CN103926228A - 一种激光扫描共焦荧光显微内窥成像系统 - Google Patents
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Abstract
本发明属于三维显微成像领域，提供了一种荧光共焦显微成像系统。该系统是在现有可获取样品三维层析图像的激光光源和共焦成像光路的基础上，另外增加可得到宽场图像的宽场成像光路、宽场照明激光光源、以及面阵探测器，并增加共焦成像光路与宽场成像光路配合使用的光学器件，以实现宽场图像与三维层析图像的同时显示。该系统可首先利用宽场图像成像模式获得宽场图像，实现对样品上待观测目标的快速搜索，在锁定待观测目标后，利用三维层析图像成像模式获得待观测目标的高精度三维层析图像，并同时获得样品的宽场表面图像。相对于现有技术，解决了样品逐点扫描所带来的扫描时间长的问题，同时结构简单，降低了系统成本，有利于系统的产业化应用。
Description
技术领域
本发明属于三维显微成像领域，尤其涉及一种荧光共焦显微成像系统。
背景技术
共焦显微成像系统是一种可对生物样品等实现光学断层成像的系统。在共焦显微成像系统中，点光源发出的光经第一物镜后聚焦到样品表面，再由样品反射或透射后经聚光镜再聚焦到探测器。点光源、物体、探测器前的小孔三者是互相共轭的。由扫描机构对样品进行xy平面扫描以得到样品的一幅二维图像，再由轴向扫描便可得到样品多个层面的扫描图像，各层图像经过图像处理，便可重构出样品的高分辨率三维层析图像。
荧光共焦显微成像系统是通过激光照射样品以激发样品发出荧光，再通过探测器接受荧光来对样品进行观察的共焦显微成像系统。现有技术提供的荧光共焦显微成像系统不具有快速准确寻找目标能力，需要采用激光逐点大范围扫描，使得获取目标样品的三维层析图像的时间较长，准确成像目标物体比较难，且由于需要采用结构复杂的扫描系统，使得系统成本增加，不利于产业化。
发明内容
本发明的目的在于提供一种荧光共焦显微成像系统，旨在解决现有的荧光共焦显微成像系统不具有快速准确寻找目标能力，需要采用激光逐点大范围扫描，使得获取目标样品的三维层析图像的时间较长，准确成像目标物体比较难，，且使得系统成本高、不利于产业化的问题。
本发明是这样实现的，一种荧光共焦显微成像系统，所述系统包括：
用于产生激发光的激光光源；
放置在所述激光光源发出的所述激发光的光路上的共焦成像光路；
放置在所述激发光经所述共焦成像光路后的光路上的第一双色镜；
放置在所述激发光经所述第一双色镜透过后的光路上的第一物镜；
放置在所述激发光经所述第一物镜会聚后的光路上的光纤束；
放置在所述激发光经所述光纤束后的光路上的第一显微透镜；
放置在所述激发光经所述第一显微透镜后的光路上的第二显微透镜；
带动所述第一显微透镜和所述第二显微透镜移动的压电陶瓷；
放置在所述激发光激发样品得到的荧光经所述共焦成像光路后的光路上的探测器；
发出宽场成像激光的宽场照明激光光源；
放置在所述宽场照明激光光源发出的所述宽场成像激光的光路上的宽场成像光路，所述宽场成像激光经所述宽场成像光路和所述第一双色镜全反射并会聚到所述第一物镜的后焦面；
放置在所述宽场成像激光经所述样品反射得到的反射光经所述宽场成像光路后的光路上的面阵探测器。
本发明提供的荧光共焦显微成像系统是在现有可获取样品三维层析图像的激光光源和共焦成像光路的基础上，另外增加可得到宽场图像的宽场成像光路、宽场照明激光光源、以及面阵探测器，并增加共焦成像光路与宽场成像光路配合使用的光学器件，以实现宽场图像与三维层析图像的同时显示。该系统在工作时，可首先利用宽场图像成像模式获得宽场图像，实现对样品上待观测目标的快速搜索，在锁定待观测目标后，通过调节第一显微透镜和所述第二显微透与光纤束端面距离，调节宽场图像范围大小，实现准确寻找共焦成像目标位置，最后利用三维层析图像成像模式获得待观测目标的高精度三维层析图像，并同时获得样品的宽场表面图像。相对于现有的荧光共焦显微成像系统，解决了样品逐点扫描所带来的扫描时间长、目标位置难以确定等问题，同时结构简单，降低了系统成本，有利于系统的产业化应用。
附图说明
图1是本发明提供的荧光共焦显微成像系统的结构图；
图2是图1中共焦成像光路的结构图；
图3是图1中宽场成像光路的结构图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明提供的荧光共焦显微成像系统是在现有可获取样品三维层析图像的激光光源和共焦成像光路的基础上，另外增加可得到宽场图像的宽场成像光路、宽场照明激光光源、以及面阵探测器，并增加共焦成像光路与宽场成像光路配合使用的光学器件，以实现宽场图像与三维层析图像的同时显示。
图1示出了本发明提供的荧光共焦显微成像系统的结构，为了便于说明，仅示出了与本发明相关的部分。
本发明提供的荧光共焦显微成像系统包括：发出激发光的激光光源11；放置在激光光源11发出的激发光的光路上的共焦成像光路12；放置在激发光经共焦成像光路12后的光路上的第一双色镜14；放置在激发光经第一双色镜14透过后的光路上的第一物镜15；放置在激发光经第一物镜15会聚后的光路上的光纤束16；放置在激发光经光纤束16后的光路上的第一显微透镜18；放置在激发光经第一显微透镜18后的光路上的第二显微透镜19；带动第一显微透镜18和第二显微透镜19移动的压电陶瓷17；放置在激发光激发样品得到的荧光经共焦成像光路12后的光路上的探测器13；发出宽场成像激光的宽场照明激光光源20；放置在宽场照明激光光源20发出的宽场成像激光的光路上的宽场成像光路21，宽场成像激光经宽场成像光路21和第一双色镜14全反射并会聚到第一物镜15的后焦面；放置在宽场成像激光经样品反射得到的反射光经宽场成像光路21后的光路上的面阵探测器22。
该荧光共焦显微成像系统的工作原理是：在系统工作前，标定压电陶瓷17的驱动电压大小，建立光纤束16的端面与第一显微透镜18和第二显微透镜19之间的距离与压电陶瓷17的驱动电压之间的关系，并确定三维层析图像成像时的第一电压范围、以及宽场图像成像时的第二电压范围。在系统工作时，首先将压电陶瓷17的驱动电压调至宽场图像成像模式下的第二电压范围，以获得实时的宽场图像，在搜索到样品上的待观测目标后，逐渐调节压电陶瓷17的驱动电压，实现逐渐调小视场直至准确锁定待观测目标，再用三维层析图像成像模式获得待观测目标的高精度三维层析图像，并同时获得样品的宽场表面图像。进一步来说，对于三维层析图像的获取，首先由激光光源11发出激发光，该激发光可为连续光或脉冲光，其波长位于荧光染料或自体荧光物质的吸收区；之后，激发光经共焦成像光路12后的准直光透过第一双色镜14进入第一物镜15，由第一物镜15会聚耦合进入光纤束16中的某根光纤；之后，由光纤束16的另一端的对应光纤出射后，由第一显微透镜18和第二显微透镜19聚焦到样品中；之后，根据光路可逆原则，样品经激发光激发出的荧光经第二显微透镜19和第一显微透镜18耦合进入光纤束16中的对应光纤，再经第一物镜15后经第一双色镜14透射到共焦成像光路12；之后，经共焦成像光路12后的荧光聚焦到探测器13。对于宽场图像的获取，首先，宽场照明激光光源20发出宽场成像激光，宽场成像激光的波长可以是808nm；之后，宽场成像激光经宽场成像光路21和第一双色镜14全反射并会聚到第一物镜15的后焦面，经第一物镜15后形成的准直光出射并充满光纤束16的整个端面，耦合进入整个光纤束16；之后，由光纤束16出射后，经第一显微透镜18和第二显微透镜19面照明到样品；之后，由样品反射的反射光经第二显微透镜19和第一显微透镜18进入光纤束16，经光纤束16出射后由第一双色镜14滤出并入射到宽场成像光路21，一部分反射光经宽场成像光路21后成像到面阵探测器22，由面阵探测器22实时观测样品的宽场图像。在该系统中，第一双色镜14具有对宽场成像激光全反、而对激发光和荧光高透的特性。
本发明中，探测器13可以是光电倍增管(Photomultiplier Tube，PMT)或其它单点探测器；面阵探测器22可以是电荷耦合元件(Charge-coupled Device，CCD)或其它可实现光信号与电信号或数字信号转换的器件。
图2示出了图1中共焦成像光路12的结构。
具体地，共焦成像光路12可包括：放置在激光光源11发出的激发光的光路上的第一会聚光学器件1201；一个端面置于激发光经第一会聚光学器件1201会聚后的光路上的光纤1202；放置在激发光经光纤1202的另一端面后的光路上的第二会聚光学器件1203；放置在激发光经第二会聚光学器件1203后的光路上的激发滤光片1204；放置在激发光经激发滤光片1204滤波后的光路上的第二双色镜1205；放置在激发光经第二双色镜1205透过后的光路上的第二物镜1206；放置在激发光经第二物镜1206会聚后的光路上的共焦针孔1207；放置在激发光经共焦针孔1207后的光路上的第三物镜1208；放置在激发光经第三物镜1208准直后的光路上的二维扫描器1209；放置在激发光经二维扫描器1209二维扫描后的光路上的扫描透镜1210，二维扫描器1209放置在扫描透镜1210的焦面；放置在激发光经扫描透镜1210后的光路上的第一管镜1211，激发光经第一管镜1211准直后透过第一双色镜14；放置在激发光激发样品得到的荧光经第二双色镜1205反射后的光路上的发射滤光片1212；放置在荧光经发射滤光片1212滤波后的光路上的聚焦透镜1213，聚焦透镜1213将荧光聚焦到探测器13。
该共焦成像光路12的工作原理是：激光光源11发出的激发光由第一会聚光学器件1201耦合进入光纤1202，以便于光路转向；之后，经光纤1202出射的激发光经第二会聚光学器件1203准直成平行光，该平行光经激发滤光片1204滤出所需的波长透过，其它波长的光则被阻挡以提高信噪比；之后，经激发滤光片1204滤波后的激发光经第二双色镜1205透射到第二物镜1206，由第二物镜1206会聚到共焦针孔1207，共焦针孔1207为大小可调的共焦针孔，可实现信噪比、对比度和分辨率等参数的调整，以增加实用性；之后，经共焦针孔1207出射后的激发光由第三物镜1208收集准直，进入二维扫描器1209；之后，经二维扫描器1209偏转的激发光经扫描透镜1210进入第一管镜1211形成平行光束，该平行光束的直径与第一管镜1211的孔径匹配，以实现最佳聚焦效果，提高分辨率；之后，经第一管镜1211准直后的激发光透过第一双色镜14。之后，样品经激发光激发出的荧光经第一物镜15后经第一双色镜14透射到第一管镜1211；之后顺次经扫描透镜1210、二维扫描器1209和第三物镜1208进入共焦针孔1207，共焦针孔1207可将荧光光束中、除传入激发光的对应光纤以外的其它光纤收集传输出的荧光阻挡掉；之后，由共焦针孔1207滤出的荧光经第二物镜1206形成准直光，该准直光再由第二双色镜1205反射到发射滤光片1212，由发射滤光片1212将残余的激发光阻挡掉，滤出荧光；之后，滤出的荧光经聚焦透镜1213聚焦到探测器13。
本发明中，为了获得样品的荧光共焦图像，二维扫描器1209每使得激发光的光束偏转一步，由第一物镜15聚焦耦合到光纤束16中、导入激发光的光纤也随之变化，导致样品中激发光的激发光点的位置也对应变化，以达到扫描样品的目的。而光纤束16中与每个位置对应的那根光纤收集的荧光都与共焦针孔1207形成共焦探测，光纤束16中的其它光纤收集的荧光则被共焦针孔1207阻挡。这样，相对于传统的仅利用光纤束中光纤孔径实现共焦光路的方式，由于共焦针孔1207的引入而实现了真正的共轭成像，能够将光纤束中其它邻近光纤收集的干扰荧光信号滤除，而传统利用光纤自身孔径的方式则无法实现该效果。另外，共焦针孔1207处于自解扫描光路中，既实现激发光点源效果，又实现了点物发光探测，相对于双孔结构更简单、性能更稳定，有利于系统产业化。
本发明中，二维扫描器1209可以是二维振镜、声光器件或其它扫描器，可实现栅扫描或随机扫描
本发明中，第一会聚光学器件1201和/或第二会聚光学器件1203可以是自聚焦透镜或其它具有会聚作用的光学器件。
本发明中，为了便于更换激光光源11，共焦成像光路12还可包括光纤连接器(图中未示出)；光纤1202又包括第一光纤段和第二光纤段，且第一光纤段与第二光纤段之间通过光纤连接器连接。这样，通过插拔光纤连接器，可方便的更换激光光源11，提高了系统的便利性。
图3示出了图1中宽场成像光路21的结构。
具体地，宽场成像光路21可包括：放置在宽场照明激光光源20发出的宽场成像激光的光路上的第二管镜211；放置在宽场成像激光经第二管镜211会聚后的光路上的分光镜212，分光镜212将经第二管镜211会聚后的宽场成像激光反射到第一双色镜14，并进而由第一双色镜14反射到第一物镜15的后焦面；放置在宽场成像激光经样品反射得到的反射光经分光镜212透射后的光路上的第三管镜213，第三管镜213将经分光镜212透射后的反射光聚焦到面阵探测器22。
该宽场成像光路21的工作原理是：宽场照明激光光源20发出的宽场成像激光经第二管镜211会聚到分光镜212，分光镜212将该宽场成像激光反射到第一双色镜14，并由第一双色镜14继续反射到第一物镜15的后焦面，经第一物镜15后形成准直光出射并充满光纤束16的整个端面，耦合进入整个光纤束16；之后，由光纤束16端面出射的宽场成像激光经第一显微透镜18和第二显微透镜19面照明样品；之后，经样品反射后的反射光经第二显微透镜19和第一显微透镜18进入光纤束16，经光纤束16出射后，由第一双色镜14反射到分光镜212；之后，一部分反射光透过分光镜212经第三管镜213成像到面阵探测器22，由面阵探测器22实时观测样品的宽场图像。
本发明提供的荧光共焦显微成像系统是在现有可获取样品三维层析图像的激光光源和共焦成像光路的基础上，另外增加可得到宽场图像的宽场成像光路、宽场照明激光光源、以及面阵探测器，并增加共焦成像光路与宽场成像光路配合使用的光学器件，以实现宽场图像与三维层析图像的同时显示。该系统在工作时，可首先利用宽场图像成像模式获得宽场图像，实现对样品上待观测目标的快速搜索，在锁定待观测目标后，利用三维层析图像成像模式获得待观测目标的高精度三维层析图像，并同时获得样品的宽场表面图像。相对于现有的荧光共焦显微成像系统，解决了样品逐点扫描所带来的扫描时间长的问题，同时结构简单，降低了系统成本，有利于系统的产业化应用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种荧光共焦显微成像系统，其特征在于，所述系统包括：
用于产生激发光的激光光源；
放置在所述激光光源发出的所述激发光的光路上的共焦成像光路；
放置在所述激发光经所述共焦成像光路后的光路上的第一双色镜；
放置在所述激发光经所述第一双色镜透过后的光路上的第一物镜；
放置在所述激发光经所述第一物镜会聚后的光路上的光纤束；
放置在所述激发光经所述光纤束后的光路上的第一显微透镜；
放置在所述激发光经所述第一显微透镜后的光路上的第二显微透镜；
带动所述第一显微透镜和所述第二显微透镜移动的压电陶瓷；
放置在所述激发光激发样品得到的荧光经所述共焦成像光路后的光路上的探测器；
发出宽场成像激光的宽场照明激光光源；
放置在所述宽场照明激光光源发出的所述宽场成像激光的光路上的宽场成像光路，所述宽场成像激光经所述宽场成像光路和所述第一双色镜全反射并会聚到所述第一物镜的后焦面；
放置在所述宽场成像激光经所述样品反射得到的反射光经所述宽场成像光路后的光路上的面阵探测器。
2.如权利要求1所述的荧光共焦显微成像系统，其特征在于，所述共焦成像光路包括：
放置在所述激光光源发出的所述激发光的光路上的第一会聚光学器件；
一个端面置于所述激发光经所述第一会聚光学器件会聚后的光路上的光纤；
放置在所述激发光经所述光纤的另一端面后的光路上的第二会聚光学器件；
放置在所述激发光经所述第二会聚光学器件后的光路上的激发滤光片；
放置在所述激发光经所述激发滤光片滤波后的光路上的第二双色镜；
放置在所述激发光经所述第二双色镜透过后的光路上的第二物镜；
放置在所述激发光经所述第二物镜会聚后的光路上的共焦针孔；
放置在所述激发光经所述共焦针孔后的光路上的第三物镜；
放置在所述激发光经所述第三物镜准直后的光路上的二维扫描器；
放置在所述激发光经所述二维扫描器二维扫描后的光路上的扫描透镜，所述二维扫描器放置在所述扫描透镜的焦面；
放置在所述激发光经所述扫描透镜后的光路上的第一管镜，所述激发光经所述第一管镜准直后透过所述第一双色镜；
放置在所述激发光激发所述样品得到的荧光经所述第二双色镜反射后的光路上的发射滤光片；
放置在所述荧光经发所述射滤光片滤波后的光路上的聚焦透镜，所述聚焦透镜将所述荧光聚焦到所述探测器。
3.如权利要求2所述的荧光共焦显微成像系统，其特征在于，所述共焦成像光路还包括光纤连接器；
所述光纤又包括第一光纤段和第二光纤段，且所述第一光纤段与所述第二光纤段之间通过所述光纤连接器连接。
4.如权利要求2所述的荧光共焦显微成像系统，其特征在于，所述二维扫描器是二维振镜或声光器件。
5.如权利要求2所述的荧光共焦显微成像系统，其特征在于，所述第一会聚光学器件和/或所述第二会聚光学器件是自聚焦透镜。
6.如权利要求1所述的荧光共焦显微成像系统，其特征在于，所述宽场成像光路包括：
放置在所述宽场照明激光光源发出的所述宽场成像激光的光路上的第二管镜；
放置在所述宽场成像激光经所述第二管镜会聚后的光路上的分光镜，所述分光镜将经所述第二管镜会聚后的所述宽场成像激光反射到所述第一双色镜；
放置在所述宽场成像激光经所述样品反射得到的反射光经所述分光镜透射后的光路上的第三管镜，所述第三管镜将经所述分光镜透射后的反射光聚焦到所述面阵探测器。
7.如权利要求1至6任一项所述的荧光共焦显微成像系统，其特征在于，所述探测器是光电倍增管。
8.如权利要求1至6任一项所述的荧光共焦显微成像系统，其特征在于，所述面阵探测器是电荷耦合元件。
9.如权利要求1至6任一项所述的荧光共焦显微成像系统，其特征在于，所述激发光为连续光或脉冲光，所述激发光的波长位于荧光染料或自体荧光物质的吸收区；
所述宽场成像激光的波长是808nm。
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