JP4291407B2 - フェリチン配置方法および無機粒子配置方法 - Google Patents
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Description
本発明はタンパク質を利用して基板上に微粒子を配置する方法に関する。
フェリチンは球状のタンパク質であり、内部には酸化鉄に代表される金属化合物を内包している。内部に金属化合物を内包せず、当該内部が空洞になっている場合には、「アポフェリチン」と呼ばれる。
特許文献１および２には、フェリチンを基板上に配置させる第１の従来技術として、基板表面の一部にアミノシラン分子修飾膜を形成し、フェリチン溶液に接触させることにより、アミノシラン分子修飾膜上に複数個のフェリチンを配置させることが開示されている。
非特許文献１および２には、第２の従来技術として、アミノシランからなる微小な分子膜スポットを基板表面の一部に形成し、次いでこの基板とフェリチン溶液とを接触させることにより、１個の、すなわち、単一のフェリチン分子を各分子膜スポットに配置することが開示されている。非特許文献１および２によれば、基板上で単一のフェリチン分子を配置する位置を自由に設定できる。
特許文献３には、第３の従来技術として、フェリチン外側表面のアミノ酸を部分的に置換することによって、基板上にフェリチンを規則正しく配列させる手法が開示されている。この特許文献３によれば、外側表面の特定部位のアミノ酸を正または負に帯電したアミノ酸に置換する。
特許文献４には、第４の従来技術として、アポフェリチンの内側表面のアミノ酸を部分的に置換することにより、金に代表される貴金属をアポフェリチン内包させることが開示されている。
特開２００６−１８７８４４号公報
特開２００６−１８７８４５号公報
国際公開第２００３／０４００２５号公報パンフレット
特開２００３−０３３１９１号公報
Kumagai et al., Jpn. J. Appl. Phys. 45 (2006) 8311
Kumagai et al., Appl. Phys. Lett. 88 (2006) 153103
特許文献１、２、および４には、単独のフェリチンを基板上に位置決めして配置する技術は開示されていない。
これに対して、非特許文献１および２に開示されている技術によれば、単独のフェリチンを基板上に位置決めして配置することができる。さらに特許文献３に開示されている技術では、フェリチン外側表面のアミノ酸を正または負に帯電したアミノ酸に置換している。
よって、特許文献３と、非特許文献１および２とを組み合わせれば、以下のような技術が導出される。すなわち、正に帯電しているアミノシランからなる微小な分子膜スポットを基板表面の一部に形成し、次いでこの基板と外側表面のアミノ酸を負に帯電したアミノ酸に置換したフェリチンとを接触させる。これにより、単一のフェリチン分子を各分子膜スポットに配置することができる。
しかし、本発明者らの検討によると、単独のフェリチンを基板上に位置決めして配置する際には、下記の２つの課題があることが判明した。
第１の課題は、フェリチンを位置決めして配置する再現性が低いことである。フェリチンを配置するために設けた分子膜スポットの総数に対する、単独のフェリチン分子が実際に配置されている分子膜スポットの割合を「単一配置率」とすると、従来技術の単一配置率は６０〜７０％程度にすぎない。
第２の課題は、フェリチンを配置するための分子膜スポットとして、直径３０ｎｍ未満の微小なスポットを形成する必要があることである。３０ｎｍ以下のスポットを形成することは、通常のフォトリソグラフィーでは困難である。そのため、電子ビーム露光装置に代表される高価かつ生産性が低い装置を使用する必要がある。
理論的には、図１２（ａ）に示すように、分子膜スポットの直径Ａとフェリチンの外径Ｂとを同一にすれば、１カ所の分子膜スポットには１個のフェリチンが配置される。しかし、フェリチンの外径は約１２〜１３ｎｍであり、この直径を有する分子膜スポットを形成することは困難である。なぜなら、分子膜スポットがあまりにも小さすぎるからである。特にこの直径を有する分子膜スポットをフォトリソグラフィーにより形成することは不可能であろう。
このため、現実的には、分子膜スポットの直径Ａをフェリチンの外径Ｂよりも大きくする。しかし、これでは、図１２（ｂ）に示すように、１カ所の分子膜スポットに２個以上のフェリチンが配置されてしまう。
さらに、本発明者らが研究を続けた結果、次のような事実も見出された。すなわち、フェリチンの外側表面に存在するアミノ酸を、できるだけ多くマイナスの電荷を有するアミノ酸に置換した方が、分子膜スポットに対する電気的引力の観点、およびフェリチン同士の斥力の観点から望ましい傾向が存在すると考えられる。
しかし、実際に実験した結果、後述する実施例および比較例からも理解されるように、このような傾向は存在しない上、アミノ酸の置換数が同じであっても、置換されている場所によって単一配置率は全く異なることが見出された。
上記課題を解決する本発明に係るフェリチン配置方法は、複数の分子膜スポットを備えた基板にフェリチンを配置する方法であって、
前記フェリチンは、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質サブユニットにより構成された改変体フェリチンであって、
前記分子膜スポットは表面にアミノ基を有し、
前記分子膜スポット１カ所の面積は２１００ｎｍ２以下であり、
前記方法は、
前記フェリチンを含有する溶液を前記基板に接触させることにより、前記各分子膜スポットに１個の前記フェリチンを配置させる配置工程を有する。
前記フェリチンは、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質サブユニットにより構成された改変体フェリチンであって、
前記分子膜スポットは表面にアミノ基を有し、
前記分子膜スポット１カ所の面積は２１００ｎｍ２以下であり、
前記方法は、
前記フェリチンを含有する溶液を前記基板に接触させることにより、前記各分子膜スポットに１個の前記フェリチンを配置させる配置工程を有する。
上記課題を解決する本発明に係る無機粒子の配置方法は、無機粒子を基板上に配置する方法であって、
前記方法は、
フェリチンを含有する溶液を、複数の分子膜スポットを備えた前記基板に接触させることにより、前記分子膜スポット１カ所に対して１個の前記フェリチンを配置させる配置工程と、
前記基板を加熱することによって、前記フェリチンを分解する分解工程と
を有し、
ここで、
前記フェリチンは、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質サブユニットにより構成された改変体フェリチンであって、
前記分子膜スポットは、表面にアミノ基を有しており、
前記分子膜スポット１カ所の面積は２１００ｎｍ２以下である。
前記方法は、
フェリチンを含有する溶液を、複数の分子膜スポットを備えた前記基板に接触させることにより、前記分子膜スポット１カ所に対して１個の前記フェリチンを配置させる配置工程と、
前記基板を加熱することによって、前記フェリチンを分解する分解工程と
を有し、
ここで、
前記フェリチンは、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質サブユニットにより構成された改変体フェリチンであって、
前記分子膜スポットは、表面にアミノ基を有しており、
前記分子膜スポット１カ所の面積は２１００ｎｍ２以下である。
前記改変体フェリチンは、鉄酸化物粒子を内包することが好ましい。
前記分子膜スポットは、アミノシラン分子膜からなることが好ましい。
前記基板はシリコン基板であり、前記基板表面の前記分子膜を除く領域にシリコン酸化膜を備えることが好ましい。
前記分子膜スポット１カ所の面積は３８０ｎｍ２以上であることが好ましい。
前記配置工程の前に、前記分子膜スポットをフォトリソグラフィーにより形成する分子膜スポット形成工程をさらに有することが好ましい。
本発明の上記目的、他の目的、特徴および利点は、添付図面参照の下、以下の好適な実施態様の詳細な説明から明らかにされる。
本発明によれば、単一配置率が高いフェリチンの配置方法および無機粒子の配置方法が提供される。
本発明で用いる改変体フェリチンは、配列番号１のアミノ酸配列からなる２４個のタンパク質サブユニットにより構成されている。この改変体フェリチン１０１の模式図を、図１に示す。配列番号１は、Ｌ鎖ウマ由来フェリチンを構成するアミノ酸配列を基礎にして構成されているが、配列番号１における９１番目のグルタミン酸は、元の配列におけるリシンから改変されたものである。図１の改変異置１０２は、各サブユニットにおける９１番目のグルタミン酸の位置を示している。
後述する実施例では、本発明において用いられるフェリチンは、「Fer8-98glu」と記述される。アポフェリチンである場合には、それは「apoFer8-98glu」と記述される。
本明細書においては、名称番号（「Fer8-98glu」における「98」）と改変異置（91番目）は、７だけ番号がずれる。これは、命名の基準としている配列が、天然のDNA配列から翻訳されたアミノ酸配列（ここでは「Fer0」の配列と記述する）であり、この明細書で基本としているFer8の配列（Fer0の配列から２〜８番目の７アミノ酸を除去したもの、配列番号３）ではないためである。ちなみに、天然のＬ鎖ウマ由来フェリチンは、Fer0でもFer8でもなく、１〜８番目の８アミノ酸が除去されたフェリチンである。一般的なフェリチンはこのアミノ酸配列を有さない。また、後述する比較例からも理解されるように、外側表面に存在するけれども９１番目ではないアミノ酸を置換しても、配列番号１以外のアミノ酸配列では、本発明の効果は得られない。
なお、フェリチンの外側表面に存在するアミノ酸としては、９１番目以外に、１５２番目、１５０番目、９８番目などを挙げることができる（例えば、プロテインデータバンク（ＰＤＢ）のＰＤＢ ＩＤ ｃｏｄｅ：１ＤＡＴに登録される立体構造を参照）。この中でも、上述したように、本発明においては、９１番目のアミノ酸をグルタミン酸で置換する。
本発明の改変体フェリチンは、内部に鉄酸化物粒子をコアとして内包することができる。鉄酸化物粒子は、基板上配置の後に、基板をエッチングしてナノピラー構造を形成するためのマスクとして利用したり、カーボンナノチューブを成長させるための触媒として利用したり、あるいはまた還元して導電性ナノ粒子を形成する用途に供することができる。
基板としては、シリコン基板を用いることができる。シリコン基板表面を熱酸化することにより、下地となる高品質のシリコン酸化膜を形成できる。
基板表面は、分子膜が形成されている領域を除き、負に帯電していることが望ましい。特にシリコン酸化膜表面であることにより、水溶液中で安定して大きな表面負電荷密度を有するので好ましい。
本発明のアミノ基を有する分子膜としては、アミノシラン分子を用いることにより、ＳｉＯ２表面に均質で微細な薄膜スポットを形成することができるので好ましい。アミノシラン分子としては、例えば３−アミノプロピルトリエトキシシラン（以下、「ＡＰＴＥＳ」と略することがある）を用いることができる。
フェリチン配置の後、基板を加熱してタンパク質を分解する分解工程により、フェリチン外部のタンパク質部分と分子膜を同時に除去しつつ、内部の無機粒子を配置された状態で基板上に残すことができる。
（実施の形態１）
以下、本発明の実施の形態をさらに詳細に説明する。
以下、本発明の実施の形態をさらに詳細に説明する。
この実施の形態１では、組み換えアポフェリチンの合成、抽出、精製、ならびに内部への鉄酸化物の導入およびその後の精製について述べる。特に、外側表面に存在するアミノ酸をグルタミン酸に置換したところ、内部へ鉄酸化物が導入可能かどうかについて検証する。結論から言えば、外側表面に存在する１５２番目のアミノ酸をグルタミン酸に置換すると、内部へ鉄酸化物が導入されなくなってしまう。
（apoFer8の合成）
まず、apoFer8を、下記の手順により合成および精製した。
まず、apoFer8を、下記の手順により合成および精製した。
組み換えアポフェリチンの作製には、以下に説明するように、公知の遺伝子組み換え技術およびタンパク質の発現方法を用いる。まず、Takedaらにより作製され、ウマ肝臓由来のアポフェリチンのＤＮＡが組み込まれたプラスミドTakeda99224（S.TakedaらBiochim.Biophys.Acta.,1174,218-220,1993参照)から、適当な制限酵素を用いてアポフェリチンのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片を切り出した。次に、このＤＮＡ断片をタンパク質発現用のベクタープラスミドであるpMK-2に挿入してアポフェリチン発現用のプラスミドを作製した。
続いて、このアポフェリチン発現用のプラスミドを鋳型とし、所望の変異を組み込んだ１本鎖ＤＮＡの断片をプライマーとしてＰＣＲ（polymerase chainreaction）を行ない、アポフェリチンのアミノ酸をコードするＤＮＡの目的の位置に部位特異的に所望の変異を導入した。こうしてアポフェリチンの２〜８番目までのアミノ酸をコードする部分のＤＮＡを欠失させた変異アポフェリチン遺伝子のＤＮＡの断片を含むプラスミドを作製した。このアポフェリチン遺伝子のＤＮＡ断片は、必要な場合には切り出し、別のベクタープラスミドに組み込んでもよい。
続いて、作製されたプラスミドを市販の大腸菌（E.coliの１種、Nova Blue）に導入し、形質転換を行なった後、この大腸菌をジャーファーメンター（大量培養装置）を用いて３７℃にて大量培養した。なお、形質転換された大腸菌はアンピシリンに耐性を持つため、これを指標として形質転換されていない大腸菌と区別し、選択することができる。この大腸菌内では、プラスミドに組み込まれた組み換えアポフェリチンのＤＮＡが発現し、２〜８番目までのアミノ酸残基が欠失したアポフェリチンが大量に生産された。この改変体アポフェリチンを、以下apoFer8と表記する。apoFer8のアミノ酸配列を、配列番号３に示す。またapoFer8にコアを導入したものを、Fer8と表記する。apoFer8は、後述する手順により大腸菌の菌体内から抽出および精製した。
（apoFer8-98glu、apoFer8-159glu、apoFer8-157glu、apoFer8-98glu105glu の合成）
次に、apoFer8-98gluを作製するために、先の操作で得られた，apoFer8のアミノ酸配列（配列番号３）をコードするＤＮＡが組み込まれたプラスミドを鋳型とし、配列番号３中の９１番目のリシン(Lys)をグルタミン酸(Glu)に置き換えたオリゴＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲを行なった。
次に、apoFer8-98gluを作製するために、先の操作で得られた，apoFer8のアミノ酸配列（配列番号３）をコードするＤＮＡが組み込まれたプラスミドを鋳型とし、配列番号３中の９１番目のリシン(Lys)をグルタミン酸(Glu)に置き換えたオリゴＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲを行なった。
この結果、配列番号２の配列を有するＤＮＡが得られた。このＤＮＡ配列は、apoFer8-98gluのアミノ酸配列（配列番号１）をコードしている。
次に、apoFer8の作製と同様の操作により、上記ＤＮＡを挿入したプラスミドを作製し、これを大腸菌（Nova Blue）に導入し、形質転換する。形質転換した大腸菌を大量培養した後、後述する手順により大腸菌の菌体内からapoFer8-98gluを抽出および精製した。
以下、同様の手順により、配列番号３中の１５２番目のグルタミン(Gln)をグルタミン酸(Glu)に置き換えた、配列番号４のアミノ酸配列を有するapoFer8-159gluを得た。
配列番号３中の１５０番目のグリシン(Gly)をグルタミン酸(Glu)に置き換えた、配列番号５のアミノ酸配列を有するapoFer8-157gluを得た。
配列番号３中の９１番目と９８番目のリシン(Lys)をいずれもグルタミン酸(Glu)に置き換えた、配列番号６のアミノ酸配列を有するapoFer8-98glu105gluを得た。
なお、本発明において、改質されたアポフェリチンをコードするＤＮＡが一旦得られれば、公知の技術によりこのＤＮＡを増幅することができる。従って、組み換えアポフェリチンを量産する場合には、再度遺伝子の組み替え工程を行なう必要はない。
（変異アポフェリチンの抽出と精製）
変異アポフェリチンの抽出および精製手順は以下の通りである。まず、培養終了後の大腸菌の培養液を遠心チューブに移して遠心分離器内にセットし、４℃、１０，０００回転／分、２５分間の条件で遠心分離し、大腸菌の菌体を沈殿させる。次に、沈殿した菌体を集めた後、液中で超音波破砕器を用いて菌体を破砕してアポフェリチンを液中に溶出させた。
変異アポフェリチンの抽出および精製手順は以下の通りである。まず、培養終了後の大腸菌の培養液を遠心チューブに移して遠心分離器内にセットし、４℃、１０，０００回転／分、２５分間の条件で遠心分離し、大腸菌の菌体を沈殿させる。次に、沈殿した菌体を集めた後、液中で超音波破砕器を用いて菌体を破砕してアポフェリチンを液中に溶出させた。
次いで、菌体を破砕した液を遠心チューブに移して遠心分離器内にセットし、４℃、１０，０００回転／分、２５分間の条件で遠心分離し、破砕されずに残った菌体を沈殿させた。
さらに、遠心チューブから上清（上澄み液）を採取し、この液を６０℃、１５分間熱処理した後遠心チューブに移し、４℃、１０，０００回転／分、２５分間の条件で遠心分離した。
さらに、遠心チューブから上清（上澄み液）を採取し、この液を６０℃、１５分間熱処理した後遠心チューブに移し、４℃、１０，０００回転／分、２５分間の条件で遠心分離した。
この操作により不要なタンパク質が変性してチューブの底部に沈殿した。続いて、遠心チューブから上清を採取した後、２５℃下、Q-sepharose HP（陰イオン交換カラム）を用いたカラムクロマトグラフィを行ない、上清中に含まれるアポフェリチン画分を採取した。このアポフェリチン画分をさらに２５℃下、Sephacryl S-300（ゲルろ過カラム）に流してカラムクロマトグラフィを行なうことにより精製した。この操作により、不純物が除かれ、精製された組み換えアポフェリチンが得られた。
（鉄酸化物コアの導入）
次に、アポフェリチンへ鉄酸化物（ferrihydrite）コアを導入するための操作を以下で説明する。
次に、アポフェリチンへ鉄酸化物（ferrihydrite）コアを導入するための操作を以下で説明する。
まず、ＨＥＰＥＳ緩衝液、アポフェリチン溶液、硫酸アンモニウム鉄（Ｆｅ（ＮＨ4）2（ＳＯ4）2）溶液の順に各溶液を混合してフェリチン溶液を作製した。このフェリチン溶液中では、それぞれの最終濃度が、ＨＥＰＥＳ緩衝液は２５０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ７．０）に、アポフェリチンは０．５ｍｇ／ｍＬに、硫酸アンモニウム鉄は５ｍｍｏｌ／Ｌとした。尚、フェリチンを調製するための操作は、すべて４℃にて行なった。
次に、鉄イオンのアポフェリチン内部への取り込み反応および取り込まれた鉄の酸化反応を完了させるため、フェリチン溶液をそのまま一晩放置した。この操作により、アポフェリチンの保持部に均一な大きさの酸化鉄が導入され、フェリチン（アポフェリチンと微粒子の複合体）が生成された。
次に、フェリチン溶液を容器に入れ、遠心分離機を用いて毎分１０，０００回転、１５―３０分の条件で遠心分離し、沈殿を除去した。続いて、沈殿を除去した後の上澄み液をさらに毎分１０，０００回転、３０分の条件で遠心分離した。
このとき、溶解可能なフェリチンは上澄み液中に分散し、凝集したフェリチンは集合体となって沈殿する。
apoFer8-98gluを用いて得られた、鉄酸化物コアの導入後のFer8-98glu溶液と、apoFer8-159gluを用いて得られた、鉄酸化物コアの導入後のFer8-159glu溶液については、溶液状態を写真撮影した。
（鉄酸化物コアを導入したフェリチンの精製）
次に、この上澄み液の溶媒を限外ろ過膜[アミコンウルトラ-15(NMWL:50,000)]を用いて濃縮し、この濃縮されたフェリチン画分をさらに２５℃下、５０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ緩衝液で平衡化されたSephacryl S-300（ゲルろ過カラム）に流してカラムクロマトグラフィを行なうことにより精製した。
次に、この上澄み液の溶媒を限外ろ過膜[アミコンウルトラ-15(NMWL:50,000)]を用いて濃縮し、この濃縮されたフェリチン画分をさらに２５℃下、５０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ緩衝液で平衡化されたSephacryl S-300（ゲルろ過カラム）に流してカラムクロマトグラフィを行なうことにより精製した。
これにより、ゲルろ過カラムによりフェリチン粒子の凝集体が除かれた、溶出液を得た。
結果は以下の実施例の通りである。
（実施例１）
apoFer8-98gluを用いて得られた、鉄酸化物コアの導入後のFer8-98glu溶液２０１を示す写真を図２の左側に示す。Fer8-98glu溶液２０１の下部には、少量のFer8-98gluの沈殿２０３が見られるが、Fer8-98gluの上澄み液２０２は可視光を吸収して濃い色（黄褐色）を呈している。この結果は、多くのフェリチンが、コア導入後も凝集せずに分散あるいは溶解したことを示している。鉄酸化物コアを導入したフェリチンの精製を行ったところ、溶出液にFer8-98gluが回収された。
apoFer8-98gluを用いて得られた、鉄酸化物コアの導入後のFer8-98glu溶液２０１を示す写真を図２の左側に示す。Fer8-98glu溶液２０１の下部には、少量のFer8-98gluの沈殿２０３が見られるが、Fer8-98gluの上澄み液２０２は可視光を吸収して濃い色（黄褐色）を呈している。この結果は、多くのフェリチンが、コア導入後も凝集せずに分散あるいは溶解したことを示している。鉄酸化物コアを導入したフェリチンの精製を行ったところ、溶出液にFer8-98gluが回収された。
（比較例１）
apoFer8-159gluを用いて得られた、鉄酸化物コアの導入後のFer8-159glu溶液２０４を示す写真を図２の右側に示す。
apoFer8-159gluを用いて得られた、鉄酸化物コアの導入後のFer8-159glu溶液２０４を示す写真を図２の右側に示す。
Fer8-159glu溶液２０４の下部には、Fer8-98gluの沈殿２０３に比較して、より多くのFer8-159gluの沈殿２０６が見られる。
また、Fer8-159gluの上澄み液２０５の液色は、Fer8-98gluの液色に比較して薄く、無色透明に近い。この結果は、ほとんど全てのFer8-159gluが、コア導入とともに凝集して沈殿し、溶解しなかったことを示している。
鉄酸化物コアを導入したフェリチンの精製を行ったところ、溶出液には、Fer8-159gluが回収されなかった。
基板上へのフェリチン配置を行うには、精製したフェリチンを回収して水溶液中に分散あるいは溶解させることが必要であるため、apoFer8-159gluは、基板上への配置に利用できない。
上記結果を、表１にまとめる。
表１において、○は精製後の溶出液中にフェリチンが回収されたことを示し、×は回収されなかったことを示す。
上記結果は、フェリチンの基板上配置に用いる上で、単に外側表面に相当するアミノ酸をグルタミン酸に置換すれば良い訳ではなく、置換位置によっては内部へのコア形成時に沈殿を生じてしまうことを示している。なお、Fer8、Fer8-157glu、Fer8-98glu105glu の各フェリチンについては、Fer8-98gluと同様、問題なくアポフェリチンへの鉄コア入れ、精製および回収ができた。
（実施の形態２）
この実施の形態２では、各組み換えフェリチンの単一配置率について検討する。結論から言えば、配列番号１により示されるFer8-98gluの単一配置率が、他の組み換えフェリチンの単一配置率よりも極めて高い。さらに他の組み換えフェリチンの単一配置率は、Fer8のそれよりも低い。
この実施の形態２では、各組み換えフェリチンの単一配置率について検討する。結論から言えば、配列番号１により示されるFer8-98gluの単一配置率が、他の組み換えフェリチンの単一配置率よりも極めて高い。さらに他の組み換えフェリチンの単一配置率は、Fer8のそれよりも低い。
まず、実施の形態１と同じ工程により、鉄酸化物コアの導入を行う。次に、下記の工程により鉄酸化物コアを導入したフェリチンの回収と精製を行い、さらに基板表面への分子膜スポット形成を行い、最後にフェリチン配置を行う。
（鉄酸化物コアを導入したフェリチンの回収と精製）
次に、この上澄み液の溶媒を限外ろ過膜[アミコンウルトラ-15(NMWL:50,000)]を用いて濃縮し、この濃縮されたフェリチン画分をさらに２５℃下、５０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ緩衝液で平衡化されたSephacryl S-300（ゲルろ過カラム）に流してカラムクロマトグラフィを行なうことにより精製した。ゲルろ過カラムによりフェリチン粒子の凝集体が除かれ、酸化鉄を内包した単体のフェリチンが得られた。
次に、この上澄み液の溶媒を限外ろ過膜[アミコンウルトラ-15(NMWL:50,000)]を用いて濃縮し、この濃縮されたフェリチン画分をさらに２５℃下、５０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ緩衝液で平衡化されたSephacryl S-300（ゲルろ過カラム）に流してカラムクロマトグラフィを行なうことにより精製した。ゲルろ過カラムによりフェリチン粒子の凝集体が除かれ、酸化鉄を内包した単体のフェリチンが得られた。
（基板表面への分子膜スポット形成）
基板表面への分子膜スポット形成について、図３を用いて説明する。
基板表面への分子膜スポット形成について、図３を用いて説明する。
まずp型シリコン基板３０１を酸化して表面に厚さ3nmのシリコン酸化膜３０２を形成した。
次に基板を純水洗浄した後、前記基板の温度を110℃に保持した状態で、10分間UV光／オゾンを照射し、前記基板の表面の洗浄および親水化処理を行った。
そして、親水化処理後の基板に電子ビームレジスト（日本ゼオン社製、ZEP520A）を塗布した。
また、電子線レジスト膜３０３aを塗布した基板に対して、電子ビーム描画露光装置（Elionix ELS-7500）を用いて電子線描画を行った。
描画においては、電子ビームの加速電圧を５０ｋＡ、ビーム電流量は２０ｐＡとし、基板上に、描画形状として(A)7.5nm角、(B)12.5nm角、(C)φ20nm円、(D)φ23nm円を描画した。
描画後、酢酸アミル（n-Amyl acetate）により現像することで、電子線レジストスポット（レジスト開口部）３０３ｂが形成された。（図３(a)）
各スポット開口部の底部にはシリコン酸化膜の親水性表面が現れた。ここで、作製した電子線レジストスポット３０３ｂの一部を走査型電子顕微鏡装置（ＳＥＭ）により観察し、その直径を測定した。
各スポット開口部の底部にはシリコン酸化膜の親水性表面が現れた。ここで、作製した電子線レジストスポット３０３ｂの一部を走査型電子顕微鏡装置（ＳＥＭ）により観察し、その直径を測定した。
描画形状(A)、(B)、(C)、(D)によりそれぞれ形成された、スポットＡ、スポットＢ、スポットＣ、スポットDの面積は、それぞれ380nm2、710nm2、1600nm2、2100nm2であった（いずれも円形、直径はそれぞれ22nm、30nm、45nm、52nm）。
密閉容器内に、上記基板と、アミノシラン分子である3-aminopropyltrimethoxysilane(APTES)を設置し、室温にて３時間から５時間の間密閉保持すると、基板表面がアミノシラン分子と反応し、アミノ基を有する分子膜スポット（分子膜修飾領域）３０４が形成した。（図３(b)）
脱水エタノールを用いて基板を洗浄し、40℃に保持したジメチルアセトアミド（dimethylacetamide)に5分間浸漬した後、さらに5分間超音波洗浄を行うことで、膜厚約10Åの微細な分子膜スポットを有する基板３０５を得た。（図３(c)）
上記において、分子膜スポット３０４は膜厚が薄く、サイズも小さいため、その形状を直接測定するには困難が伴い誤差も大きい。しかし、その形状は電子線レジストスポット３０３ｂの形状に対応しているので、電子線レジストスポット３０３ｂを測定することで、簡単かつ正確にそのサイズを評価できる。
脱水エタノールを用いて基板を洗浄し、40℃に保持したジメチルアセトアミド（dimethylacetamide)に5分間浸漬した後、さらに5分間超音波洗浄を行うことで、膜厚約10Åの微細な分子膜スポットを有する基板３０５を得た。（図３(c)）
上記において、分子膜スポット３０４は膜厚が薄く、サイズも小さいため、その形状を直接測定するには困難が伴い誤差も大きい。しかし、その形状は電子線レジストスポット３０３ｂの形状に対応しているので、電子線レジストスポット３０３ｂを測定することで、簡単かつ正確にそのサイズを評価できる。
ＰＴＡ（リンタングステン酸）溶液を用いて分子膜スポットを染色し、ＳＥＭ観察した際の分子膜スポットの直径と、レジストスポットの直径は、ＳＥＭ観察像の解像度の限界による測定誤差（２〜５ｎｍ）の範囲内で一致した。
なお、電子線レジストスポット３０３ｂの中で、ＳＥＭ観察時に電子ビームを照射した領域は表面状態が変化するが、それ以外の領域はＳＥＭ観察の影響を受けないので、以降のプロセスに利用できる。
（フェリチン配置）
前述の鉄酸化物コアを導入したフェリチンの回収と精製により作製したフェリチン３０６を、０．５ｍｇ/ｍＬ含むフェリチン溶液３０７の調整を行った。水溶液には、緩衝剤としてMES（2-(4-Morpholino)
ethanesulfonic acid）およびTris（2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol）をｐＨ７となるよう添加した。MESおよびTrisの濃度は同一とし、このとき溶液のpHは７であった。緩衝剤の濃度については後述するが、例えば「緩衝剤濃度を0.1mMとする」と記述する場合、溶液中のMESおよびTrisの濃度はいずれも0.1mMである。この際、必要に応じて、限外ろ過膜と超遠心分離装置を用いて溶液中フェリチンを濃縮し目的濃度の緩衝剤を含む溶液で希釈した。この濃縮および希釈の操作を５回ないし１０回繰り返すことで、緩衝剤の置換と濃度調整を行った。
前述の鉄酸化物コアを導入したフェリチンの回収と精製により作製したフェリチン３０６を、０．５ｍｇ/ｍＬ含むフェリチン溶液３０７の調整を行った。水溶液には、緩衝剤としてMES（2-(4-Morpholino)
ethanesulfonic acid）およびTris（2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol）をｐＨ７となるよう添加した。MESおよびTrisの濃度は同一とし、このとき溶液のpHは７であった。緩衝剤の濃度については後述するが、例えば「緩衝剤濃度を0.1mMとする」と記述する場合、溶液中のMESおよびTrisの濃度はいずれも0.1mMである。この際、必要に応じて、限外ろ過膜と超遠心分離装置を用いて溶液中フェリチンを濃縮し目的濃度の緩衝剤を含む溶液で希釈した。この濃縮および希釈の操作を５回ないし１０回繰り返すことで、緩衝剤の置換と濃度調整を行った。
前述の基板表面への分子膜スポット形成により作製した分子膜スポットを有する基板３０５に、上記のフェリチン溶液３０７を滴下し、室温にて１分間静置した。この際、溶液中のフェリチンの一部が、基板上の分子膜スポット上に吸着した（３０６ｂ）。
上記の後、基板を純水の流水中で５分間洗浄することにより、吸着していない余剰のフェリチン３０６ａを除去した。洗浄後の基板を乾燥し、１１０℃で３分間ベーキングして吸着したフェリチン３０６ｂを基板上に固定し、分子膜スポット３０４上にフェリチン微粒子が吸着固定された基板３０８を得た。上記の基板３０８の表面を、ＳＥＭにより観察した。
本実施の形態２においては、特に基板上への単一フェリチン配置の再現性を向上することを目的とし、スポットＡあるいはスポットＢを用い、緩衝剤濃度は0.1mMあるいは0.01 mMとして、最も単一配置の再現性の高い条件での比較を行った。
結果は以下の実施例および比較例に示す通りである。
（実施例２）
Fer8-98gluとスポットＢを用い、緩衝剤濃度を0.1 mMとしてフェリチン配置を行った。得られたフェリチンの単一配置の様子を示す写真を図４に示す。
Fer8-98gluとスポットＢを用い、緩衝剤濃度を0.1 mMとしてフェリチン配置を行った。得られたフェリチンの単一配置の様子を示す写真を図４に示す。
図４では、再現性の高い単一配置が確認でき、ほとんどの分子膜スポット上で単独のフェリチンが固定されている。なお、図４における単一率は、94％であった。
（比較例２）
Fer8とスポットＡを用い、緩衝剤濃度を0.01 mMとしてフェリチン配置を行った。得られたフェリチンの単一配置の様子を示す写真を図５に示す。
Fer8とスポットＡを用い、緩衝剤濃度を0.01 mMとしてフェリチン配置を行った。得られたフェリチンの単一配置の様子を示す写真を図５に示す。
図５では、配置の再現性は低く、一部のスポット上には単独配置があるものの、２個配置されたスポットおよびフェリチンが配置されていないスポットが、それぞれ複数ある。なお、図５における単一率は、63％であった。
なお、スポットＢ上では、緩衝剤濃度が0.1mMと0.01 mMのいずれの場合も多数のFer8が吸着し、単一配置は得られなかった。また、スポットＡ上で、緩衝剤濃度が0.1mMの場合も多数のFer8が吸着し、単一配置は得られなかった。
（比較例３）
Fer8-157gluとスポットＡを用い、緩衝剤濃度を0.01 mMとしてフェリチン配置を行った。得られたフェリチンの単一配置の様子を示す写真を図６に示す。
Fer8-157gluとスポットＡを用い、緩衝剤濃度を0.01 mMとしてフェリチン配置を行った。得られたフェリチンの単一配置の様子を示す写真を図６に示す。
図６でも、配置の再現性は低く、一部のスポット上には単独配置があるものの、２個配置されたスポットおよびフェリチンが配置されていないスポットが、それぞれ複数ある。なお、図６における単一率は、50％であった。
なお、スポットＢ上では、緩衝剤濃度が0.1mMと0.01 mMのいずれの場合も多数のFer8-157gluが吸着し、単一配置は得られなかった。また、スポットＡ上で、緩衝剤濃度が0.1mMの場合も多数のFer8-157gluが吸着し、単一配置は得られなかった。
（比較例４）
Fer8-98glu105gluとスポットＡを用い、緩衝剤濃度を0.01 mMとしてフェリチン配置を行った。得られたフェリチンの単一配置の様子を示す写真を図７に示す。
Fer8-98glu105gluとスポットＡを用い、緩衝剤濃度を0.01 mMとしてフェリチン配置を行った。得られたフェリチンの単一配置の様子を示す写真を図７に示す。
図７でも、配置の再現性は低く、一部のスポット上には単独配置があるものの、２個以上配置されたスポットおよびフェリチンが配置されていないスポットが、それぞれ複数ある。なお、図７における単一率は、38％であった。
なお、スポットＢ上では、緩衝剤濃度が0.1mMと0.01 mMのいずれの場合も多数のFer8-98glu105gluが吸着し、単一配置は得られなかった。また、スポットＡ上で、緩衝剤濃度が0.1mMの場合も多数のFer8-98glu105gluが吸着し、単一配置は得られなかった。
上記の結果から、各フェリチンを用いた際の単一配置率を計算した結果を、表２にまとめる。
ここで、単一配置率とは、フェリチンを配置するために設けた分子膜スポットの総数に対する、単独のフェリチン分子が実際に配置されている分子膜スポットの割合であり、数値が１００％に近い方が再現性が高いことを示す指標である。なお、用語「単一配置率」は、本明細書においては、「再現率」「再現性」と呼ばれることもある。
Fer8の結果は、第２の従来技術による配置の結果にほぼ対応している。これに対して、Fer8-98glu の再現性は各段に向上しており、９０％以上の配置位置で、単独のフェリチン分子の配置に成功している。一方、Fer8-157glu の再現性は、改変前のFer8に比較してもさらに低下している。
Fer8-98glu105gluは、Fer8-98gluに比較してさらに外側表面のグルタミン酸が増加しているにもかかわらず、やはり改変前のFer8よりも低い再現性を示している。
上記結果は、単純に、外側表面のアミノ酸をグルタミン酸に置換すること、あるいは外側に提示される負電荷量を増加させるだけで、単一配置の再現性が向上するわけではなく、特に配列番号１のアミノ酸配列が特異的な効果を有することを示している。
以上の結果からも理解されるように、フェリチンを基板上の目的の位置に高い再現性で１個ずつ配置するためには、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質サブユニットにより構成された改変体フェリチンを用いることが必要である。
（実施の形態３）
この実施の形態３では、分子膜スポットの大きさについて検討する。あまりにも大きすぎる、すなわち、表面積が大きすぎる分子膜スポットには、どのようなフェリチンを用いても、単一のフェリチンが配置されることはないからである。
この実施の形態３では、分子膜スポットの大きさについて検討する。あまりにも大きすぎる、すなわち、表面積が大きすぎる分子膜スポットには、どのようなフェリチンを用いても、単一のフェリチンが配置されることはないからである。
本実施の形態でも、実施の形態２と同様に、鉄酸化物コアの導入、鉄酸化物コアを導入したフェリチンの回収と精製、さらに基板表面への分子膜スポット形成を行って、最後にフェリチン配置を行う。
ただし、本実施の形態では、実施の形態２と異なり、より大面積の分子膜スポット上への単一フェリチン配置を目指し、スポットＣあるいはスポットＤを用い、各フェリチンにおける単一性を比較した（スポットの大きさについては実施の形態２を参照）。
いずれのフェリチンにおいても緩衝剤濃度を0.01 mM未満にしても吸着状態に変化は無く、逆に緩衝剤濃度を0.1 mM以上とすると吸着フェリチンの個数が増加して単一性は低下したので、緩衝剤濃度としては0.01 mMを用いた。
結果は以下の実施例および比較例に示す通りである。
（実施例３）
Fer8-98gluとスポットＣを用いて得られたフェリチンの単一配置の様子を示す写真を図８に示す。
Fer8-98gluとスポットＣを用いて得られたフェリチンの単一配置の様子を示す写真を図８に示す。
図８では、多くの分子膜スポット上で単独のフェリチンが固定されている。なお、図８における平均配置数は、1.0個である。
（実施例４）
Fer8-98gluとスポットＤを用いて得られたフェリチンの単一配置の様子を示す写真を図１３に示す。
Fer8-98gluとスポットＤを用いて得られたフェリチンの単一配置の様子を示す写真を図１３に示す。
図１３では、２個のフェリチンが配置された分子膜スポットもあるが、いくつかの分子膜スポット上では単独のフェリチンが固定されている。なお、図１３における平均配置数は、1.4個である。
（比較例５）
Fer8とスポットＣを用いて得られたフェリチンの単一配置の様子を示す写真を図９に示す。
Fer8とスポットＣを用いて得られたフェリチンの単一配置の様子を示す写真を図９に示す。
図９では、配置の単一性は低く、ほとんどの分子膜スポット上に複数のフェリチンが吸着されている。なお、図９における平均配置数は、4.2個である。
（比較例６）
Fer8-157gluとスポットＣを用いて得られたフェリチンの単一配置の様子を示す写真を図１０に示す。
Fer8-157gluとスポットＣを用いて得られたフェリチンの単一配置の様子を示す写真を図１０に示す。
図１０でも、配置の単一性は低く、ほとんどの分子膜スポット上に複数のフェリチンが吸着されている。なお、図１０における平均配置数は、4.8個である。
（比較例７）
Fer8-98glu105gluとスポットＣを用いて得られたフェリチンの単一配置の様子を示す写真を図１１に示す。
Fer8-98glu105gluとスポットＣを用いて得られたフェリチンの単一配置の様子を示す写真を図１１に示す。
図１１でも、配置の単一性は低く、ほとんどの分子膜スポット上に複数のフェリチンが吸着されている。なお、図１１における平均配置数は、3.8個である。
上記の結果から、各フェリチンを用いた際のスポットＣ上での平均配置個数を計算した結果を、表３にまとめる。
ここで、平均配置個数とは、分子膜スポット上に配置されたフェリチン分子の総数を、分子膜スポットの個数で除した値であり、数値が１に近い方が良好な単一配置であることを示す指標である。
上記結果は、Fer8-98glu 以外のフェリチンでは、直径45nmのスポットＤ上への単一配置ができないことを示している。言い換えれば、Fer8-98gluであれば、直径45nmのスポットＤ上への単一配置が可能である。
Fer8-98gluと同様に外側アミノ酸をグルタミン酸に置換した改変フェリチンであっても、改変異置が異なったり、あるいは改変数が増加したりすると、効果は得られない。
以上の結果からも理解されるように、フェリチンを基板上の目的の位置に高い再現性で１個ずつ配置するためには、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質サブユニットにより構成された改変体フェリチンを用いることが必要である。
（実施の形態４）
この実施の形態４では、無機粒子の配置方法について説明する。
この実施の形態４では、無機粒子の配置方法について説明する。
本実施の形態でも、実施の形態２および実施の形態３と同様に、鉄酸化物コアの導入、鉄酸化物コアを導入したフェリチンの回収と精製、基板表面への分子膜スポット形成、およびフェリチン配置を行う。次に、下記の工程によりタンパク質の除去を行う。
（タンパク質の除去）
フェリチンを配置した基板をランプ加熱炉に入れて、炉内を真空引きし、炉内が大気圧になるまで酸素ガスを供給した（流量１００ｓｃｃｍ）。
フェリチンを配置した基板をランプ加熱炉に入れて、炉内を真空引きし、炉内が大気圧になるまで酸素ガスを供給した（流量１００ｓｃｃｍ）。
次に、大気圧、酸素ガス流量１００ｓｃｃｍの条件下で基板を加熱し、５００℃で１０分間、熱処理を行った。
熱処理後、窒素ガスを流量１０Ｌ/ｍ供給して基板を冷却し、基板温度が１００℃以下となった時点で炉内から基板を取り出した。取り出した基板をＳＥＭにより観察した。
結果は以下の実施例に示す通りである。
（実施例４）
実施例２と同様にFer8-98gluとスポットＢを用い、緩衝剤濃度を0.1 mMとしてフェリチン配置を行った基板を用いてタンパク質の除去を行った。ＳＥＭ観察により、コアである鉄酸化物微粒子は基板上に残り、各配置位置に単独ナノドットが配置された状態を保っていることが確認できた。
実施例２と同様にFer8-98gluとスポットＢを用い、緩衝剤濃度を0.1 mMとしてフェリチン配置を行った基板を用いてタンパク質の除去を行った。ＳＥＭ観察により、コアである鉄酸化物微粒子は基板上に残り、各配置位置に単独ナノドットが配置された状態を保っていることが確認できた。
なお、上記の熱処理条件によりフェリチン外側のタンパク質が除去されることは、別途、全面にフェリチンを配置した基板のＸＰＳ（X線光電子分光）分析により確認されている。（Yoshii et al., Jpn. J. Appl. Phys. 44 (2005),1518）
（補足）
本明細書において用いられる用語「単一」、用語「単独」、および用語「１つの」は、同一の意味である。用語「改変体フェリチン」、用語「変異フェリチン」、および用語「組み換えフェリチン」も同一の意味である。用語「改変体アポフェリチン」、用語「変異アポフェリチン」、および用語「組み換えアポフェリチン」も同一の意味である。
本明細書において用いられる用語「単一」、用語「単独」、および用語「１つの」は、同一の意味である。用語「改変体フェリチン」、用語「変異フェリチン」、および用語「組み換えフェリチン」も同一の意味である。用語「改変体アポフェリチン」、用語「変異アポフェリチン」、および用語「組み換えアポフェリチン」も同一の意味である。
上記説明から、当業者にとっては、本発明の多くの改良や他の実施の形態が明らかである。したがって、上記説明は例示としてのみ解釈されるべきであり、本発明を実行する最良の態様を当業者に教示する目的で提供されたものである。本発明の精神を逸脱することなく、その構造および／または機能の詳細を実質的に変更できる。
本発明にかかるフェリチンの配置方法および無機粒子の配置方法は、基板上への微粒子配置法として有用である。特に特定位置への選択的な微粒子配置が要求される、例えば半導体素子等の用途に特に有用できる。
１０１ 改変体フェリチン Fer8-98glu
１０２ 改変位置（９１番目のグルタミン酸の位置）
２０１ 鉄酸化物コアの導入後のFer8-98glu溶液
２０２ Fer8-98gluの上澄み液
２０３ Fer8-98gluの沈殿
２０４ 鉄酸化物コアの導入後のFer8-159glu溶液
２０５ Fer8-159gluの上澄み液
２０６ Fer8-159gluの沈殿
３０１ シリコン基板
３０２ シリコン酸化膜
３０３ａ 電子線レジスト膜
３０３ｂ 電子線レジストスポット
３０４ 分子膜スポット
３０５ 分子膜スポットを有する基板
３０６ フェリチン
３０６ａ 溶液中のフェリチン
３０６ｂ 分子膜スポット上のフェリチン
３０７ フェリチン溶液
３０８ 分子膜上にフェリチンが配置された基板
１０２ 改変位置（９１番目のグルタミン酸の位置）
２０１ 鉄酸化物コアの導入後のFer8-98glu溶液
２０２ Fer8-98gluの上澄み液
２０３ Fer8-98gluの沈殿
２０４ 鉄酸化物コアの導入後のFer8-159glu溶液
２０５ Fer8-159gluの上澄み液
２０６ Fer8-159gluの沈殿
３０１ シリコン基板
３０２ シリコン酸化膜
３０３ａ 電子線レジスト膜
３０３ｂ 電子線レジストスポット
３０４ 分子膜スポット
３０５ 分子膜スポットを有する基板
３０６ フェリチン
３０６ａ 溶液中のフェリチン
３０６ｂ 分子膜スポット上のフェリチン
３０７ フェリチン溶液
３０８ 分子膜上にフェリチンが配置された基板
配列番号１の<223>：改変ウマ由来フェリチン (apoFer8-98glu)
配列番号２の<223>：改変ウマ由来フェリチン (apoFer8-98glu) の組み換えDNA
配列番号3の<223>：改変ウマ由来フェリチン (apoFer8)
配列番号4の<223>：改変ウマ由来フェリチン (apoFer8-159glu)
配列番号5の<223>：改変ウマ由来フェリチン (apoFer8-157glu)
配列番号6の<223>：改変ウマ由来フェリチン (apoFer8-98glu105glu)
配列番号２の<223>：改変ウマ由来フェリチン (apoFer8-98glu) の組み換えDNA
配列番号3の<223>：改変ウマ由来フェリチン (apoFer8)
配列番号4の<223>：改変ウマ由来フェリチン (apoFer8-159glu)
配列番号5の<223>：改変ウマ由来フェリチン (apoFer8-157glu)
配列番号6の<223>：改変ウマ由来フェリチン (apoFer8-98glu105glu)
Claims (12)
- 複数の分子膜スポットを備えた基板にフェリチンを配置する方法であって、
前記フェリチンは、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質サブユニットにより構成された改変体フェリチンであって、
前記分子膜スポットは表面にアミノ基を有しており、
前記分子膜スポット１カ所の面積は２１００ｎｍ２以下であり、
前記方法は、
前記フェリチンを含有する溶液を前記基板に接触させることにより、前記分子膜スポット１カ所に対して１個の前記フェリチンを配置させる配置工程を有する、方法。 - 前記改変体フェリチンが鉄酸化物粒子を内包する、請求項１に記載の方法。
- 前記分子膜スポットがアミノシラン分子膜からなる、請求項１に記載の方法。
- 前記基板がシリコン基板であり、前記基板表面の前記分子膜を除く領域にシリコン酸化膜を備える、請求項１に記載の方法。
- 前記分子膜スポット１カ所の面積は３８０ｎｍ２以上である、請求項１に記載の方法。
- 前記配置工程の前に、前記分子膜スポットをフォトリソグラフィーにより形成する分子膜スポット形成工程をさらに有する、請求項１に記載の方法。
- 無機粒子を基板上に配置する方法であって、
前記方法は、
フェリチンを含有する溶液を、複数の分子膜スポットを備えた前記基板に接触させることにより、前記各分子膜スポットに１個の前記フェリチンを配置させる配置工程と、
前記基板を加熱することによって、前記フェリチンを分解する分解工程と
を有し、
ここで、
前記フェリチンは、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質サブユニットにより構成された改変体フェリチンであって、
前記分子膜スポットは表面にアミノ基を有し、
前記分子膜スポット１カ所の面積は２１００ｎｍ２以下である、方法。 - 前記改変体フェリチンが鉄酸化物粒子を内包する、請求項７に記載の方法。
- 前記分子膜スポットがアミノシラン分子膜からなる、請求項７に記載の方法。
- 前記基板がシリコン基板であり、前記基板表面の前記分子膜を除く領域にシリコン酸化膜を備える、請求項７に記載の方法。
- 前記分子膜スポット１カ所の面積は３８０ｎｍ２以上である、請求項７に記載の方法。
- 前記配置工程の前に、前記分子膜スポットをフォトリソグラフィーにより形成する分子膜スポット形成工程をさらに有する、請求項７に記載の方法。
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