CN103424365A

CN103424365A - 一种微载体生物芯片及其应用

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Publication number: CN103424365A
Application number: CN2012101668872A
Authority: CN
Inventors: 李强; 黄国亮; 王同舟; 黎新; 赵松敏
Original assignee: Tsinghua University; CapitalBio Corp
Current assignee: Tsinghua University; CapitalBio Corp
Priority date: 2012-05-25
Filing date: 2012-05-25
Publication date: 2013-12-04
Anticipated expiration: 2032-05-25
Also published as: CN103424365B

Abstract

本发明公开了一种微载体芯片及其应用。本发明所提供的微载体芯片，包括基底（11），基底（11）上设置可以在低相干光源作用下产生特异性的颜色反射光的表面结构。它具体由基底（11），基底上覆盖的透明薄膜（12），透明薄膜表面的化学修饰层（13），以及在化学修饰层上以共价键方式或者物理吸附的方式固定的分子探针（14）组成。本发明采用基于低相干光的颜色编码技术，设计了微载体芯片，实现了对多种生物分子的高灵敏度与特异性的检测。该方法克服了激光编码方法的周期性缺点。在1μm内，微载体表面的颜色可与薄膜厚度特异性地对应。利用颜色编码/解码分析方法，微载体薄膜厚度变化的分辨率可以达到5nm。

Description

一种微载体生物芯片及其应用

技术领域

本发明涉及一种微载体生物芯片及其应用，特别涉及一种利用低相干光干涉编码的微载体生物芯片及其应用。

背景技术

在药物开发、新药筛选和快速诊断中，一般都要求对数量巨大的待测分子进行筛选检测。用于库筛选的探针一般都是些特殊的靶分子，如抗原、抗体、核酸和多肽等。筛选的过程实际包括了成千上万反应同时进行，因此其理想目标是要能让多种不同的探针进行同步的微量混合筛选。此外，还需要能对筛选过程中不同的反应进行跟踪。根据这一要求，目前有两种不同的技术方法。其一是将所有的待测分子分别置于相互隔离的多孔板和微试管中，或者对它们进行诸如高密度DNA芯片那样的特殊定位。(D.Gershon,Nature 416(6883),885-891(2002))其次，是使用不同的微载体或者微球，将不同的待测分子定位于不同微球的表面，然后再对微球进行编码以识别其表面载有的待测分子。(S.A.Dunbar,Clin.Chim.Acta 363(1-2),71-82(2006))显然，后一种方法比前一种具有更大的灵活性和优势，特别是，它可以将载有不同待测分子的微球混合在一起进行筛选，只需识别筛选结果中呈阳性微球的编码，就可以确定与探针作用的待测分子。

目前已经报道的基于微载体的编码方式有很多种，其中包括荧光掺杂编码、量子点编码、基于微加工的二维编码，拉曼光谱或红外光谱的编码方法。其中，荧光编码技术发展最为成熟，目前已经有商用化编码平台Luminex xMAP^TM。该系统采用在粒径约5.5μm的聚苯乙烯微球上精确加载不同比例的红色（发射波长λem>650nm）和橙色（λem约580nm）荧光染料，再用绿色荧光报告分子（λem约530nm）对探针荧光筛选反应进行定量分析。(J.P.Nolan and L.A.Sklar,Trends Biotechnol.20(1),9-12(2002))筛选时，所有载体微球高速通过两个不同的激光束，其中一束用于分析微球的荧光染料组成比例以识别其编码，另一束则通过测量荧光报告分子的荧光强度来分析载体上的分子对筛选探针的反应活性。通过调整两种荧光染料的比例，就可以制造出拥有不同荧光特性的微球。

该技术将两种近红外荧光染料按照不同比例混合，并与微球合成掺杂，制造出具有不同光谱特性的编码微球。目前，可合成100种带有不同比例的荧光微球。

该方法也具有以下缺点，首先，由于荧光发射光谱存在一定的重叠，该方法的编码能力受到较大的制约。为了保证解码的正确性，所使用的荧光染料必须具有相似的激发光谱并且其发射光谱能被一一区分开。除此之外，报告荧光与编码荧光之间可能会发生荧光共振能量转移现象。

目前，基于微载体或微球的条形以及二维编码技术可实现对超大库容量样本的编码，但通常需要较复杂的化学合成技术和表面化学修饰工艺。（K.D.Janda andA.R.Vaino,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97(14),7692-7696(2000))由于涉及大量合成与微加工工艺，导致其重复性差，不易实现大规模生产。且目前无法实现快速、方便的检测与解码。

通过以上分析，可以发现目前存在的用于高通量并行检测的编码方法普遍存在成本较高，制备工艺复杂且解码检测步骤繁琐等缺点，因此产生了开发一种新型的光学编码技术的需求，可以方便实现大容量编码与快速解码，满足生物样品高通量、低成本、并行检测的应用需要。

发明内容

本发明的目的是提供一种微载体芯片及其应用。

本发明所提供的微载体芯片，包括基底11，其中，基底11上设置可以在低相干光源作用下产生特异性的颜色反射光的表面结构。

所述可以在低相干光源作用下产生特异性的颜色反射光的结构可以为薄膜结构等在低相干光源作用下产生特异性的颜色反射光的结构。

所述微载体芯片由基底11，基底上覆盖的薄膜12，薄膜表面的化学修饰层13，以及在化学修饰层上以共价键方式或者物理吸附的方式固定的分子探针14组成。

所述薄膜12的厚度为1μm以下。所述薄膜的具体材料可以为氮化硅、二氧化硅、氧化钛、氧化铝、氟化镁、单质金、银或者铬等表面可进行化学修饰，能以共价键方式或者通过物理吸附的方法固定分子探针的材料。

表面修饰层可以是氨基、羧基、巯基、环氧基等；所述分子探针为核酸、蛋白、多肽、化合物、微生物（如细菌、真菌、病毒等）或者动植物细胞。

所述基底的材料为硅、玻璃、金属、塑料、高分子聚合物或其他化合物；基底形状可以是矩形，圆形、球形或其他不规则形状（如多孔结构或台阶结构等）。

所述的微载体芯片可用于检测待测靶标。

所述检测待测靶标的方法是将在低相干光光源作用下产生不同反射光并分别固定不同探针的微载体芯片置于含待测靶标的液体中反应，检测所述微载体生物芯片的表面颜色信息，并在标准颜色空间内进行分析解码，反推出微载体表面薄膜的厚度，从而确定微载体上固定的分子探针，通过分子探针确定与其结合的靶标。

所述解码所使用的标准颜色空间可以是但不限于CEA、HSI、HSV、RGB、CMY、CMYK、HSL、HSB、Ycc、XYZ、Lab或YUV标准色彩空间。

与传统的基于微载体荧光编码方法相比，本发明的微载体具有编码容量更大（200）、检测手段简便且不存在淬灭及荧光共振能量转移等干扰问题。具体表现在下述特点：

(1)被编码的微载体芯片可以是固体等，其材料可以是硅、玻璃、金属、塑料、高分子聚合物或其他化合物等。只要其基底表面能够通过适当的化学方法生成微纳米级别的薄膜即可。并且可通过化学修饰或物理吸附等方法，使该表面能够连接分子探针。

(2)光源采用具有宽光谱特性的低相干光源，可以是氘灯，汞灯，卤素灯，钨灯，LED。在光源的照射下，微载体芯片表面的反射光束可以被检测系统接受。检测系统用于测定微载体芯片表面的反射光特性，包括强度，颜色等信息。检测系统可以选用显微成像系统，或选用光谱仪，通过滤色片（或棱镜、光栅）滤波分光，然后通过透镜（或反射镜）会聚到探测器上来实现。探测器可以是面CCD、线CCD、光电倍增管、光电池等元件。

(3)颜色编码技术。通过我们的研究表明，微载体芯片表面的薄膜可使特定波段的低相干光产生相消或相长干涉。形成特异性的反射光谱，在一定厚度范围内（1μm以下），该反射光谱与薄膜厚度特异性地对应。利用光谱与颜色的转化关系，我们发现将反射光谱转化至RGB,CMYK,LAB等标准颜色空间，就可以简化解码过程，实现快速解码分析。

本发明的微载体芯片可以在低相干光源下产生特异性的颜色反射光，实现对多种微载体颜色编码，利用颜色解码方法，可在标准颜色空间内分析微载体表面的低相干图像颜色，实现对微载体表面薄膜厚度信息的解读，达到区分微载体的目的，并实现对多重靶标分子的高灵敏度并行检测。

可在标准颜色空间的多个通道内分析低相干图像颜色，只要微载体表面薄膜存在微小差异，就可以分析比较多个通道的信号获得厚度信息，达到区分微载体的目的。当所使用的解码标准颜色空间为RGB时，颜色解码方法可以将0-1000nm范围内的微载体表面反射光谱转化为可视化色彩，克服了单色光干涉方法在该范围内存在光谱周期无法与薄膜厚度一一对应的问题。

本发明的微载体芯片可以用于多靶标分子检测药物开发、新药筛选和快速诊断中，可以实现对多种生物分子相互作用的快速检测与分析。用于实现高通量、快速、并行的生化反应检测。可以实现对多种DNA，RNA，mRNA,microRNA，抗原，抗体，多肽，氨基酸等生物分子的高通量检测，也可以检测细胞、细菌、病毒或其他微生物。其检测灵敏度高于传统的微阵列生物芯片方法。

本发明采用基于低相干光的颜色编码技术，设计了微载体芯片，实现了对多种生物分子的高灵敏度与特异性的检测。该方法克服了激光编码方法的周期性缺点。在1μm内，微载体表面的颜色可与薄膜厚度特异性地对应。利用颜色编码/解码分析方法，微载体薄膜厚度变化的分辨率可以达到5nm。

本发明的微载体芯片的核心是利用低相干光干涉产生的不同表面颜色，区分具有不同厚度薄膜的微载体。区别于传统的荧光编码方法，该方法解决了荧光编码方法所存在的荧光干扰问题。并且该方法还具有制备简单、快速解码等优点。利用此方法编码的悬浮微载体，可获得比传统微阵列芯片更高的检测灵敏度，故可实现对多种生物分子高通量、高灵敏度的特异性检测。该方法在生命科学、药物分析以及医学领域中具有广泛的应用前景。

附图说明

图1是本发明中基于低相干光干涉编码测量的微载体芯片一个实施例示意图。

图2是本发明中基于低相干光干涉编码测量的装置结构实施例示意图。

图3是本发明中干涉编码RGB颜色值与解码厚度对应值的一个实施例示意图。

图4是本发明中纳米分辨率测量的干涉编码与厚度解码的一个实施例示意图。

具体实施方式

本发明的微载体芯片，它包括基底11，其中，基底11上设置可以在低相干光源作用下产生特异性的颜色反射光的表面结构。具体的表面结构为薄膜结构。本实施例中，以薄膜结构为例说明本发明的微载体生物芯片的构建与应用。

本实施例中，微载体芯片如图1所示，具体由微载体固体基底11，固体基底上覆盖的微纳米薄膜12，薄膜表面的用于连接表面分子探针的表面化学修饰层13，以及在化学修饰层上以共价键方式或者物理吸附的方式固定的分子探针14组成；

其中，微载体的基底11可以是硅、玻璃、金属、塑料、高分子聚合物或其他化合物。基底表面的薄膜12可以是氮化硅、二氧化硅、氧化钛、氧化铝、氟化镁、单质金、银或者铬等材料。表面化学修饰层13可通过共价连接或者物理吸附连接不同类型的分子探针，用于检测多种靶标分子。表面分子探针14可以是核酸（如DNA、RNA等）、蛋白质类（如抗原、抗体、多肽等）、氨基酸等生物分子。

微载体的具体制备方法如下所述：

1.通过化学方法在微载体的固体基质表面产生均匀的微纳米薄膜，制备具有不同厚度薄膜的微载体。

2.对微载体表面进行化学修饰或利用物理吸附方法，将探针固定于微载体表面。

3.将固定有不同探针的具有不同厚度薄膜的微载体置于样品溶液中，充分反应。

4.反应结束后，采集微载体表面的荧光图像，确认是否有靶标分子结合。靶标分子的存在可通过荧光，化学发光，磁珠标记，胶体金标记或者放射性标记等方法进行检测。

5.采集微载体的低相干图像进行分析解码，以获得靶标分子的具体类型。

采集微载体的低相干图像进行分析解码的系统示意图具体如图2所示，它包括具有宽光谱发射能力的光源21，汇聚光源发射光的透镜22，对透过透镜22的光线进行滤色的三色滤色片组件23，待测微载体检测台25，汇聚微载体的反射光线的透镜24，接收透镜24汇聚的光线的分束器26，将分束器26反射的光线会聚到探测器28上的透镜27，对探测器28接收的信号进行颜色分析的计算机29。

光源21可以是固体发光光源或气体发光光源或生物发光源或化学发光源或多种单色光源构成的组合光源等，如氘灯、氙灯、LED、钨灯或其它发光光源。。探测器可以是面阵CCD、线阵CCD、光电倍增管、光电池等元件。滤色片也可以是棱镜、光栅或其他分色器件。将探测器28接收的信号进行颜色分析的计算机29为安装有信号提取与颜色分析的软件的计算机，可以通过计算机接口实时读取检测系统的信号，并完成显示、存储、颜色分析、计算薄膜厚度解码等。

光源21发出的光束通过透镜22，三色滤色片组件23以及透镜24照射到微载体25固体表面。其表面反射光通过分束器26，以及透镜27后被探测器28采集。最后利用信号提取与颜色分析的计算机软件系统29计算该微载体的表面颜色数值，并反推重建计算获得其表面薄膜厚度值，从而实现对厚度编码微载体的解码。

图3为颜色数值对应于不同厚度的薄膜。其具体步骤如下，

(1)通过矢量合成法计算薄膜表面在光源的各个波长下的能量反射率。

(2)利用光谱仪采集光源的光谱，利用步骤1得到能量反射率，计算出薄膜表面反射光谱

(3)利用经典的RGB模型，将以上反射光谱映射至RGB空间，即得到薄膜厚度与RGB的对应关系。

以RGB颜色空间为例，图中红色曲线代表R通道，绿色曲线代表G通道，蓝色曲线代表B通道。利用图3所得到的RGB值与薄膜厚度的关系可以发现，当薄膜厚度在1μm以内，薄膜颜色与薄膜厚度呈现一一对应关系。显然，低相干干涉产生的颜色可以代替多色荧光标记编码或位置编码，用于微载体的解码识别应用。

基于上述设计，本发明可应用于核酸（如DNA、RNA等）、蛋白质类（如抗原、抗体、多肽等）、氨基酸、小分子类（如常见毒品，兽药等）以及其他生物分子或小分子的多重快速检测与定量测量，也可以用于检测细胞、细菌、病毒或其他微生物。

通过以下实施实例对本发明做进一步说明。

实施例1、本发明的微载体的制备及其应用效果实验

1.制备微载体及其表面薄膜。

利用硼掺杂的晶型为100的硅片，在1000℃下通入氢气与氧气的混合气体。通过控制反应时间，控制其表面二氧化硅薄膜厚度。最后采用划片工艺，制备大小为500μmx500μm的微载体。制备了具有93.0nm、267.2nm和360.7nm薄膜厚度的微载体。

对于特定薄膜厚度，其反应时间可通过下述公式获得：

t = \frac{X_{o}^{2}}{B} + \frac{X_{o}}{B / A}

其中A、B均为常数，X_o为二氧化硅薄膜厚度，t为所需要的氧化反应时间。（其中A、B参数取值及具体工艺过程可参见文献：B.Deal,E.and L.E.Grove,J.Appl.Phys,1965,34,418-423.）

2.利用共价交联或物理吸附的方法固定探针于薄膜表面，并进行表面封闭。具体固定探针的方法是，微载体首先在丙酮中用超声波降解法清洗，而后在甲醇中冲洗，最后用去离子水冲洗芯片。然后，将芯片放入质量百分比浓度为10％的NaOH溶液中10分钟，再用去离子水清洗，并用氮气吹干。然后将芯片置于体积分数为3%的3-缩水甘油氧基丙基甲基二乙氧基硅烷的甲苯溶液3分钟，再用甲苯冲洗5分钟。芯片用氮气吹干，密封并置于真空干燥箱中，使用前在-4℃下贮存24小时。将表面修饰过的93.0nm、267.2nm和360.7nm的微载体分别于2mg/ml的人IgG（北京中杉金桥生物技术有限公司，ZDR-5002）、小鼠IgG（北京中杉金桥生物技术有限公司，ZDR-5006）、兔IgG溶液（北京中杉金桥生物技术有限公司，ZDR-5004）中，室温下）反应1小时，以链接表面探针。

3.取100μL靶标溶液（5μg/ml Cy3标记的羊抗小鼠IgG溶液，北京博奥森生物技术有限公司，bs-0296G-Cy3），将上述制备的93.0nm、267.2nm和360.7nm并固定不同探针的微载体置于5μg/ml Cy3标记的羊抗小鼠IgG溶液中，室温反应至0.5h。

4.反应结束后，利用荧光显微镜（DP71,奥林巴斯,日本）采集微载体表面的荧光图像，确认是否有靶标分子结合。

5.使用上述的荧光显微镜，在明场照明下（图2所示，也可使用光谱仪）采集微载体的低相干图像，在RGB空间分析其表面颜色以实现解码，可以获得靶标分子的具体类型。薄膜厚度为93.0nm、267.2nm和360.7nm的微载体RGB值分别为（63.4±0.89，36.8±1.92，34.6±1.67），（172.0±2.12，63.4±0.89，69.4±1.82），（89.2±1.92，134.6±1.67，67.6±1.52）。

6.分析数据获得阳性信号所对应的微载体载有的探针类型，完成对靶标分子的检测鉴定。93.0nm、267.2和360.7nm的微载体表面的荧光信号噪声比如下：1.12±0.12，8.37±0.21，1.09±0.08。阳性信号约是阴性信号的8倍，显示了良好的特异性。

实施例2、本发明微载体薄膜厚度分辨率验证

按照实施例1的步骤1的方法制备具有氧化硅薄膜和硅基底的微载体，其中薄膜厚度为83.2nm、87.7nm、93.0nm。

使用上述采集微载体的低相干图像的系统采集微载体的低相干图像，在RGB空间分析其表面颜色以实现解码，83.2nm、87.7nm、93.0nm RGB值分别为（82.4±1.52，39.6±1.67，28.0±2.55），（76.6±2.07，32.0±2.35，22.0±1.01），（65.2±0.93，34.2±1.92，35.0±1.71）,

如图4所示，这三个具有约5nm厚度差别的微载体，其表面颜色信号可在R，G，B三个通道内获得明显区分，并且通过T检验分析，发现三个通道内的信号均存在显著性差异。（***：p<0.001;**:p<0.01,*:p<0.05，p<0.05即为存在显著性差异）。

即可通过该方法实现5nm的纵向薄膜厚度分辨率。又如上所述利用图3所得到的RGB值与薄膜厚度的关系可以发现，当薄膜厚度在1μm以内，薄膜颜色与薄膜厚度呈现一一对应关系。因此，本发明的微载体同时编码个数可达到200个。

实施例3、本发明微载体灵敏度检测

使用实施例1的步骤1-2所述的方法制备的薄膜厚度为93.0nm、267.2nm和360.7nm的微载体，按照实施例1中的步骤3的方法检测靶标溶液，靶标溶液为100ul分别将5μg/ml Cy3标记的羊抗小鼠IgG溶液依次使用1x PBS(配制方法：氯化钠(NaCl)：8g，氯化钾(KCl)：0.2g，磷酸氢二钠(Na₂HPO₄)：1.44g，磷酸二氢钾(KH₂PO₄)：0.24g，调pH7.4,定容至1L)进行10、10²、10³、10⁴、10⁵稀释后获得的溶液，使用荧光显微镜检测荧光信号获得靶标分子浓度与荧光信号的之间的关系，采用3σ原则，即用背景荧光信号值加上其三倍偏差作为信号值，求得其检测下限为0.5ng/ml。

上述实施例1-3通过上述具体微载体检测步骤，对具有氧化硅薄膜和硅基底的微载体可达到以下具体指标：

(1)该微载体的薄膜厚度分辨率可达到5nm。

(2)该微载体的羊抗小鼠检测下限0.5ng/mL。

(3)该微载体的编码个数可达到200个。

对于氮化硅、氧化钛、氧化铝、氟化镁、单质金、银或者铬等其他薄膜材料而言，其上下表面反射光均可导致干涉现象。因此，与二氧化硅相类似，其均可在一定的厚度范围内，对低相干光实现调制，形成特异的反射光谱，进而产生表面颜色。那么在厚度范围内，其薄膜厚度会与其表面颜色形成对应关系，实现颜色编码。

Claims

1.一种微载体芯片，包括基底（11），其特征在于，基底（11）上设置可以在低相干光源作用下产生特异性的颜色反射光的表面结构。

2.根据权利要求1所述的微载体芯片，其特征在于：所述可以在低相干光源作用下产生特异性的颜色反射光的表面结构为薄膜结构。

3.根据权利要求2所述的微载体芯片，其特征在于：所述微载体芯片由基底（11），基底上覆盖的薄膜（12），薄膜表面的化学修饰层（13），以及在化学修饰层上以共价键方式或者物理吸附的方式固定的分子探针（14）组成。

4.根据权利要求2或3所述的微载体芯片，其特征在于：所述薄膜（12）的厚度为1μm以下。

5.根据权利要求4所述的微载体芯片，其特征在于：所述薄膜的材料为氮化硅、氧化钛、氧化铝、氟化镁、单质金、银或铬。

6.根据权利要求4或5所述的微载体芯片，其特征在于：表面修饰层可以是氨基、羧基、巯基或环氧基；所述分子探针为核酸、蛋白、多肽、化合物、微生物或者动植物细胞。

7.根据权利要求1-6中任意一项所述的微载体芯片，其特征在于：所述基底的材料为硅、玻璃、金属、塑料或高分子聚合物；基底形状可以是矩形，正方形、圆形、球形、椭圆形或其他对称形状与不规则形状。

8.权利要求1-7中任意一项所述的微载体芯片在检测待测靶标中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述检测待测靶标的方法是将在低相干光源作用下产生不同反射光并分别固定不同探针权利要求1-7中任意一项所述的微载体芯片置于含待测靶标的液体中反应，检测所述微载体生物芯片的表面颜色信息，并在标准颜色空间内进行分析解码，反推出微载体表面透明薄膜的厚度，从而确定微载体上固定的分子探针，通过分子探针确定与其结合的靶标。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述解码所使用的标准颜色空间为CEA、HSI、HSV、RGB、CMY、CMYK、HSL、HSB、Ycc、XYZ、Lab或YUV标准色彩空间。

11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于：所述靶标为核酸、蛋白、多肽、化合物、微生物或者动植物细胞。