалентно связанных нуклеотидов или, по меньшей мере, двух ковалентно связанных пиримидиновых или пуриновых оснований от сайта ковалентного присоединения (фотоиндуцибельной) группировки, обладающей окислительно-восстановительной активностью. В частности, электрод может представлять восстанавливающий агент.

Фотоиндуцибельный - Фотоиндуцибельный означает, что определенное свойство проявляется только при облучении светом с определенной или любой данной длиной волны. Например, фотоиндуцибельная группировка, обладающая окислительно-восстановительной активностью, проявляет свою окислительновосстановительную активность, или другими словами, свое свойство выполнять разделение заряда в пределах фотоиндуцибельной группировки, обладающей окислительно-восстановительной активностью, при определенных внешних условиях, например, образуя состояние Ό⁺Ά^- и отдавая электроны другому подходящему окисляющему агенту или принимая электроны от другого подходящего восстанавливающего агента, только при облучении светом с определенной или любой данной длиной волны. Дополнительным примером является фотоиндуцибельная реакционноспособная группа, то есть группа, которая становится химически активной только при облучении светом с определенной или любой данной длиной волны.

Обладающий окислительно-восстановительной активностью - Окислительно-восстановительная активность обозначает свойство группировки, обладающей окислительновосстановительной активностью, отдавать электроны подходящему окисляющему агенту или принимать электроны от подходящего восстанавливающего агента при определенных внешних условиях, или свойство вещества, обладающего окислительно-восстановительной активностью, отдавать электроны подходящему электронному акцептору или принимать электроны от подходящего электронного донора при определенных внешних условиях.

Свободное вещество, обладающее окислительно-восстановительной активностью - Свободный окисляющий или восстанавливающий агент, ковалентно не связанный, но находящийся в контакте с группировкой, обладающей окислительно-восстановительной активностью, с олигомером нуклеиновой кислоты или с проводящей поверхностью, например, через раствор, добавленный к модифицированной проводящей поверхности, причем свободное вещество, обладающее окислительно-восстановительной активностью способно быть, например, незаряженной молекулой, любой солью или белком или ферментом, обладающим окислительно-восстановительной активностью (оксидоредуктаза). Свободное вещество, обладающее окислительно-восстановительной активностью, характеризуется тем, что оно может снова восстанавливать окисленный донор (или снова окислять восстановленный акцептор) фотоиндуцибельной группировки, обладающей окислительно-восстановительной активностью, или тем, что это свободное вещество, обладающее окислительно-восстановительной активностью, может восстанавливать донор (или окислять акцептор) химически индуцибельной группировки, обладающей окислительно-восстановительной активностью.

Фотоиндуцибельная группировка, обладающая окислительно-восстановительной активностью - Общий термин для группировки, которая включает одну или несколько электронодонорных молекул или одну или несколько электроноакцепторных молекул, причем эта (эти) электоронодонорная молекула(ы) и/или электроноакцепторная молекула(ы) способны внедряться в одну или несколько макромолекул. Электронный донор(ы) и электронный акцептор(ы) могут соединяться друг с другом через одну или несколько ковалентных или ионных связей, через водородные связи, мостики Вандер-Ваальса, π-π-взаимодействие или через координацию посредством отдачи и принятия электронной пары, при этом ковалентные связи могут быть прямыми или опосредованными свя зями (например, через спейсер, но не через олигомер нуклеиновой кислоты). Кроме того, электронный донор(ы) и/или электронный акцептор(ы), которые внедряются в одну макромолекулу или несколько макромолекул, могут соединяться с этой макромолекулой (макромолекулами) через ковалентное присоединение к этой макромолекуле (макромолекулам), через инкапсуляцию в подходящих молекулярных полостях (связывающих карманах) этой макромолекулы (макромолекул), через ионные связи, водородные связи, мостики Ван-дер-Ваальса, ππ-взаимодействие или через координацию посредством отдачи и принятия электронной пары между этой макромолекулой (макромолекулами) и электронодонорной молекулой (молекулами) и/или электроноакцепторной молекулой (молекулами). Если фотоиндуцибельная группировка, обладающая окислительно-восстановительной активностью, составлена из многочисленных макромолекул, то связывание макромолекул друг с другом может происходить таким же образом ковалентно, ионно, через водородные связи, мостики Ван-дер-Ваальса, π-πвзаимодействие или через координацию посредством отдачи и принятия электронной пары. Кроме включения электронного донора(ов) и электронного акцептора(ов) или электронного донора(ов), электронного акцептора(ов) и макромолекулы (макромолекул), важными особенностями фотоиндуцибельной группировки, обладающей окислительно-восстановительной активностью, являются: (ί) в формах, имеющих отношение к данному изобретению (электронный донор(ы) и электронный акцептор(ы) в их первоначальном состоянии или в окисленном или восстановленном состоянии), эта группировка является стабильной и не диссоциирует на составляющие ее компоненты, (и) группировка не включает нуклеиновую кислоту, (ш) состав группировки, включающий электронный донор(ы) и электронный акцептор(ы) или электронный донор(ы), электронный акцептор(ы) и макромолекулу(ы), может распознаваться специалистом в данной области независимо от связи между этими компонентами, так как, в принципе, они могут встречаться в виде отдельных молекул, и (ίν) при тех же или похожих внешних условиях электронный донор(ы) и электронный акцептор(ы) фотоиндуцибельной группировки, обладающей окислительно-восстановительной активностью, в виде отдельных молекул действуют в растворе как электронный донор(ы) и электронный акцептор(ы), то есть даже в случае свободного растворенного электронного донора(ов) и электронного акцептора(ов), электрон может переноситься от растворенного электронного донора(ов) на растворенный электронный акцептор(ы), непосредственно или под влиянием определенных внешних условий, зависящих от условий, которые приводят к переносу электрона в пределах фотоиндуцибельной группировки, обладающей окислительно-восстановительной активностью. Фотоиндуцибельная группировка, обладающая окислительно-восстановительной активностью, может быть, например, любым фотоиндуцибельным белком/ферментом, обладающим окислительно восстановительной активностью, или любым фотоиндуцибельным, сшитым, по меньшей мере, бимолекулярным электронодонорным/электроноакцепторным комплексом, обладающим окислительно-восстановительной активностью. При облучении светом с определенной или любой данной длиной волны определенный/неопределенный электронный донор отдает электрон одному из электронных акцепторов и образуется структура с разделенными зарядями Ό⁺Ά^-, по меньшей мере временно, включающее окисленный донор и восстановленный акцептор. Этот процесс в пределах фотоиндуцибельной группировки, обладающей окислительно-восстановительной активностью, обозначается как фотоиндуцированное разделение заряда. При наличии соответственно выбранных внешних условий, фотоиндуцибельная группировка, обладающая окислительновосстановительной активностью, проявляет свою окислительно-восстановительную активность, другими словами, свое свойство отдавать электроны подходящему окисляющему агенту или принимать электроны от подходящего восстанавливающего агента, только в структуре с разделенными зарядами, так как восстанавливающий агент переносит (или окисляющий агент принимает) электроны только на окисленный донор (или от восстановленного акцептора) фотоиндуцибельной группировки, обладающей окислительно-восстановительной активностью, например, в присутствии восстанавливающего агента, который может восстанавливать Ό⁺, но не Ό (или в присутствии окисляющего агента, который может окислять А^-, но не А). В частности, этот окисляющий или восстанавливающий агент может быть также электродом, при этом фотоиндуцибельная группировка, обладающая окислительно-восстановительной активностью, способна отдавать электрон на электрод (или принимать электрон от него) только после фотоиндуцированного разделения заряда, например, если на электроде устанавливается потенциал, при котором А^-, но не А, окисляется (или при котором Ό⁺, но не Ό, восстанавливается).

Химически индуцибельная группировка, обладающая окислительно-восстановительной активностью - Соответствует фотоиндуцибельной группировке, обладающей окислительновосстановительной активностью, по составу и способу функционирования, но в отличие от способа, при котором функционирует фотоиндуцибельная группировка, обладающая окислительно-восстановительной активностью, фотоактивация предотвращается как внешнее усло вие для развития окислительно-восстановительной активности группировки, обладающей окислительно-восстановительной активностью. Группировка, обладающая окислительновосстановительной активностью, может быть, например, любым белком/ферментом, обладающим окислительно-восстановительной активностью, или любым сшитым, по меньшей мере, бимолекулярным электронодонорным/ электроноакцепторным комплексом, обладающим окислительно-восстановительной активностью. При наличии соответственно выбранных внешних условий группировка, обладающая окислительно-восстановительной активностью, проявляет свою окислительно-восстановительную активность, например, свое свойство отдавать электроны подходящему окисляющему агенту, только после того как электрон перенесется от восстанавливающего агента на определенный/ неопределенный электронный донор Ό, который может переносить электрон на акцептор А только в восстановленном состоянии Ό^-, и окисляющий агент принимает электроны только от этого восстановленного акцептора А^- группировки, обладающей окислительно-восстановительной активностью, другими словами, в присутствии окисляющего агента, который может окислять А^-, но не А (последовательный перенос заряда). В частности, этот окисляющий агент может быть также электродом, например, если на электроде устанавливается потенциал, при котором А^-, но не А, окисляется. Наоборот, при наличии других выбранных внешних условий группировка, обладающая окислительно-восстанови-тельной активностью, может проявлять свою окислительновосстановительную активность, например, свое свойство принимать электроны от подходящего восстанавливающего агента, только после того, как электрон перенесется от электронного акцептора А на окисляющий агент, если только окисленный акцептор А⁺ может принимать электрон от донора Ό, и восстанавливающий агент может переносить электроны только на окисленный донор Ό⁺ группировки, обладающей окислительно-восстано-вительной активностью, например, в присутствии восстанавливающего агента, который может восстанавливать Ό⁺, но не Ό (последовательный перенос заряда). В частности, этот восстанавливающий агент может быть также электродом, например, если на электроде устанавливается потенциал, при котором Ό⁺, но не Ό, восстанавливается.

Фотоиндуцибельный белок/фермент, обладающий окислительно-восстановительной активностью - Обычно состоит из того, что известно как апопротеин - предпочтительная молекула(ы) данного изобретения - и кофакторов - электронного донора(ов) и электронного акцептора(ов) в пределах смысла данного изобретения. Фотоиндуцированное разделение заряда в пределах фотоактивируемого бел ка/фермента, обладающего окислительновосстановительной активностью, запускается светом с определенной или любой данной длиной волны. Так, например, в фотосинтетическом реакционном центре (РЦ) кофакторы в виде первичного электронного донора Р и многочисленные электронные акцепторы А, включая хиноновый кофактор(ы) О. внедряются в белковый матрикс, образуя таким образом полимолекулярную группировку (ср. структуру 1). В этом случае, внедрение происходит через инкапсуляцию кофакторов в подходящих полостях (известных как связывающие карманы) белкового матрикса, включающего многочисленные белковые субъединицы. В случае некоторых естественно встречающихся РЦ, как белковые субъединицы, так и инкапсуляция кофакторов в белковом матриксе осуществляются через нековалентные связи. При облучении светом с подходящей длиной волны, первичный донор отдает электрон на один из электронных акцепторов, и образуется структура РЦ с разделенными зарядами Р⁺А^-, и особенно структура Р'О^-· по меньшей мере временно, включающая первоначально нейтральные кофакторы.

Химически индуцибельный белок/фермент, обладающий окислительно-восстановительной активностью - Соответствует фотоиндуцибельному белку/ферменту, обладающему окислительно-восстановительной активностью, по составу и способу функционирования, но, в отличие от способа, при котором функционирует фотоиндуцибельный белок/ фермент, обладающий окислительно-восста-новительной активностью, фотоактивация предотвращается как внешнее условие для развития окислительновосстановительной активности группировки, обладающей окислительно-восстановительной активностью; химически индуцибельный белок/фермент, обладающий окислительновосстановительной активностью, обычно состоит из того, что известно как апопротеин - предпочтительная молекула(ы) данного изобретения - и кофакторов - электронного донора(ов) и электронного акцептора(ов) в пределах смысла данного изобретения. Свойство белка/фермента, обладающего окислительно-восстановительной активностью, последовательно переносить заряд запускается свободным веществом (субстратом), обладающим окислительно-восстановительной активностью.

Фотоиндуцибельный, обладающий окислительно-восстановительной активностью, сшитый, по меньшей мере, бимолекулярный электронодонорный/электроноакцепторный комплекс - Соединение, включающее одну или несколько электронодонорных молекул Ό1, Ό2, Ό3 и т.д. и, по меньшей мере, одну или несколько подходящих электроноакцепторных молекул А1, А2, А3 и т.д., при этом электронный донор(ы) и электронный акцептор(ы) соединяются друг с другом через одну или несколько ковалентных или ионных связей, через водородные связи, мостики Ван-дер-Ваальса, через π-πвзаимодействие или через координацию посредством отдачи и принятия электронной пары. Ковалентные связи в этом смысле могут быть прямыми или опосредованными связями (например, через спейсер, но не через олигомер нуклеиновой кислоты). Кроме включения электронного донора(ов) и электронного акцептора(ов), важными особенностями фотоиндуцибельного, обладающего окислительно-восстановительной активностью, сшитого, по меньшей мере, бимолекулярного электронодонорного/электроноакцепторного комплекса, являются: (ί) в формах, имеющих отношение к данному изобретению (электронный донор(ы) и электронный акцептор(ы) в их первоначальном состоянии или в окисленном или восстановленном состоянии), этот электронодонорный/электроноакцепторный комплекс является стабильным и не диссоциирует на составляющие его компоненты, (ίί) группировка не включает нуклеиновую кислоту, (ίίί) состав, по меньшей мере, бимолекулярного электронодонорного/электроноакцепторного комплекса, включающий электронный донор(ы) и электронный акцептор(ы) или электронный донор(ы), электронный акцептор(ы) и макромолекулу(ы), может распознаваться специалистом в данной области независимо от связи между этими компонентами, и (ίν) при тех же или похожих внешних условиях электронный донор(ы) и электронный акцептор(ы) фотоиндуцибельного, обладающего окислительно-восстановительной активностью, сшитого, по меньшей мере, бимолекулярного электронодонорного/электроно-акцепторного комплекса также в виде отдельных молекул в растворе действуют как электронный донор(ы) и электронный акцептор(ы), то есть даже в случае свободного растворенного электронного донора(ов) и электронного акцептора(ов), электрон может переноситься от растворенного электронного донора(ов) на растворенный электронный акцептор(ы), непосредственно или под влиянием определенных внешних условий, зависящих от условий, которые приводят к переносу электрона в пределах фотоиндуцибельной группировки, обладающей окислительновосстановительной активностью. По способу его функционирования, который имеет отношение к данному изобретению, фотоиндуцибельный, обладающий окислительно-восстановительной активностью, сшитый, по меньшей мере, бимолекулярный электронодонорный/электроноакцепторный комплекс соответствует фотоиндуцибельному белку/ферменту, обладающему окислительно-восстановительной активностью, то есть здесь облучение светом с подходящей длиной волны также приводит к фотоиндуцированному разделению заряда, и, по меньшей мере временно, образуется структура с разделенными зарядами Ό⁺Α^- (где Ό обозначает любые Ό1, Ό2, Ό3 и т.д., и А - любые А1, А2, А3 и т.д.). В выражении фотоиндуцибельный, обладающий окислительно-восстановительной активностью, сшитый, по меньшей мере, бимолекулярный электронодонорный/электроноакцепторный комплекс термин по меньшей мере, бимолекулярный указывает на то, что комплекс состоит, по меньшей мере, из одного электронного донора и, по меньшей мере, одного электронного акцептора, даже если донор прямо (или опосредованно через спейсер) ковалентно соединяется с акцептором.

Химически индуцибельный, обладающий окислительно-восстановительной активностью, сшитый, по меньшей мере, бимолекулярный электронодонорный/электроноакцепторный комплекс - Соответствует фотоиндуцибельному, обладающему окислительно-восстановительной активностью, сшитому, по меньшей мере, бимолекулярному электронодонорному/электроноакцепторному комплексу по составу и способу функционирования, но в отличие от способа, при котором функционирует фотоиндуцибельный, обладающий окислительно-восстановительной активностью, сшитый, по меньшей мере, бимолекулярный электронодонорный/электроноакцепторный комплекс, фотоактивация предотвращается как внешнее условие для развития окислительно-восстановительной активности группировки, обладающей окислительновосстановительной активностью.

При наличии соответственно выбранных внешних условий, фотоиндуцибельная группировка, обладающая окислительно-восстановительной активностью, проявляет свою окислительновосстановительную активность, например, свое свойство отдавать электроны подходящему окисляющему агенту, только после того как электрон перенесется от восстанавливающего агента на определенный/неопределенный электронный донор Ό, который может переносить электрон на акцептор А только в восстановленном состоянии Ό^-, и окисляющий агент принимает электроны только от этого восстановленного акцептора А^- группировки, обладающей окислительно-восстановительной активностью, другими словами, в присутствии окисляющего агента, который может окислять А^-, но не А (последовательный перенос заряда). В частности, этот окисляющий агент может быть также электродом, например, если на электроде устанавливается потенциал, при котором А^-, но не А, окисляется. Наоборот, при наличии других выбранных внешних условий группировка, обладающая окислительно-восстановительной активностью, может проявлять свою окислительно-восстановительную активность, например, свое свойство принимать электроны от подходящего восстанавливающего агента только после того, как электрон перенесется от электронного акцептора А на окисляющий агент, если только окисленный акцептор А⁺ может принимать электрон от донора Ό, и восстанавливающий агент может переносить электроны только на окисленный донор Ό⁺ группировки, обладающей окислительно-восстановительной активностью, например, в присутствии восстанавливающего агента, который может восстанавливать Ό⁺, но не Ό (последовательный перенос заряда). В частности, этот восстанавливающий агент может быть также электродом, например, если на электроде устанавливается потенциал, при котором Ό⁺, но не Ό, восстанавливается. В выражении обладающий окислительно-восстановительной активностью, сшитый, по меньшей мере, бимолекулярный электронодонорный/электроноакцеп-торный комплекс термин по меньшей мере, бимолекулярный указывает на то, что комплекс состоит, по меньшей мере, из одного электронного донора и, по меньшей мере, одного электронного акцептора, даже если донор прямо (или опосредованно через спейсер) ковалентно соединяется с акцептором.

РЦ - Реакционный центр. Пример фотоиндуцибельного белка/фермента, обладающего окислительно-восстановительной активностью. Белок/фермент является тем, что известно как пигмент/белковый комплекс, состоящий из апопротеина, включающего многочисленные белковые субъединицы, и многочисленных кофакторов (известных как пигменты в примере РЦ). Первые этапы управляемого светом разделения заряда в бактериальном или растительном фотосинтезе наблюдаются в таких пигмент/белковых комплексах. Например, РЦ фотосинтезирующих бактерий штамма КйобоЬас1ег крйаегоИек (ср. структура 1) состоит из трех белковых субъединиц и восьми кофакторов (пигментов). Кофакторы: димер бактериохлорофилла Р, два мономера бактериохлорофилла В_А и В_в, два мономера бактериофеофитина Н_А и Н_в и две молекулы убихинона-50 ШО) 0_Л и 0_В локализуются в соответствующих белковых связывающих карманах (то есть Р, В_А и т.д. связывающих карманах).

Од белковый связывающий карман - Белковый связывающий карман (или белковое окружение), в котором локализуется хиноновый кофактор Од. В РЦ КйобоЬас1ег крйаегоИек хиноновым кофактором является, например, убихинон-50 (ср. структура 1).

связывающий карман - белковый связывающий карман.

Химические вещества/группы

ΖηΒΟιΙ - Цинк-бактериохлорофилл (формула 11 с М=2и)

О - Обычно хинон; в примере 3 и эпизодах, относящихся к тому же, О является модифицированным антрахиноном или пирролхинолинхиноном (Р00).

ир - Убихинон-50, РЦ кофактор и временный электронный акцептор, например, в РЦ фотосинтезирующих бактерий КйобоЬас1ег 8рйаего1бе8 или Кйоборкеиботоиак νίτίάίδ.

(цит с₂)²⁺ - Восстановленная форма цитохрома с₂, свободно перемещающийся гемопротеин, который при бактериальном фотосинтезе в К1юбоЬас1ег зрйаегоИез восстанавливает окисленный первичный донор Р⁺ до Р; пример вещества, обладающего окислительновосстановительной активностью.

Р00 - Пирролхинолинхинон; соответствует 4,5 -дигидро-4,5 - диоксо -1 Н-пиррол [2,3-ί] хинолин-2,7,9-трикарбоновой кислоте.

ЭДТА - Этилендиаминотетраацетат (натриевая соль)

Сульфо-ΝΗδ - Ν-гидроксисульфосукцинимид

ЕЭС - (3-Диметиламинопропил)карбодиимид

НЕРЕ8 - №[2-гидроксиэтил]пиперазин-Ы'[2-этансульфоновая кислота]

Тпк - Трисгидроксиметиламинометан

Алкил - Термин алкил относится к насыщенной углеводородной группе, которая представляет собой нормальную (прямую) или разветвленную цепь (например, этил, 2,5диметилгексил или изопропил и т. д.). Когда термин алкил используется для определения линкера или спейсера, этот термин указывает на группу, имеющую две доступные валентности для ковалентного связывания (например, -СН2СН2-, -СН2С(СН3)2СН2СН2С(СН3)2СН2- или СН₂СН₂СН₂- и т. д.). Алкильные группы, предпочтительные в качестве заместителей или боковых цепей К, являются группами с длиной цепи 1-30 (наиболее длинная непрерывная цепь атомов, ковалентно связанных друг с другом). Алкильные группы, предпочтительные в качестве линкеров или спейсеров, являются группами, имеющими длину цепи 1-20, главным образом длину цепи 1-14, где длина цепи представляет собой наиболее короткое непрерывное звено между структурами, соединенными через линкер или спейсер, другими словами, между двумя молекулами или между поверхностным атомом, поверхностной молекулой или поверхностной молекулярной группой и другой молекулой.

Алкенил - Алкильные группы, в которых одна или более одинарных связей С-С заменяются на двойные связи С=С.

Алкинил - Алкильные или алкенильные группы, в которых одна или более одинарных связей С-С или двойных связей С=С заменяются на тройные связи С^С.

Гетероалкил - Алкильные группы, в которых одна или более С-Н-связей или одинарных связей С-С заменяются на связи С-Ν, ΟΝ, С-Р, С=Р, С-О, С=О, С-8 или С=8.

Гетероалкенил - Алкенильные группы, в которых одна или более С-Н-связей, одинарных С-С или двойных связей С=С заменяются на связи С-Ν, ϋ=Ν, С-Р, С=Р, С-О, С=О, С-8 или С=8.

Гетероалкинил - Алкинильные группы, в которых одна или более С-Н-связей, одинарных

С-С, двойных С=С или тройных связей С=С заменяются на связи С-Ν, ΟΝ, С-Р, С=Р, С-О,

С=О, С-8 или С=8.

Линкер - Молекулярное звено между двумя молекулами или между поверхностным атомом, поверхностной молекулой или поверхностной молекулярной группой и другой молекулой. Линкеры могут приобретаться обычно в виде алкильных, алкенильных, алкинильных, гетероалкильных, гетероалкенильных или гетероалкинильных цепей, причем цепь снабжена в двух местах (одинаковыми или разными) реакционноспособными группами. Эти группы образуют ковалентную химическую связь в простых/известных химических реакциях с соответствующими реакционными партнерами. Эти реакционноспособные группы могут быть также фотоактивируемыми, то есть эти реакционноспособные группы активируются только светом с определенной или любой данной длиной волны. Предпочтительными являются линкеры, имеющие длину цепи 1-20, особенно длину цепи 1-14, где длина цепи представляет собой наиболее короткое непрерывное звено между соединяемыми структурами, другими словами, между двумя молекулами или между поверхностным атомом, поверхностной молекулой или поверхностной молекулярной группой и другой молекулой.

Спейсер - Линкер, который ковалентно присоединяется через реакционноспособные группы к одной или обеим соединяемым структурам (см. линкер). Предпочтительными являются спейсеры, имеющие длину цепи 1-20, особенно длину цепи 1-14, где длина цепи представляет собой наиболее короткое непрерывное звено между соединяемыми структурами.

(п х Н8-спейсер)-олиго - Олигомер нуклеиновой кислоты, к которому присоединяются п тиольных функциональных групп, каждая через спейсер, где каждый спейсер может иметь разную длину цепи (наиболее короткое непрерывное звено между тиольной функциональной группой и олигомером нуклеиновой кислоты), особенно любую длину цепи между 1 и 14. Эти спейсеры, в свою очередь, могут связываться с различными реакционноспособными группами, которые естественно присутствуют на олигомере нуклеиновой кислоты или которые к тому же зафиксированы посредством модификации, и п представляет собой любое целое число, особенно число между 1 и 20.

[п х К-8-8-спейсер)-олиго - Олигомер нуклеиновой кислоты, к которому присоединяются п дисульфидных функциональных групп, каждая через спейсер, и любой остаток К насыщает эту дисульфидную функциональную группу. Каждый спейсер, участвующий в присоединении дисульфидной функциональной группы к олигомеру нуклеиновой кислоты, может иметь разную длину цепи (наиболее короткое непрерывное звено между дисульфидной функциональной группой и олигомером нуклеиновой кислоты), особенно любую длину цепи между 1 и 14. Эти спейсеры, в свою очередь, могут связываться с различными реакционноспособными группами, которые естественно присутствуют на олигомере нуклеиновой кислоты или которые к тому же зафиксированы посредством модификации. Переменная η представляет собой любое целое число, особенно число между 1 и 20.

Олиго-спейсер-8-8-спейсер-олиго - Два одинаковых или различных олигомера нуклеиновой кислоты, которые соединяются друг с другом через дисульфидный мостик, причем дисульфидный мостик присоединяется к олигомерам нуклеиновой кислоты через два любых спейсера, и эти два спейсера имеют различные длины цепей (наиболее короткое непрерывное звено между дисульфидным мостиком и соответствующим олигомером нуклеиновой кислоты), особенно любую длину цепи между 1 и 14, и эти спейсеры, в свою очередь, могут связываться с различными реакционноспособными группами, которые естественно присутствуют на олигомере нуклеиновой кислоты или которые к тому же зафиксированы посредством модификации.

Модифицированные поверхности/электроды

Слюда - Пластинки мусковита, подложка для нанесения тонких слоев.

Аи-8-(СН₂)₂-55-о1фо-спейсср-иО(РЦ) - Золотая пленка на поверхности слюды, имеющая ковалентно связанный монослой производного одноцепочечного олигонуклеотида ДНК длиной 12 п.о. (последовательность: ТАСТСССААССА). Здесь, концевая фосфатная группа олигонуклеотида на 3'-конце этерифицируется (НО-(СН₂)₂-8)₂ с образованием Р-О-(СН₂)₂-8-8(СН₂)₂-ОН, при этом происходит гомолитическое расщепление 8-8-связи и получение, для каждого атома 8, одной связи Аи-8-Κ. Концевое тиминовое основание на 5'-конце олигонуклеотида модифицируется по С-5 атому углерода с помощью -СН=СН-СО-НН-СН₂-СН₂-НН₂, и этот остаток, в свою очередь, связывается через свою свободную аминогруппу с карбоксильной группой модифицированного убихинона-50 посредством аминирования. После этого ир восстанавливается оставшимся РЦ.

Аи-8-(С.Н₂)₂-б5-о1фо-спенсер-иО(РЦ) - Аи8-(СН₂)₂-55-о1|до-спейсср-иО(РЦ). который гибридизуется с олигонуклеотидом, комплементарным 88-олиго (последовательность: ТАСТСССААССА).

Аи-8-(С.Н₂)₂-55-о1фо-спейсер-О-2пВС111 Идентичен Аи-8-(СН₂)₂-58-о11до-спейсер-ир(РЦ), за исключением того, что вместо РЦ, присоединенного через ир, в качестве фотоиндуцибельной группировки, обладающей окислительновосстановительной активностью, присоединяется р-2пБСЫ.

Аи-8-(СН₂)₂-б5-о1|до-спейсер-О-2пВС111 Аи-8-(СН₂)₂-88-о11до-спейсер-Р-2пВСЫ, который гибридизуется с олигонуклеотидом, комплементарным 88-олиго (последовательность:

ТАСТСССААССА).

Электрохимия

Е - Электродный потенциал на рабочем электроде.

Е_Ох - Потенциал при максимальном токе окисления обратимого электроокисления или электровосстановления.

ί - плотность тока (ток на см² электродной поверхности)

Циклическая вольтамметрия - Запись кривой ток-напряжение. Здесь потенциал стационарно работающего электрода изменяется линейно, как функция времени, начиная с потенциала, при котором не наблюдается электроокисление или электровосстановление, вплоть до потенциала, при котором группы, которые растворены или сорбированы на электроде, окисляются или восстанавливаются (то есть течет ток). После прохождения через операцию окисления или восстановления, которая образует в кривой ток-напряжение первоначальное увеличение тока и, после достижения максимума, постепенного уменьшения тока, направление подачи потенциала меняется на обратное. Поведение продуктов электроокисления или электровосстановления затем записывается в обратном ходе кривой.

Амперометрия - Запись кривой изменения тока от времени. Здесь, потенциал стационарно работающего электрода устанавливается, например, посредством скачка потенциала, до потенциала, при котором происходит электроокисление или электровосстановление растворенных или сорбированных групп, и текущий ток записывается как функция времени.

Данное изобретение направлено на олигомер нуклеиновой кислоты, который модифицируется путем химического присоединения группировки, обладающей окислительно-восстановительной активностью. Группировка, обладающая окислительно-восстановительной активностью, является либо фотоиндуцибельной группировкой, обладающей окислительновосстановительной активностью, либо химически индуцибельной группировкой, обладающей окислительно-восстановительной активностью. После фотоиндуцированного высвобождения электрона на внешний окисляющий агент, например, электрод, или принятия электрона от внешнего восстанавливающего агента, например, электрода, фотоиндуцибельная группировка, обладающая окислительно-восстановительной активностью, может быть снова восстановлена или окислена свободным веществом, обладающим окислительно-восстановительной активностью, другими словами, она может быть возвращена в ее первоначальное состояние. После отдачи электрона на внешний окисляющий агент, химически индуцибельная группировка, обладающая окислительно-восстановительной активностью, может быть восстановлена внешним восстанавливающим агентом, например, электродом, или после принятия электрона от внешнего восстанавливающего агента - окислена внешним окисляющим агентом, например, электродом.

В контексте данного изобретения, соединение, состоящее, по меньшей мере, из двух ковалентно соединенных нуклеотидов или, по меньшей мере, двух ковалентно соединенных пиримидиновых (например, цитозин, тимин или урацил) или пуриновых оснований (например, аденин или гуанин), предпочтительно фрагмент ДНК, РНК или ПНК, используется в качестве олигомера нуклеиновой кислоты. В данном изобретении термин нуклеиновая кислота относится к любому скелету ковалентно соединенных пиримидиновых или пуриновых оснований, как например, к сахарофосфатному скелету ДНК, кДНК или РНК, пептидному скелету ПНК или аналогичным скелетным структурам, таким как тиофосфатный, дитиофосфатный или фосфоамидный скелет. Основным свойством нуклеиновой кислоты, в пределах смысла данного изобретения, является то, что она может последовательность-специфически связываться с нативной (естественного происхождения) кДНК или РНК. Термины олигонуклеотид, олигонуклеотидный зонд, нуклеиновая кислота и олигомер используются в качестве альтернативы термина олигомер нуклеиновой кислоты.

В контексте данного изобретения термин электронный акцептор или электроноакцепторная молекула и термин электронный донор или электронодонорная молекула относятся к компоненту группировки, обладающей окислительно-восстановительной активностью.

В контексте данного изобретения термин группировка, обладающая окислительновосстановительной активностью подразумевает любую группировку, которая включает одну или несколько электронодонорных молекул или одну или несколько электроноакцепторных молекул. Электронодонорная молекула(ы), или молекулярная группировка(группировки), и электроноакцепторная молекула(ы), или молекулярная группировка(группировки), этой группировки, обладающей окислительно-восстановительной активностью, могут соединяться друг с другом через одну или несколько ковалентных или ионных связей, через водородные связи, мостики Ван-дер-Ваальса, через π-πвзаимодействие или через координацию посредством отдачи и принятия электронной пары, при этом ковалентные связи могут быть прямыми или опосредованными связями (например, через спейсер, но не через олигомер нуклеиновой кислоты). Кроме того, эта (эти) электоронодонорная молекула(ы) и/или электроноакцепторная молекула(ы) могут внедряться в одну или не сколько макромолекул, и это внедрение происходит через инкапсуляцию в подходящих молекулярных полостях (связывающих карманах) макромолекулы (макромолекул) через водородные связи, мостики Ван-дер-Ваальса, через π-πвзаимодействие или через координацию посредством отдачи и принятия электронной пары между этой макромолекулой (макромолекулами) и электронодонорной молекулой (молекулами) и/или электроноакцепторной молекулой (молекулами). Таким образом, в этом случае, эта макромолекула(ы) и электронодонорная молекала(ы) и электроноакцепторная молекула(ы) образуют группировку, обладающую окислительно-восстановительной активностью. Если компонентами группировки, обладающей окислительно-восстановительной активностью, являются многочисленные макромолекулы, то связывание этих молекул друг с другом может осуществляться таким же образом: ковалентно, ионно, через водородные связи, мостики Вандер-Ваальса, π-π-взаимодействие или через координацию посредством отдачи и принятия электронной пары.

В соответствии с данным изобретением вышеупомянутые донорные и акцепторные молекулы образуют группировку, обладающую окислительно-восстановительной активностью, то есть они связаны друг с другом прямо или через дополнительные молекулярные группировки. Единственным ограничением для молекул или молекулярных группировок, соединяющих компоненты группировки, обладающей окислительно-восстановительной активностью, в соответствии с данным изобретением, является исключение олигомеров нуклеиновой кислоты. В соответствии с данным изобретением группировка, обладающая окислительно-восстановительной активностью, связывается с олигонуклеотидным зондом как целая (сотр1е!е) группировка, при этом, конечно, между олигонуклеотидом и группировкой, обладающей окислительно-восстановительной активностью, могут образовываться многочисленные химические связи. Исключение олигомеров нуклеиновой кислоты в качестве молекул или молекулярных группировок, соединяющих компоненты группировки, обладающей окислительновосстановительной активностью, преследует цель ясно показать, что они не являются индивидуальными частями группировки, обладающей окислительно-восстановительной активностью, которые присоединены к различным сайтам олигонуклеотидного зонда. Таким образом, олигонуклеотидный зонд точно не представляет звено между электронодонорной молекулой (молекулами), или молекулярной группировкой (группировками), и электроноакцепторной молекулой (молекулами), или молекулярной группировкой (группировками), этой группировки, обладающей окислительно-восстано-вительной активностью.

Группировка, обладающая окислительновосстановительной активностью, является либо фотоиндуцибельной группировкой, обладающей окислительно-восстановительной активностью, либо химически индуцибельной группировкой, обладающей окислительно-восстановительной активностью.

В контексте данного изобретения, фотоиндуцибельный означает, что окислительновосстановительная активность фотоиндуцибельной группировки, обладающей окислительно-восстановительной активностью, другими словами, ее свойство отдавать электроны на подходящий окисляющий агент или принимать электроны от подходящего восстанавливающего агента при определенных внешних условиях, проявляется только при облучении светом с определенной или любой данной длиной волны. При облучении светом с определенной или любой данной длиной волны электронный донор Б отдает электрон на один из электронных акцепторов А'', и образуется структура с разделенными зарядами Б⁺А^-, по меньшей мере временно, включающая окисленный донор и восстановленный акцептор. Этот процесс в пределах фотоиндуцибельной группировки, обладающей окислительно-восстановительной активностью, обозначается как фотоиндуцированное разделение заряда. При наличии соответственно выбранных внешних условий, фотоиндуцибельная группировка, обладающая окислительно-восстановительной активностью, проявляет свою окислительно-восстановительную активность только в структуре с разделенными зарядами, так как восстанавливающий агент может переносить (или окисляющий агент может принимать) электроны только на окисленный донор (или от восстановленного акцептора) фотоиндуцибельной группировки, обладающей окислительно-восстановительной активностью, например, в присутствии окисляющего агента, который может окислять А^-, но не А (или в присутствии восстанавливающего агента, который может восстанавливать Б⁺, но не Б).

В частности, вышеупомянутый окисляющий или восстанавливающий агент может быть электродом, при этом фотоиндуцибельная группировка, обладающая окислительно-восстановительной активностью, может отдавать электрон на электрод (или принимать электрон от него) только после фотоиндуцированного разделения заряда, например, если на электроде устанавливается потенциал, при котором А^-, но не А, окисляется (или Б⁺, но не Б, восстанавливается). Кроме того, окисляющий или восстанавливающий агент может быть свободным веществом, обладающим окислительновосстановительной активностью, при этом группировка, обладающая окислительно-восстановительной активностью, может отдавать электрон (или принимать электрон от) на свободное вещество, обладающее окислительновосстановительной активностью, только после фотоиндуцированного разделения заряда, например, если свободное вещество, обладающее окислительно-восстановительной активностью, окисляет А^-, но не А (или восстанавливает Б⁺, но не Б).

В контексте данного изобретения химически индуцибельный означает, что окислительно-восстановительная активность химически индуцибельной группировки, обладающей окислительно-восстановительной активностью, другими словами, ее свойство отдавать электроны на подходящий окисляющий агент (или принимать электроны от подходящего восстанавливающего агента) при определенных внешних условиях проявляется только после восстановления (или окисления) внешним восстанавливающим агентом (или окисляющим агентом). Химически индуцибельная группировка, обладающая окислительно-восстановительной активностью, соответствует фотоиндуцибельной группировке, обладающей окислительновосстановительной активностью, по составу и способу функционирования, но в отличие от способа, при котором функционирует фотоиндуцибельная группировка, обладающая окислительно-восстановительной активностью, фотоактивация предотвращается как внешнее условие для развития окислительно-восстановительной активности группировки, обладающей окислительно-восстановительной активностью. При наличии соответственно выбранных внешних условий, химически индуцибельная группировка, обладающая окислительновосстановительной активностью, проявляет свою окислительно-восстановительную активность, например, свое свойство отдавать электроны на подходящий окисляющий агент только после того, как электрон перенесется от восстанавливающего агента на определенный/неопределенный донор Б. Только в восстановленном состоянии Б^- электронный донор может переносить электрон на акцептор А, и окисляющий агент может принимать электроны только от этого восстановленного акцептора А^- группировки, обладающей окислительновосстановительной активностью, например, в присутствии окисляющего агента, который может окислять А^-, но не А (последовательный перенос заряда). В частности, вышеупомянутый окисляющий агент может быть также электродом, например, если на электроде устанавливается потенциал, при котором А^-, но не А, окисляется. Наоборот, при наличии других выбранных внешних условий химически индуцибельная группировка, обладающая окислительновосстановительной активностью, может проявлять свою окислительно-восстановительную активность, например, свое свойство принимать электроны от подходящего восстанавливающего агента, только после того, как электрон перенесется от электронного акцептора А на окисляющий агент. Только в окисленном состоянии А⁺ электронный акцептор может принимать электрон от донора Ό, и восстанавливающий агент может переносить электроны только на окисленный донор Ό⁺ группировки, обладающей окислительно-восстановительной активностью, например, в присутствии восстанавливающего агента, который может восстанавливать Ό⁺, но не Ό (последовательный перенос заряда). В частности, вышеупомянутый восстанавливающий агент может быть также электродом, например, если на электроде устанавливается потенциал, при котором Ό⁺, но не Ό, восстанавливается.

Кроме включения электронного донора(ов) и электронного акцептора(ов), или электронного донора(ов), электронного акцептора(ов) и макромолекулы (макромолекул), важными особенностями фотоиндуцибельной или химически индуцибельной группировки, обладающей окислительно-восстановительной активностью, являются: (ί) в формах, имеющих отношение к данному изобретению (электронный донор(ы) и электронный акцептор(ы) в их первоначальном состоянии или в окисленном или восстановленном состоянии), эта группировка является стабильной и не диссоциирует на составляющие ее компоненты, (и) группировка не включает нуклеиновую кислоту, (ίίί) состав группировки, включающий электронный донор(ы) и электронный акцептор(ы), или электронный донор(ы), электронный акцептор(ы) и макромолекулу(ы), может распознаваться специалистом в данной области независимо от связи между этими компонентами, так как, в принципе, электронный донор(ы) и акцептор(ы) могут встречаться также в виде отдельных молекул, и (ίν) электронный донор(ы) и электронный акцептор(ы) группировки, обладающей окислительновосстановительной активностью, при тех же или похожих внешних условиях для тех из их форм, которые имеют отношение к данному изобретению, как компоненты группировки, обладающей окислительно-восстановительной активностью, действуют также как электронный донор(ы) и электронный акцептор(ы) в виде отдельных молекул в растворе, то есть, даже в случае свободного растворенного электронного донора(ов) и электронного акцептора(ов), электрон может переноситься от растворенного электронного донора(ов) на растворенный электронный акцептор(ы) непосредственно или под влиянием определенных внешних условий, зависящих от условий, которые приводят к переносу электрона в пределах группировки, обладающей окислительно-восстановительной активностью. Как и в случае электронного донора(ов) и электронного акцептора(ов) фотоиндуцибельной группировки, обладающей окислительно-восстановительной активностью, таким внешним условием для свободного, растворенного электронного донора(ов) и электронного акцептора(ов) может быть поглощение света свободным, растворенным электронным донором (донорами) и электронным акцептором (акцепторами), при этом определенный/ неопределенный электронный донор Ό отдает электрон на определенный/неопределенный электронный акцептор А, и образуется структура с разделенными зарядами Ό⁺Α^-, по меньшей мере временно, включающая свободный, растворенный окисленный донор и свободный, растворенный восстановленный акцептор. Другим таким внешним условием может быть - как с электронным донором (донорами) и электронным акцептором (акцепторами) химически индуцибельной группировки, обладающей окислительно-восстановительной активностью, - перенос электрона на свободный, растворенный электронный донор восстанавливающим агентом или высвобождение электрона на окисляющий агент свободным, растворенным электронным акцептором.

Фотоиндуцибельной группировкой, обладающей окислительно-восстановительной активностью, может быть, например, любой фотоиндуцибельный белок/фермент, обладающий окислительно-восстановительной активностью, или любой фотоиндуцибельный, обладающий окислительно-восстановительной активностью, сшитый, по меньшей мере, бимолекулярный электронодонорный/электроноакцепторный комплекс. В выражении фотоиндуцибельный, обладающий окислительно-восстановительной активностью, сшитый, по меньшей мере, бимолекулярный электронодонорный/электроноакцепторный комплекс, термин по меньшей мере, бимолекулярный означает, что этот комплекс составлен, по меньшей мере, из одного электронного донора и, по меньшей мере, одного электронного акцептора, даже если этот донор и этот акцептор прямо (или опосредованно через спейсер) соединяются ковалентной связью. При облучении светом с определенной или любой данной длиной волны, определенный/ неопределенный электронный донор отдает электрон на один из электронных акцепторов, и образуется структура с разделенными зарядами Ό⁺Α^-, по меньшей мере временно, включающая окисленный донор и восстановленный акцептор. Этот процесс в пределах фотоиндуцибельной группировки, обладающей окислительновосстановительной активностью, обозначается как фотоиндуцированное разделение заряда. При наличии соответственно выбранных внешних условий, фотоиндуцибельная группировка, обладающая окислительно-восстановительной активностью, проявляет свою окислительновосстановительную активность, другими словами, свое свойство отдавать электроны на подходящий окисляющий агент, только в структуре с разделенными зарядами, так как восстанавли вающий агент переносит (или окисляющий агент принимает) электроны только на окисленный донор (или от восстановленного акцептора) фотоиндуцибельной группировки, обладающей окислительно-восстановительной активностью, например, в присутствии восстанавливающего агента, который может восстанавливать Ό⁺, но не Ό (или в присутствии окисляющего агента, который может окислять А^-, но не А). В частности, этот окисляющий или восстанавливающий агент может быть также электродом, при этом фотоиндуцибельная группировка, обладающая окислительно-восстановительной активностью, может отдавать электрон на электрод (или принимать электрон от него) только после фотоиндуцированного разделения заряда, например, если на электроде устанавливается потенциал, при котором А^-, но не А, окисляется (или Ό⁺, но не Ό, восстанавливается).

Химически индуцибельной группировкой, обладающей окислительно-восстановительной активностью, может быть, например, любой химически индуцибельный белок/фермент, обладающий окислительно-восстановительной активностью, или любой химически индуцибельный, обладающий окислительно-восстановительной активностью, сшитый, по меньшей мере, бимолекулярный электронодонорный/электроноакцепторный комплекс. В выражении химически индуцибельный, обладающий окислительно-восстановительной активностью, сшитый, по меньшей мере, бимолекулярный электронодонорный/электроноакцепторный комплекс, термин по меньшей мере, бимолекулярный означает, что этот комплекс составлен, по меньшей мере, из одного электронного донора и, по меньшей мере, одного электронного акцептора, даже если этот донор и этот акцептор прямо (или опосредованно через спейсер) соединяются ковалентной связью. При наличии соответственно выбранных внешних условий, химически индуцибельная группировка, обладающая окислительно-восстановительной активностью, проявляет свою окислительновосстановительную активность, другими словами, свое свойство отдавать электроны на подходящий окисляющий агент (или принимать электроны от подходящего восстанавливающего агента) при определенных внешних условиях, только после восстановления (или после окисления) внешним восстанавливающим агентом (или окисляющим агентом). Только после того, как электрон перенесется от восстанавливающего агента на определенный/неопределенный электронный донор Ό, восстановленный далее донор Ό^- может переносить электрон на акцептор А, и окисляющий агент может принимать электроны только от этого восстановленного акцептора А^- группировки, обладающей окислительно-восстановительной активностью. В частности, вышеупомянутым окисляющим агентом может быть также электрод, например, если на электроде устанавливается потенциал, при котором А^-, но не А, окисляется. Наоборот, при наличии других выбранных внешних условий, только после того, как электрон перенесется от акцептора А на внешний окисляющий агент, электронный акцептор химически индуцибельной группировки, обладающей окислительно-восстановительной активностью, в его уже окисленном состоянии А⁺, может принимать электрон от донора Ό, и восстанавливающий агент может переносить электроны только на окисленный донор Ό⁺ группировки, обладающей окислительно-восстановительной активностью. В частности, вышеупомянутый восстанавливающий агент может быть также электродом, например, если на электроде устанавливается потенциал, при котором Ό⁺, но не Ό, восстанавливается.

В контексте данного изобретения термин окисляющий агент относится к химическому соединению (химическому веществу), которое, принимая электроны от другого химического соединения (химического вещества, электронного донора, электронного акцептора), окисляет это другое химическое соединение (химическое вещество, электронный донор, электронный акцептор). Окисляющий агент ведет себя аналогично электронному акцептору, но используется в контексте данного изобретения для обозначения внешнего электронного акцептора, не принадлежащего непосредственно группировке, обладающей окислительно-восстановительной активностью. В этом контексте непосредственно не означает, что окисляющим агентом является либо свободное вещество, обладающее окислительно-восстановительной активностью, которое не связано, но находится в контакте с олигомером нуклеиновой кислоты, либо что окисляющий агент ковалентно присоединен к олигомеру нуклеиновой кислоты, но в сайте олигомера нуклеиновой кислоты, который располагается, по меньшей мере, на расстоянии двух ковалентно соединенных нуклеотидов или, по меньшей мере, двух ковалентно соединенных пиримидиновых или пуриновых оснований от сайта ковалентного присоединения группировки, обладающей окислительно-восстановительной активностью. В частности, электрод может представлять окисляющий агент.

В пределах контекста данного изобретения термин восстанавливающий агент относится к химическому соединению (химическому веществу), которое, отдавая электроны другому химическому соединению (химическому веществу, электронному донору, электронному акцептору), восстанавливает это другое химическое соединение (химическое вещество, электронный донор, электронный акцептор). Восстанавливающий агент ведет себя аналогично электронному донору, но используется в контексте данного изобретения для обозначения внешнего электронного донора, не принадлежащего непо средственно группировке, обладающей окислительно-восстановительной активностью. В этом контексте, непосредственно не означает, что восстанавливающим агентом является либо свободное вещество, обладающее окислительновосстановительной активностью, которое не связано, но находится в контакте с олигомером нуклеиновой кислоты, либо что восстанавливающий агент ковалентно присоединяется к олигомеру нуклеиновой кислоты, но в сайте олигомера нуклеиновой кислоты, который располагается, по меньшей мере, на расстоянии двух ковалентно соединенных нуклеотидов или, по меньшей мере, двух ковалентно соединенных пиримидиновых или пуриновых основаниий от сайта ковалентного присоединения группировки, обладающей окислительно-восстановительной активностью. В частности, электрод может представлять восстанавливающий агент.

В контексте данного изобретения термин свободное вещество, обладающее окислительно-восстановительной активностью относится к свободному окисляющему или восстанавливающему агенту, ковалентно не связанному, но находящемуся в контакте с группировкой, обладающей окислительно-восстановительной активностью, с олигомером нуклеиновой кислоты или с проводящей поверхностью, например, через раствор, добавленный к модифицированной проводящей поверхности, при этом свободное вещество, обладающее окислительновосстановительной активностью, может быть незаряженной молекулой, любой солью или белком или ферментом, обладающим окислительно-восстановительной активностью (оксидоредуктазой). Свободное вещество, обладающее окислительно-восстановительной активностью, характеризуется тем, что оно может снова восстанавливать окисленный донор (или снова окислять восстановленный акцептор) фотоиндуцибельной группировки, обладающей окислительно-восстановительной активностью, или тем, что свободное вещество, обладающее окислительно-восстановительной активностью, может восстанавливать донор (или окислять акцептор) химически индуцибельной группировки, обладающей окислительно-восстановительной активностью. Кроме того, свободное вещество, обладающее окислительно-восстановительной активностью, характеризуется тем, что оно способно окисляться или восстанавливаться при потенциале φ, где φ удовлетворяет условию 2,0 ν>φ>-2,0 V. В данной работе потенциал относится к свободной молекуле, обладающей окислительно-восстановительной активностью, находящейся в соответствующем растворителе, и измеряется против стандартного водородного электрода. В контексте данного изобретения, этот потенциал предпочтительно находится в пределах 1,7 ν>φ>-1,7 V, причем особенно предпочтительно в пределах 1,4ν>φ>-1,2 V и наиболее предпочтительно в пределах 0,9 ν>φ> -0,7 V, в которых вещества из прилагаемых примеров, обладающие окислительно-восстановительной активностью, окисляются (или восстанавливаются).

Модифицированный олигомер нуклеиновой кислоты прямо или опосредованно (через спейсер) связывается с проводящей поверхностью. Термин проводящая поверхность означает любую электропроводящую поверхность любой толщины, особенно металлические поверхности; поверхности, включающие металлические сплавы; или легированные или нелегированные полупроводниковые поверхности, при этом все полупроводники могут использоваться в виде чистых веществ или в виде смесей. В контексте данного изобретения, проводящая поверхность может быть представлена сама по себе или приложена к любой подложке типа стекла. В контексте данного изобретения термин электрод используется в качестве альтернативы проводящей поверхности.

Термин модифицированная проводящая поверхность означает проводящую поверхность, которая модифицируется присоединением олигомера нуклеиновой кислоты, модифицированного группировкой, обладающей окислительно-восстановительной активностью.

В соответствии с дополнительным аспектом данное изобретение направлено на способ, который позволяет осуществлять электрохимическое определение молекулярных структур, в частности, электрохимическое определение фрагментов ДНК/РНК/ПНК в растворе зонда посредством последовательность-специфической гибридизации олигомера нуклеиновой кислоты. Определение событий гибридизации через электрические сигналы является простым и экономным способом и, в случае использования прибора для секвенирования, работающего от аккумуляторной батареи, позволяет применять его прямо на месте.

Данное изобретение, кроме того, представляет фотонаправляемый способ считывания для определения молекулярных структур, между прочим, для определения гибридизационных событий на олигомерном чипе, например, через электрические сигналы. Предполагают, что в соответствии с данным изобретением, фотонаправляемый (на олигомерный чип) способ считывания является способом, в котором определение молекулярных структур ограничивается специфическим тест-сайтом или группой тестсайтов в пределах целой системы (целого олигомерного чипа) при действии света с определенной или любой данной длиной волны, пространственно сфокусированного (ограниченного) на этом тест-сайте (группе) для того, чтобы индуцировать окислительно-восстановительную активность фотоиндуцибельной группировки, обладающей окислительно-восстановительной активностью.

Связывание группировки, обладающей окислительно -восстановительной активностью, с олигомером нуклеиновой кислоты

Предпосылкой способа в соответствии с данным изобретением является связывание фотоиндуцибельной группировки, обладающей окислительно-восстановительной активностью, или химически индуцибельной группировки, обладающей окислительно-восстановительной активностью, с олигомером нуклеиновой кислоты.

Представлены некоторые примеры фотоиндуцибельной группировки, обладающей окислительно-восстановительной активностью:

(ί) Фотосинтетический бактериальный реакционный центр (РЦ), как например, РЦ Р1юбоЬас!ег 5рНасго1бс8, имеющий схематичную структуру 1; РЦ другой фотосинтетической бактерии, а именно реакционный центр Яйоборзеиботопаз утб18 или Р1юбоЬас1ег сарзиШиз; или реакционный центр фотосинтезирующих растений, такой как фотосистема 1 или фотосистема 2, в качестве примера фотоиндуцибельного белка/фермента, обладающего окислительновосстановительной активностью.

(ίί) Циклофаны, или соединенные мостиком порфирин-хиноновые системы, имеющие основную структуру 2, в качестве примера фотоиндуцибельного, обладающего окислительновосстановительной активностью, сшитого, по меньшей мере, бимолекулярного злектронодонорного/электроноакцепторного комплекса. Два соединенных спейсером ковалентных звена (-спейсер-- в структуре 2) между электронным акцептором (1,4-бензохинон в структуре 2) и электронным донором (металлопорфирин в структуре 2) могут быть присоединены к любому сайту на электронном доноре и/или электронном акцепторе. Кроме электронных акцепторов, представленных в структуре 2, могут использоваться также флавины, имеющие общую формулу 1, никотинамиды, имеющие общую формулу 2 или другие хиноны, например хиноны, имеющие основные формулы 3-8, или органические или неорганические электронные акцепторы и, кроме того, помимо (металло)порфиринов, имеющих общую формулу 9, другие электронные доноры, такие как (металло)хлорофиллы, имеющие общую формулу 10, или (металло)бактериохлорофиллы, имеющие общую формулу 11, или другие органические или неорганические электронные доноры. Кроме этого, в качестве фотоиндуцибельных, обладающих окислительно-восстановительной активностью, сшитых, по меньшей мере, бимолекулярных электронодонорных/электроноакцепторных комплексов могут использоваться простые, ковалентно соединенные (через спейсер-) электронодонорные/электроноакцепторные комплексы, такие как ковалентные соединения вещества, соответствующего формуле 9, и одного из веществ, соответствующего одной из формул 3-8, ковалентные соединения вещества, соответствующего формуле 10, и одного из веществ, соответствующего одной из формул 18, или ковалентные соединения вещества, соответствующего формуле 11, и одного из веществ, соответствующего одной из формул 1-8.

(ш) Фотоиндуцибельные, обладающие окислительно-восстановительной активностью, сшитые, по меньшей мере, бимолекулярные электронодонорные/электроноакцепторные комплексы, в которых (один из) электронный донор(ов) и/или (один из) электронный акцептор(ов) представляет собой комплекс для переноса заряда или комплекс для перехода металла. Примерами комплексов для перехода металла являются [Кц(бипи)₂(пи)(им)]²⁺, любые другие комплексы [Яи(11)(Ы)(Ь2)(Ь3)(Ь4)(Ь5) (Ьб)], комплексы Сг(111), Ее(П), 08(11) или Со(11), где бипи обозначает биспиридиловый лиганд, пи - пиридиловый лиганд, им имидазольный лиганд и Ь1-Ь3 - любой лиганд, а также больше или меньше чем б лигандов могут координировать переход металла.

Примерами химически индуцибельной группировки, обладающей окислительновосстановительной активностью, являются комплекс цитохром-Ьс или комплекс цитохром-с₂ фотосинтезирующих бактерий (комплекс, включающий белковый матрикс и четыре встроенных железо-порфириновых кофактора в качестве электронных доноров и/или электронных акцепторов), так же как примерами химически индуцибельного белка/фермента, обладающего окислительно-восстановительной активностью, или как перечислено в пунктах (и) и (ш), соответственно составленные циклофаны или аналогичные соединения, как примеры химически индуцибельного, обладающего окислительно-восстановительной активностью, сшитого, по меньшей мере, бимолекулярного электронодонорного/электроноакцепторного комплекса.

Структура 1.

Реакционный центр, состоящий из кофакторов Р (первичный донор, димер бактериохлорофилла), В_А и В_в (мономеры бактериохлорофилла), Н_А и Н_в (бактериофеофитины), 0_А и 0_в (убихинон-50), и белковых субъединиц Ь, М и Н (не показаны), которые окружают кофакторы.

Структура 2.

Циклофан; М=например, 2Н, Мд, Ζη, Си, N1, Рб, Со, Сб, Мп, Ее, 8п, Ρΐ и т.д.; Я₁-Я₈ или спейсеры, независимо друг от друга, представляют собой любые алкильные, алкенильные, алкинильные, гетероалкильные, гетероалкенильные или гетероалкинильные заместители.

Формула 11

М=2Н, Мд, Ζη, Си, N1, Рб, Со, Сб, Мп, Ее, 8п, Ρΐ и т.д.; К1-К12, независимо друг от друга, представляют собой Н или любые алкильные, алкенильные, алкинильные, гетероалкильные, гетероалкенильные или гетероалкинильные заместители.

Кроме того, в соответствии с данным изобретением, характерной особенностью группировки, обладающей окислительно-восстановительной активностью, является то, что вышеупомянутая группировка отдает электроны на окисляющий агент, который также ковалентно присоединен к олигомеру нуклеиновой кислоты, или принимает электроны от другого восстанавливающего агента, который также ковалентно присоединен к олигомеру нуклеиновой кислоты, причем этот окисляющий или восстанавливающий агент может быть, в частности, электропроводящей поверхностью (электродом), и группировка, обладающая окислительно-восстановительной активностью, способна электроокисляться/электровосстанавливаться путем приложения внешнего напряжения к этому электроду в электрохимически доступном для него интервале потенциалов.

В соответствии с данным изобретением характерной особенностью вещества, обладающего окислительно-восстановительной активноЯ₁-Я₈ независимо друг от друга представляют собой Н или любые алкильные, алкенильные, алкинильные, гетероалкильные, гетероалкенильные или гетероалкинильные заместители.

стью, является то, что оно может снова восстанавливать фотоиндуцибельную группировку, обладающую окислительно-восстановительной активностью (или может снова окислять ее), после того, как последняя отдаст электрон другому окисляющему агенту, который отличается от вещества, обладающего окислительновосстановительной активностью, и ковалентно присоединяется к олигонуклеотиду (или после того, как последняя примет электрон от другого восстанавливающего агента, который отличается от вещества, обладающего окислительновосстановительной активностью, и ковалентно присоединяется к олигонуклеотиду), или то, что свободное вещество, обладающее окислительно-восстановительной активностью, может восстанавливать (или окислять) донор (или акцептор) химически индуцибельной группировки, обладающей окислительно-восстановительной активностью. В соответствии с данным изобретением, для этого может использоваться любое вещество, обладающее окислительновосстановительной активностью, поскольку оно способно окисляться или восстанавливаться при потенциале φ, где φ удовлетворяет условию 2,0 ν>φ>-2,0 V, и поскольку этот потенциал подходит для обратного восстановления (или обратного окисления) вышеупомянутой группировки, обладающей окислительно-восстановительной активностью, после того как последняя отдаст электрон на другой окисляющий агент, который также ковалентно присоединен к олигомеру нуклеиновой кислоты (или примет электрон от другого восстанавливающего агента, который также ковалентно присоединен к олигомеру нуклеиновой кислоты), или для восстановления или окисления вышеупомянутой химически индуцибельной группировки, обладающей окислительно-восстановительной активностью. В данной работе потенциал относится к свободному, немодифицированному веществу, обладающему окислительновосстановительной активностью, находящемуся в соответствующем растворителе, и измеряется против стандартного водородного электрода. В контексте данного изобретения, этот потенциал предпочтительно находится в пределах 1,7 ν>φ>-1,7 V, причем особенно предпочтительно в пределах 1,4 ν>φ>-1,2 V, и наиболее предпочтительно в пределах 0,9 V > φ > -0,7 V, в которых вещества из прилагаемых примеров, обладающие окислительно-восстановительной активностью, окисляются (или снова восстанавливаются). Кроме обычных органических и неорганических молекул, обладающих окислительно-восстанови-тельной активностью, как например, гексацианоферраты, ферроцены, кобальтоцены и хиноны, соответствующими возможностями обладают наиболее важные аскорбиновая кислота (или ее Να'-соль). |Κλ.ι(ΝΗ₃)₆|²¹ или цитохром с2 (цит с2)²⁺, свободно перемещающийся железосодержащий белок, который восстанавливает окисленный первичный донор Р⁺ в РЦ К1юбоЬас1ег врйаегойек до Р и при этом сам окисляется до (цит с2)³⁺.

В предпочтительной реализации данного изобретения фотоиндуцибельный или химически индуцибельный, обладающий окислительно-восстановительной активностью, сшитый, по меньшей мере, бимолекулярный электронодонорный/электроноакцепторный комплекс встраивается в одну или несколько макромолекул таким образом, что эта макромолекула ведет себя как электрически изолирующая, обертывающая часть для обладающего окислительновосстановительной активностью, сшитого, по меньшей мере, бимолекулярного электронодонорного/электроноакцепторного комплекса путем предотвращения прямого электроокисления/электровосстановления обладающего окислительно-восстановительной активностью, сшитого, по меньшей мере, бимолекулярного электронодонорного/электроноакцепторного комплекса на электроде, например, в случае прямого контакта между электродом и обладающим окислительно-восстановительной активностью, сшитым, по меньшей мере, бимолекулярным электронодонорным/электроноакцепторным комплексом, но разрешая непрямое электроокисление/электровосстановление электронодонорного/электроноакцепторного комплекса, опосредованное двухцепочечным олигомером нуклеиновой кислоты. Такой молекулой может быть, например, сшитый циклодекстрин, который благодаря своей форме в виде срезанного конуса, полого внутри, покрывает циклофан или похожий электронодонорный/электроноакцепторный комплекс.

В соответствии с данным изобретением, группировка, обладающая окислительно-восстановительной активностью, ковалентно связывается с олигомером нуклеиновой кислоты посредством реакции этого олигомера нуклеиновой кислоты с группировкой, обладающей окислительно-восстановительной активностью, или ее частями (см. также раздел Способ выполнения изобретения). Эта связь может быть достигнута четырьмя различными путями:

а) Свободная фосфорнокислая, С-3-гидроксигруппа сахара, карбоксильная или аминогруппа олигонуклеотидного скелета, особенно группа на одном из двух концов олигонуклеотидного скелета, используется в качестве реакционноспособной группы для образования связи на олигомере нуклеиновой кислоты. Свободные, концевые фосфорнокислые, С-3-гидроксигруппы сахаров, карбоксильные или аминогруппы проявляют повышенную химическую активность и, следовательно, легко вступают в обычные реакции, такие как аминирование (первичной или вторичной) аминогруппами или кислотными группами; этерификация (первичной, вторичной или третичной) спиртовыми или кислотными группами; образование тиоэфира (первичной, вторичной или третичной) тиоспиртовыми или кислотными группами, или конденсация амина и альдегида с последующим восстановлением образующейся в результате СН=№связи до СН₂-ЯН-связи. Сопряженная группа (кислотная, амино-, спиртовая, тиоспиртовая или альдегидная функциональная группа), необходимая для ковалентного присоединения группировки, обладающей окислительновосстановительной активностью, или естественным образом присутствует на группировке, обладающей окислительно-восстановительной активностью, или получается посредством хи мической модификации группировки, обладающей окислительно-восстановительной активностью. Присоединение группировки, обладающей окислительно-восстановительной активностью, происходит целиком или в участках группировки с последующим завершением группировки, обладающей окислительно-восстановительной активностью.

б) Олигомер нуклеиновой кислоты модифицируется реакционноспособной группой по олигонуклеотидному скелету или по основанию через ковалентно присоединенную молекулярную группировку (спейсер) любого состава и длины цепи (наиболее длинная непрерывная цепь атомов, связанных друг с другом), особенно с длиной цепи от 1 до 14. Модификация предпочтительно происходит на одном из концов олигонуклеотидного скелета или на концевом основании. В качестве спейсера может использоваться, например, алкильный, алкенильный, алкинильный, гетероалкильный, гетероалкенильный или гетероалкинильный заместитель. Возможные простые реакции для образования ковалентной связи между группировкой, обладающей окислительно-восстановительной активностью, и олигомером нуклеиновой кислоты, модифицируемым таким образом, представляют собой, как описано в пункте а), аминирование из кислоты и аминогруппы, этерификацию из кислоты и спиртовой группы, образование тиоэфира из кислоты и тиоспиртовой группы или конденсацию альдегида и амина с последующим восстановлением образующейся в результате СН=Ы-связи до СН₂-НН-связи. Присоединение группировки, обладающей окислительно-восстановительной активностью, может происходить целиком или в участках группировки с последующим завершением группировки (см. ниже).

в) Если олигомер нуклеиновой кислоты синтезируется, то концевое основание может заменяться группировкой, обладающей окислительно-восстановительной активностью. Это присоединение группировки, обладающей окислительно-восстановительной активностью, может происходить целиком или в участках группировки с последующим завершением группировки, обладающей окислительно-восстановительной активностью (см. ниже).

г) Если в качестве группировки, обладающей окислительно-восстановительной активностью, используется сшитый (по меньшей мере, бимолекулярный) электронодонорный/электроноакцепторный комплекс, то электронный акцептор (или донор) в первой ковалентной модификации, как описано в пунктах б) или в) этого раздела, будет связываться с концевым основанием, или вместо концевого основания, с олигомером нуклеиновой кислоты, и после этого, во второй ковалентной модификации электронного донора (или акцептора), как описано в пункте а) этого раздела, будет связываться на том же конце олигомерного скелета нуклеиновой кислоты с реакционноспособной группой скелета или с реакционноспособной группой акцептора (или донора). Если используется ковалентно сшитый, тримолекулярный или больший электронодонорный/электроноакцепторный комплекс, то вместо электронного акцептора (или донора), в первой ковалентной модификации может использоваться также любая часть электронодонорного/электроноакцепторного комплекса и завершаться во второй или дополнительной ковалентной модификации (модификациях).

В соответствии с данным изобретением связывание группировки, обладающей окислительно-восстановительной активностью, с олигомером нуклеиновой кислоты может происходить целиком или в участках до или после того, как олигомер нуклеиновой кислоты свяжется с проводящей поверхностью. Таким образом, в случае белка/фермента, обладающего окислительно-восстановительной активностью, включающего апопротеин и кофактор(ы), вместо целой группировки, обладающей окислительновосстановительной активностью, могут присоединяться также только апопротеин, апопротеин и часть кофакторов, или один или несколько кофакторов, и группировка, обладающая окислительно-восстановительной активностью, будет завершаться (укомплектовываться) последующей реконструкцией оставшимися недостающими частями. Если в качестве группировки, обладающей окислительно-восстановительной активностью, используется сшитый (по меньшей мере, бимолекулярный) электронодонорный/электроноакцепторный комплекс, то электронный акцептор (или донор) в первой ковалентной модификации, как описано в пунктах Ь) или с) этого раздела, будет связываться с концевым основанием, или вместо концевого основания, с олигомером нуклеиновой кислоты, и после этого, во второй ковалентной модификации электронного донора (или акцептора), как описано в пункте а) этого раздела, связываться на том же конце олигомерного скелета нуклеиновой кислоты с реакционноспособной группой этого скелета. Если используется ковалентно сшитый, тримолекулярный или больший электронодонорный/электроноакцепторный комплекс, то вместо электронного акцептора (или донора), в первой ковалентной модификации может использоваться также любая часть электронодонорного/электроноакцепторного комплекса и завершаться во второй или дополнительной ковалентной модификации. Эти модификации могут происходить до или после того, как олигомер нуклеиновой кислоты свяжется с проводящей поверхностью.

Если имеются несколько различных комбинаций олигомера нуклеиновой кислоты (тестсайтов) на разделенной поверхности, и группировка, обладающая окислительно-восстанови тельной активностью, присоединяется к поверхности после иммобилизации олигомера нуклеиновой кислоты, то полезно стандартизировать (ковалентное) присоединение группировки, обладающей окислительно-восстановительной активностью, к олигомерам нуклеиновой кислоты для целой поверхности путем выбора соответствующей реакционноспособной группы на свободных концах олигомеров нуклеиновой кислоты различных тест-сайтов.

Если в качестве группировки, обладающей окислительно-восстановительной активностью, используются белки/ферменты, обладающие окислительно-восстановительной активностью, то ковалентное присоединение олигомера нуклеиновой кислоты может происходить к любой реакционноспособной группе, которая естественно присутствует на белке или присоединяется к белку благодаря модификации, или - в случае, когда белок/фермент, обладающий окислительно-восстановительной активностью, состоит из апопротеина и кофактора(ов) - к любой реакционноспособной группе, которая естественно присутствует на кофакторе или присоединяется к (любому) кофактору благодаря модификации. В контексте данного изобретения, предпочтительно ковалентное присоединение к любой реакционноспособной группе, которая естественно присутствует на кофакторе или присоединяется к (любому) кофактору белка. Не вдаваясь в механистические подробности, если имеются несколько кофакторов, то особое предпочтение отдается тому кофактору, который может отдавать электроны на внешний окисляющий агент, который также ковалентно присоединяется к олигомеру нуклеиновой кислоты, или который может принимать электроны от внешнего восстанавливающего агента, который также ковалентно присоединяется к олигомеру нуклеиновой кислоты (см. также раздел Способ амперометрического определения гибридов олигомеров нуклеиновой кислоты).

Проводящая поверхность

В соответствии с данным изобретением, термин проводящая поверхность подразумевает любую подложку, имеющую электропроводящую поверхность любой толщины, особенно поверхности, содержащие платину, палладий, золото, кадмий, ртуть, никель, цинк, углерод, серебро, медь, железо, свинец, алюминий и марганец.

Кроме того, также могут использоваться любые легированные или нелегированные полупроводниковые поверхности любой толщины. Все полупроводники могут использоваться в виде чистых веществ или в виде смесей. Примеры включают, но не ограничиваются, углерод, кремний, германий, α-олово и галогениды Си(1) и Ад(1) любой кристаллической структуры. Подходящими являются также все двойные соединения любого состава и любой структуры, включающие элементы групп 14 и 16, элементы групп 13 и 15 и элементы групп 15 и 16. Кроме того, могут использоваться тройные соединения любого состава и любой структуры, включающие элементы групп 11, 13 и 16 или элементы групп 12, 13 и 16. Обозначения этих групп периодической системы даются со ссылкой на рекомендации ГОРАС 1985 года.

Связывание олигомера нуклеиновой кислоты с проводящей поверхностью

В соответствии с данным изобретением олигомер нуклеиновой кислоты связывается прямо или через линкер/спейсер с поверхностными атомами или молекулами проводящей поверхности описанного выше типа. Это связывание может быть осуществлено тремя различными способами:

а) Поверхность модифицируется таким образом, что реакционноспособная молекулярная группа становится доступной. Это может осуществляться посредством прямой модификации (образования производных) поверхностных молекул, например, посредством химического или электрохимического окисления/восстановления в жидкой среде. Так, например, поверхность графитовых электродов может быть снабжена альдегидными или карбоксильными группами посредством химического окисления в жидкой среде. Можно электрохимически, например, посредством восстановления в присутствии солей арилдиазония, связать соответствующий (функционализированный, то есть снабженный реакционноспособной группой) арильный радикал, или посредством окисления в присутствии И'СО₂Н, связать (функционализированный) И'радикал с поверхностью графитового электрода. Примером прямой модификации полупроводниковых поверхностей является модификация кремниевых поверхностей с образованием химически активных силанолов, то есть кремниевых подложек, имеющих на своей поверхности 81-ОВ-группы, где оба радикала И' и И представляют собой любой снабженный функциональными группами органический остаток (например, алкильный, алкенильный, алкинильный, гетероалкильный, гетероалкенильный или гетероалкинильный заместитель). С другой стороны, целая поверхность может быть модифицирована путем ковалентного присоединения реакционноспособной группы бифункционального линкера таким образом, чтобы мономолекулярный слой, состоящий из любых молекул и включающий реакционноспособную группу, предпочтительно терминально, наносился на поверхность. Термин бифункциональный линкер подразумевает любую молекулу с любой длиной цепи, особенно с длиной цепи 2-14, имеющую две идентичные (гомобифункциональный) или две различные (гетеробифункциональный) реакционноспособные молекулярные группы.

Если на поверхности должно сформироваться несколько различных тест-сайтов путем использования методологии фотолитографии, то, по меньшей мере, одна из реакционноспособных групп гомо- или гетеробифункциональных линкеров является фотоиндуцибельной реакционноспособной группой, то есть группой, которая становится химически активной только при облучении светом с определенной или любой данной длиной волны. Этот линкер применяется таким образом, что определенная/неопределенная фотоактивируемая реакционноспособная группа становится доступной после того, как линкер ковалентно присоединяется к поверхности. Олигомеры нуклеиновой кислоты ковалентно присоединяются к модифицированной таким образом поверхности, и сами модифицируются реакционноспособной группой через спейсер любого состава и длины цепи, особенно с длиной цепи 1-14, предпочтительно около конца олигомера нуклеиновой кислоты. Реакционноспособной группой олигонуклеотида является любая из групп, которая прямо (или опосредованно) реагирует с модифицированной поверхностью для образования ковалентной связи. Кроме того, с олнгомерами нуклеиновой кислоты около их второго конца может связываться дополнительная реакционноспособная группа, причем эта реакционноспособная группа, в свою очередь, присоединяется, как описано выше, прямо или через спейсер любого состава и длины цепи, особенно с длиной цепи 114. Более того, в качестве альтернативы этой дополнительной реакционноспособной группы выступает группировка, обладающая окислительно-восстановительной активностью (целиком или ее части), которая может присоединяться к этому второму концу олигомера нуклеиновой кислоты.

б) Олигомер нуклеиновой кислоты, приложенный к проводящей поверхности, модифицируется одной или несколькими реакционноспособными группами через ковалентно присоединенный спейсер любого состава и длины цепи, особенно с длиной цепи 1-14, причем эти реакционноспособные группы располагаются предпочтительно около конца олигомера нуклеиновой кислоты. Эти реакционноспособные группы являтся группами, которые могут непосредственно реагировать с немодифицированной поверхностью. Некоторые примеры представляют собой (ί) тиоловые (Н8-) или дисульфидные (-8-8-) производные олигомеров нуклеиновой кислоты, имеющие общую формулу (η х Н8-спейсер)-олиго, (п х К-8-8-спейсер)-олиго или олиго-спейсер-8-8-спейсер-олиго, которые реагируют с золотой поверхностью, образуя связи золото-сера, или (ίί) амины, которые присоединяются к платиновой или кремниевой поверхностям посредством химической или физической сорбции. Кроме того, с олигомерами нуклеиновой кислоты около их второго конца может связываться дополнительная реакционноспособная группа, причем эта реакционно способная группа, в свою очередь, присоединяется, как описано выше, прямо или через спейсер любого состава и длины цепи, особенно с длиной цепи 1-14. Более того, в качестве альтернативы этой дополнительной реакционноспособной группы, к этому второму концу олигонуклеотида может присоединяться фотоиндуцибельная группировка, обладающая окислительно-восстановительной активностью (целиком или ее части). Особое преимущество имеют олигомеры нуклеиновой кислоты, которые модифицируются несколькими соединенными со спейсером тиольными или дисульфидными мостиками ((п х Н8-спейсер)-олиго или (п х Я-8-8спейсер)-олиго), поскольку такие олигомеры нуклеиновой кислоты могут присоединяться к проводящей поверхности под определенным углом (угол между перпендикуляром к поверхности и осью спирали двухцепочечного спирального олигомера нуклеиновой кислоты или между перпендикуляром к поверхности и осью, перпендикулярной парам оснований двухцепочечного неспирального олигомера нуклеиновой кислоты), если эти спейсеры, присоединяющие тиольные или дисульфидные функциональные группы к олигомеру нуклеиновой кислоты, обладают увеличивающейся или уменьшающейся длиной цепи, если смотреть от конца нуклеиновой кислоты.

в) Фосфорнокислые, С-3-гидроксигруппы сахара, карбоксильные или аминогруппы олигонуклеотидного скелета, особенно концевые группы, используются в качестве реакционноспособных групп на олигомерном зонде нуклеиновой кислоты. Фосфорнокислые, С-3гндроксигруппы сахара, карбоксильные или аминогруппы проявляют повышенную химическую активность и, следовательно, легко вступают в обычные реакции, такие как аминирование (первичной или вторичной) амино- или кислотными группами, этерификация (первичной, вторичной или третичной) спиртовыми или кислотными группами, образование тиоэфиров (первичной, вторичной или третичной) тиоспиртовыми или кислотными группами, или конденсация амина и альдегида с последующим восстановлением образующейся в результате СН=№связи до С’Н₂АН-связи. В этом случае, сопряженная группа, необходимая для ковалентного присоединения к фосфорнокислой, С3-гидроксигруппе сахара, карбоксильной или аминогруппе, является частью процесса поверхностной модификации с помощью (мономолекулярного) слоя, имеющего любую длину молекулы, как описано в пункте а) этого раздела, или фосфорнокислая, С-3-гидроксигруппа сахара, карбоксильная или аминогруппа могут реагировать непосредственно с немодифицированной поверхностью, как описано в пункте б) этого раздела. Кроме того, дополнительная реакционноспособная группа может связываться с олигонуклеотидами около их второго конца, причем эта реакционноспособная группа, в свою очередь, присоединяется, как описано выше, прямо или через спейсер любого состава и длины цепи, особенно с длиной цепи 1-14. Более того, в качестве альтернативы этой дополнительной реакционноспособной группы выступает группировка, обладающая окислительно-восстановительной активностью (целиком или ее части), которая может присоединяться к этому второму концу олигомера нуклеиновой кислоты.

Связывание олигомера нуклеиновой кислоты с проводящей поверхностью может происходить до или после присоединения к олигомеру нуклеиновой кислоты группировки, обладающей окислительно-восстановительной активностью. В случае белка/фермента, обладающего окислительно-восстановительной активностью, включающего апопротеин и кофактор(ы), вместо полной группировки, обладающей окислительно-восстановительной активностью, могут также присоединяться только апопротеин, апопротеин и часть кофакторов, или один или несколько кофакторов, и группировка, обладающая окислительно-восстановительной активностью, будет завершаться последующей реконструкцией оставшимися недостающими частями. Если в качестве группировки, обладающей окислительно-восстановительной активностью, используется сшитый (по меньшей мере, бимолекулярный) электронодонорный/электроноакцепторный комплекс, то электронный акцептор (или донор), как описано в пунктах б) или в) раздела Связывание группировки, обладающей окислительно-восстановительной активностью, с олигомером нуклеиновой кислоты, может присоединяться к концевому основанию, или вместо концевого основания, к олигомеру нуклеиновой кислоты, и электронный донор (или акцептор) может присоединяться путем последующего ковалентного присоединения к реакционноспособной группе электронного акцептора (или донора) или, как описано в пункте а) раздела ''Связывание группировки, обладающей окислительно-восстановительной активностью, с олигомером нуклеиновой кислоты, путем последующего присоединения к концевой реакционноспособной группе олигомерного скелета нуклеиновой кислоты на том же конце (см. также раздел Способ выполнения изобретения). С другой стороны, связывание олигомера нуклеиновой кислоты с проводящей поверхностью может происходить до или после присоединения спейсера, имеющего реакционноспособную группу для связывания группировки, обладающей окислительно-восстановительной активностью. Связывание уже модифицированного олигомера нуклеиновой кислоты с проводящей поверхностью, то есть связывание с поверхностью после присоединения к олигомеру нуклеиновой кислоты группировки, обладающей окислительновосстановительной активностью, или после присоединения частей группировки, обладающей окислительно-восстановительной активностью, или после присоединения спейсера, имеющего реакционноспособную группу для связывания группировки, обладающей окислительно-восстановительной активностью, происходит так же, как описано в пунктах от а) до в) этого раздела.

В создании тест-сайтов, при присоединении одноцепочечных олигомеров нуклеиновой кислоты к поверхности, нужно обратить внимание на то, чтобы оставалось достаточное расстояние между отдельными олигомерами нуклеиновой кислоты для того, чтобы обеспечить, во-первых, пространство, необходимое для гибридизации с олигомером-мишенью, а вовторых, пространство, необходимое для присоединения группировки, обладающей окислительно-восстановительной активностью. Для этой цели предлагаются три различных способа получения (или их комбинации).

1) . Получение модифицированной поверхности путем присоединения гибридизованного олигомера нуклеиновой кислоты, другими словами, модификация поверхности с помощью гибридизованного олигонуклеотидного зонда вместо одноцепочечного олигонуклеотидного зонда. Олигонуклеотидная цепь, используемая для гибридизации, не модифицируется (присоединение к поверхности осуществляется, как описано в пунктах а) - в) этого раздела). После этого гибридизованная двойная олигонуклеотидная цепь дегибридизуется температурой, таким образом образуя модифицированную с помощью одноцепочечных олигонуклеотидов поверхность носителя, имеющую большее расстояние между олигонуклеотидными зондами.

2) . Получение модифицированной поверхности путем присоединения одноцепочечного или двухцепочечного олигомера нуклеиновой кислоты и добавление в процессе модификации поверхности подходящего монофункционального линкера, который, вдобавок к одноцепочечному или двухцепочечному олигомеру нуклеиновой кислоты, также связывается с поверхностью (присоединение к поверхности осуществляется, как описано в пунктах а)-в) этого раздела). В соответствии с данным изобретением этот монофункциональный линкер имеет длину цепи, которая идентична длине цепи спейсера между поверхностью и олигомером нуклеиновой кислоты, или которая отличается максимально на четыре атома цепи. Если для модификации поверхности используется двухцепочечный олигомер нуклеиновой кислоты, то двухцепочечный олигомер нуклеиновой кислоты дегибридизуется температурой после совместного присоединения двухцепочечного олигомера нуклеиновой кислоты и линкера к поверхности. При одновременном присоединении линкера к поверхности расстояние между одноцепочечными или двухцепочечными олигомерами нук леиновой кислоты, которые также связываются с поверхностью, увеличивается. Если используется двухцепочечный олигомер нуклеиновой кислоты, то этот эффект усиливается в дальнейшем путем последующей температурной дегибридизации.

3). Получение модифицированной поверхности путем присоединения одноцепочечного или двухцепочечного олигонуклеотида, к которому уже присоединена группировка, обладающая окислительно-восстановительной активностью, причем эта группировка, обладающая окислительно-восстановительной активностью, имеет диаметр больше 30 А. Если используется двухцепочечный олигонуклеотид, то двойная цепь олигонуклеотида дегибридизуется температурой после того, как двухцепочечный олигонуклеотид присоединится к поверхности.

Что касается отдельных этапов в Связывании группировки, обладающей окислительновосстановительной активностью, с олигомером нуклеиновой кислоты, следует отметить, что в разделе Способ выполнения изобретения, в примере (фиг. 2), показаны различные комбинационные возможности отдельных этапов, которые приводят к тому же конечному результату.

Способ электрохимического определения гибридов олигомеров нуклеиновой кислоты

В соответствии с данным способом электрохимического определения гибридов олигомеров нуклеиновой кислоты, выгодно несколько олигонуклеотидных зондов, различающихся по последовательности, в идеале все необходимые комбинации олигомера нуклеиновой кислоты, прикладывать к олигомерному (ДНК) чипу для определения последовательности любого олигомера-мишени или (фрагментированной) ДНКмишени, или для поиска и последовательностьспецифического определения мутаций в этой мишени. С этой целью, поверхностные атомы или молекулы из определенного района (тестсайта) на проводящей поверхности связывают с ДНК/РНК/ПНК-олигонуклеотидами с известной, но случайной последовательностью, как описано выше. Однако, в наиболее общей реализации, ДНК-чип также может быть модифицирован с помощью одного олигонуклеотидного зонда. Предпочтительные олигонуклеотидные зонды представляют собой олигомеры нуклеиновой кислоты (например, фрагменты ДНК, РНК или ПНК) с длиной от 3 до 50 оснований, предпочтительно, с длиной от 5 до 30 оснований, особенно предпочтительно, с длиной от 8 до 25 оснований. В соответствии с данным изобретением, группировка, обладающая окислительно-восстановительной активностью, связана или становится связанной с олигонуклеотидными зондами, как описано ниже.

Модификация олигонуклеотидных зондов группировкой, обладающей окислительновосстановительной активностью, может происходить полностью или в компонентах группи ровки, обладающей окислительно-восстановительной активностью, или до, или после связывания олигонуклеотидного зонда с проводящей поверхностью. Различные комбинационные возможности отдельных этапов (последовательности реакций) продемонстрированы в разделе Способ выполнения изобретения с помощью фиг. 2, использующей пример группировки, обладающей окислительно-восстановительной активностью, связанной с электродом через олигонуклеотидный зонд.

Несмотря на соответствующую последовательность реакций, конструируется поверхностный гибрид, имеющий основную структуру электрод-спейсер-88-олиго-спейсер-группировка, где группировка представлена фотоиндуцибельной или химически индуцибельной группировкой, обладающей окислительно-восстановительной активностью. Конечно, мостики могут быть также получены без спейсеров или с помощью только одного спейсера (электрод-88-олигоспейсер-группировка или электрод-спейсер-88олиго-группировка). В примере на фиг. 2 группировка представлена фотоиндуцибельной группировкой, обладающей окислительновосстановительной активностью, а именно, рекционным центром (РЦ) фотосинтезирующей бактерии штамма Е1юйоЬае1ег зрйаегойез, фотоиндуцибельным белком, обладающим окислительно-восстановительной активностью, состоящим из апопротеина и кофакторов. В примере на фиг. 2, 3 и 4, РЦ, через его кофактор убихинон-50 ШО). в котором, как известно, Од является белковым связывающим карманом РЦ, ковалентно связывается с олигомером нуклеиновой кислоты. РЦ образует 1:1 комплекс с кофактором убихиноном-50 в О_А связывающем кармане, причем убихинон-50 ковалентно связывается с олигомером нуклеиновой кислоты уже описанным способом. В примере на фиг. 5 и 6 группировка представлена фотоиндуцибельным, обладающим окислительновосстановительной активностью, сшитым, по меньшей мере, бимолекулярным электронодонорным/электроноакцепторным комплексом, а именно, ковалентно сшитым цинкбактериофилл-хиноновым комплексом, который ковалентно соединяется (через спейсер) с олигомером нуклеиновой кислоты через хинон, электроноакцепторную молекулу комплекса.

Электрохимическая связь между (проводящей) поверхностью и группировкой, обладающей окислительно-восстановительной активностью (группировкой), осуществляемая через одноцепочечный олигонуклеотид, имеющий основную структуру электрод-спейсер-88олиго-спейсер-группировка, является слабой или вовсе отсутствует.

На следующем этапе тест-сайты приводят в контакт с раствором исследуемого олигомера нуклеиновой кислоты (мишени). Это приводит к гибридизации только в том случае, если раствор содержит олигонуклеотидные цепи, которые комплементарны олигонуклеотидным зондам, связанным с проводящей поверхностью, или комплементарны, по меньшей мере, в обширных участках. Гибридизация между зондом и олигонуклеотидами-мишенями приводит к увеличенной проводимости между поверхностью и группировкой, обладающей окислительновосстановительной активностью, поскольку группировка теперь связана через олигомер нуклеиновой кислоты, состоящий из двойной цепи. Фиг. 3 схематично иллюстрирует это с использованием структуры электрод-спейсер-кколиго-спейсер-иО(РЦ) в качестве примера. На фиг. 4 подробно показана последовательность этапов электронного переноса в структуре электрод-спейсер-б5-олиго-спейсер-иО(РЦ). тогда как фиг. 5 схематично иллюстрирует пример со структурой электрод-спейсер-кк-олиго-спейсерР-2пВСЫ, а фиг. 6 подробно показывает последовательность этапов электронного переноса в структуре электрод-спейсер-бк-олиго-спейсерΡ-ΖηΒΟΜ.

В результате гибридизации олигонуклеотидного зонда и комплементарной ему олигонуклеотидной цепи (мишени) изменяется электрическая связь между (проводящей) поверхностью и фотоиндуцибельной группировкой, обладающей окислительно-восстановительной активностью. Таким образом, событие последовательность-специфической гибридизации может быть определено с использованием электрохимических способов, таких как циклическая вольтамметрия, амперометрия или измерение проводимости.

В циклической вольтамметрии потенциал стационарно работающего электрода изменяется линейно, как функция времени. Начиная с потенциала, при котором не наблюдается электроокисление или электровосстановление, этот потенциал изменяется до тех пор, пока вещество, обладающее окислительно-восстановительной активностью, не окислится или не восстановится (то есть течет ток). После прохождения через процесс окисления или восстановления, который образует на кривой ток-напряжение первоначально увеличивающийся ток, затем максимальный ток (пик) и в конце концов постепенно уменьшающийся ток, направление подачи потенциала меняется на обратное. Поведение продуктов электроокисления или электровосстановления затем записывается в обратном ходе кривой.

Альтернативный способ электрической детекции, амперометрия, возможен благодаря применению подходящего постоянного электродного потенциала, такого, что группировка, обладающая окислительно-восстановительной активностью, может электроокисляться (электровосстанавливаться), но обратное восстановление (обратное окисление) группировки, обладающей окислительно-восстановительной ак тивностью, до ее первоначального состояния происходит не путем изменения электродного потенциала, как в циклической вольтамметрии, а путем добавления подходящего восстанавливающего агента (окисляющего агента), вещества, обладающего окислительно-восстановительной активностью, в раствор мишени, тем самым замыкающего токовую цепь целой системы. Пока присутствует восстанавливающий агент (окисляющий агент) или пока израсходованный восстанавливающий агент (окисляющий агент) снова восстанавливается (снова окисляется) на противоположном электроде, течет электрический ток, который может определяться амперометрически и который пропорционален числу событий гибридизации.

Этот принцип амперометрической детекции будет объяснен более подробно на примере глюкозооксидазы, для того чтобы представить себе фотоиндуцибельную группировку, обладающую окислительно-восстановительной активностью, или группировку, обладающую окислительно-восстановительной активностью. Глюкозооксидаза является ферментом, обладающим окислительно-восстановительной активностью, состоящим из апопротеина и одного кофактора (флавинадениндинуклеотида). Олигонуклеотидный зонд, один конец которого ковалентно присоединен к электроду, может быть снабжен функциональной группой по другому, свободному концу за счет целой глюкозооксидазной ферментативной группировки, например, путем ковалентного присоединения кофактора флавинадениндинуклеотида (ФАД) этого фермента к олигонуклеотидному зонду и последующей реконструкции его апопротеином глюкозооксидазы (Сох). Результирующий поверхностный гибрид, имеющий основную структуру электрод-спейсер-88-олиго-спейсер-ФАД(Сох), проявляет маленькую или вовсе не проявляет проводимость между электродом и ФАД. В случае гибридизации с Ά-олиго''-комплементарным олигонуклеотидом-мишенью проводимость значительно увеличивается. При добавлении глюкозного субстрата к раствору олигонуклеотида-мишени ФАД глюкозооксидазы (ФАД (Сох)) восстанавливается до ФАДН₂ глюкозооксидазы (ФАДН₂(Сох)), при этом глюкоза окисляется до глюконовой кислоты. Если затем к электроду прилагается подходящий внешний потенциал, такой, чтобы электроны от (ФАДН₂(Сох)) переходили на электрод через гибридизованный олигонуклеотид, и (ФАДН₂(Сох)) таким образом снова окислялся до (ФАД(Сох)) (но ни глюкоза, ни глюконовая кислота не могут электроокисляться или электровосстанавливаться на этом электроде), то ток будет течь в системе электрод-спейсер-бк-олиго-спейсер-ФАД (Сох) до тех пор, пока ФАД(Сох) восстанавливается свободной глюкозой, то есть, пока не израсходуется вся глюкоза, или в случае, когда к противоположному электроду прикладывается потен циал, при котором глюконовая кислота может восстановиться до глюкозы, до тех пор пока глюконовая кислота не восстановится на противоположном электроде. Этот ток может быть определен амперометрически, и он пропорционален числу событий гибридизации.

Фотоиндуцибельная или химически индуцибельная группировки, обладающие окислительно-восстановительной активностью, относящиеся к данному изобретению, обладают, однако, вместо одного электронного донора или электронного акцептора, по меньшей мере, одним электронным донором и, по меньшей мере, одним электронным акцептором.

В случае химически индуцибельной группировки, обладающей окислительно-восстановительной активностью, в пределах способа данного изобретения, по меньшей мере, один этап переноса заряда находится между электронным донором (донорами) и электронным акцептором (акцепторами). Свободное вещество, обладающее окислительно-восстановительной активностью, которое восстанавливает Ό (или окисляет А), и таким образом инициирует электронный перенос от Ό^- на А с образованием А^- (или электронный перенос от Ό на А⁺ с образованием Ό⁺), дает возможность установить на электроде потенциал, при котором А^- (или Ό⁺), но не А (или Ό) может окисляться (или восстанавливаться). Это выгодно потому, что электрод обладает потенциалом, при котором прямая реакция свободного вещества, обладающего окислительно-восстанови-тельной активностью, в присутствии электрода может быть существенно супрессирована, и могут быть определены первичные электронные переносы между группировкой, обладающей окислительно-восстановительной активностью, и электродом.

Если группировкой, обладающей окислительно-восстановительной активностью, является фотоиндуцибельная группировка, обладающая окислительно-восстановительной активностью, то окислительновосстановительная активность запускается только светом с определенной или любой данной длиной волны. В соответствии с данным изобретением, это свойство используется с успехом, поскольку электрохимическое определение запускается только путем облучения светом поверхностного гибрида, имеющего основную структуру электрод-спейсер-(б§олиго-спейсер-группировка (поверхностный гибрид с гибридизованной мишенью), и поддерживается, в лучшем случае, пока продолжается облучение светом. Таким образом, особенно в случае амперометрической детекции, если используется фотоиндуцибельная группировка, обладающая окислительновосстановительной активностью, то при определенных внешних условиях, (довольно долговременный) ток будет течь только в том случае, если свет излучается на поверхностный гибрид. Такими внешними условиями являются, например, присутствие восстанавливающего агента (или окисляющего агента), подходящего для восстановления (или окисления) образующегося в результате фотоиндукции окисленного донора Ό⁺ (или восстановленного акцептора А^-) фотоиндуцибельной группировки, обладающей окислительновосстановительной активностью, и приложение к электроду потенциала, при котором образующийся в результате фотоиндукции восстановленный акцептор А^- (или окисленный донор Ό⁺) фотоиндуцибельной группировки, обладающей окислительно-восстановительной активностью, может окисляться (или восстанавливаться), но невосстановленный акцептор А (или неокисленный донор Ό) не может окисляться (или восстанавливаться). В разделе Способ выполнения изобретения это объясняется более подробно с использованием различных примеров структуры электрод-спейсер-88-олиго-спейсер-группировка, имеющей фотоиндуцибельную группировку, обладающую окислительно-восстановительной активностью. Таким образом, детекция, использующая фотоиндуцибельную группировку, обладающую окислительно-восстановительной активностью, может быть пространственно ограничена определенным тестсайтом или группой тест-сайтов на олигомерном чипе путем ограничения света размером этого тест-сайта или группы тест-сайтов. В соответствии с данным изобретением, различные тест-сайты (комбинации олигомера нуклеиновой кислоты) олигомерного чипа могут быть таким образом приложены к разделенной, непрерывной, электропроводящей поверхности. Особый тест-сайт или группа тестсайтов могут быть адресными и определяться амперометрически просто путем приложения подходящего внешнего потенциала к (целой) поверхности, если этот тест-сайт или группа тест-сайтов точно облучается светом. Различные тест-сайты таким образом не должны прикладываться к отдельным (микро-)электродам, которые электрически изолированы друг от друга и способны индивидуально контролировать приложение потенциала и считывание тока. Более того, если поверхностные гибриды, имеющие основною структуру электрод-спейсер-88-олиго-спейсер-группи-ровка, используются с фотоиндуцибельной группировкой, обладающей окислительно-восстановительной активностью, и амперометрической детекцией, то процедура считывания для определения отдельных последовательностьспецифических гибридизационных событий на олигомерном чипе может быть оптимизирована путем первоначального считывания тест-сайтов путем приблизительного сканирования их соответствующим образом сфокусированным светом и затем последовательно увеличивающейся разрешающей способностью в решетках, имеющих гибридизационные события, как например, для октамерного чипа, имеющего 65 536 тест-сайтов, например, считываются 64 группы из каждых 1024 тест-сайтов, затем группы тест-сайтов, которые показаны амперометрическими измерениями для выявления гибридизационных событий могут исследоваться, например, в 32 тест-сайт-группах из каждых 32 тест-сайтов, и после этого в тест-сайт-группах, которые снова демонстрируют гибридизационные события, тест-сайты исследуются индивидуально. Таким образом, индивидуальные гибридизационные события могут быть быстро приписаны определенным олигомерным зондам с небольшими экспериментальными расходами.

Краткое описание рисунков

Изобретение будет объяснено более детально ниже с помощью примеров и рисунков, где фиг. 1 показывает схематическую диаграмму олигонуклеотидного секвенирования посредством гибридизации на чипе;

фиг. 2 показывает различные последовательности реакций для получения поверхностного гибрида структуры электрод-спейсер-88олиго-спейсер-иО(РЦ). Фотоиндуцибельной группировкой, обладающей окислительно-восстановительной активностью, в этом поверхностном гибриде является реакционный центр (РЦ) фотосинтезирующих бактерий КйобоЬас1ег зрйаегоМез. Этот фотоиндуцибельный белок, обладающий окислительно-восстановительной активностью, состоит из апопротеина и кофакторов. РЦ, через его кофактор убихинон-50 ШО). в котором известно, что Од - белковый связывающий карман, ковалентно связывается через спейсер с олигонуклеотидом;

фиг. 3 показывает схематическую диаграмму способа фотоиндуцированного амперометрического измерения, использующего пример поверхностного гибрида основной структуры электрод-спейсер-88-олиго-спейсер-иО(РЦ) на фиг. 2 (1ιν: облучение светом; Р: первичный донор РЦ; ИО: убихинон-50 электронный акцептор в О_А белковом связывающем кармане РЦ; Кеб/Ох: восстановленная или окисленная форма свободного вещества, обладающего окислитель-новосстановительной активностью, добавленная к раствору мишени, например, цит с₂ ²⁺, аскорбат натрия или Ре(СИ)6²⁺, которые могут снова восстанавливать окисленную форму Р⁺ до его первоначального нейтрального состояния Р; ЕОх: потенциал электрода, при котором ИО^- окисляется до ИО через перенос электрона на электрод; 1ι ν вкл.: начало светового облучения; Ιιν выкл.: конец светового облучения);

фиг. 4 показывает подробную схематичную диаграмму поверхностного гибрида Аи8(СН₂)₂-08-олиго-спейсер-О-2иВСЫ на фиг. 3, имеющего золото в качестве твердой подложки, меркаптоэтанол в качестве спейсера (-8-СН₂СН₂спейсер) между электродом и олигонуклеотидом и -СН₂-СН=СН-СО-ИН-СН₂-СН₂-ИН- в качестве спейсера между электронным акцептором РОО и олигонуклеотидом, а также диаграмму последовательности этапов фотоиндуцированного переноса электронов. Апопротеин РЦ показан только в виде оболочки (сплошная линия) (ср. со структурой 1). Подробно показан олигонуклеотидный зонд длиной 12 п.о. с типичной последовательностью 5'ТАСТСССААССА-3' в гибридизованном состоянии;

фиг. 5 показывает схематичную диаграмму способа фотоиндуцированного амперометрического измерения, использующего пример поверхностного гибрида основной структуры электрод-спейсер-88-олиго-спейсер-0-2иВСЫ (Ιιν: облучение светом; 2иВСЫ: электронодонорная молекула цинк-бактериохлорофилла; О: электроноакцепторная молекула хинона, например, модифицированный антрахинон или РОО; Кеб/Ох: восстановленная или окисленная форма свободного вещества, обладающего окислительновосстановительной активностью, добавленная к раствору мишени, например, Ре(СЫ)₆ ²⁺, который может снова восстанавливать окисленную форму электронного донора 2иВСЬ1⁺ до его первоначального нейтрального состояния ΖπΒΟιΙ; Е_Ох: электродный потенциал, при котором О^- окисляется до О, отдавая электрон на электрод; Ιιν вкл.: начало светового облучения; Ιιν выкл.: конец светового облучения);

фиг. 6 показывает подробную схематичную диаграмму поверхностного гибрида основной структуры Аи-8(СН₂)₂-Й8-олиго-спейсер-0ΖηВСЫ на фиг. 5, имеющего золото в качестве твердой подложки, меркаптоэтанол в качестве спейсера (-8-СН₂СН₂-спейсер) между электродом и олигонуклеотидом и -СН₂-СН=СН-СОИН-СН₂-СН₂-ИН- в качестве спейсера между электронным акцептором РОО и олигонуклеотидом, а также диаграмму последовательности этапов фотоиндуцированного переноса электронов. Подробно показан олигонуклеотидный зонд длиной 12 п.о. с типичной последовательностью 5'-ТАСТСССААССА-3' в гибридизованном состоянии.

Способ выполнения изобретения

Характерная единица типичного тест-сайта с гибридизованной мишенью, Аи-8(СН₂)₂-бз-олигоспейсер-ИО(РЦ), имеющая основную структуру электрод-спейсер-бз-олиго-спейсер-группировка, показана на фиг. 4. В контексте данного изобретения термин характерная единица понимают как наименьшую повторяющуюся единицу тест-сайта. В примере на фиг. 4 поверхностью является золотой электрод. Связь между золотым электродом и олигонуклеотидным зондом была образована с помощью линкера (НО-(СН₂)₂-8)₂, который был этерифицирован концевой фосфатной группой на 3'-конце для образования Р-О-(СН₂)₂-8-8(СН₂)₂-ОН и последующего гомолитического распада 8-8-связи на поверхности золота с получением одной Аи-8-связи, с которой коадсорбировался на поверхности 2-гидроксимеркаптоэтанол и меркаптоэтанол, связанный с олигонуклеотидом. Фотоиндуцибельной группировкой, обладающей окислительновосстановительной активностью, в примере на фиг. 4, является реакционный центр (РЦ) фотосинтезирующей бактерии Р1юбоЬас1ег врйаегоК без, фотоиндуцибельный белок, обладающий окислительно-восстано-вительной активностью, состоящий из апопротеина и кофакторов. В приложенном примере РЦ, через его кофактор убихинон-50 ШР), в котором известно, что Рд связывающий карман РЦ, ковалентно соединяется с олигонуклеотидом, где свободный ир был сначала обеспечен реакционноспособной карбоксильной группой (см. пример 1), затем ковалентно присоединялся к олигонуклеотидному зонду через эту карбоксильную группу (аминирование и дегидратация концевой аминогруппы -СН=СН-СО-№Н-СН₂-СН₂-№Н₂ линкера, присоединенного к С-5 атому 5'-тимина), и наконец, оставшийся РЦ (апопротеин со всеми кофакторами, за исключением ЬР( был реконструирован до ир.

Как уже упоминалось выше, модификация олигонуклеотидных зондов может происходить с целой группировкой, обладающей окислительно-восстановительной активностью, или с ее компонентом, либо до, либо после того, как олигонуклеотидный зонд свяжется с проводящей поверхностью. Различные комбинационные возможности отдельных этапов, которые фактически приводят к одной и той же характерной единице тест-сайта, будут проиллюстрированы ниже с помощью фиг. 2, использующей в качестве примера поверхностный гибрид Аи8(СН₂)₂-88-олиго-спейсер-ИР(РЦ) или его более общую разновидность электрод-спейсер-88олиго-спейсер-ир(РЦ).

Реакционный центр может быть освобожден от двух убихиноновых кофакторов в Рд и Ρΐ; связывающем кармане путем простой манипуляции (Риппег, М.К, КоЬейзоп, Ό.Τ., Рийои, Р.Ь., 1986, 1оигпа1 о£ РНу81са1 Сйегазйу, Уо1. 90, рр. 3783-3795), давая таким образом убихинон, отделенный от оставшегося РЦ (апопротеин, включающий все кофакторы, за исключением убихинона в Р_А и р_н связывающем кармане). Олигонуклеотидный зонд имеет (идентичные или отличающиеся) реакционноспособные группы, присоединенные через (любой) спейсер, около каждого из его концов. В последовательности реакций 1, в присутствии монофункционального линкера (в соответствии с пунктами а)-с) и 2) в разделе Связывание олигонуклеотида с проводящей поверхностью), олигонуклеотидный зонд, модифицированный таким образом, может быть ковалентно присоединен к электроду вместе с монофункциональным линкером, обеспечивая уверенность в том, что присоединяется достаточное количество монофункционального линкера подходящей длины цепи, для того чтобы обеспечить достаточное пространство между отдельными олигонуклеотидными зондами для гибридизации с олигонуклеотидной мишенью и для присоединения группировки, обладающей окислительно-восстановительной активностью. После этого ир, который был предварительно снабжен подходящей реакционноспособной сопряженной группой, присоединяется к свободной, связанной через спейсер, реакционноспособной группе олигонуклеотидного зонда. Присоединение происходит, как описано в пунктах а) или б) в разделе Связывание группировки, обладающей окислительновосстановительной активностью, с олигомером нуклеиновой кислоты. На заключительном этапе этой последовательности реакций 1, оставшийся РЦ (апопротеин со всеми кофакторами, за исключением ир) восстанавливается (гссощШШеб) до ир. При отклонении от этой последовательности реакций (последовательность реакций 2), модифицированный (спейсером или реакционноспособными группами) олигонуклеотидный зонд может сначала ковалентно связываться с электродом без свободного монофункционального линкера (спейсера), являясь причиной плоского присоединения олигонуклеотида. После этого свободный монофункциональный линкер (спейсер) ковалентно связывается с электродом. Дополнительная возможность (последовательность реакций 2) заключается в том, чтобы модифицировать уже модифицированный (спейсером или реакционноспособными группами) олигонуклеотидный зонд сначала с помощью ИР, затем ковалентно присоединить его к электроду в присутствии свободного монофункционального линкера (спейсера) и затем восстановить его оставшимся РЦ. И наконец, в последовательности реакций 4, модифицированный (спейсером или реакционноспособными группами) олигонуклеотидный зонд сначала может быть модифицирован ир, так чтобы затем восстановить его оставшимся РЦ и после этого ковалентно присоединить его к электроду. Когда, как и в случае РЦ, группировка, обладающая окислительновосстановительной активностью, имеет существенно больший диаметр, чем гибридизованный бзолигонуклеотид (больше 30 А), то можно обойтись без ковалентного присоединения подходящего монофункционального линкера (спейсера) к электроду; иначе, присоединение структуры -спейсер-ззолиго-спейсер-ИР(РЦ) к электроду происходит в присутствии свободного монофункционального линкера.

В примере на фиг. 2 РЦ, через его кофактор убихинон-50 (ир), в котором, как известно, р_А белковый связывающий карман РЦ, ковалентно связывается с олигонуклеотидом. С другой стороны, вместо кофактора ир в р_А связывающем кармане, к олигонуклеотидному зонду может ковалентно присоединяться также другой кофактор РЦ или апопротеин, могут применяться лю бые комбинации последовательностей реакций 1, 2, 3 или 4 на фиг. 2, поскольку они дают одинаковый конечный продукт (ср. фиг. 2), и на любых реакционных этапах олигонуклеотидный зонд, гибридизующийся с комплементарным, немодифицированным олигонуклеотидом (мишенью), может использоваться вместо одноцепочечных олигонуклеотидных зондов. Олигонуклеотидный зонд может также присоединяться прямо, другими словами, не связываться через спейсер, как с электродом, так и с группировкой, обладающей окислительно-восстановительной активностью, как описано в пункте с) в разделе Связывание олигонуклеотида с проводящей поверхностью или в пункте а) в разделе Связывание группировки, обладающей окислительновосстановительной активностью, с олигомером нуклеиновой кислоты.

Электрическая связь между проводящей поверхностью и группировкой, обладающей окислительно-восстановительной активностью, связанной через одноцепочечный олигонуклеотид в основной структуре электрод-спейсер-88-олигоспейсер-группировка, является слабой или вовсе отсутствует. Если гибридизация происходит между зондом и мишенью, то обработка тест-сайта (тест-сайтов) раствором исследуемого олигонуклеотида приводит к увеличивающейся проводимости между поверхностью и группировкой, обладающей окислительно-восстановительной активностью, связанной через двухцепочечный олигонуклеотид. Для типичной единицы тест-сайта Ли-8(СН₂)₂-б8-олиго-спейсер-ир(РЦ) (с олигонуклеотидными зондами длиной 12 п.о.), использованными в качестве примера, это показано схематично на фиг. 3 с помощью амперометрических измерений.

Кофактор Р, названный также первичным донором, электронно возбуждается при облучении РЦ светом с подходящей длиной волны, вызывающим фотоиндуцированное разделение заряда в пределах кофакторов РЦ, при этом электрон переносится от возбужденного первичного донора Р* на ир в Рд связывающем кармане. Если к электроду прикладывается подходящий потенциал для переноса электрона от восстановленного убихинона ШР^-) на электрод, то ток все же не будет течь в случае, если олигонуклеотидный зонд не гибридизуется олигонуклеотидом-мишенью, так как проводимость 88-олигонуклеотида в структуре Ли-8(СН₂)₂-58олиго-спейсер-ИР(РЦ) очень мала или вовсе отсутствует. Однако в гибридизованном состоянии (Ли-8(СН₂)₂-б8-олиго-спейсер-ир(РЦ)) проводимость высокая, электрон может переноситься от ИР^- на электрод (образуя ИР) и, в присутствии подходящего вещества, обладающего окислительно-восстановительной активностью, которое восстанавливает Р⁺ до Р, контур замыкается, и дополнительное поглощение света реакционным центром (РЦ) начинает цикл заново. Это проявляется амперометрически в неодинаковом (бкйпс!) течении тока между электродом и фотоиндуцибельной группировкой, обладающей окислительно-восстановительной активностью (фиг. 3). Таким образом можно определять последовательностьспецифическую гибридизацию мишени с олигонуклеотидными зондами посредством амперометрии, используя фотоиндукцию. Отдельные этапы переноса электронов, которые запускаются в поверхностном гибриде Ли-8(СН₂)₂-б§олиго-спейсер-ИР(РЦ) световым облучением и в присутствии подходящего вещества, обладающего окислительно-восстановительной активностью, которое восстанавливает Р* до Р, показаны на фиг. 4. При наличии подходящих внешних условий и подходящем присоединении (например, присоединении РЦ к олигонуклеотидному зонду около первичного донора), поверхностный гибрид Ли-8(СН₂)₂-б§-олигоспейсер-ИР(РЦ) может, конечно, также обратимо изменяться, так, что после светового облучения Р⁺ восстанавливается электродом и р^- окисляется подходящим окисляющим агентом.

Другой тест-сайт Ли-8(СН₂)₂-58-олигоспейсер-Р-2пВС.'111. имеющий основную структуру электрод-спейсер-88-олиго-спейсер-группировка, показан на фиг. 5. При облучении ΖπΒΟιΙ светом с подходящей длиной волны, ΖηΒСЫ электронно возбуждается и происходит фотоиндуцированное разделение заряда, при этом электрон переносится от возбужденного ΖηΒСЫ* на хинон р. Если к электроду прикладывается подходящий потенциал, для того чтобы перенести на электрод электрон от хинона (Р^-), восстановленного таким образом, то ток тем не менее не будет течь в случае олигонуклеотидного зонда, не гибридизованного с олигонуклеотидом-мишенью, так как проводимость 88-олигонуклеотида в Ли-8(СН2)2-58-олигоспейсер-Р^пВСЫ очень мала или вовсе отсутствует. Однако в гибридизованном состоянии Ли-§(СН2)2-б8-олиго-спейсер-Р^пВСЫ проводимость высокая, электрон может переноситься от р^-на электрод (образуя Р) и в присутствии подходящего вещества, обладающего окислительно-восстановительной активностью, которое восстанавливает ΖηΒСЫ⁺ до ΖпΒСЫ, контур замыкается, и дополнительное поглощение света ΖпΒСЫ начинает цикл заново. Это проявляется амперометрически в неодинаковом течении тока между электродом и фотоиндуцибельной группировкой, обладающей окислительновосстановительной активностью (фиг. 5). Последовательность-специфическая гибридизация мишени с олигонуклеотидными зондами может быть таким образом определена посредством амперометрии с использованием фотоиндукции. При наличии подходящих внешних условий и подходящем присоединении (например, Ли8(СН2)₂-б5-олиго-спейсер-Р^пВСЫ), поверхностный гибрид Ли-8(СН₂)₂-б5-олиго-спейсер-РΖηΒСЫ может, конечно, также обратимо изме няться, так, что после светового облучения ΖπΒΟιΙ' восстанавливается электродом, и 0 окисляется подходящим окисляющим агентом.

Так как окислительно-восстановительная активность фотоиндуцибельной группировки, обладающей окислительно-восстановительной активностью, - даже при соответствующем электродном потенциале - запускается только облучением светом с подходящей длиной волны и поддерживается, в лучшем случае, пока продолжается облучение светом, это условие может успешно использоваться, в соответствии с данным изобретением, в том, что особый (конкретный) тест-сайт или группа тест-сайтов олигомерного чипа пространственно разрешается путем ограничения света в этом тест-сайте или группе тест-сайтов. Преимущество в соответствии с данным изобретением состоит в том, что различные тест-сайты (комбинации олигомеров нуклеиновой кислоты) олигомерного чипа могут быть приложены к общей, непрерывной, электропроводящей поверхности, и специфический тест-сайт или специфическая группа тестсайтов может быть направленно и амперометрически определена просто путем приложения подходящего внешнего потенциала к (целой) поверхности, если только этот тест-сайт или группа тест-сайтов облучаются светом. Таким образом, различные тест-сайты не должны прилагаться к отдельным (микро-) электродам, которые электрически изолированы друг от друга и управляются индивидуально для подачи потенциала и выбора тока.

Кроме того, дефектное спаривание оснований (ошибочное спаривание оснований) может распознаваться посредством измененной циклической вольтамметрической характеристики. Ошибочное спаривание проявляется в большем различии потенциала между максимумами тока электровосстановления и обратного электроокисления (отмена электровосстановления, когда направление подачи потенциала изменяется на обратное), или электроокисления и обратного электровосстановления в регистрируемом циклической вольтамметрией обратимом переносе электрона между электропроводящей поверхностью и фотоиндуцибельной группировкой, обладающей окислительно-восстановительной активностью. Этот факт имеет полезное влияние прежде всего на амперометрическое определение, потому что ток может тестироваться при потенциале, при котором полностью гибридизизующаяся олигонуклеотидная мишень дает значительный ток, а дефектно спаренная олигонуклеотидная мишень - нет.

Пример 1. Модификация убихинона-50 реакционноспособной карбоксильной группой, связанной через спейсер.

2-метоксигруппу убихинона-50 (ир-50) модифицируют до 2-гидроксигруппы эфирным расщеплением в присутствии НВг, стандартным способом (альтернативно, 2-ΟΗ-υρ-50 может быть получен по способу Мооге, Η.ν. и Ро1кегк, К., 1оигпа1 ок Ле Лтепсап С11еннса1 8оае1у. 1966, 88, рр. 564-570 или Оауек, О. и соавт., коигпа1 ок Ле Лтепсап С11еннса1 8ос1е1у, 1968, 90, рр. 5587-5593). Соответственно в стандартном способе, использующем эквимолярное количество С1-СН₂-СН₂-СО₂Н, 2-ΟΗ-ΡΟ-50 превращается в 2-(СН₂-СН₂-СО₂Н)-ИР-50 и хроматографически очищается. С другой стороны, в стандартном способе, 5-ОН-6-алкил-1,4бензохиноновые аналоги ир-50 (полученные по способу СаЛп и соавт., коита1 ок Ле Лтепсап С11еннса1 8ос1е1у, 1968, 90, рр. 3572-3574) могут быть модифицированы до 5-(СН₂-СН₂-СО₂Н)υθ-50-аналогов с использованием эквимолярного количества С1-СН₂-СН₂-СО₂Н.

Пример 2. Получение олигонуклеотидного электрода Ли-8(СН₂)₂-58-олиго-спейсер-ир(РЦ).

Ли-8(СН₂)₂-58-олиго-спейсер-ир(РЦ) получают в четыре этапа, а именно получение проводящей поверхности, модификация поверхности с помощью олигонуклеотидного зонда в присутствии подходящего монофункционального линкера (этап инкубации), ковалентное присоединение модифицированного убихинона-50 (окислительно-восстановительный этап) и реконструкция оставшегося РЦ (этап реконструкции).

Приблизительно 100 нм тонкой золотой пленки на слюде (пластинки мусковита) образуют подложку для ковалентного присоединения двухцепочечных олигонуклеотидов. С этой целью свежерасщепленная слюда очищалась с помощью аргонионной плазмы в электрической разрядной камере, и золото (99,99%) наносилось посредством электрического разряда слоем толщиной приблизительно 100 нм. После этого золотая пленка, освобождалась от поверхностных примесей (окисление органических накоплений) с помощью 30% Η₂Ο₂/70% Η₂8Ο₄ и погружалась в этанол приблизительно на 20 мин для разгонки любых форм кислорода, адсорбированных на поверхности. После промывки поверхности бидистиллированной водой, предварительно приготовленный 1х10^-4 молярный раствор (модифицированного) двухцепочечного олигонуклеотида добавляют к горизонтально расположенной поверхности, таким образом, чтобы вся золотая поверхность была смочена этим раствором (этап инкубации, смотреть также ниже).

Для инкубации использовали дважды модифицированный одноцепочечный олигонукле отид длиной 12 п.о., имеющий последовательность 5'-ТАСТСССААССА-3', который этерифицируется с (НО-(СН₂)₂-8)₂ по фосфатной группе 3'-конца с образованием Р-О-(СН₂)₂-8-8(СН₂)₂-ОН. На 5'-конце концевое тиминовое основание олигонуклеотида модифицируется по С-5 углероду с помощью -СН=СН-СО-НН-СН₂ΟΗ₂-ΝΗ₂. Приблизительно от 10^-4 до 10^-1 молярного раствора 2-гидроксимеркаптоэтанола (или другого тиольного или дисульфидного линкера с подходящей длиной цепи) добавляли к 2х10^-4 молярному раствору этого олигонуклеотида в буфере НЕРЕ8 (0,1 М в воде, рН 7,5 с 0,7 молярной добавкой ТЕАТЕВ, см. сокращения) и (этим раствором) полностью смачивали золотую поверхность тест-сайта и инкубировали с ним в течение 2-24 ч. Во время этой реакции дисульфидный спейсер Р-О-(СН₂)₂-8-8-(СН₂)₂-ОН олигонуклеотида гомолитически расщеплялся. В этом процессе спейсер образует ковалентную Аи-8- связь с Аи атомами поверхности, таким образом, приводя к 1:1 коадсорбции 88олигонуклеотида и расщепленного 2-гидроксимеркаптоэтанола. Свободный 2-гидроксимеркаптоэтанол, который также присутствует в инкубационном растворе, также коадсорбируется, образуя Аи-8- связь (этап инкубации).

Золотой электрод, модифицированный таким образом с помощью монослоя, состоящего из 88-олигонуклеотида и 2-гидроксимеркаптоэтанола, промывали бидистиллированной водой и затем смачивали раствором 3х10^-3 молярного хинона 2-(СН2-СН2-СО2Н)-ИР-50, 10^-2 молярного ЕЭС и 10^-2 молярного сульфо-ΝΗδ в буфере НЕРЕ8 (0,1 М (в воде, рН=7,5). После приблизительно 1-4 ч реакции, -СН=СН-СОМН-СН2-СН₂-ЯН₂-спейсер и 2-(СН₂-СН₂-СО₂Н)ЕО-50 образуют ковалентную связь (аминирование между аминогруппой спейсера и С-2кислотной функциональной группой 2-(СН₂СН_;-СО₂Н)-иО-50. окислительно-восстановительный этап).

После этого золотой электрод, модифицированный таким образом, промывали бидистиллированной водой и инкубировали приблизительно 12 ч с раствором приблизительно 5х10^-3 молярного убихинон-50-свободного РЦ в 10 тМ Тп8, рН=8, с 0,7 молярной добавкой ТЕАТЕВ приблизительно при 4°С для реконструкции оставшегося РЦ до ир-50, связанного с олигонуклеотидом (этап реконструкции).

Альтернативно, для того чтобы ковалентно присоединить 2-(СН₂-СН₂-СО₂Н)-ир-50 к олигонуклеотидному зонду при тех же условиях, может быть использован также 5-(СН2-СН2СО₂Н)-ир-50-аналог (пример 1) или другой хинон формулы 1-8, имеющий реакционноспособную карбоксильную группу, так как убихинон-50-свободный РЦ может быть также реконструирован до них.

Пример 3. Получение олигонуклеотидного электрода Аи-8(СН₂)₂-88-олиго-спейсер-Р2иВСЫ.

Аи-8(СН₂)₂-88-олиго-спейсер-О-2пВС111 получают в пять этапов, а именно получение проводящей поверхности, модификация поверхности с помощью олигонуклеотидного зонда (гибридизованного с комплементарной цепью) в присутствии подходящего монофункционального линкера (этап инкубации), ковалентное присоединение электронного акцептора (акцепторный этап), ковалентное присоединение электронного донора (донорный этап) и дегибридизация температурой двухцепочечного олигонуклеотида (этап дегибридизации).

Подложка для ковалентного присоединения двухцепочечных олигонуклеотидов, приблизительно 100 нм тонкой золотой пленки на слюде (пластинки мусковита), была получена, как описано в примере 1.

Для инкубации использовали дважды модифицированный одноцепочечный олигонуклеотид длиной 12 п.о., имеющий последовательность 5'-ТАСТСССААССА-3', который был этерифицирован (НО-(СН₂)₂-8)₂ по фосфатной группе на 3'-конце с образованием Р-О-(СН₂)₂-88-(СН₂)₂-ОН. На 5'-конце концевое тиминовое основание олигонуклеотида модифицируется по С-5 углероду с помощью -СН=СН-СО-№-СН₂СН₂-ЯН₂. 2х10^-4 молярный раствор этого олигонуклеотида в гибридизационном буфере (10 тМ Тп8, 1 тМ ЭДТА, рН 7,5 с 0,7 молярной добавкой ТЕАТЕВ, см. сокращения) гибридизовали с 2х10^-4 молярным раствором (немодифицированной) комплементарной цепи в гибридизационном буфере при комнатной температуре в течение приблизительно 2 ч (этап гибридизации). После гибридизации приблизительно от 10^-4 до 10^-1 молярного раствора 2-гидроксимеркаптоэтанола (или другого тиольного или дисульфидного линкера с подходящей длиной цепи) добавляли теперь к 1х10^-4 молярному раствору двухцепочечного олигонуклеотида и золотую поверхность тест-сайта полностью смачивали этим раствором и инкубировали в течение 2-24

ч. Во время этой реакции дисульфидный спейсер Р-О-(СН₂)₂-8-8-(СН₂)₂-ОН олигонуклеотида гомолитически расщеплялся. В этом процессе спейсер образует ковалентную Аи-8- связь с Аи атомами поверхности, таким образом, приводя к 1:1 коадсорбции бк-олигонуклеотида и расщепленного 2-гидроксимеркаптоэтанола. Свободный 2-гидроксимеркаптоэтанол, который также присутствует в инкубационном растворе, также коадсорбируется, образуя Аи-8-связь (этап инкубации).

Золотой электрод, модифицированный таким образом с помощью монослоя, состоящего из б8-олигонуклеотида и 2-гидроксимеркаптоэтанола, промывали бидистиллированной водой и затем смачивали раствором 3х10^-3 молярного хинона РОО- 10^-2 молярного ЕЭС и

10^-2 молярного сульфо-ΝΗδ в буфере НЕРЕ8. После приблизительно 1-4ч реакции, -СН=СНСΟ-NН-СН₂-СН₂-NН₂-спейсер и РОС образуют ковалентную связь (аминирование между аминогруппой спейсера и С-7-карбоксильной функциональной группой РОО- акцепторный этап).

После этого золотой электрод, модифицированный таким образом, промывали бидистиллированной водой и смачивали водным раствором 3х10^-3 молярного донора ΖηΒΟιΙ (свободная кислота), 1,5х10^-1 молярного ЕИС, 2,5х10^-3 молярного гидразинмоногидрата (ΝΗ₂-ΝΗ₂χΗ₂Ο) и 1 х10^-1 молярного имидазола. После приблизительно 16 ч реакции при 23°С, С-1карбоксильная функциональная группа РОО. связанная с олигонуклеотидом, связывается через гидразин со свободной карбоксильной группой ΖηВСЫ (аминирование между аминогруппами гидразина и С-1-карбоксильной функциональной группой РОС или свободной карбоксильной группой ΖηВСЫ, донорный этап). После этого двойные цепи термически дегибридизовали при температурах Т>40°С и снова промывали бидистиллированной водой (этап дегибридизации). ΖηВСЫ (свободную кислоту) получают из Ζη-ВСЫ (по способу Η;·ιΠ\νίο1ι и соавт., 1оигпа1 о£ Ые Лтепсап СБетюа1 δοοίοΐν, 1998, 120, рр. 3684-3693) инкубацией с трифторуксусной кислотой.

Ζη-ВСЫ (свободная кислота)

(Связанный олигонуклеотиднын зонд)

С другой стороны, например, ΖηВСЫ (свободная кислота) может также связываться с 3ОН группой 5'-концевого сахара олигонуклеотидного зонда посредством этерификации, в соответствии со стандартными способами, или предварительно ковалентно соединенный элек тронодонорный/электроноакцепторный комплекс присоединяется к олигонуклеотидному зонду, как описано в донорном этапе, через свободную карбоксильную группу, например, донора. Вместо РОС· при тех же реакционных условиях, в акцепторном этапе может использоваться двунатриевая соль антрахинон-2,6дисульфокислоты. Если используется ПНК олигонуклеотид, например, с ^Н-(СН₂)₂-^СОСН₂основание)-СН2СО- в качестве олигонуклеотидного строительного блока, то существует альтернативная возможность для присоединения группировки ΖηВСЫ-Р^^ к олигомеру нуклеиновой кислоты (ПНК олигонуклеотиду) в соответствии с пунктом г) в разделе Связывание фотоиндуцибельной группировки, обладающей окислительно-восстановительной активностью, с олигомером нуклеиновой кислоты. В этом случае, во время синтеза ПНК олигонуклеотида, вместо Ν-концевого основания в стандартной реакции синтеза ПНК, присоединяется РОС через его пиррольный азот. После этого, способом, сходным с тем, который описан в донорном этапе, ΖηВСЫ связывается с аминоконцом пептидного скелета посредством инкубации ПНК-олигонуклеотида, модифицированного с помощью РОС, с 3х10^-3 молярным раствором ΖηВСЫ (свободная кислота), 1,5х10^-1 молярным ЕИС, 10^-2 и 2х10^-1 молярным сульфо-НН8 в буфере НЕРЕ8 (аминирование между аминогруппой скелета и карбоксильной группой Ζη-ВСЫ (свободная кислота)).

Claims (68)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Олигомер нуклеиновой кислоты, модифицированный путем ковалентного присоединения группировки, обладающей окислительновосстановительной активностью, характеризующийся тем, что группировка, обладающая окислительно-восстановительной активностью, включает, по меньшей мере, одну электронодонорную молекулу и, по меньшей мере, одну электроноакцепторную молекулу, причем электронодонорная молекула и электроноакцепторная молекула не связаны друг с другом олигомерами нуклеиновой кислоты.
2. 2. Олигомер нуклеиновой кислоты по п.1, отличающийся тем, что группировка, обладающая окислительно-восстановительной активностью, содержит, по меньшей мере, один сшитый, по меньшей мере, бимолекулярный электронодонорный/электроноакцепторный комплекс, обладающий окислительно-восстановительной активностью, причем, по меньшей мере, одна электронодонорная молекула группировки, обладающей окислительно-восстановительной активностью, и, по меньшей мере, одна электроакцепторная молекула группировки, обладающей окислительно-восстановительной активностью, связаны друг с другом одной или несколькими связями.
3. 3. Олигомер нуклеиновой кислоты по п.2, отличающийся тем, что эти связи являются ковалентными связями.
4. 4. Олигомер нуклеиновой кислоты по п.1, отличающийся тем, что группировка, обладающая окислительно-восстановительной активностью, включает, по меньшей мере, один сшитый, по меньшей мере, бимолекулярный электронодонорный/электроноакцепторный комплекс, обладающий окислительно-восстановительной активностью, причем, по меньшей мере, одна электронодонорная молекула группировки, обладающей окислительно-восстановительной активностью, и, по меньшей мере, одна электроакцепторная молекула группировки, обладающей окислительно-восстановительной активностью, ковалентно связаны друг с другом посредством одной или нескольких разветвленных или линейных молекулярных группировок любого состава и длины цепи.
5. 5. Олигомер нуклеиновой кислоты по п.4, отличающийся тем, что разветвленные или линейные молекулярные группировки имеют длину цепи от 1 до 20 атомов.
6. 6. Олигомер нуклеиновой кислоты по п.5, отличающийся тем, что разветвленные или линейные молекулярные группировки имеют длину цепи от 1 до 14 атомов.
7. 7. Олигомер нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что группировка, обладающая окислительно-восстановительной активностью, дополнительно содержит одну или несколько макромолекул.
8. 8. Олигомер нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-7, отличающийся тем, что группировка, обладающая окислительно-восстановительной активностью, представляет собой нативный или модифицированный реакционный центр фотосинтезирующих микроорганизмов.
9. 9. Олигомер нуклеиновой кислоты по п.8, отличающийся тем, что группировка, обладающая окислительно-восстановительной активностью, представляет собой нативный или модифицированный реакционный центр фотосинтезирующих бактерий.
10. 10. Олигомер нуклеиновой кислоты по одному из пп.1-7, отличающийся тем, что, по меньшей мере, одна из электронодонорных молекул и электроноакцепторных молекул представляет собой пигмент.
11. 11. Олигомер нуклеиновой кислоты по п.10, отличающийся тем, что пигмент представляет собой флавин, (металло)порфирин, (металло)хлорофилл, (металло)бактериохлорофилл или производное этих пигментов.
12. 12. Олигомер нуклеиновой кислоты по одному из пп.1-7, отличающийся тем, что, по меньшей мере, одна из электронодонорных молекул и электроноакцепторных молекул представляет собой никотинамид или хинон.
13. 13. Олигомер нуклеиновой кислоты по п.12, отличающийся тем, что хинон представляет собой пирролхинолинхинон (Р00), 1,2-бензохинон, 1,4-бензохинон, 1,2-нафтохинон, 1,4нафтохинон, 9,10-антрахинон или одно из их производных.
14. 14. Олигомер нуклеиновой кислоты по одному из пп.1-7, отличающийся тем, что, по меньшей мере, одна из электронодонорных молекул и электроноакцепторных молекул является комплексом с переносом заряда.
15. 15. Олигомер нуклеиновой кислоты по п.14, отличающийся тем, что комплекс с переносом заряда представляет собой комплекс, содержащий переходный металл.
16. 16. Олигомер нуклеиновой кислоты по п.15, отличающийся тем, что комплекс с переносом заряда представляет собой комплекс, содержащий Ки(П), Сг(111), Ее(П), ОЦП) или Со(11).
17. 17. Олигомер нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-16, отличающийся тем, что этот модифицированный олигомер нуклеиновой кислоты может последовательность-специфично связывать одноцепочечную ДНК, РНК и/или ПНК.
18. 18. Олигомер нуклеиновой кислоты по п.17, отличающийся тем, что модифицированный олигомер нуклеиновой кислоты представляет собой олигомер дезоксирибонуклеиновой кислоты, олигомер рибонуклеиновой кислоты или олигомер пептидной нуклеиновой кислоты.
19. 19. Олигомер нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-18, отличающийся тем, что группировка, обладающая окислительно-восстановительной активностью, ковалентно связана с одной из фосфорнокислых групп, одной из карбоксильных групп, одной из аминогрупп или с сахаром олигомерного скелета нуклеиновой кислоты.
20. 20. Олигомер нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-19, отличающийся тем, что группировка, обладающая окислительно-восстановительной активностью, ковалентно связана с гидроксигруппой сахарного остатка олигомерного скелета нуклеиновой кислоты.
21. 21. Олигомер нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-18, отличающийся тем, что группировка, обладающая окислительно-восстановительной активностью, ковалентно связана с тиольной группой, гидроксильной группой, карбоксильной группой или аминогруппой модифицированного основания олигомера нуклеиновой кислоты.
22. 22. Олигомер нуклеиновой кислоты по п.21, отличающийся тем, что тиольная, гидроксильная, карбоксильная или аминогруппа основания ковалентно связана с основанием через разветвленную или линейную молекулярную группировку любого состава и длины цепи, при этом наиболее коротким непрерывным звеном между тиольной, гидроксильной, карбоксильной или аминогруппой и основанием является раз ветвленная или линейная молекулярная группировка, имеющая длину цепи 1-20 атомов.
23. 23. Олигомер нуклеиновой кислоты по п.22, отличающийся тем, что наиболее коротким непрерывным звеном между тиольной, гидроксильной, карбоксильной или аминогруппой и основанием является разветвленная или линейная молекулярная группировка, имеющая длину цепи из 1-14 атомов.
24. 24. Олигомер нуклеиновой кислоты по любому из пп.19-22, отличающийся тем, что группировка, обладающая окислительно-восстановительной активностью, связана с концом олигомерного скелета нуклеиновой кислоты или с концевым модифицированным основанием.
25. 25. Олигомер нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-24, отличающийся тем, что группировка, обладающая окислительно-восстановительной активностью, представляет собой фотоиндуцибельную группировку.
26. 26. Олигомер нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-24, отличающийся тем, что группировка, обладающая окислительно-восстановительной активностью, представляет собой химически индуцибельную группировку.
27. 27. Способ получения модифицированного олигомера нуклеиновой кислоты, охарактеризованного в любом из пп.1-26, отличающийся тем, что группировку, обладающую окислительновосстановительной активностью, ковалентно присоединяют к олигомеру нуклеиновой кислоты посредством одного или нескольких аминирований амино- или кислотной группами группировки, обладающей окислительно-восстановительной активностью, посредством этерификации спиртовой или кислотной группами группировки, обладающей окислительно-восстановительной активностью, посредством образования тиоэфира тиоспиртовой или кислотной группами группировки, обладающей окислительно-восстановительной активностью, или посредством конденсации одной или нескольких аминогрупп олигомера нуклеиновой кислоты с альдегидными группами группировки, обладающей окислительно-восстановительной активностью, и последующего восстановления результирующей двойной связи углерод-азот.
28. 28. Способ по п.27, отличающийся тем, что группировку, обладающую окислительновосстановительной активностью, присоединяют к олигомеру нуклеиновой кислоты путем ковалентного присоединения, по меньшей мере, одной электронодонорной молекулы.
29. 29. Способ по п.27, отличающийся тем, что группировку, обладающую окислительновосстановительной активностью, присоединяют к олигомеру нуклеиновой кислоты путем ковалентного присоединения, по меньшей мере, одной электроноакцепторной молекулы.
30. 30. Способ по п.27, отличающийся тем, что группировку, обладающую окислительно-восстановительной активностью, присоединяют к олигомеру нуклеиновой кислоты путем ковалентного присоединения, по меньшей мере, одной макромолекулы или путем ковалентного присоединения, по меньшей мере, одного белка.
31. 31. Способ по любому из пп.28-30, отличающийся тем, что присоединение группировки, обладающей окислительно-восстановительной активностью, завершают путем добавления, по меньшей мере, одного компонента, выбранного из группы, состоящей из электроноакцепторных молекул, электронодонорных молекул, макромолекул и белков.
32. 32. Способ по одному из пп.27-31, отличающийся тем, что, по меньшей мере, одну разветвленную или линейную молекулярную группировку любого состава и длины цепи ковалентно присоединяют к группировке, обладающей окислительно-восстановительной активностью, и эта разветвленная или линейная молекулярная группировка имеет реакционноспособную амино-, гидроксильную, тиольную, кислотную или альдегидную группу для ковалентного присоединения к олигомеру нуклеиновой кислоты.
33. 33. Способ по п.32, отличающийся тем, что наиболее коротким непрерывным звеном между олигомером нуклеиновой кислоты и группировкой, обладающей окислительно-восстановительной активностью, является разветвленная или линейная молекулярная группировка, имеющая длину цепи из 1-20 атомов.
34. 34. Способ по п.33, отличающийся тем, что наиболее коротким непрерывным звеном между олигомером нуклеиновой кислоты и группировкой, обладающей окислительно-восстановительной активностью, является разветвленная или линейная молекулярная группировка, имеющая длину цепи из 1-14 атомов.
35. 35. Модифицированная проводящая поверхность, отличающаяся тем, что с проводящей поверхностью связан, по меньшей мере, один тип модифицированного олигомера нуклеиновой кислоты, охарактеризованный в одном из пп.1-26.
36. 36. Модифицированная проводящая поверхность по п.35, отличающаяся тем, что эта поверхность состоит из металла или металлического сплава.
37. 37. Модифицированная проводящая поверхность по п.36, отличающаяся тем, что эта поверхность состоит из металла, выбранного из группы, включающей платину, палладий, золото, кадмий, ртуть, никель, цинк, серебро, медь, железо, свинец, алюминий и марганец.
38. 38. Модифицированная проводящая поверхность по п.35, отличающаяся тем, что эта поверхность состоит из полупроводника.
39. 39. Модифицированная проводящая поверхность по п.38, отличающаяся тем, что эта поверхность состоит из полупроводника, выбранного из группы, включающей углерод, кремний, германий и олово.
40. 40. Модифицированная проводящая поверхность по п.35, отличающаяся тем, что эта поверхность состоит из двойного соединения элементов групп 14 и 16, двойного соединения элементов групп 13 и 15, двойного соединения элементов групп 15 и 16 или двойного соединения элементов групп 11 и 17.
41. 41. Модифицированная проводящая поверхность по п.35, отличающаяся тем, что эта поверхность состоит из тройного соединения элементов групп 11, 13 и 16 или тройного соединения элементов групп 12, 13 и 16.
42. 42. Модифицированная проводящая поверхность по пп.35-41, отличающаяся тем, что присоединение модифицированных олигомеров нуклеиновой кислоты к проводящей поверхности происходит ковалентно или посредством химической или физической сорбции.
43. 43. Модифицированная проводящая поверхность по пп.35-42, отличающаяся тем, что одна из фосфорнокислых, карбоксильных или аминогрупп или сахарная группа олигомерного скелета нуклеиновой кислоты связана с проводящей поверхностью ковалентно или посредством химической или физической сорбции.
44. 44. Модифицированная проводящая поверхность по п.43, отличающаяся тем, что гидроксильная группа сахарного остатка олигомерного скелета нуклеиновой кислоты связана с проводящей поверхностью ковалентно или посредством химической или физической сорбции.
45. 45. Модифицированная проводящая поверхность по пп.35-42, отличающаяся тем, что тиольная, гидроксильная, карбоксильная или аминогруппа модифицированного основания олигомера нуклеиновой кислоты связана с проводящей поверхностью ковалентно или посредством химической или физической сорбции.
46. 46. Модифицированная проводящая поверхность по пп.43-45, отличающаяся тем, что модифицированный олигомер нуклеиновой кислоты связан с проводящей поверхностью через группу на конце олигомерного скелета нуклеиновой кислоты или через группу концевого, модифицированного основания.
47. 47. Модифицированная проводящая поверхность по пп.35-46, отличающаяся тем, что разветвленная или линейная молекулярная группировка любого состава и длины цепи связана с проводящей поверхностью ковалентно или посредством химической или физической сорбции, и модифицированные олигомеры нуклеиновой кислоты ковалентно связаны с этими молекулярными группировками.
48. 48. Модифицированная проводящая поверхность по п.47, отличающаяся тем, что наиболее коротким непрерывным звеном между проводящей поверхностью и олигомером нуклеиновой кислоты является разветвленная или линейная молекулярная группировка, имеющая длину цепи из 1-20 атомов.
49. 49. Модифицированная проводящая поверхность по п.48, отличающаяся тем, что наиболее коротким непрерывным звеном между проводящей поверхностью и олигомером нуклеиновой кислоты является разветвленная или линейная молекулярная группировка, имеющая длину цепи из 1-12 атомов.
50. 50. Модифицированная проводящая поверхность по пп.47-49, отличающаяся тем, что разветвленная или линейная молекулярная группировка связана с фосфорнокислой группой, карбоксильной группой, аминогруппой или сахарной группой олигомерного скелета нуклеиновой кислоты или тиольной, гидроксильнои, карбоксильной или аминогруппой модифицированного основания олигомера нуклеиновой кислоты.
51. 51. Модифицированная проводящая поверхность по п.50, отличающаяся тем, что разветвленная или линейная молекулярная группировка связана с гидроксигруппой сахарного остатка олигомерного скелета нуклеиновой кислоты.
52. 52. Модифицированная проводящая поверхность по п.50 или 51, отличающаяся тем, что разветвленная или линейная молекулярная группировка связана с фосфорнокислой группой, гидроксигруппой сахарного остатка, карбоксильной или аминогруппой на конце олигомерного скелета нуклеиновой кислоты или с тиольной, гидроксильной, карбоксильной или аминогруппой концевого, модифицированного основания.
53. 53. Модифицированная проводящая поверхность по пп.35-52, отличающаяся тем, что преимущественно один тип модифицированного олигомера нуклеиновой кислоты связан с пространственно ограниченной областью проводящей поверхности.
54. 54. Модифицированная проводящая поверхность по п.53, отличающаяся тем, что только один тип модифицированного олигомера нуклеиновой кислоты связан с пространственно ограниченной областью проводящей поверхности.
55. 55. Способ получения модифицированной проводящей поверхности, охарактеризованной в пп.35-54, отличающийся тем, что, по меньшей мере, один тип модифицированного олигомера нуклеиновой кислоты присоединяют к проводящей поверхности посредством инкубации проводящей поверхности в растворе олигомера нуклеиновой кислоты в течение времени, необходимого для осуществления реакции между реактивными группами на этой поверхности с реактивными группами олигомеров нуклеиновой кислоты.
56. 56. Способ получения модифицированной проводящей поверхности, охарактеризованной в пп.35-54, отличающийся тем, что, по меньшей мере, один тип олигомера нуклеиновой кислоты присоединяют к проводящей поверхности и мо дификацию олигомеров нуклеиновой кислоты впоследствии осуществляют с помощью способа по пп.27-34.
57. 57. Способ по п.55 или 56, отличающийся тем, что олигомеры нуклеиновой кислоты или модифицированные олигомеры нуклеиновой кислоты гибридизуют с соответствующей комплементарной цепью олигомера нуклеиновой кислоты и присоединяют к проводящей поверхности в виде двухцепочечного гибрида.
58. 58. Способ по п.55 или 56, отличающийся тем, что олигомер нуклеиновой кислоты или модифицированный олигомер нуклеиновой кислоты присоединяют к проводящей поверхности в присутствии дополнительных химических соединений, которые также присоединяют к проводящей поверхности.
59. 59. Способ электрохимического определения событий гибридизации олигомера, отличающийся тем, что, по меньшей мере, одну модифицированную проводящую поверхность, охарактеризованную в пп.35-54, приводят в контакт с олигомерами нуклеиновой кислоты и затем определяют электрическое связывание между группировкой, обладающей окислительно-восстановительной активностью, и проводящей поверхностью.
60. 60. Способ по п.59, отличающийся тем, что определение электрического связывания осуществляют посредством циклической вольтаметрии, амперометрии или измерения проводимости.
61. 61. Способ по п.59 или 60, отличающийся тем, что электрохимическое определение инициируют фотоиндуцированным разделением заряда в фотоиндуцибельной группировке, обладающей окислительно-восстановительной активностью, присоединенной к проводящей поверхности через олигомер нуклеиновой кислоты.
62. 62. Способ по п.61, отличающийся тем, что облучение светом для фотоиндуцированного разделения заряда в фотоиндуцибельной группировке, обладающей окислительновосстановительной активностью, присоединенной к проводящей поверхности через олигомер нуклеиновой кислоты, ограничивают областью проводящей поверхности, имеющей, по меньшей мере, один тип модифицированного олигомера нуклеиновой кислоты.
63. 63. Способ по п.61 или 62, отличающийся тем, что окисленную в результате облучения светом с определенной или любой данной длиной волны электронодонорную молекулу фотоиндуцибельной группировки, обладающей окислительно-восстановительной активностью, снова восстанавливают подходящим свободным веществом, обладающим окислительновосстановительной активностью, которое не связано, но находится в контакте с олигомером нуклеиновой кислоты, то есть, возвращают в то состояние, которое было исходным до облучения светом.
64. 64. Способ по п.61 или 62, отличающийся тем, что восстановленную в результате облучения светом с определенной или любой данной длиной волны электроноакцепторную молекулу фотоиндуцибельной группировки, обладающей окислительно-восстановительной активностью, снова окисляют подходящим свободным веществом, обладающим окислительно-восстановительной активностью, которое не связано, но находится в контакте с олигомером нуклеиновой кислоты, то есть возвращают в то состояние, которое было исходным до облучения светом.
65. 65. Способ по п.59 или 60, отличающийся тем, что при электрохимическом определении используют свободное вещество, обладающее окислительно-восстановительной активностью, которое осуществляет перенос теплового заряда на группировку, обладающую окислительновосстановительной активностью.
66. 66. Способ по п.64 или 65, отличающийся тем, что свободное вещество, обладающее окислительно-восстановительной активностью, которое не связано, но находится в контакте с олигомером нуклеиновой кислоты, способно избирательно окисляться или восстанавливаться при потенциале φ, где φ удовлетворяет условию 2,0 ν>φ>> -2,0 V, измеряемом относительно стандартного водородного электрода.
67. 67. Способ по пп.63-66, отличающийся тем, что свободное вещество, обладающее окислительно-восстановительной активностью, которое не связано, но находится в контакте с олигомером нуклеиновой кислоты, представляет собой свободный хинон, свободный гексацианоферратный(П) комплекс, свободный аскорбат натрия, свободный Ки(П)-гексаминовый комплекс или свободный белок, обладающий окислительно-восстановительной активностью.
68. 68. Способ по п.67, отличающийся тем, что свободное вещество, обладающее окислительно-восстановительной активностью, которое не связано, но находится в контакте с олигомером нуклеиновой кислоты, представляет собой свободный цитохром.