CN110687089A - 基于单细胞检测的高通量并行拉曼光谱仪 - Google Patents

基于单细胞检测的高通量并行拉曼光谱仪 Download PDF

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Abstract

本发明提供了用于检测细胞的高通量并行拉曼光谱仪。具体地，本发明提供了一种拉曼光谱仪，它包括：移动平台，用于放置含细胞的待测样品；显微成像模块，用于对待测样品进行显微成像；激光聚焦模块，用于对激光进行聚焦，使激光照射至待测细胞区域，从而以线阵多细胞方式激发拉曼信号；光谱采集模块，用于采集来自被经激光聚焦模块聚焦后的激光照射的细胞所产生的拉曼信号；采集规划控制模块，用于控制所述移动平台根据规划路线进行移动，从而使得所述光谱采集模块进行线阵细胞的拉曼光谱采集；拉曼光谱处理模块，对来自所述光谱采集模块的拉曼光谱进行处理，从而获得对应单个细胞的拉曼光谱信号；输出模块，用于输出检测结果。

Description

基于单细胞检测的高通量并行拉曼光谱仪
技术领域
本发明属于单细胞检测领域，具体涉及一种高通量并行拉曼光谱仪及使用该拉曼光谱仪检测细胞的方法。
背景技术
单细胞分析对重大疾病早期诊断、治疗、药物筛选和细胞生理、病理过程的研究有重要意义，目前已成为研究的热点之一。由于细胞极小，直径一般为5～500μm，体积在fL～nL，组分含量少(fmol～zmol)、种类繁多，使得操纵和分析难度比较大。因此，要开展单细胞水平的研究，细胞信号采集成为必要的前提条件。
单细胞的识别，其基础在于正确的采集表征细胞信息的指标。现有传统流式细胞仪中，细胞和颗粒信息的识别主要采用普通光信号，单位时间对目标的信息获得率较低，因此在满足工程应用的识别效率前提下，缺乏足够信息量，只能对细胞/颗粒的形态、折光率、反射率或荧光强度等有限指标进行区分，而难以区分活体细胞的细胞类型和生理特性，更无法提供细胞水平的基因表达与功能信息，使将拉曼技术用于单细胞分析显得尤为重要。
拉曼光谱是一种高效的信息识别技术，通过对特定入射光线对化合物的非弹性散射谱线分析，拉曼显微光谱可以直接检测化合物分子振动或转动能级，通过对拉曼特征谱线的分析，可以获得化合物分子构成和结构信息。
但是目前已有的拉曼显微技术用于样品分析时存在缺陷，以微生物单细胞测量为例：单细胞拉曼光谱信号强度较弱，尤其是当细胞悬浮于液体中时，通常仅有106-8分之一的光子通过拉曼散射，导致获得完整可信的拉曼光谱信号的光谱扫描时间较长，从而致使采集通量较低。由于细胞内物质组分含量低，为了获取有效的拉曼信号，提高采集时间成为必要的手段，从而对采集通量造成影响。目前商品化拉曼光谱仪大多设计为在静止或光镊捕获相对静止状态下，通过单点采集来获得高质量的信号，其信号采集模式和通量均无法满足高通量采集的要求。
综上所述，本领域迫切需要开发一种高效、快速、准确地进行单细胞检测的高通量并行拉曼光谱仪及使用该拉曼光谱仪检测细胞的方法。
发明内容
本发明的目的就是一种高效、快速、准确地进行单细胞检测的高通量并行拉曼光谱仪及使用该拉曼光谱仪检测细胞的方法。
在本发明的第一方面，提供了一种用于检测细胞的拉曼光谱仪，所述拉曼光谱仪包括：
移动平台(9)，所述移动平台用于放置含细胞的待测样品；
显微成像模块，所述显微成像模块用于对待测样品进行显微成像；
激光聚焦模块，所述激光聚焦模块用于对激光进行聚焦，使激光照射至待测细胞区域，从而以线阵多细胞方式激发拉曼信号；
光谱采集模块，所述光谱采集模块用于采集来自被经激光聚焦模块聚焦后的激光照射的细胞所产生的拉曼信号；
采集规划控制模块，所述采集规划控制模块用于控制所述移动平台根据规划路线进行移动，从而使得所述光谱采集模块进行线阵细胞的拉曼光谱采集；
拉曼光谱处理模块，所述的拉曼光谱处理模块对来自所述光谱采集模块的拉曼光谱进行处理，从而获得对应单个细胞的拉曼光谱信号；
输出模块，所述的输出模块用于输出检测结果。
在另一优选例中，所述采集规划控制模块基于图像处理方式对细胞进行识别和采集路径规划，从而控制移动平台根据规划路线进行移动。
在另一优选例中，所述的拉曼光谱仪还包括：
时序控制模块，所述的时序控制模块用于按预定的或所需的时序，控制所述移动平台的移动，以及所述光谱采集模块的工作状态。
在另一优选例中，在所述的时序中，当所述移动平台的移动时，所述光谱采集模块不进行拉曼光谱采集；而当所述移动平台的不移动时，所述光谱采集模块进行拉曼光谱采集。
在另一优选例中，在所述光谱采集模块中，对于所述待测样品中的单个细胞，进行n次拉曼光谱采集，其中n为≥3的正整数。
在另一优选例中，n为4-50。
在另一优选例中，所述的拉曼光谱处理模块还包括高性能计算子模块，以及通过所述高性能计算子模块并行对待测细胞区域中的线阵细胞对应的多个拉曼光谱信号分别进行叠加处理，并单一输出已经进行n次采集的细胞拉曼光谱。
在另一优选例中，所述光谱采集模块包括探测器(12)，且所述的采集规划控制模块还用于划分探测器曝光区域。
在另一优选例中，所述的采集规划控制模块接收来自所述显微成像模块获得的待测样品的显微图像，基于所述显微图像通过图像处理方式进行路径规划，并确定移动平台的移动相关参数和所述探测器曝光区域的划分；所述的移动平台接收来自所述控制模块的所述移动参数，并进行相应移动。
在另一优选例中，所述采集规划控制模块根据显微成像模块的图像可自动对待测细胞进行图像处理、定位和线阵采集线径规划。
在另一优选例中，所述的移动平台移动后，在所述的激光照射于待测样品的区域(即激光聚焦区，优选地为带状聚焦区)中，存在q个细胞，其中q为≥3的正整数。
在另一优选例中，q为4-50；较佳地，q为5-20。
在另一优选例中，所述q个细胞为相同种类的细胞或不同种类细胞。
在另一优选例中，所述光谱采集模块用于对拉曼光谱信号进行分区采集，其中每个分区对应于m个细胞，其中m为1、2或3。
在另一优选例中，m为1。
在另一优选例中，所述光谱采集模块通过光纤对拉曼光谱信号进行分区采集，其中每个分区对应p个光纤通道，其中p为1、2或3。
在另一优选例中，p为1。
在另一优选例中，所述的采集规划控制模块将探测器感光芯片根据线阵细胞个数划分出对应的多个曝光区(即分区)，使各个曝光区(分区)和待测细胞区域的各个细胞一一对应，从而并行获得对应于单个细胞的拉曼光谱信号。
在另一优选例中，在激光聚焦模块中，所述的激光以带状聚焦区形式聚焦于所述的待测细胞区域。
在另一优选例中，所述的带状聚焦区为狭长状。
在另一优选例中，所述的带状聚焦区为或基本为矩形，其中所述矩形的长度a为10～300微米，宽度b为2～40微米；优选地，长度a为200微米，宽度b为30微米。
在另一优选例中，所述的移动平台包括二维移动平台或三维移动平台；优选地，为三维移动平台。
在另一优选例中，所述显微成像模块包括光源(16)和显微物镜(8)；
所述激光聚焦模块包括激光器(1)、线光源产生器(4)和显微物镜(8)；以及
所述光谱采集模块包括探测器(12)、显微物镜(8)、狭缝(11)和柱面镜(10)。
在另一优选例中，所述的探测器为CCD或EMCCD；优选地为EMCCD。
在另一优选例中，所述探测器包括曝光用的感光芯片，且所述探测器具有信号采集状态及信号输出状态。
在另一优选例中，所述显微成像模块还包括高速CCD(15)、分光片(13)，和双胶合透镜(14)。
在另一优选例中，所述光源为LED光源。
在另一优选例中，所述激光聚焦模块还包括：衰减器(2)、扩束镜(3)、长通滤波片(6)和一个或多个反射镜(5)。
在另一优选例中，所述光谱采集模块还包括二向色镜(7)、和长通滤波片(6)。
本发明的第二方面提供了一种一种检测细胞的方法，所述方法包括步骤：
(1)提供一种含细胞的待测样品；
(2)用如第一方面所述的用于检测细胞的拉曼光谱仪，对所述待测样品进行检测，从而获得对应于所述检测样品的拉曼光谱信号，从而获得检测结果。
在另一优选例中，在步骤(2)中，还包括步骤：将所述的拉曼光谱信号与构建的单细胞表型数据库中的标准的拉曼光谱信号或参考的拉曼光谱信号进行比较，获得确定细胞的类型。
在另一优选例中，所述的待测样品固定于固相载体上。
在另一优选例中，所述固相载体为载玻片；更优选地，所述载体为CaF2载玻片。
在另一优选例中，所述待测样品是通过将107～109个细胞/mL的细胞溶液点至所述固相载体后，干燥得到的。
在另一优选例中，在所述固相载体上点0.5～2uL的所述细胞溶液。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1为光谱仪系统光路图；
图2为高通量细胞样品采集工作时序控制示意图；
图3为探测器感光芯片工作区域划分方式示意图。
图4为大肠杆菌细胞并行采集的7个拉曼谱图。
图5为叠加了10次后的光谱信号的光谱，其中Sa代表的是金黄色葡萄球菌细胞，E.coli代表的是大肠杆菌细胞。
图中，各标识如下：
1为激光器；2为衰减器；3为扩束镜；4为线光源产生器；5为反射镜；6为高通滤波片；7为二向色镜；8为显微物镜(或称聚焦物镜)；9为位移平台；10为柱面镜；11为狭缝；12为探测器；13为分光片；14为双胶合透镜；15为高速CCD；16为光源；17为激光光束。
具体实施方式
本发明人经过长期而深入的研究，首次开发了一种用于可高通量并行检测细胞的拉曼光谱仪。通过对模块的优化，本发明的拉曼光谱仪从而可以高效、快速、准确地实现单细胞检测。具体地，本发明的拉曼光谱仪以线阵多细胞方式进行拉曼光谱的激发和采集，从而可对于样品中各个单细胞并行高通量并行检测。在此基础上完成了本发明。
具体地，本发明人设计了拉曼线阵采集的光路，实现线阵细胞的并行采集。此外，本发明还提供了优化的高通量并行拉曼采集算法。此外，为了提高采集速度，本发明还采用单次快速采集、多次测量累加的方式对线阵细胞进行信号获取。此外，本发明还优化采集光路以实现明场下拉曼信号的采集以及细胞表型信息收集，使得明场高速CCD分选过程监控与拉曼信号采集同步进行，并配有基于图像处理方法的采集规划控制模块。
光谱仪
本发明的基于线阵探测技术的高通量并行拉曼光谱仪系统借鉴正置显微镜框架，笼式结构模块化搭建激光聚焦模块、显微成像模块、共焦收集模块、软件采集模块这四大模块，系统的光路图如图1所示。
激光聚焦模块：采用激光器1作为激发光源，激光器出射的激光依次经过衰减器2、扩束镜3、线光源产生器4、反射镜5、高通滤波片(如长通滤波片M4)6和二向色镜7(如二向色镜DM)反射，进入显微物镜8(如10X/50X/100X低中高倍复消色差(APO)显微物镜)，以实现线阵并行的细胞拉曼信号激发功能。
显微成像模块：采用光源16(如LED光源)，借鉴柯勒照明结构，分别在眀场反射、暗场透射条件下，配合高速CCD 15获取细胞样品图像。光源(LED)出射的白光经过分光片13反射入射到显微物镜8中，样品的反射光经由聚焦物镜经由双胶合透镜14(如双胶合消色差透镜)聚焦到高速CCD中进行样品成像。
光谱采集模块：基于不同倍率聚焦物镜，优选地，采用共焦狭缝方式进行线性排列的细胞信号采集。样品拉曼信号经过聚焦物镜(显微物镜)8、二向色镜7后反射通过高通滤波片6滤掉激发光的瑞利散射，然后进入柱面镜10从而聚焦到狭缝11中，进入探测器12并通过采集规划控制模块实现对光谱仪的精确控制，完成线阵并行化细胞样品数据采集。
采集规划控制模块：主要借助于图像处理方式、控制光源、高速CCD等器件实现对细胞图像进行识别和位置定位，并进行采集路径规划，进而对光谱仪、激光器、探测器、狭缝和三维平台等关键器件进行精准控制，根据规划路线进行线阵细胞高通量信号并行获取。
参见图2，为了实现高通量信号并行采集，通过控制探测器的工作时序并移动三维电动平台，达到完全相互匹配，实现多个细胞样品并行高速采集和信号获取。参见图3，同时通过对探测器感光芯片工作区域(曝光区域)进行人为控制划分，基于采集细胞数对感光芯片进行曝光区域的划分，使之相互匹配。然后控制三维平台沿着细胞开始移动，并进行光谱信号采集，当同一个细胞在每个曝光区域均采集完成后，进行信号叠加并输出，从而完成多细胞序列中单个细胞的多次测量累加，在缩短了采集时间的同时，尽量减少信号损失。
具体地，(1)本发明通过特殊的拉曼线阵采集光路和/或高通量并行拉曼采集算法，实现线阵细胞的并行采集。(2)本发明通过采用单次快速采集、多次测量累加的方式对线阵细胞进行信号获取以提高采集速度；这种特殊采集方式缩短了单次采集时间，同时又减少信号的损失，从而为后续细胞流式分选通量的提高提供了基础。(3)本发明优化了采集光路，实现明场下拉曼信号的采集以及细胞表型信息收集，使得明场高速CCD分选过程监控与拉曼信号采集同步进行。(4)本发明借助于图像处理方法，开发了采集规划控制模块，用于在样品中寻找并定位待测细胞区域及识别区域中的各个单独的细胞位置，实现对细胞进行识别和采集路径规划，从而控制各模块及移动平台根据规划路线对于样品中各个单细胞并行高通量检测。
本发明的主要优点包括：
(a)本发明可对线阵细胞进行并行采集。可一次并行检测多个细胞。
(b)通过分区采集，可多次读取同一细胞的拉曼数据并叠加获得强度较高的细胞拉曼光谱。
(c)本发明通过时序控制模块，有效降低采集“死时间”引起的效率下降，从而能有效提高细胞的采集通量。
(d)本发明采集时间短且信号损失小。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例1
取1mL大肠杆菌细胞悬液，室温以最低转数离心收集细胞，去离子水清洗3遍，重悬于1mL去离子水中，调整细胞数至106/mL，取1uL重悬液点到CaF2载玻片上，在超净台中风干后待测。
检查各部分接线，接线完全正确后，打开1激光器，预热15分钟，打开LED光源16，探测器12、高速CCD15，之后打开探测器和CCD的控制软件；将准备好的干片放在移动平台9上，先使用10X显微物镜找到待测细胞区域，然后换成100X显微物镜，调整三维移动平台的高度，使得细胞清晰成像。通过图像识别技术对细胞进行识别和定位，规划线阵细胞采集路线，控制位移平台使激光点起始位置对准采集路线起始位置首个细胞。
关闭LED光源，打开激光快门，在探测器控制软件上设置采集参数，基于如图2所示工作方式开始进行信号采集和存储。批量测试干片上的细胞，获得拉曼光谱信号，并进行数据分析，得出实验结果(参见图4)。
图4中展示了一个大肠杆菌细胞并行采集的7个拉曼谱图，然后通过叠加方式对信号进行叠加和输出，全过程不需要人工操作，自动批量化完成细胞信号采集，定位细胞准确率93％以上，采集通量至少可达600细胞/分钟，获取90％以上有效细胞信号。
实施例2
分别取1mL大肠杆菌细胞悬液、金黄色葡萄球菌细胞悬液，室温以最低转数离心收集细胞，去离子水清洗3遍，重悬于1mL去离子水中，调整细胞数至106/mL；之后各取500μL均匀混合后，取1μL重悬液点到CaF2载玻片上，在超净台中风干后待测。
检查各部分接线，接线完全正确后，打开1激光器，预热15分钟，打开LED光源16，探测器12、高速CCD15，之后打开探测器和CCD的控制软件；将准备好的干片放在移动平台9上，先使用10X显微物镜找到待测细胞区域，然后换成100X显微物镜，调整三维移动平台的高度，使得细胞清晰成像。通过图像识别技术对混合细胞进行识别和定位，规划线阵细胞采集路线，控制位移平台使激光点起始位置对准采集路线起始位置首个细胞。
关闭LED光源，打开激光快门，在探测器控制软件上设置采集参数，基于如图2所示工作方式开始进行信号采集和存储。批量测试干片上的细胞，获得拉曼光谱信号，并进行数据分析，得出实验结果(参见图5)。
如图5所示的光谱为叠加了10次后的光谱信号，Sa代表的是金黄色葡萄球菌细胞，E.coli代表的是大肠杆菌细胞。整个采集过程不需要人工操作，自动并行化完成细胞信号采集，定位细胞准确率93％以上，采集通量至少可达600细胞/分钟，获取90％以上有效细胞信号，并且根据细胞的光谱数据结合单细胞表型数据库区分金黄色葡萄球菌和大肠杆菌信号。
对比例1
取1mL大肠杆菌细胞悬液，室温以最低转数离心收集细胞，去离子水清洗3遍，重悬于1mL去离子水中，调整细胞数至106/mL，取1uL重悬液点到CaF2载玻片上，在超净台中风干后待测。
通常采用的是常规共焦拉曼光谱仪，其采集方式是单点测量方法。对于干片上的细胞，通过移动平台将激光光点对准单个细胞，采集一个拉曼光谱，然后调整三维位移平台，依次逐个的测试待测细胞，此类方式采集细胞拉曼信号通量约为60细胞/分钟。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种用于检测细胞的拉曼光谱仪，其特征在于，所述拉曼光谱仪包括：
移动平台(9)，所述移动平台用于放置含细胞的待测样品；
显微成像模块，所述显微成像模块用于对待测样品进行显微成像；
激光聚焦模块，所述激光聚焦模块用于对激光进行聚焦，使激光照射至待测细胞区域，从而以线阵多细胞方式激发拉曼信号；
光谱采集模块，所述光谱采集模块用于采集来自被经激光聚焦模块聚焦后的激光照射的细胞所产生的拉曼信号；
采集规划控制模块，所述采集规划控制模块用于控制所述移动平台根据规划路线进行移动，从而使得所述光谱采集模块进行线阵细胞的拉曼光谱采集；
拉曼光谱处理模块，所述的拉曼光谱处理模块对来自所述光谱采集模块的拉曼光谱进行处理，从而获得对应单个细胞的拉曼光谱信号；
输出模块，所述的输出模块用于输出检测结果。
2.如权利要求1所述的拉曼光谱仪，其特征在于，所述采集规划控制模块基于图像处理方式对细胞进行识别和采集路径规划，从而控制移动平台根据规划路线进行移动。
3.如权利要求1所述的拉曼光谱仪，其特征在于，所述的拉曼光谱仪还包括：
时序控制模块，所述的时序控制模块用于按预定的或所需的时序，控制所述移动平台的移动，以及所述光谱采集模块的工作状态。
4.如权利要求1所述的拉曼光谱仪，其特征在于，在所述光谱采集模块中，对于所述待测样品中的单个细胞，进行n次拉曼光谱采集，其中n为≥3的正整数。
5.如权利要求4所述的拉曼光谱仪，其特征在于，所述的拉曼光谱处理模块还包括高性能计算子模块，以及通过所述高性能计算子模块并行对待测细胞区域中的线阵细胞对应的多个拉曼光谱信号分别进行叠加处理，并单一输出已经进行n次采集的细胞拉曼光谱。
6.如权利要求1所述的拉曼光谱仪，其特征在于，所述光谱采集模块包括探测器(12)，且所述的采集规划控制模块还用于划分探测器曝光区域。
7.如权利要求1所述的拉曼光谱仪，其特征在于，在激光聚焦模块中，所述的激光以带状聚焦区形式聚焦于所述的待测细胞区域。
8.如权利要求1所述的拉曼光谱仪，其特征在于，所述显微成像模块包括光源(16)及显微物镜(8)；
所述激光聚焦模块包括激光器(1)、线光源产生器(4)及显微物镜(8)；以及
所述光谱采集模块包括探测器(12)、显微物镜(8)、狭缝(11)及柱面镜(10)。
9.一种检测细胞的方法，其特征在于，包括步骤：
(1)提供一种含细胞的待测样品；
(2)用权利要求1所述的用于检测细胞的拉曼光谱仪，对所述待测样品进行检测，从而获得对应于所述检测样品的拉曼光谱信号，从而获得检测结果。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，还包括步骤：将所述的拉曼光谱信号与构建的单细胞表型数据库中的标准的拉曼光谱信号或参考的拉曼光谱信号进行比较，获得确定细胞的类型。
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