CN108414445A - 一种液相生物分子多重检测方法及装置 - Google Patents

一种液相生物分子多重检测方法及装置 Download PDF

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CN108414445A CN201810200909.XA CN201810200909A CN108414445A CN 108414445 A CN108414445 A CN 108414445A CN 201810200909 A CN201810200909 A CN 201810200909A CN 108414445 A CN108414445 A CN 108414445A
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Abstract

提供一种液相生物分子多重检测方法及装置，所述方法包括如下步骤：(1)以微米尺度的厚度均匀的基片作为探针分子的载体，在相同光学厚度的基片上修饰同一种探针分子，在不同光学厚度的基片上修饰不同种的探针分子，并建立基片的光学厚度和探针分子种类的对应关系库；(2)在液相环境中，将修饰过探针分子的基片与待测生物分子、标记分子进行杂交反应；(3)对基片进行光学厚度测量，并激发、检测标记分子的荧光强度；(4)根据光学厚度以及对应关系库确定待测分子的种类，根据荧光强度确定待测分子的浓度。本申请消除了已有液相生物芯片的解码准确性和稳定性差的问题，在生物分子分析和临床疾病诊断等领域中具有很好的应用前景。

Description

一种液相生物分子多重检测方法及装置
技术领域
本发明涉及生物分子检测领域，特别是涉及一种液相生物分子多重检测方法及装置。
背景技术
液相生物芯片技术整合了荧光编码微球、流式细胞术、激光检测和高速数字信号处理等多项技术，以不同种类的荧光编码微球作为载体进行杂交反应和信号检测，以多色流式细胞仪作为解码和检测平台，在液相反应体系中实现核酸、蛋白质等多种生物分子的检测。目前已经商用的液相生物芯片技术通过在微球表面接枝有机荧光染料或在微球中包裹荧光量子点来形成荧光编码微球，然后在荧光编码微球表面结合上探针分子，在液相环境中与被标记分子标记的待测分子进行杂交反应，使反应后的荧光编码微球单个流过检测平台中的检测区域，选用双色波长照射微球，一个波长用于激发荧光编码微球的荧光来进行分类，一个波长用来确定荧光编码微球的探针上结合的标记分子的荧光强度，从而确定待测分子的浓度。这样通过双色激光的同时检测，可以确定被结合的生物分子的种类和浓度。
上述液相生物芯片技术中，通过在微球中包裹不同的荧光物质或者不同荧光物质的组合，以及改变不同荧光物质的包裹比例，就可以利用得到的荧光编码微球的荧光光谱对微球进行辨别，即编码和解码过程。该荧光编码微球技术，受荧光特性所限，有多方面的局限性：1、无论是有机荧光染料微球还是量子点微球，发射的荧光谱峰宽度都较宽，在多组分检测中容易导致光谱重叠，直接影响解码准确性，增加了解码难度，使编码数目受限；2、荧光的编码和解码依赖于荧光光谱的谱型，在制备过程中要求同类微球拥有同样的荧光光谱，不同类微球要具备足够的可区分度，给制备工艺提出了较高的要求；3、由于对荧光波形的高度依赖，解码过程需要较为精细的强度拟合和分析方法；4、编码所用的有机荧光染料的发光性能易受外界因素影响，而量子点之间易发生荧光共振能量转移，磁性荧光编码微球中量子点的荧光易被磁性颗粒吸收，这些都会影响编码的稳定性；5、荧光编码微球中经常使用的含镉量子点具有毒性；6、荧光编码微球作为液相杂交反应的载体，其分类检测常常需要借助复杂的流式检测系统。
基于荧光发光光谱的编码微球技术近年来在以上问题上虽有改进，但仍未从根本上解决这些问题。
发明内容
为了弥补上述现有技术的不足，本发明提出一种液相生物分子多重检测方法及装置。
本发明的技术问题通过以下的技术方案予以解决：
一种液相生物分子多重检测方法，包括如下步骤：
(1)以微米尺度的厚度均匀的基片作为探针分子的载体，其中，在相同光学厚度的基片上修饰同一种探针分子，在不同光学厚度的基片上修饰不同种的探针分子，并建立基片的光学厚度和探针分子种类的对应关系库；
(2)在液相环境中，将修饰过探针分子的基片与待测生物分子、标记分子进行杂交反应，或者将修饰过探针分子的基片与已标记有标记分子的待测分子进行杂交反应；
(3)对杂交反应后的基片进行光学厚度测量，并激发、检测结合到基片上的标记分子的荧光强度；
(4)根据测得的基片的光学厚度以及所述对应关系库来确定待测分子的种类，并根据测得的标记分子的荧光强度来确定待测分子的浓度。
优选地，所述基片的光学厚度为5-200μm，一个基片对应一个厚度。
优选地，所述基片由无色透明玻璃、无色透明石英晶体或无色透明聚合物制成。
优选地，所述步骤(4)中根据测得的标记分子的荧光强度来确定待测分子的浓度时，对单个基片上的荧光强度进行面积平均，或者对同种光学厚度的基片上的荧光强度进行平均，再确定待测分子的浓度。
一种用于所述的液相生物分子多重检测方法的装置，包括光学厚度解码通道和荧光检测通道，其中，所述光学厚度解码通道对杂交反应后的基片进行光学厚度测量，所述荧光检测通道对杂交反应后的基片进行荧光检测。
优选地，所述光学厚度解码通道包括双波长光源输出模块、第一分光模块、第一光学延迟线、第二光学延迟线、显微模块、第一成像模块、第二分光模块和第二面阵探测器；其中，所述双波长光源输出模块输出两个波长的工作光，对每个工作光，经过第一分光模块后分成参考光和样品光，所述参考光通过第二光学延迟线进入第二分光模块，所述样品光通过第一光学延迟线、显微模块和第一成像模块后进入第二分光模块，所述参考光和样品光在所述第二分光模块中被耦合后成像于第二面阵探测器；所述荧光检测通道包括激发光源、第一二向色镜、显微模块、第二二向色镜、滤光片、第二成像模块和第一面阵探测器；其中，所述激发光源发出的激发光经过第一二向色镜反射进入显微模块，打在显微模块中的样品上，激发出的荧光经过第二二向色镜反射后，经过滤光片透过激发出的荧光，激发出的荧光信号由第二成像模块成像到第一面阵探测器上。
优选地，所述光学厚度解码通道为双波长数字全息相位显微成像系统，包括宽带光源、单模光纤、准直透镜、滤光片切换装置、第一分光棱镜、第一光学延迟线、第二光学延迟线、第一反射镜、第二反射镜、样品台、显微物镜、第四透镜、第二分光棱镜和第二面阵CCD；
所述荧光检测通道为荧光显微成像系统，包括样品台、显微物镜、第一二向色镜、快门、荧光激发光源、第二二向色镜、长通滤光片、短通滤光片、第三透镜和第一面阵CCD；
其中，所述光学厚度解码通道的工作过程如下：
宽带光源发出的宽带光经过单模光纤耦合输出，由准直透镜准直后，被滤光片切换装置滤波，分时输出两个不同波长的工作光，对每个工作光，经第一分光棱镜分成参考光和样品光，分别进入第二光学延迟线和第一光学延迟线；
第二光学延迟线调节参考光的光程，通过第一反射镜反射后进入第二分光棱镜；
第一光学延迟线调节样品光的光程，使所述样品光的光程等于参考光的光程，第二反射镜将样品光导入样品台和显微物镜，样品光穿过第一二向色镜和第二二向色镜，通过第四透镜进入第二分光棱镜，经过第一反射镜反射的参考光和通过第四透镜后的样品光由第二分光棱镜耦合后，成像于第二面阵CCD；
所述荧光检测通道的工作过程如下：
荧光激发光源发出激发光，由第一二向色镜反射进入显微物镜后打在样品台上的样品上，激发出的荧光穿过显微物镜和第一二向色镜，由第二二向色镜反射，经过长通滤光片将混在荧光信号中的激发光抑制而透过激发出的荧光，再经过短通滤光片将混在荧光信号中的光学厚度测量通道的两个工作光抑制而透过激发出的荧光，激发出的荧光信号由第三透镜成像到第一面阵CCD上。
优选地，所述双波长数字全息相位显微成像系统还包括位于所述滤光片切换装置和第一分光棱镜之间的线性偏振片，以及位于第一分光棱镜和第二光学延迟线之间的四分之一波片，滤光片切换装置分时输出的两个工作光，都被线性偏振片起偏再进入第一分光棱镜，从第一分光棱镜分出的参考光先由四分之一波片调节其偏振状态后进入第二光学延迟线，通过线性偏振片和四分之一波片的联合调节，使第二面阵CCD采集到的干涉条纹的对比度达到最大。
优选地，所述双波长数字全息相位显微成像系统还包括位于第二光学延迟线和第一反射镜之间的第一透镜和第二透镜，从所述第二光学延迟线出来的参考光经过第一透镜和第二透镜的扩束后再由第一反射镜反射。
优选地，所述滤光片切换装置包括的两个滤光片中，一个滤光片垂直光轴安装，另一个滤光片与光轴的夹角为锐角以倾斜于光轴安装，通过调节倾斜安装的滤光片的倾斜角度，使得滤光片切换装置输出的两个工作光的合成波长大于所有需检测的基片的光学厚度。
本发明与现有技术对比的有益效果包括：
代替现有技术中的荧光编码微球，本申请直接用不同光学厚度的片状的基片(厚度均匀)进行编码，也即将不同光学厚度的基片作为不同种类探针分子的载体，在液相环境中与标记过的待测分子进行杂交反应，然后对基片进行高分辨率的光学厚度分析来识别待测分子，并检测结合到基片上的标记分子的荧光来确定待测分子数量，进而检测待测分子的浓度，在解码过程中，通过光学厚度来对生物分子种类进行分类，本申请具有如下优点：
1、本申请的编码和解码维度不同于现有的用荧光编码微球所用的荧光发射光谱，不存在编码荧光对解码和定量过程带来的不好影响，可以解决现有的基于荧光编码微球的液相生物芯片技术所存在的上述问题，具有编解码信号稳定性好、可编码数目大、解码准确性高、检测灵敏度高等优点。
2、平面的基片作为载体，让液相杂交反应的载体的制备变得简单可靠，而且降低了成本，更加环保；对标记分子的荧光信号的采集也更加灵敏，数据处理也可以更加准确。
3、摒弃了流式检测系统，利用能够同时进行光学厚度测量和荧光检测的多模态成像系统作为该方法的解码和检测平台，用其光学厚度解码通道来测量杂交反应后不同基片的光学厚度，同时用荧光检测通道来测量对应基片发出的荧光强度。
4、进一步地，本申请首次将双波长数字全息相位显微成像系统和荧光显微成像系统相结合，经过优化，具备亚微米量级的相位分辨率和百微米量级的相位轴向测量范围，非常适合解码基片。
附图说明
图1是本发明具体实施方式中的液相生物分子多重检测装置的框图示意图；
图2是本发明一优选实施方式中的液相生物分子多重检测装置的示意图；
图3的a图和b图是本发明另一优选实施方式中得到的光学厚度图；
图3的c图是本发明另一优选实施方式中得到的荧光图。
具体实施方式
下面对照附图并结合优选的实施方式对本发明作进一步说明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
一种液相生物分子多重检测方法包括以下步骤：
1、制备具有不同光学厚度的基片
该步骤中，基片可选用微米尺寸的透明固体片状无毒材料，且在整个生物分子检测过程中除在基片表面能够修饰上探针分子以外不发生任何反应，例如可以选择由无色透明玻璃、无色透明石英晶体或无色透明聚合物(如有机玻璃PMMA)制成的基片，优选地，可选玻璃基片。
基片的光学厚度优选为5-200μm，且基片的几何厚度小于基片除厚度外的面上的最远两点的几何距离，以保证基片散落在载玻片上进行检测时是平躺的而不是竖立的。基片的形状不限(是平整的厚度均匀的片状即可)，例如可以是方形、圆形、多边形等，除厚度外的基片的其他面上的尺寸为100-300μm，例如当为方形时，方形基片的长宽可以各自独立地为100-300μm。
制备不同光学厚度的基片有多种方法可供选择，例如，可以购买不同厚度的片材，切割成所需的微米尺度的基片，为了便于切割，在切割前，可以先在超薄基片的一面贴上PET膜，然后进行激光切割，切割后将基片从PET膜上剥离，经过清洗，就可以进行后面的修饰和检测步骤。
2、在基片上修饰探针分子
该步骤中，以微米尺度的厚度均匀的基片作为探针分子的载体，用常规的化学方法在具有相同光学厚度的基片上修饰同一种探针分子，不同光学厚度的基片上修饰不同种的探针分子。建立基片的光学厚度和探针分子种类的对应关系库。
3、在液相环境中将修饰过探针分子的基片与待测分子、标记分子进行杂交反应，或者将修饰过探针分子的基片与已标记有标记分子的待测分子进行杂交反应。
该步骤中，待测分子例如可以是RNA、DNA、多肽、蛋白质、糖分子等等待检测的生物分子；标记分子是有机荧光染料或者荧光量子点标记的分子。在杂交反应时，基片表面的探针分子与待测分子结合，待测分子与标记分子结合。
4、对杂交反应后的基片进行光学厚度测量，并激发、检测结合到基片上的标记分子的荧光强度。
5、根据测得的基片的光学厚度以及前述建立的对应关系库来确定待测分子的种类，并根据测得的标记分子的荧光强度来确定待测分子的浓度。
该步骤中，根据步骤2中建立的基片光学厚度和探针分子种类的对应关系库，确定所测基片所对应的探针分子，从而确定待测分子的种类。根据测得的对应基片的荧光强度，来确定对应的待测分子的浓度(由本领域常规的定标实验来测得浓度)。
进行步骤4中的光学厚度测量和荧光强度测量的装置包括光学厚度解码通道和荧光检测通道，其中，用光学厚度解码通道测得杂交反应后的不同基片的光学厚度，荧光检测通道测量对应基片的荧光强度。
在具体实施方式中，如图1所示，光学厚度解码通道包括双波长光源输出模块、第一分光模块、第一光学延迟线、第二光学延迟线、显微模块、第一成像模块、第二分光模块和第二面阵探测器；其中，双波长光源输出模块输出两个波长的工作光，对每个工作光，经过第一分光模块后分成参考光和样品光，参考光通过第二光学延迟线进入第二分光模块，样品光通过第一光学延迟线、显微模块和第一成像模块后进入第二分光模块，参考光和样品光在第二分光模块中被耦合后成像于第二面阵探测器。荧光检测通道包括激发光源、第一二向色镜、显微模块、第二二向色镜、滤光片、第二成像模块和第一面阵探测器；其中，激发光源发出的激发光经过第一二向色镜反射进入显微模块，打在显微模块中的样品上，激发出的荧光经过第二二向色镜反射后，经过滤光片透过激发出的荧光，激发出的荧光信号由第二成像模块成像到第一面阵探测器上。
在一优选的实施方式中，如图2所示，光学厚度解码通道为双波长数字全息相位显微成像系统，荧光检测通道为荧光显微成像系统，两个通道通过样品台14、显微物镜15、第一二向色镜16和第二二向色镜(19)进行耦合。具体地，宽带光源1为光学厚度解码通道的光源，发出的光由单模光纤2耦合输出，由准直透镜3进行准直。滤光片切换装置4用于切换两个滤光片轮流滤出两个不同波长的工作光，来实现对宽带光源1发出的光进行分时的滤波，对于每个波长的工作光，第一分光棱镜6将光束分成参考光和样品光；较佳地，被第一分光棱镜6分光之前通过线性偏振片5起偏，分成的参考光经过四分之一波片7调节其偏振状态，通过线性偏振片5和四分之一波片7的联合调节从而使第二面阵CCD26采集到的干涉条纹的对比度最大；第一光学延迟线8用于调节样品光的光程，第二光学延迟线9用于调节参考光的光程，当两者的光程差为零时，在第二面阵CCD26上会得到明显的干涉条纹；10为第一透镜、11为第二透镜，第一透镜10的焦距小于第二透镜11的焦距，从而将参考光扩束，扩束比为第二透镜11与第一透镜10的焦距比；第一反射镜12和第二反射镜13用于调整光路方向；14为样品台，用于放置待测样品；显微物镜15对样品进行显微成像；16为第一二向色镜，其能够反射激发光，透射激发出的荧光；18为荧光激发光源，作为荧光检测通道的激发光源，并优选在荧光激发光源18和第一二向色镜16之间设置快门17，用于控制激发光的通断；19为第二二向色镜，能够反射激发出的荧光，透射光学厚度解码通道的两个工作波长；20为长通滤光片，能够进一步截止激发光而透过激发出的荧光；21为短通滤光片，能够进一步截止光学厚度解码通道的两个工作光而透过激发出的荧光；22为第三透镜，将激发出的荧光成像到第一面阵CCD 23上；24为第四透镜，其和显微物镜15组成无限远成像系统，而且显微物镜15的后焦点与透镜24的前焦点重合，即同时又是望远系统，以减小显微物镜15引入的像差；25为第二分光棱镜，将参考光和样品光进行耦合；26为第二面阵CCD，用于分别采集每个波长工作时产生的干涉图样，由此重建出每个波长对应的相位图。
其中，双波长数字全息相位显微成像系统包括宽带光源1、单模光纤2、准直透镜3、滤光片切换装置4、线性偏振片5、第一分光棱镜6、四分之一波片7、第一光学延迟线8、第二光学延迟线9、第一透镜10、第二透镜11、第一反射镜12、第二反射镜13、样品台14、显微物镜15、第四透镜24、第二分光棱镜25和第二面阵CCD 26。其工作过程如下：
宽带光源1发出的宽带光经过单模光纤2耦合输出，由准直透镜3准直后，被滤光片切换装置4滤波，分时输出两个工作波长，对每个工作波长，都被线性偏振片5起偏，经第一分光棱镜6分成参考光和样品光，参考光进入第二光学延迟线9，样品光进入第一光学延迟线8；四分之一波片7进一步调节参考光的偏振状态，第二光学延迟线9调节参考光的光程，第一透镜10和第二透镜11对参考光进行扩束，通过第一反射镜12反射后进入第二分光棱镜25；第一光学延迟线8调节样品光的光程，使样品光的光程等于参考光的光程，第二反射镜13将样品光导入样品台14和显微物镜15，样品光穿过第一二向色镜16和第二二向色镜19，通过第四透镜24后进入第二分光棱镜25，参考光和样品光在第二分光棱镜25中被耦合后成像于第二面阵CCD 26。
其中，通过调整第一反射镜12和第二反射镜13，使参考光和样品光形成离轴干涉光路，通过第一光学延迟线(8)和第二光学延迟线(9)的联合调节，使参考光和样品光的光程相等，从而使第二面阵CCD(26)能够采集到干涉条纹，通过调整第一反射镜(12)和第二反射镜(13)，使参考光和样品光形成离轴干涉光路。第二面阵CCD 26分别采集每个波长工作时产生的干涉图样，由此重建出每个波长对应的相位图。根据双波长合成的原理，可以由这两个不同波长的相位图得到由两个波长合成的拍频对应的波长的相位图，该合成波长可达几十甚至几百微米，其对应的相位图能够解析出编码微片的光学厚度信息。其中，根据需求，双波长数字全息相位显微成像系统可以优化两个波长的间隔来得到合适的轴向测量范围，本实施例使用两个滤光片来轮流对一个宽带光源进行滤光，并对这两个滤光片的中心波长的间隔进行了优化，具体地，滤光片切换装置4可以为购买的电动或者手动滤光片轮，其上装有购买的两个滤光片，优选将其中一个滤光片垂直于光轴安装，另一个滤光片倾斜于光轴安装，即光轴和该滤光片的夹角为锐角，逐步改变倾斜安装的滤光片的倾斜角度以得到中心波长可变的一个过滤光，与由垂直于光轴安装的滤光片所得到的另一个过滤光相组合，可以得到所需的较优的中心波长间隔，进而得到所需的轴向测量范围。滤出的两个波长λ1和λ2，根据公式Λ12＝λ1λ2/|λ1-λ2|计算得出的两者的合成波长Λ12大于所有需检测的基片的光学厚度。
荧光显微成像系统包括样品台14、显微物镜15、第一二向色镜16、快门17、荧光激发光源18、第二二向色镜19、长通滤光片20、短通滤光片21、第三透镜22和第一面阵CCD 23。其工作过程如下：
荧光激发光源18发出激发光，经过快门17后由第一二向色镜16反射进入显微物镜15，打在样品台14上的样品上，激发出的荧光穿过显微物镜15和第一二向色镜16，并由第二二向色镜19反射，经过长通滤光片20将混在荧光信号中的激发光抑制而透过激发出的荧光，再经过短通滤光片21将混在荧光信号中的光学厚度测量通道的两个工作光抑制而透过激发出的荧光，激发出的荧光信号由第三透镜22成像到第一面阵CCD 23上。
其中，激发光的波长可以根据激发荧光物质的激发特性而定，一般为蓝光或者紫光，在本实施例中为405nm，即荧光激发光源18采用405nm激光器，当然，在其他实施方式中可以根据情况采用不同的波长。
本优选实施例中，将双波长数字全息相位显微成像系统和荧光显微成像系统进行耦合构成检测装置，双波长数字全息相位显微成像系统对光学厚度的解析精度可达纳米量级，只要选取的不同种基片间的光学厚度差大于所用光学厚度测量技术的分辨率，就不会出现解码错误和检测通量受限问题，也不存在稳定性差的问题。由于本申请把编解码维度(光学厚度)和定量维度(标记荧光)进行了分离，光学厚度解码通道和荧光检测通道所探测的两种信号产生机制完全不同，两个检测通道之间不存在任何干扰，因此荧光检测通道几乎是零背景检测，具有高灵敏度的特点，对应具备较低的待测分子浓度检测限。
由于生物分子结合反应在微观上容易分布不均，即基片表面不同地方结合上的生物分子数量不同，所以激发出的标记荧光强度也不同，但相比于微球，本申请的基片由于是平整的片状载体，受激发光的照射更加均匀，更容易得到整个平面的像，所以更容易准确探测到整个基片表面的荧光，就可以进行整个基片表面的荧光强度平均，从而减小统计误差，因此，优选地，可对单个基片上的标记荧光强度进行面积平均。同样，由于每个基片反应后测到的荧光强度相当于对待测分子浓度的一次采样，对多个同种光学厚度基片上的荧光强度进行统计平均，相当于对待测分子浓度进行多次测量求平均值，因此，还可以对同种光学厚度基片上的荧光强度进行平均，从而减少测量误差和统计误差。
以下通过一个更具体的实施例对本发明作进一步阐述。
本实施例中，购买厚度为30～70微米、边长为20毫米的超薄石英片，然后将每块超薄石英片分别切割成许多边长为100微米的基片，作为该方法的反应载体。
选取光学厚度分别为40um、53um、82um的石英片，对应分别修饰上三种探针分子小鼠IgG、兔IgG和大鼠IgG，并与待测样品(量子点标记的抗IgG：15nM的525nm@羊抗兔IgG，15nM的565nm@羊抗大鼠IgG和250pM的605nm@羊抗小鼠IgG)充分混合反应后，放在如图2所示的装置上同时进行光学厚度测量和荧光检测，具体地，采用如图2所示的装置：取反应后的基片混合物放置在载玻片上后置于样品台14上，由双波长数字全息相位显微成像系统进行光学厚度分析，由荧光显微成像系统进行荧光检测。由第二面阵CCD 26分别采集两个波长(830.0nm和833.4nm)各自对应的干涉图样，然后由衍射理论重建出干涉图样各自对应的相位图，得到的相位图往往包含有系统分别工作在每个波长下的像差，接着分别对相位图进行像差补偿，得到修正后的相位图；根据双波长合成原理，由修正后的相位图得到合成波长对应的相位图，并解析出如图3的a图所示的石英片的光学厚度，图3的a图中白线位置处的光学厚度分布如图2的b图所示，明显可以看出，有三种不同的光学厚度，其数值从左到右分别对应53um，82um，40um，即正确解码出三种光学厚度的石英片。由图3的a图和b图可以清楚得出每个石英片的光学厚度，从而知道其表面修饰上的IgG分子，由生物分子结合的特异性，就可以得知与其发生反应的待测抗IgG分子的种类。
图3的c图为荧光检测通道得到的荧光图。从图3的c图中对应的微石英片上检测出的标记分子的荧光的强度，就可以获得该种待测抗IgG分子的浓度信息。为了提高准确度，可以对测得的同种分子的标记分子的荧光强度进行平均。
从以上实施例可以看出，利用所提出的检测方法和装置，本申请能够对多种生物分子的混合样品进行种类分析和定量检测。本发明在检测前只需制备不同光学厚度的基片，过程简单，所用材料安全无毒，易于保存和运输，成本低廉，且从根本上就消除了已有液相生物芯片的解码准确性和稳定性差的问题，在生物分子分析和临床疾病诊断等领域中具有很好的应用前景。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干等同替代或明显变型，而且性能或用途相同，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种液相生物分子多重检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)以微米尺度的厚度均匀的基片作为探针分子的载体，其中，在相同光学厚度的基片上修饰同一种探针分子，在不同光学厚度的基片上修饰不同种的探针分子，并建立基片的光学厚度和探针分子种类的对应关系库；
(2)在液相环境中，将修饰过探针分子的基片与待测生物分子、标记分子进行杂交反应，或者将修饰过探针分子的基片与已标记有标记分子的待测分子进行杂交反应；
(3)对杂交反应后的基片进行光学厚度测量，并激发、检测结合到基片上的标记分子的荧光强度；
(4)根据测得的基片的光学厚度以及所述对应关系库来确定待测分子的种类，并根据测得的标记分子的荧光强度来确定待测分子的浓度。
2.如权利要求1所述的液相生物分子多重检测方法，其特征在于：所述基片的光学厚度为5-200μm，一个基片对应一个厚度。
3.如权利要求1所述的液相生物分子多重检测方法，其特征在于：所述基片由无色透明玻璃、无色透明石英晶体或无色透明聚合物制成。
4.如权利要求1所述的液相生物分子多重检测方法，其特征在于：所述步骤(4)中根据测得的标记分子的荧光强度来确定待测分子的浓度时，对单个基片上的荧光强度进行面积平均，或者对同种光学厚度的基片上的荧光强度进行平均，再确定待测分子的浓度。
5.一种用于权利要求1所述的液相生物分子多重检测方法的装置，其特征在于：包括光学厚度解码通道和荧光检测通道，其中，所述光学厚度解码通道对杂交反应后的基片进行光学厚度测量，所述荧光检测通道对杂交反应后的基片进行荧光检测。
6.如权利要求5所述的装置，其特征在于：
所述光学厚度解码通道包括双波长光源输出模块、第一分光模块、第一光学延迟线、第二光学延迟线、显微模块、第一成像模块、第二分光模块和第二面阵探测器；其中，所述双波长光源输出模块输出两个波长的工作光，对每个工作光，经过第一分光模块后分成参考光和样品光，所述参考光通过第二光学延迟线进入第二分光模块，所述样品光通过第一光学延迟线、显微模块和第一成像模块后进入第二分光模块，所述参考光和样品光在所述第二分光模块中被耦合后成像于第二面阵探测器；
所述荧光检测通道包括激发光源、第一二向色镜、显微模块、第二二向色镜、滤光片、第二成像模块和第一面阵探测器；其中，所述激发光源发出的激发光经过第一二向色镜反射进入显微模块，打在显微模块中的样品上，激发出的荧光经过第二二向色镜反射后，经过滤光片透过激发出的荧光，激发出的荧光信号由第二成像模块成像到第一面阵探测器上。
7.如权利要求5或6所述的装置，其特征在于：所述光学厚度解码通道为双波长数字全息相位显微成像系统，包括宽带光源(1)、单模光纤(2)、准直透镜(3)、滤光片切换装置(4)、第一分光棱镜(6)、第一光学延迟线(8)、第二光学延迟线(9)、第一反射镜(12)、第二反射镜(13)、样品台(14)、显微物镜(15)、第四透镜(24)、第二分光棱镜(25)和第二面阵CCD(26)；
所述荧光检测通道为荧光显微成像系统，包括样品台(14)、显微物镜(15)、第一二向色镜(16)、快门(17)、荧光激发光源(18)、第二二向色镜(19)、长通滤光片(20)、短通滤光片(21)、第三透镜(22)和第一面阵CCD(23)；
其中，所述光学厚度解码通道的工作过程如下：
宽带光源(1)发出的宽带光经过单模光纤(2)耦合输出，由准直透镜(3)准直后，被滤光片切换装置(4)滤波，分时输出两个不同波长的工作光，对每个工作光，经第一分光棱镜(6)分成参考光和样品光，分别进入第二光学延迟线(9)和第一光学延迟线(8)；
第二光学延迟线(9)调节参考光的光程，通过第一反射镜(12)反射后进入第二分光棱镜(25)；
第一光学延迟线(8)调节样品光的光程，使所述样品光的光程等于参考光的光程，第二反射镜(13)将样品光导入样品台(14)和显微物镜(15)，样品光穿过第一二向色镜(16)和第二二向色镜(19)，通过第四透镜(24)进入第二分光棱镜(25)，经过第一反射镜(12)反射的参考光和通过第四透镜(24)后的样品光由第二分光棱镜(25)耦合后，成像于第二面阵CCD(26)；
所述荧光检测通道的工作过程如下：
荧光激发光源(18)发出激发光，由第一二向色镜(16)反射进入显微物镜(15)后打在样品台(14)上的样品上，激发出的荧光穿过显微物镜(15)和第一二向色镜(16)，由第二二向色镜(19)反射，经过长通滤光片(20)将混在荧光信号中的激发光抑制而透过激发出的荧光，再经过短通滤光片(21)将混在荧光信号中的光学厚度测量通道的两个工作光抑制而透过激发出的荧光，激发出的荧光信号由第三透镜(22)成像到第一面阵CCD(23)上。
8.如权利要求7所述的装置，其特征在于：所述双波长数字全息相位显微成像系统还包括位于所述滤光片切换装置(4)和第一分光棱镜(6)之间的线性偏振片(5)，以及位于第一分光棱镜(6)和第二光学延迟线(9)之间的四分之一波片(7)，滤光片切换装置(4)分时输出的两个工作光，都被线性偏振片(5)起偏再进入第一分光棱镜(6)，从第一分光棱镜(6)分出的参考光先由四分之一波片(7)调节其偏振状态后进入第二光学延迟线(9)，通过线性偏振片(5)和四分之一波片(7)的联合调节，使第二面阵CCD(26)采集到的干涉条纹的对比度达到最大。
9.如权利要求7所述的装置，其特征在于：所述双波长数字全息相位显微成像系统还包括位于第二光学延迟线(9)和第一反射镜(12)之间的第一透镜(10)和第二透镜(11)，从所述第二光学延迟线(9)出来的参考光经过第一透镜(10)和第二透镜(11)的扩束后再由第一反射镜(12)反射。
10.如权利要求7所述的装置，其特征在于：所述滤光片切换装置(4)包括的两个滤光片中，一个滤光片垂直光轴安装，另一个滤光片与光轴的夹角为锐角以倾斜于光轴安装，通过调节倾斜安装的滤光片的倾斜角度，使得滤光片切换装置(4)输出的两个工作光的合成波长大于所有需检测的基片的光学厚度。
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