CN103529014A

CN103529014A - 可精确调节共焦区域的显微共焦拉曼外光路装置

Info

Publication number: CN103529014A
Application number: CN201310525118.1A
Authority: CN
Inventors: 范苑; 刘木华; 吴瑞梅; 艾施荣; 吴彦红; 王晓彬; 严霖元
Original assignee: Jiangxi Agricultural University
Current assignee: Jiangxi Agricultural University
Priority date: 2013-10-31
Filing date: 2013-10-31
Publication date: 2014-01-22

Abstract

本发明可精确调节共焦区域的显微共焦拉曼外光路装置，属于拉曼光谱技术领域。提出一种可精确连续调节共焦区域大小的显微共焦拉曼光谱仪外光路装置，装置中的显微物镜采用变倍显微物镜，利用目镜观察对应的共焦区域，通过调节变倍显微物镜来实现对共焦区域的目视精确连续调节。本发明由显微共焦观察光路子系统可准确观察到由显微共焦拉曼散射光收集光路子系统的共焦区域范围；利用变倍显微物镜可实现对显微共焦拉曼散射光收集光路子系统的共焦区域大小的连续调节。

Description

可精确调节共焦区域的显微共焦拉曼外光路装置

技术领域

本发明涉及拉曼光谱技术领域，特指一种可精确调节共焦区域的显微共焦拉曼外光路装置。

背景技术

激光拉曼光谱技术是基于拉曼散射效应而发展起来的光谱分析技术，能得到物质的分子振动、转动信息，每种物质分子都有其特定的特征拉曼谱峰，已广泛应用于物质的鉴定、分子结构研究。当激发光照射到物质上时会发生弹性散射和非弹性散射，散射光中除有与激发光波长相同的弹性成分(这部分光是瑞利散射光)以外，还有比激发光波长长的和短的成分(这部分光是拉曼散射光)。由于拉曼散射光强度很弱，比瑞利散射光强度小10¹⁰～10¹⁴倍。因此拉曼光谱仪的设计，必须能排除瑞利散射光，且灵敏度高，才能有效收集物质的拉曼散射光谱。

激光显微拉曼技术的出现使拉曼光谱仪的灵敏度和分辨率大大提高，激光显微拉曼光谱仪是显微技术和拉曼光谱技术的完美结合，采用显微共焦方式来滤除杂散光。如申请号201110288486.X、名称为“一种显微共焦拉曼光谱仪”的专利申请，采用现成的商业化显微镜模块来实现对样品的显微观察，再利用显微模块和针孔相结合的方式实现显微共焦，达到提高拉曼光谱仪信噪比的目的。英国显微拉曼光谱仪制造商雷尼绍公司生产的inVia Reflex型号激光显微拉曼光谱仪，采用德国leica显微镜，标配有5倍、20倍、50倍、100倍显微物镜，同样采用显微共焦模块来减少杂散光，以实现高信噪比的目的。上述显微共焦拉曼模块采用物镜旋转台来切换不同倍率显微物镜，显微物镜的放大倍率是固定的，通常为：5倍、10倍、20倍、50倍和100倍。虽然通过更换固定倍率的显微物镜可实现对不同大小样品的微区拉曼分析，但存在一些缺陷：(1)显微物镜的放大倍率是非连续的，无法对样品微区连续放大观察。(2)显微共焦光路收集拉曼光谱信号的共焦区域范围大小调节是非连续的。(3)共焦针孔的调节或更换仅凭个人经验和感觉，如果共焦针孔直径过大，会有更多的瑞利散射信号和杂散光进入光栅光谱仪；如果共焦针孔过小，则有一部分微弱拉曼信号被挡在共焦针孔外面，两种情况都会造成信噪比的降低。

发明内容

本发明的目的是为克服现有技术的不足，提出一种可精确连续调节共焦区域大小的显微共焦拉曼光谱仪外光路装置(装置中的显微物镜采用变倍显微物镜)，利用目镜观察对应的共焦区域，通过调节变倍显微物镜来实现对共焦区域的目视精确连续调节。

本发明的技术方案是：

可精确调节共焦区域的显微共焦拉曼外光路装置，包括显微共焦观察光路子系统、显微拉曼激光激发光路子系统、显微共焦拉曼散射光收集光路子系统；三个光路子系统按照光路顺序次连接而成，构成T型常见显微共焦结构。

可精确调节共焦区域的显微共焦拉曼外光路装置中设置有样品台，待测样品放置在水平放置的样品台上，该样品台在x，y，z三个方向可调；其中所述的显微共焦观察光路子系统垂直于水平放置的样品台，用于精确定位待测样品目标微区和选择合适共焦目标微区大小，包括变倍显微物镜、镜筒透镜、观察针孔、目镜和白光照明光源组成；沿垂直于水平样品台方向，由下至上依次配置变倍显微物镜、镜筒透镜、观察针孔和目镜，白光照明光源位于水平样品台左上方；

其中所述的显微拉曼激光激发光路子系统，用于将激光精确聚焦到待测样品的目标微区表面中央，包括激光器、激光扩束器、全反射镜I、全反射镜II、凹陷滤光片I、全反射镜III和变倍显微物镜；激光器位于显微共焦观察光路子系统右侧下方，激光器水平向左放置，在激光器出射光路上水平方向依次配置激光扩束器、全反射镜I、沿全反射镜I反射方向放置的全反射镜II、沿全反射镜II反射方向放置的凹陷滤光片I、沿凹陷滤光片I光路反射方向放置的全反射镜III和全反射镜III下方放置的变倍显微物镜。

其中所述的显微共焦拉曼散射光收集光路子系统，用于将待测样品目标微区的拉曼信号收集并滤除绝大部分瑞利散射光后，聚焦进入共焦针孔，包括变倍显微物镜、全反射镜III、凹陷滤光片I、凹陷滤光片II、聚焦透镜和共焦针孔；沿垂直于水平样品台方向依次配置变倍显微物镜、全反射镜III、沿全反射镜III反射方向依次配置的凹陷滤光片I、凹陷滤光片II、聚焦透镜和共焦针孔。

利用上述可精确调节共焦区域的显微共焦拉曼外光路装置获取物质的拉曼光谱信号的方法，按照下述步骤进行：(1)打开显微镜照明白光源，利用目镜观察样品，上下调整样品位置至清晰，水平调整样品至待测微区位于目镜视场中心。加入观察针孔，调节变倍显微物镜，直到选定好最佳共焦区域。(2)打开激光器，激光通过显微拉曼激光激发子系统精确聚焦到待测样品表面，待测样品被激光激发后产生拉曼散射光和瑞利散射光。(3)由显微共焦拉曼信号收集光路子系统收集拉曼散射光和瑞利散射光，该子系统中的凹陷滤光片将瑞利散射光滤除，而拉曼散射光则被聚焦透镜聚焦，进入光栅光谱仪的前置针孔，最后由光栅光谱仪获取拉曼散射信号。

本发明的有益效果：

1.由显微共焦观察光路子系统可准确观察到由显微共焦拉曼散射光收集光路子系统的共焦区域范围。

2.利用变倍显微物镜可实现对显微共焦拉曼散射光收集光路子系统的共焦区域大小的连续调节。

附图说明

图1为一种可精确调节共焦区域的显微共焦拉曼外光路装置的结构示意图，其中1、激光器2、激光扩束器3、全反射镜I4、全反射镜II5、凹陷滤光片I6、凹陷滤光片II7、全反射镜III8、变倍显微物镜9、样品台10、白光照明光源11、镜筒透镜12、观察针孔13、目镜14、眼睛15、聚焦透镜16、共焦针孔17、光栅光谱仪18、吸光装置。

图2为利用光学模拟软件模拟得到的显微共焦拉曼外光路装置的光路图。

图3为变倍显微物镜倍率分别为40X、20X、13.3X(对应焦距分别为4.5mm，9mm，13.5mm)时的光学结构图。

图4为显微共焦拉曼散射光收集光路子系统的共焦原理图。

图5为通过目镜观察到的样品在变倍显微物镜的不同倍率下的共焦区域图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明进一步说明。本发明的可精确调节共焦区域的显微共焦拉曼外光路系统结构图如图1所示，按功能分为3个子系统：显微共焦观察光路子系统、显微拉曼激光激发光路子系统、显微共焦拉曼散射光收集光路子系统。三个光路子系统利用多个二向色镜依次连接而成，构成T型常见显微共焦结构。

可精确调节共焦区域的显微共焦拉曼外光路装置中设置有样品台9，待测样品放置在水平放置的样品台上，该样品台在x，y，z三个方向可调。显微共焦观察光路子系统垂直于水平样品台9，用于精确定位待测样品目标微区和选择合适共焦目标微区大小。沿垂直于水平样品台9方向，由下至上依次配置变倍显微物镜8、可移除全反射镜7、镜筒透镜11、观察针孔12和目镜13，白光照明光源10位于水平样品台9左上方；显微拉曼激光激发光路子系统用于将激光精确聚焦到待测样品的目标微区表面中央。激光器1位于显微共焦观察光路子系统右侧下方，并且激光出射方向垂直于显微共焦观察光路子系统。在激光器1的激光出射光路上水平方向，依次配置激光扩束器2、全反射镜3、沿反射镜3反射方向放置的全反射镜4、沿全反射镜4反射方向放置的凹陷滤光片5、沿凹陷滤光片5光路反射方向放置的全反射镜7和全反射镜7下方的变倍显微物镜8；显微共焦拉曼散射光收集光路子系统用于收集待测样品目标微区的拉曼信号并滤除绝大部分瑞利散射光后，聚焦进入共焦针孔16，该子系统由垂直于水平样品台的变倍显微物镜8、位于变倍显微物镜8正上方的全反射镜7、沿全反射镜7反射方向依次配置的凹陷滤光片5、凹陷滤光片6、聚焦透镜15和光栅光谱仪前置共焦针孔16和光栅光谱仪17组成。

显微共焦观察光路子系统用于观察样品表面及寻找目标微区，使用时须移除全反射镜7，利用白光照明光源10照射样品9，被照明样品9经变倍显微物镜8和镜筒透镜11成像到观察针孔12所在平面，人眼14通过目镜13，可对样品表面微小结构进行观察。上下调节样品9至清晰可见，水平调整样品9，使待测目标区域位于目镜视场中央。加入观察针孔12(其直径与共焦针孔16的直径相同)，调整变倍显微物镜8的倍率，目镜13的可视范围随着物镜倍率的变化而放大或缩小，直至调整到目镜13可见区域恰好为待测样品目标微区时为止。此时选定的区域即是显微共焦拉曼散射光收集光路子系统的最佳共焦区域范围，实现对样品表面微结构的观察定位，同时还可精确确定共焦区域的范围。

显微共焦观察光路子系统精确选取共焦区域原理如下：显微共焦观察光路子系统和显微共焦拉曼散射光收集光路子系统共同使用变倍显微物镜8，镜筒透镜11和聚集透镜15为同一型号透镜，即：f_镜筒透镜＝f_聚焦透镜，故显微共焦观察光路子系统和显微共焦拉曼散射光收集光路子系统光学成像的放大倍率相同(即：

)，而且观察针孔12和共焦针孔16的直径相同。因此，由目镜13观察到的区域和由显微共焦拉曼光谱收集子系统收集拉曼光谱的共焦区域是完全相同的。利用显微共焦观察光路子系统选定好最佳共焦区域后，用显微共焦拉曼散射光收集光路子系统收集拉曼光谱信号，可达到精确共焦去除杂散光的目的。

显微拉曼激光激发光路子系统的作用是将激光精确聚焦到待测样品微区表面中央。激光激发被测样品后，除产生拉曼散射光外，还伴随有瑞利散射光。利用此子系统将激光精确聚焦到被测样品表面激发产生拉曼散射光和瑞利散射光的过程如下：利用显微共焦观察光路子系统选定好最佳共焦区域后，插入全反射镜7(反射镜的位置如附图1所示)；打开激光器1，激光依次经过激光扩束器2、全反射镜3、全反射镜4、凹陷滤光片5、全反射镜7反射后，由变倍显微物镜8聚集到待测样品9上，样品被激发产生拉曼散射光和瑞利散射光；

显微共焦拉曼散射光收集光路子系统用于收集尽可能多的拉曼散射光谱信号，滤除瑞利散射光信号。在打开激光器1的同时，待测样品9被激发产生拉曼散射光和瑞利散射光，此时，拉曼散射光和瑞利散射光被变倍显微镜物镜8收集并准直变成平行光，平行光被全反射镜7反射折转90度后，到达凹陷滤光片5，此时跟激发光波长相同的部分光波(跟激发光波长相同的光是瑞利散射光)由凹陷滤光片5反射，而比激发光波长长的和短的光波(比激发光波长的和短的光波是拉曼散射光)则透过凹陷滤光片5和凹陷滤光片6，透过的拉曼散射光被聚焦透镜15聚焦到光栅光谱仪前置共焦针孔16，而共焦针孔16的直径和显微共焦观察光路子系统中的观察针孔12的直径相同，则由共焦针孔16滤除了大部分共焦区域以外的各种杂散光。透过共焦针孔16的散射光即共焦区域范围内的拉曼散射光被光栅光谱仪17收集。

本发明由光学模拟软件模拟了激发光、拉曼散射光和瑞利散射光的传输路径。模拟得到的激发光、拉曼散射光和瑞利散射光的传输路径如附图2所示。通过模拟发现，本系统具有良好的杂散光抑制能力，加入两片凹陷滤光片可将瑞利散射强度降低10¹²个数量级。由模拟结果发现，系统中还存在一些不可避免的较强内部杂散光，本发明通过添加吸光装置18来吸收内部杂散光。

变倍显微物镜8的主要特点是可实现连续变焦。在镜筒透镜13和聚焦透镜15焦距都为180mm时，连续变倍显微物镜8的倍率调节范围为13.3倍～40倍，对应的可调焦距范围为4.5mm～13.5mm，在不更换显微物镜的情况下，可实现共焦区域范围大小的连续调节。附图3为调节变倍显微物镜的倍率分别为：40倍、20倍、13.3倍时(对应焦距分别为：4.5mm、9mm、13.5)的光学结构图。

激光显微拉曼光谱仪最关键技术之一是实现共焦。附图4(a)为本发明所用共焦光路原理图，样品9表面散射光经变倍显微物镜8准直，由全反射镜7反射折转90度后，被聚焦透镜15会聚到共焦针孔16上。共焦区域内散射光经过共焦光路后，大部分散射光被会聚在共焦针孔16的针孔中央，可以顺利经过共焦针孔16，共焦区域内散射光投射到共焦针孔16表面上的光线散点图如附图4(b)所示。而非共焦区域光线(即杂散光)经过共焦光路后，大部分被会聚在共焦针孔16的针孔周围，不能透过共焦针孔16，非共焦区域光线在共焦针孔16表面的光线散点图如附图4(c)所示。由模拟图可看出，本发明的外光路系统能滤除共焦区域以外的杂散光。

附图5为通过目镜观察到的样品在变倍显微物镜不同倍率下的共焦区域图，图中圆圈中的深色区域为待测样品微区，浅色区域为杂散光区域。附图5(a)为不加入观察针孔12，且变倍显微物镜8的放大倍率调至13.3倍时，通过目镜13观察到的样品表面目标区域图。该倍率目镜的实际视场区域范围为0.3mm×0.3mm，区域中深色部分为待测样品微区，深色区域周围的浅色区域为可能引入的杂散光区域。由图可看出，由共焦光路能将浅色区域的杂散光排除在共焦针孔16之外。附图5(b)为共焦针孔16的直径为0.5mm，且变倍显微物镜8的放大倍率为13.3倍时，显微共焦拉曼光谱收集子系统的实际共焦区域图。由图可看出，共焦区域中还包含有浅色杂散光区域，未能实现通过共焦原理将浅色区域的杂散光排除在共焦针孔16外的目的。附图5(c)为变倍显微物镜放大倍率为40倍时，显微共焦拉曼光谱收集子系统的实际共焦区域图。由图可看出，共焦针孔16能完全将浅色区域的杂散光排除。但由于放大倍率过大，共焦针孔16也将部分深色区域待测样品微区信号排除在外，导致了原本十分微弱的拉曼散射光损失。附图5(d)为变倍显微物镜放大倍率为22.5倍时，显微共焦拉曼光谱收集子系统的实际共焦区域。由图可看出，待测样品的微区散射光可全部通过共焦针孔16，而浅色杂散光则被共焦针孔16完全排除，实现最佳共焦来滤除杂散光，最大限度收集有用拉曼光谱信号，提高了显微共焦拉曼光谱仪器的信噪比。

Claims

1.可精确调节共焦区域的显微共焦拉曼外光路装置，其特征在于包括显微共焦观察光路子系统、显微拉曼激光激发光路子系统、显微共焦拉曼散射光收集光路子系统；三个光路子系统按照光路顺序依次连接而成，构成T型常见显微共焦结构。

2.根据权利要求1所述的可精确调节共焦区域的显微共焦拉曼外光路装置，其特征在于可精确调节共焦区域的显微共焦拉曼外光路装置中设置有样品台，其中所述的显微共焦观察光路子系统垂直于水平放置的样品台，该样品台在x，y，z三个方向可调，用于精确定位待测样品目标微区和选择合适共焦目标微区大小，包括变倍显微物镜、镜筒透镜、观察针孔、目镜和白光照明光源组成；沿垂直于水平样品台方向，由下至上依次配置变倍显微物镜、镜筒透镜、观察针孔和目镜，白光照明光源位于水平样品台左上方。

3.根据权利要求1所述的可精确调节共焦区域的显微共焦拉曼外光路装置，其特征在于其中所述的显微拉曼激光激发光路子系统，用于将激光精确聚焦到待测样品的目标微区表面中央，包括激光器、激光扩束器、全反射镜I、全反射镜II、凹陷滤光片I、全反射镜III和变倍显微物镜；激光器位于显微共焦观察光路子系统右侧下方，激光器水平向左放置，在激光器出射光路上水平方向依次配置激光扩束器、全反射镜I、沿全反射镜I反射方向放置的全反射镜II、沿全反射镜II反射方向放置的凹陷滤光片I、沿凹陷滤光片I光路反射方向放置的全反射镜III和全反射镜III下方放置的变倍显微物镜。

4.根据权利要求1所述的可精确调节共焦区域的显微共焦拉曼外光路装置，其特征在于其中所述的显微共焦拉曼散射光收集光路子系统，用于将待测样品目标微区的拉曼信号收集并滤除绝大部分瑞利散射光后，聚焦进入共焦针孔，包括变倍显微物镜、全反射镜III、凹陷滤光片I、凹陷滤光片II、聚焦透镜和共焦针孔；沿垂直于水平样品台方向依次配置变倍显微物镜、全反射镜III、沿全反射镜III反射方向依次配置的凹陷滤光片I、凹陷滤光片II、聚焦透镜和共焦针孔。

5.利用上述权利要求1所述的可精确调节共焦区域的显微共焦拉曼外光路装置获取物质的拉曼光谱信号的方法，按照下述步骤进行：(1)打开显微镜照明白光源，利用目镜观察样品，上下调整样品位置至清晰，水平调整样品至待测微区位于目镜视场中心；加入观察针孔，调节变倍显微物镜，直到选定好最佳共焦区域；(2)打开激光器，激光通过显微拉曼激光激发子系统精确聚焦到待测样品表面，待测样品被激光激发后产生拉曼散射光和瑞利散射光；(3)由显微共焦拉曼信号收集光路子系统收集拉曼散射光和瑞利散射光，该子系统中的凹陷滤光片将瑞利散射光滤除，而拉曼散射光则被聚焦透镜聚焦，进入光栅光谱仪的前置针孔，最后由光栅光谱仪获取拉曼散射信号。