CN1997892A - 配体分析 - Google Patents

Abstract

本文描述的是分析受体－配体对的方法。该方法可提供与配体和受体的结合亲和力相关的信息，或者可以提供与配体和受体的结合动力学相关的信息。在某些情况中，该方法提供了一种非常全面的用于评估和/或优化受体－配体相互作用的系统，该系统可被应用于多种类型的受体－配体相互作用，例如蛋白质－小分子相互作用。

Description

配体分析

相关申请参照

本申请要求赋予下列申请以权利，即2003年3月10日提交的美国临时申请60/453,473、2003年3月10日提交的美国临时申请60/453,457、2003年4月7日提交的美国临时申请60/460,910、2003年4月15日提交的美国临时申请60/463,025和2003年9月12日提交的美国临时申请60/502,670，这些申请均被完整引入本文作为参考。

发明背景

诸如组合化学的技术和对人类基因组的阐明已使探索可治疗多种疾病的药物的努力发生了巨大的变化。应用于基因组和生物学筛选两方面的高通量技术，以及计算机技术的极大发展使得以这些工具作为理论方法的一部分应用于新药的研究更加地可行。

不过，实现化学基因组的全部潜能需要研发出普通并有效的工具，可针对新近发现的疾病目标，将诸如组合化学的技术的优势应用于引导化合物的研发中。目前，尽管化学合成方面的进展已使人们能够构建相当复杂的用于探测蛋白质功能的不同化合物文库，仍然缺乏可直接评估结合机制和评价混合物形式中的配体亲和力的常规技术。对小分子治疗人类疾病而言，基因组和蛋白组分析法迅速地增加了可被鉴定为靶的人和细菌蛋白质的数量，对评价蛋白质-配体结合的方法提出了一个关键性的要求，即可适用于无法利用功能测定试验所检测的新靶。对X射线共结晶结构无法进入的靶而言，尤其需要根据结合位点进行亲和力评级和配体化学型分类，以解释配体结构-活性关系。

可行药物候选物的一个早期预报因子是其K_d，即与其靶生物分子的平衡解离常数。K_d是衡量所述药物候选物与其靶的结合如何紧密的测量值，是与该候选物的效能、潜在毒性和副作用有关的预报因子。药物候选物的动力学，例如药物候选物与其靶的解离率k₂也可作为预报该药物候选物最终是否能成为药物的早期预报因子。k₂是衡量所述药物候选物与其靶的结合如何紧密的测量值，可作为该候选物的潜在效能、毒性和副作用的指示。以有效和简化的方式评估包括K_d和k₂在内的多种结合特性的能力可显著地促进药物的发现过程。

概述

亲和选择-质谱(AS-MS)技术尤其有希望用于评估配体(例如小分子和有机化合物)与受体(例如蛋白质和酶)的结合特性。这些技术独特地根据多种混合物中蛋白质结合组分的分子量或碰撞诱导断裂模式，从所述多种混合物中鉴别出蛋白质结合组分，并使对化合物文库中的多个配体进行同时评估成为可能。现代MS技术的异常灵敏性使AS-MS试验能够仅利用最少量的纯化生物分子受体便得以进行。与细胞或其它复杂生化试验相比，AS-MS技术仅报告可选择性地与被关注靶结合的化合物，从而避免了与靶无关的活性所导致的假阳性。

我们在此描述了多维层析-质谱法，用于同时对多个配体与蛋白质受体的亲和力进行评级，但在某些情况中，也证明所述配体的结合位点是否与选择竞争配体的结合位点相同，或者是通过相互作用结合在变构结合位点上。当两个配体结合在不同位点上时，该方法可在某些情况下获得它们的绝对结合亲和力和对它们之间的结合协同性程度的定量评估。

在一个方面中，本发明的特征在于分析多种混合物中受体与配体的亲和力的方法，该多种混合物包括受体E、配体S_i和受体-配体结合对ES_i。该方法包括下述步骤：

(a)提供多种混合物，每种混合物包括受体[E]₀、配体[S_i]₀和滴定剂T，其中E、S_i和T这三项中的一项或多项的浓度是选定的，以便测定T取代S的相对能力；

(b)使上述多种混合物中的每一种达到平衡；

(c)将多种混合物中的每一种中的受体-配体结合对ES_i与未结合配体S_i分离；

(d)测定从分析装置获得的多种混合物中的每一种中受体-配体结合对ES_i的信号响应；并

(e)评估由步骤(d)获得的受体-配体结合对ES_i的信号响应，以确定配体S_i与受体E的结合亲和力。

在某些情况中，每种混合物是特定的，其中T相对于[E]₀和[S_i]₀的浓度是选定的，以便比较S_i取代T的相对能力。

在某些情况中，所述方法包括提供多种混合物，每种混合物包括初始浓度的受体[E]₀、初始浓度的配体[S_i]₀和已知浓度的滴定剂，其中[E]₀和[S_i]₀在多种混合物中的每一种中始终恒定，多种混合物中的每一种中的[S_i]₀大致相同，所述滴定剂的浓度在所述多种混合物中是变动的。

在某些情况中，多种混合物中的每一种均包括多种配体S_i和多种受体-配体结合对ES_i，所述信号响应是针对至少两种受体-配体结合对ES_i测定的，并且还确定了所述受体-配体结合对ES_i的相对结合。

在某些情况中，例如，当所述混合物包括多种配体时，这些配体S_i中的至少大约90％具有独特分子量。

在某些情况中，每种混合物是特定的，其中T相对于[E]₀和[S_i]₀的浓度是选定的，以便对第一种配体S₁的结合亲和力和第二种配体S₂的结合亲和力进行比较，以提供S₁对E和S₂对E的相对结合亲和力的测量值。

在某些情况中，所述结合亲和力为相对结合平衡常数K_dis。

在某些情况中，所述方法包括计算一种或多种配体的ACE₅₀，即当受体-配体对的信号响应值是所述滴定剂浓度为0时的信号响应值的50％时的滴定剂浓度。

在某些情况中，多种配体的相对K_ds是确定的，从而使具有最低ACE₅₀值的配体具有配体混合物的最高K_d，而具有最高ACE₅₀值的配体则具有配体混合物的最低K_d。

在某些情况中，所述方法包括通过将多种混合物中的每一种中受体-配体结合对的浓度[ESi]变化作为滴定剂浓度的函数代入公式(I)所示等式或公式(I)的推导式中，以计算多种混合物中受体-配体结合对ES_i的Kd_i

$K_{\mathrm{di}}=\frac{({\[E\]}_0-\underset{i}{\mathrm{\Σ}}\[E{S}_i\])({\[S_i\]}_0-\[E{S}_i\])}{\[E{S}_i\]}$

公式(I)

在某些情况中，多种配体S_i的相对K_dis是确定的。

在某些情况中，受体的初始浓度[E]₀是已知的，配体的初始浓度[S_i]₀是已知的。

在某些情况中，受体浓度[E]₀大于配体浓度[S_i]₀的总和。

在某些情况中，所述方法还包括确定配体S_i是否以竞争方式、变构方式或非竞争方式与受体E结合。例如，如果受体配体对ES_i在多种混合物中的每一种中保持相对恒定的信号响应，则配体S_i以非竞争方式与受体E结合。在某些情况中，所述方法包括确定在多种混合物中的每一种中，受体配体对ES_i的信号响应与受体-滴定剂对响应之比相对于滴定剂浓度的变分，其中如果多种混合物中的每一种的该比率与滴定剂浓度为线性关系，则配体S_i以竞争方式结合受体，其中如果多种混合物中的每一种的该比率与滴定剂浓度为非线性关系，则配体S_i以变构方式结合受体。

在某些情况中，所述受体为生物分子、多肽、酶或核酸。

在某些情况中，所述配体为有机分子，诸如药物化合物或小分子(例如分子量小于大约600a.m.u.的分子)或多肽。

在某些情况中，所述多种混合物达到了受体配体结合对ES_i、未结合受体和未结合配体的平衡。

在某些情况中，所述方法包括利用可在解离受体-配体结合对的条件下应用的液相层析，例如，反相液相层析。

在某些情况中，所述受体结合配体是通过大小排阻层析或超滤与多种混合物中的每一种分离的。

在某些情况中，所述信号响应是通过质谱分析法测定的。

在某些情况中，所述方法包括破坏受体-配体结合对ES_i。

在某些情况中，受体-配体结合对ES_i的信号响应是通过测定在多种混合物中的每一种中，受体-配体结合对ES_i中的配体S_i的相对量而得以确定的。

在某些情况中，配体S_i的相对量是通过评估从质谱仪获得的信号响应而得以确定的。

在另一个方面中，本发明的特征在于测定受体-配体结合对的平衡解离常数K_d的方法。该方法包括下述步骤：

(a)提供根据所述受体-配体结合对中的配体校准的质谱仪；

(b)提供多种混合物，每种混合物包括受体[E]₀和配体[S]₀，其中E₀和S₀这两项或其中之一的浓度是选定的，以便测定S与E的结合亲和力；

(c)使多种混合物中的每一种达到已结合受体-配体结合对ES、未结合受体和未结合配体的平衡。

(d)使受体结合配体与多种混合物中的每一种分离；

(e)测定从质谱仪获得的多种混合物中的每一种中的受体-配体结合对的信号响应；并

(f)利用在步骤a-e中已知、测定或获得的信息，将多种混合物中的每一种的受体-配体对浓度[ES]和初始已知配体浓度[S]₀代入公式(I)所示等式，获得受体-配体结合对的K_d。

$K_d=\frac{({\[E\]}_0-\[\mathrm{ES}\])({\[S\]}_0-\[\mathrm{ES}\])}{\[\mathrm{ES}\]}$

公式(I)

在某些情况中，多种混合物中的每一种包括初始浓度的受体[E]₀和初始已知浓度的配体[S]₀，其中多种混合物中的每一种的[E]₀大致相同，多种混合物中的每一种的[S]₀是变动的。

在某些情况中，所述方法还包括测定混合物中的初始受体浓度[E]₀。

在某些情况中，所述受体为生物分子、多肽、酶或核酸。

在某些情况中，所述配体为有机分子，诸如药物化合物或小分子(例如分子量小于大约600a.m.u.的分子)或多肽。

在某些情况中，所述多种混合物达到了已结合受体-配体结合对、未结合受体和未结合配体的平衡。

在某些情况中，所述受体结合配体是通过大小排阻层析与所述混合物分离的。

在某些情况中，所述方法包括利用液相层析。

在某些情况中，所述方法还包括通过例如，在高温条件下进行反相液相层析，破坏受体-配体结合对ES。

在某些情况中，所述受体-配体结合对的浓度[ES]是通过测定在多种混合物中的每一种中，受体-配体结合对ES中的配体量而得以确定的。

在另一个方面中，本发明的特征在于分析受体-配体结合对的结合动力学的方法。该方法包括下述步骤：

(a)提供包括受体[E]₀和配体[S_i]₀的混合物；

(b)使该混合物达到受体[E]、配体[S_i]和受体-配体结合对[ES_i]的平衡；

(c)用过量的竞争性抑制剂I处理该混合物；

(d)通过下述步骤测定所述受体-配体结合对在多个时间点的减少；

(i)使受体-配体结合对与未结合配体分离；并

(ii)利用分析装置测定所述受体-配体结合对在上述各时间点的信号响应；并

(e)利用从步骤(a)-(d)已知、测定或获得的信息评估所述受体-配体结合对的结合动力学。

在某些情况中，所述受体-配体结合对的信号响应是利用分析装置测定的。

在某些情况中，所述混合物包括多种配体S_i。

在某些情况中，例如，当所述混合物包括多种配体S_i时，其中的至少90％具有独特分子量。

在某些情况中，结合动力学是利用已知、测定或获得的信息，通过将受体-配体结合对的信号响应随时间的变化代入公式(XVIII)所示等式或其推导式，计算受体-配体结合对的解离速度k_s2而得以评估的

[ES]＝[ES]_t＝0e^-ks2·t

公式(XVIII)

在某些情况中，所述方法包括鉴定以非竞争方式结合的配体，其中如果配体-受体结合对在上述各时间点保持相对恒定的浓度，则该配体以非竞争方式与受体结合。

在某些情况中，比较了所述多种配体中至少两种配体S_i的结合动力学。

在某些情况中，所述受体为生物分子、多肽、酶或核酸。

在某些情况中，所述配体和/或竞争性抑制剂为有机分子，诸如药物化合物或小分子(例如分子量小于大约600a.m.u.的分子)或多肽。

在某些情况中，所述方法包括对所述受体结合配体进行液相层析。

在某些情况中，所述受体结合配体是通过大小排阻层析与未结合配体分离的。

在某些情况中，信号响应是通过质谱分析法测定的。

在某些情况中，所述方法还包括破坏所述受体-配体结合对。

在某些情况中，所述受体-配体结合对的信号响应是通过测定配体在所述受体-配体结合对中的相对量而得以确定的。

在某些情况中，所述方法还包括测定所述受体配体结合对的半衰期t_1/2。

在一个方面中，本发明的特征在于从样品中鉴定受体-配体复合物的方法。该方法包括下述步骤：

(a)提供包括受体-配体复合物的样品；

(b)对该样品进行大小排阻层析，其中该大小排阻层析的洗脱液通过了UV检测器和包括进样环在内的多通道阀门。

(c)利用UV检测器检测样品中的受体-配体复合物，其中对该受体-配体复合物的检测起动了与所述UV检测器和包括进样环在内的多通道阀门相连的控制器，其中该控制器经过校准，可在所述受体-配体复合物存在于进样环中时起动上述多通道阀门，而其中多通道阀门的起动则将进样环中存在的受体-配体复合物转移至层析装置；并

(d)鉴定所述受体-配体复合物中的配体，从而鉴定了该受体-配体复合物。

在某些情况中，样品还包括未结合配体。

在某些情况中，所述受体-配体复合物是与未结合配体分离的。

在某些情况中，所述方法还包括使所述受体-配体复合物解离。

在某些情况中，所述受体-配体复合物的解离发生在层析装置中。

所述受体-配体复合物中的受体可以是例如，多肽、酶或核酸。

所述受体-配体复合物中的配体可以是例如，多肽、有机分子或核酸。

在某些情况中，所述控制器是手动校准的。在其它情况中，该控制器是利用计算机软件程序校准的。

在某些情况中，所述层析装置为反相柱。

在某些情况中，所述解离配体是通过质谱分析法鉴定的。

在某些情况中，所述配体缺乏识别标记。在某些情况中，该配体具有识别标记，该标记可以是例如，荧光标记或放射性标记。

在另一个方面中，本发明的特征在于从样品中鉴定多种受体-配体复合物的方法。该方法包括：

(a)提供包括多种受体-配体复合物的样品；

(b)对该样品进行大小排阻层析，其中大小排阻层析的洗脱液通过了UV检测器和包括进样环在内的多通道阀门；

(c)利用上述UV检测器检测样品中的受体-配体复合物，其中该受体-配体复合物的检测起动了与上述UV检测器和包括进样环在内的多通道阀门相连的控制器，其中该控制器经过校准，可在至少一部分所述受体-配体复合物存在于上述进样环中时起动上述多通道阀门，其中该多通道阀门的起动可将进样环中存在的受体-配体复合物转移至层析装置中；并

(d)鉴定解离受体-配体复合物中的解离配体。

在某些情况中，所述样品还包括多种未结合配体。

在某些情况中，所述受体-配体复合物是与未结合配体分离的。

在某些情况中，所述方法包括鉴定多种解离配体。

在某些情况中，所述方法包括单一受体。

在某些情况中，所述方法还包括使所述受体-配体复合物解离。

在某些情况中，所述受体-配体复合物的解离发生在上述层析装置中。

所述受体-配体复合物中的受体可以是例如，多肽、酶或核酸。所述受体配体复合物中的配体可以是例如，多肽、有机分子或核酸。

在某些情况中，所述控制器是手动校准的。在其它情况中，该控制器是利用计算机软件程序校准的。

在某些情况中，所述层析装置为反相柱。

在某些情况中，一种或多种解离配体是通过质谱分析法鉴定的。

在某些情况中，所述配体缺乏识别标记。在某些情况中，该配体具有识别标记，该标记可以是例如，荧光标记或放射性标记。

在某些情况中，上述多种配体中至少大约90％的配体具有独特分子量。例如，大约90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的配体均可具有独特分子量。

在某些情况中，本发明涉及鉴定一种或多种具有理想结合特征的化合物的方法。通常，这种化合物可通过下述步骤得以鉴定：(1)提供特定配体的混合物，该配体可作为第一种配体的化学结构的结构变体(即相关化合物)，(在某些情况中，可根据这些化合物的独特分子量对它们进行鉴定)，(2)对该混合物结构变体进行分析，相对于原始配体对其生物分子受体的亲和力或该原始配体与其生物分子受体的结合动力学，定性和/或定量地对所述结构变体进行评级，并(3)利用该结果鉴定理想配体并设计适用于混合、合成配体和/或对配体评级的后续循环的相关配体。

本文所述的所有方法均可以例如，与本文所述的另一种方法一起，以重复或循环或连续方式应用。例如，如果第一种方法被用于提供与配体或配体混合物有关的结合信息(例如相对结合亲和力)，可利用在该第一种方法中获得的信息设计或检验其它配体。可进一步地评估上述其它配体，例如利用上述第一种方法，或者可选地，利用本文所述的第二种方法。例如可首先通过对结合亲和力进行评级以评估配体混合物；接着，该结合亲和力信息可被用于设计其它配体，随后根据结合亲和力或结合动力学对这些配体进行评级。

虽然本文所述的一种或多种方法的结果可被用于引导其它用于评估的配体的合成或装配，在某些实例中，可利用多重方法或利用重复运行所述方法中的一个或多个步骤的单一方法，以评估单一配体或配体混合物。例如，可通过评估结合亲和力(例如K_d)以及评估结合动力学(例如K_off)，评定单一配体或配体混合物。这些评估结合亲和力和结合动力学的方法可以任意次序进行，也可以重复方式进行。在某些情况中，单一方法是利用相同配体或配体混合物进行的，以确保该方法的重复性。

本文所述方法可提供非常有效地鉴定样品中的受体-配体复合物的方法。这些方法可直接将由大小排阻层析获得的受体-配体复合物送递至分析装置，诸如LC-MS装置，该分析装置可快速筛选样品，并降低因利用流分收集器或样品与分析装置表面的粘着所导致的样品损失。此外，该方法的预期输出量可利用与单一配体相对的配体混合物(例如组合文库)实现，并且无需纯化配体。在某些情况中，本文所述方法具有的优势在于提供了分析微量样品的能力。另一项优势在于可包括提供可自动化进行的高通量方法。相应地，可针对受体同时筛选大量化合物。上述方法还可以是高灵敏性的，可实现对微量样品的准确检测和表征。此外，可以仅当原料实际存在于取样环中时收集代表性样品，与寻找用于分析的预期产物而从所述分析装置洗脱时对洗脱液的随机取样形成对比。

本文所述过程可提供用于优化受体-配体相互作用的非常概括的体系，并可适用于广泛多种类型的蛋白质种类和小分子相互作用，包括但不限于可溶性蛋白质、膜相关蛋白、酶、核激素受体和G-蛋白偶联受体(GPCRs)。此外，该过程不需要生化实验分析其输出量，并且仅利用极少量的纯化蛋白或其它生物分子受体，典型地每次试验少于5μg。而且，本文所述方法的实施无需与所述受体结构有关的知识。进一步地，所述方法的预期输出量可利用配体混合物(例如组合文库)实现，且无需纯化配体。

附图和下述内容具体描述了本发明的一种或多种实施方案。由这些描述和附图，以及权利要求，将会理解本发明的其它特征、目标和优势。

附图简述

图1为曲线图，所示为受体-配体复合物ES的配体回收与初始配体浓度[S]₀的理论曲线关系图，获得变动的K_d。

图2为曲线图，所示为受体-配体复合物ES的配体回收与初始配体浓度[S]₀的理论曲线关系图，获得变动的初始有效受体浓度[E]₀。

图3所示为受体-配体复合物[ES]相对于初始配体浓度[S]₀的配体回收数据与理论数据在数学上相符，具有10％的随机误差。

图4所示为受体-配体复合物ES_i相对于初始竞争配体浓度[S₁]₀的理论曲线关系图，描述了单一化合物S₂与附加竞争剂S₁之间的竞争。

图5A所示为在受体过量条件下，对由三种不同K_d的配体组成的混合物进行的模拟ACE₅₀试验：实线显示的是特定配体浓度为1μM时的回收；虚界线指出了0.33或3.0μM时的回收。

图5B所示为与图5A所示相似的模拟ACE₅₀，但受体浓度(2μM)受限于总配体浓度(15μM)。

图6所示为公式(I)的解答。

图7所示为对三组分混合物而言，受体-配体复合物ES_i与初始竞争配体浓度[S₁]₀的理论曲线关系图。

图8所示为对三组分混合物而言，受体-配体复合物ES_i与初始竞争配体浓度[S₁]₀的标准化理论曲线关系图。

图9所示为变构-竞争性滴定剂和配体的模拟信号响应(从AS-MS试验获得)以及它们随滴定剂浓度递增而变化的比率。

图10所示为AS-MS测定的Akt-1-NGD-28835和Akt-1-星形孢菌素复合物浓度以及它们随滴定剂浓度递增而变化的比率。渐进结合比率图指出的是变构结合。

图11A所示为AS-MS测定的滴定剂(浓度)和配体响应，这些响应是通过在星形孢菌素与通过筛选质量编码组合文库发现的配体混合物之间进行的ACE₅₀试验获得的。

图11B所示为从(C)中的数据获得的滴定剂-配体回收率，说明了变构竞争。

图11C-D所示分别为AS-MS测定的蛋白质-配体复合物浓度和比率图，是通过ACE₅₀试验在M-1与(A)和(B)所示配体的混合物之间获得的。与采用星形孢菌素所获得的结果形成对比，在集合成员与M-1之间观测到正立体(orthosteric)结合竞争。

图12A-D为曲线图，所示为星形孢菌素和M-1在ATP浓度递增条件下对Akt-1生化活性的抑制。12A和12B所示为与星形孢菌素对应的结果，显示在星形孢菌素与ATP之间为竞争性结合。12C和12D所示为与M-1对应的结果，显示在M-1与ATP之间为混合、非竞争性结合。注意：星形孢菌素是相对于纳摩尔浓度轴作图的，M-1是相对于微摩尔轴作图的。

图13A-B为曲线图，所示为相对于阿托品，对配体集合与毒_碱性乙酰胆碱受体M₂的亲和力的评级和对结合竞争模式的确定。13A所示为ACE₅₀试验结果的对数图，显示NGD-3350的素和力高于其同类NGD-3348和NGD-3346及其它集合组成。13B所示为线性滴定剂-配体响应比率图，显示在阿托品与所述配体集合组成之间为正立体竞争。

图14所示为在计时起点，高浓度抑制剂I对E+S平衡溶液的1∶1稀释液[ES]的影响的数学模型，其中所述抑制剂I的解离速度k_i1的变动范围是0-0.1μM^-1秒^-1(0→10⁵M^-1秒^-1)。理论衰变曲线[E·S]₀e^-ks2-t如(E)所示。

图15所示为在计时起点，高浓度抑制剂I对E+S平衡溶液的1∶1稀释液[ES]的影响的对数图数学模型，其中所述抑制剂I的解离速度k_i1的变动范围是0-0.1μM^-1秒^-1(0→10⁵M^-1秒^-1)。理论衰变曲线-[ES]₀k_s2·t(斜率＝k_s2)如(E)所示。

图16所示为在计时起点，高浓度抑制剂I对E+S平衡溶液的1∶1稀释液[ES]的影响的数学模型。k_s2的变动范围是1-0.001秒^-1；理论衰变曲线-[ES]₀k_s2·t(斜率＝k_s2)如(E)所示。

图17所示为在计时起点，高浓度抑制剂inh(I)对E+S平衡溶液的1∶1稀释液[ES]的影响的数学模型。建模k_s2＝0.01秒^-1(A)；理论衰变曲线如(E)所示k_s2＝0.01±0.001秒^-1。

图18所示为模拟亲和力选择-质谱响应，以及从受体过量到受体限制条件下，E+S_i+S_v平衡溶液中受体-配体复合物[ES_i]和[ES_v]的比率与受体浓度[E]₀的函数关系。

图19所示为描述了受体-配体复合物中配体途径的流程图。

图20A-20B所示为处于两个不同位置20A和20B的多通道阀门。

图21所示为在230nm波长条件下，四次连续样品注射的UV数据。

图22A-22F所示为峰变化缩短多通道阀门延迟时间的效果。

图23所示为对人血清白蛋白+苄丙酮香豆素而言，受体-配体复合物[ES]的配体回收数据与初始配体浓度[S]₀的数学关系。

图24所示为对与猪毒_碱受体对应的五组分混合物而言，受体-配体复合物ES_i的配体回收与初始竞争配体(阿托品)浓度[S₁]₀的标准化关系图，以及它们的导出ACE₅₀值。

图25所示为对两种选自五组分混合物的配体而言，受体-配体复合物ES_i的配体回收与初始竞争配体(阿托品)浓度[S₁]₀的标准化关系图，以及它们的K_d值。

图26所示为可获得Zap-70复合物Zap-70·NGD-746和Zap-70·NGD-6380的k₂和半衰期的图解。

图27所示为可获得Zap-70复合物和配体混合物的k₂和半衰期的图解。

图28所示为与来源于优化文库的受体-配体复合物对应的标准化亲和力选择-质谱响应与总竞争配体星形孢菌素浓度的关系曲线，以及导出的ACE₅₀和K_d值，星形孢菌素K_d＝100nM。

发明详述

美国专利No.6,207,861涉及构建质量编码组合文库的方法和鉴定(即筛选)那些与一种或多种生物分子相关的质量编码组合文库中的化合物的方法。该质量编码文库是设计并合成的，其中至少大约90％(即包括90-100之间的任意整数百分比)的个体化合物具有的分子量与该质量编码文库中其它个体化合物的分子量不同。

美国专利No.6,207,861中的筛选方法描述了被称为自动化配体识别系统(ALIS)的系统。ALIS系统通常具有下述功能：(1)被关注生物分子(例如蛋白质)的溶液是在配体(例如小有机分子或其文库)存在条件下被温育指定长度的时间，使该生物分子-配体复合物形成反应并达到平衡；(2)使含有生物分子、未结合配体和生物分子-配体复合物的溶液通过大小排阻层析，以基于分子大小将生物分子外加生物分子-配体复合物与未结合配体分离，该生物分子外加生物分子-配体复合物是在洗脱液流的前部共洗脱；(3)对含有上述生物分子外加生物分子-配体复合物而不含任何未结合配体的洗脱液流部分进行反相层析，以脱盐并洗脱进质谱仪中，在该质谱仪中，可基于有机分子的分子量或质谱-质谱断裂模式鉴定有机分子，并通过测定其校准信号响应对其定量。

本文所述方法应用了美国专利No.6,207,861所描述的技术，并且还部分地基于了下述发现，即对受体-配体对的定量分析可通过分析由分析装置或检测器(例如质谱仪、HPLC、UV、IR、NMR等)获得的信号响应而得以实现，该信号响应与在一个配体浓度范围内进行配体结合试验所获得的配体回收对应，而该配体回收则以未结合和已结合配体的分离为基础(例如通过大小排阻层析、凝胶过滤、超速离心)。这些试验获得了可被数学代入描述了受体-配体结合动力学和平衡热力学的模型中的数据。这些模型可被用于估计受体与配体混合物的平衡解离常数(K_d)、初始受体浓度[R]₀和绝对解离速度(脱离速度，k_off)。

术语“平衡解离常数”(K_d)指对E+S＝ES型反应而言，反向与正向速度常数的比率。平衡时，该平衡解离常数(K_d)等于反应物浓度的乘积被反应产物浓度除(K_d＝[E][S]/[ES])。K_d值越小，关联反应物之间的结合相互作用越强。所述亲和力(结合)常数是所述平衡常数的倒数。

配体与受体的可逆结合如下所示：

K_d的表示如下：

$K_d=\frac{k_{\mathrm{off}}}{k_{\mathrm{on}}}=\frac{\[E\]\[S\]}{\[\mathrm{ES}\]}$

在某些情况中，k_on被描述为k₁，k_off被描述为k₂。

总初始受体浓度[E]₀可被定义为游离受体的浓度[E]，外加已结合受体的浓度[ES]，([E]₀＝[E]+[ES])。总配体浓度[S]₀可被定义为游离配体浓度外加已结合配体的浓度([S]₀＝[S]+[ES])。

相应地，可根据平衡复合物浓度[ES]和初始受体和底物浓度[E]₀和[S]₀将K_d表达如下：

$K_d=\frac{({\[E\]}_0-\[\mathrm{ES}\])({\[S\]}_0-\[\mathrm{ES}\])}{\[\mathrm{ES}\]}.$

为测定K_d，平衡复合物浓度[ES]、初始受体和底物浓度[E]₀和[S]₀必须已知或确定。

[ES]可通过试验测定(例如，利用大小排阻层析使已结合配体与未结合配体分离，接着利用液相层析，其中所述受体-配体复合物被破坏，进一步通过质谱分析，其中已根据配体校准了质谱仪)。

[S]₀可以是已知或估计的。

[E]₀可根据条件变化，并可通过试验测定。为测定[E]₀，可利用受体滴定配体。[E]₀值时的复合物[ES]回收达到最大，相应的滴定曲线可由下列等式代入生成：

[ES]²-[ES](K_d+[E]₀+[S]₀)+[E]₀[S]₀＝0

该等式结果描述的是，受体-配体复合物ES的平衡浓度是参数K_d、[S]₀和[E]₀的函数。对特定K_d和[E]₀而言，[ES]与[S]₀对应的曲线图与图1所示的矩形双曲线相符。该曲线的准确形状取决于被研究配体的K_d。如图2所示，[ES]的渐进线极限取决于[E]₀。该行为被描述为饱和结合。

通过在不同[S]₀值条件下进行的校准试验测定获得了一组[ES]值，通过数值非线性回归技术使上述等式适用于[ES]、[S]₀数据对，可获得对参数K_d和[E]₀而言的最适值(参见图3)。

被用于描述单一配体与单一受体的相互作用的相同表达式也可被用于描述化合物(例如配体)的混合物与单一受体-结合位点的相互作用，如下所示：

E+S₁+S₂+...S_i→ES₁+ES₂+...ES_i。

与各配体S_i对应的K_d可被表达如下：

$K_{\mathrm{di}}=\frac{\[E\]\[S_i\]}{\[E{S}_i\]}$

该公式可通过类推至在单一配体情况中如上表达的K_d表达式，从而延伸为

$K_{\mathrm{di}}=\frac{\left(\right[E_0-\underset{i}{\mathrm{\Σ}}\left[E{S}_i\right])({\[S_i\]}_0-\[E{S}_i\])}{\[E{S}_i\]}$

公式(I)

对所含配体S₁的浓度是一个范围而第二种配体S₂浓度固定的理论双组分混合物而言，公式(I)的联立解获得了图4所示对受体-配体复合物浓度[ES₁]和[ES₂]在图示条件下的图形表示。已知配体S₁的初始浓度[S₁]₀升高，相应的受体-配体复合物浓度[ES₁]也升高。不过，当S₁和S₂竞争性地(例如正立体结合)结合受体时，由于较高浓度的S₁在竞争受体E结合位点方面胜于S₂，导致受体-配体复合物浓度[ES₂]降低。

当混合物中存在多种配体时，在与受体的结合亲和力方面相对弱于第二种配体的第一种配体将比第二种配体更易被较低浓度的滴定剂(例如已知的竞争配体)竞争出局。例如，当存在多种未知配体的情况下滴定已知酶抑制剂时，可通过评估这些配体被竞争配体取代并与所述酶脱离的次序而确定相对结合亲和力。

术语“ACE₅₀”指将受体-配体复合物浓度降低为当缺乏被关注配体的竞争剂化合物时其浓度值的1/2(50％)所需要的该竞争剂化合物的浓度。ACE₅₀取决于下述参数，诸如被关注配体和竞争剂的平衡结合常数K_d，以及所述受体和配体的浓度。ACE₅₀值描述了已知化合物竞争优于被关注配体时的浓度，是描述了被关注配体竞争优于已知化合物，例如放射性配体时的浓度的生化或生物物理学IC₅₀常规定义的相反定义。与常规IC₅₀值相反，较高的ACE₅₀值表示具有较高亲和力的配体：需要较高的竞争剂浓度从所述结合位点取代被关注的化合物。

在试验条件下，即受体E相对于被关注配体S_i的集合过量存在，并用另一种竞争配体滴定所述受体-配体集合混合物时，该集合各组分之间的竞争被认为无意义，仅观测到对特定配体S_i而言的明显竞争，即该配体S_i与附加竞争剂之间的竞争。

对含有三种不同K_d的配体的混合物进行的模拟结合取代试验如图5a所示，说明了ACE₅₀法如何可以被用于同时对多种化合物进行亲和力评级。在该模拟中，全部集合组分的总浓度([S₁]₀＝[S₂]₀＝[S₃]₀＝1.0μM)与总受体浓度(5.0μM)同级。在这些条件下，文库内的竞争有限，且个体文库组分仅与滴定剂竞争。ACE₅₀值不易受配体浓度影响：任意一种配体浓度的9倍变化获得的是相同等级的亲和力。该方法的这一特征在直接评估合成混合物时是有利的，其中该合成混合物中的配体浓度可能由于在建立阻断反应性方面的差异而变化。集合浓度比受体浓度高的结果如图5b所示。在该模拟显示的极端情况中，不同K_d的三种配体在特定条件下可获得几乎相等的ACE₅₀值，该特定条件是这三种文库组分的总配体浓度均为5μM，受体浓度为2μM。

从根据配体混合物所获的ACE₅₀数据中提取K_d信息，归纳为对含有配体S_i与附加竞争剂的二元混合物的解答。

利用上述原理，已知总受体浓度[E₀]和配体S_i的总配体浓度[S_i]₀的K_d表达式(即K_di)如下列公式(I)所示。

$K_{\mathrm{di}}=\frac{({\[E\]}_0-\underset{i}{\mathrm{\Σ}}\[E{S}_i\])({\[S_i\]}_0-\[E{S}_i\])}{\[E{S}_i\]}$

公式(I)

缺乏竞争配体S₁时，配体S₂的K_d表达式(即K_di)简化为下列公式(II)所示的等式。

$K_{d2}=\frac{({\[E\]}_0-\[E{S}_2\])({\[S_2\]}_0-\[E{S}_2\])}{\[E{S}_2\]}$

公式(II)

为简化和易读，在下列等式中采用了下列术语。

kd1＝K_d1

kd2＝K_d2

s10＝[S₁]₀

s20＝[S₂]₀

e0＝[E]₀

es1＝[ES₁]

es2＝[ES₂]

公式(II)对[ES₂]的解答获得两个根，实根如下列公式(III)所示：

公式(III)

该表达式表示在缺乏竞争剂S₁条件下的[ES₂]值。该值的一半被定义为竞争剂S₁的总浓度[S₁]₀等于ACE₅₀时存在的[ES₂]的量。

公式(III)对[ES₂]的解答获得两个根，实根如下列公式(IV)所示：

公式(IV)

该表达式获得了与竞争剂S₁竞争时的[ES₂]值。将公式(IV)的右手边(rhs)设定为等于该rhs的1/2，解答[ES₁]，获得下列公式(V)：

公式(V)

公式(V)表示当[ES₂]是其在缺乏竞争剂S₁条件下所获值的1/2时的[ES₁]值；换言之，即[S₁]₀＝ACE₅₀时的[ES₁]值。

依此类推，对[ES₁]的解答获得两个根，实根如下列公式(VI)所示：

公式(VI)

当与竞争剂S2竞争时，将ACE50时的[ES2]值，即公式(III)rhs的1/2代入[ES1]值的表达式，即公式(VI)中，获得下列公式(VII)：

es1＝

公式(VII)

上述公式(V)和(VII)均为当[S₁]₀＝ACE₅₀时[ES₁]的表达式。将公式(V)的rhs设定等于公式(VII)的rhs，并解[S₁]₀，获得下列表达式，即当[ES₂]是其在缺乏竞争剂条件下所获值的1/2时的[S₁]₀值；换言之，下列表达式中的[S₁]₀等于ACE₅₀，根据竞争剂的K_d1和被关注配体的K_d2、总受体浓度[E]₀和被滴定配体的总浓度[S₂]₀，将其表达为：

公式(VIII)

公式(VIII)使使用者可以根据已知的试验参数组，即K_d1、K_d2、E₀和[S₂]₀，预测ACE₅₀的值。此外，该表达式可被用于优化用于测定ACE₅₀的参数。

公式(VIII)对K_d2的解答获得四个根，其中的一个实根是根据ACE₅₀、竞争剂K_d1的K_d、总受体浓度E₀和被滴定配体的总浓度[S₂]₀获得的K_d2的表达式。如图6所示，公式(I)的准确解答不实用，由ACE₅₀、K_d1、E₀和[S₂]₀的试验数值导出K_d2值的可选方法是以ACE₅₀、K_d1、E₀和[S₂]₀作为输入参数，利用公式(VIII)对K_d2的数解。

图7所示为用已知配体S₁滴定含有化合物S₁、S₂、S₃的三元混合物的理论滴定结果。指出这些配体(不包括附加竞争剂)的总浓度小于总受体浓度。在这些情况中，上述混合物中的化合物可以被认为不具有彼此竞争性，仅与过量加入的配体竞争。

存在2.0μM、K_d2＝0.5μM的正立体竞争性配体S₂的情况下，用S₁滴定获得对E·S₁而言较浅的结合曲线，当受体被S₁饱和时，蛋白质-配体复合物E·S₂的浓度降低。当受体为限制试剂时(即当滴定剂和配体必须竞争受体位点时)，E·S₁与E·S₂的比率随着总滴定浓度[S₁]₀的增大而线性升高。该线性关系说明了互斥竞争性结合，通过与受体的正立体相互作用可最简化地解释该结合，并可如下列等式所示：

$\frac{E\·S_1}{E\·S_2}=\frac{{\[S_1\]}_0{K}_{d2}}{{\[S_2\]}_0{K}_{d1}}$

因此，E·S₁与E·S₂的配体回收比率与总滴定剂浓度[S₁]₀的关系图将获得与正立体配体对应的直线，其中[S₁]₀＞[E]₀。如果滴定剂和配体的MS响应校准系数已知，该直线的斜率对应的是配体和滴定剂亲和力与配体浓度的比率。

在本文中被用于描述受体结合配体的术语“正立体”指这些配体结合在相同受体位点，并且通常为互斥方式的结合。例如，一种配体与所述受体的结合物理阻断了另一种配体与该受体的结合。

上述方法的实例如图8所示。图7所示数据的标准化图显示混合物中各配体的ACE₅₀值作为其K_d的函数而发生变化。已知在一个[S₁]₀值范围内测定的一组ACE₅₀值，可对配体混合物中各组分与蛋白质靶的亲和力进行评级。此外，通过图6所示等式的解答，各配体S_i的ACE₅₀值获得了对个体结合亲和力K_di的定量估计值。

变构结合的三元复合物模型如下所示。在该模型中，配体S₁和S₂结合了受体E上的不同位点，且解离常数分别为K_d1和K_d2。不过，如果两个配体同时与该受体结合，它们以系数α影响着彼此的结合常数。例如，S₁与E结合，解离常数为K_d1，但与二元复合物E·S₂结合形成三元复合物E·S₁·S₂，解离常数为α·K_d1。α＞1时，其中一种配体的变构相互作用提高了另一种配体的解离常数，产生了负协同效应。当α＜1时，为正协同效应，如果α＝1，一种配体的变构相互作用不影响另一种配体的结合。

利用大小排阻法分离混合物组分通常不能使二元蛋白质-配体复合物与变构结合的三元复合物分离；例如，当采用大小排阻层析时，所有蛋白质均从该SEC阶段共同洗脱。同样，特定配体的实测回收代表含有该配体的蛋白质-配体复合物的总和；例如，回收S₁与产物E·S₁和E·S₁·S₂的总浓度相关。图9显示了两种变构配体的模拟回收，其中K_d1＝2.0μM的S₁被滴定进含有浓度为5.0μM的受体E和浓度为2.0μM且K_d2＝0.5μM的S₂的混合物中。对协同系数α＝10而言，两个位点之间的负协同效应使S₂的回收随着滴定剂浓度的递增而减少。不过，其回收在正立体结合竞争情况中不会降低至零；当然，所述配体的回收因其受体浓度保持恒定而达到稳态(S₂的结合位点未被滴定剂占据)，而K_d2则以系数α倍数增大。这对两种配体的回收比率具有重要并可测定的影响：该比率在受体限制条件下并非随着滴定剂浓度的变化而线性提高，可根据下列公式(IX)作出该比率的双曲线图：

$\frac{E\·S_1+E\·S_1\·S_2}{E\·S_2+E\·S_1\·S_2}=\frac{{\[S_1\]}_0({\[S_2\]}_0+\mathrm{\α}{K}_{d2})}{{\[S_2\]}_0({\[S_1\]}_0+\mathrm{\α}{K}_{d1})}$

公式(IX)

且该比率渐进地受限于公式(X)所示的数值

$\underset{{\[S_1\]}_0\→\∞}{\mathrm{Lim}}\frac{{\[S_1\]}_0({\[S_2\]}_0+\mathrm{\α}{K}_{d2})}{{\[S_2\]}_0({\[S_1\]}_0+\mathrm{\α}{K}_{d1})}=1+\frac{\mathrm{\α}{K}_{d2}}{{\[S_2\]}_0}$

公式(X)

当负协同效应显著时，所述相互作用与互斥竞争性结合无法区分，公式(IX)的右手边可归纳为公式(XI)的右手边：

$\underset{\mathrm{\α}\→\∞}{\mathrm{Lim}}\frac{{\[S_1\]}_0({\[S_2\]}_0+\mathrm{\α}{K}_{d2})}{{\[S_2\]}_0({\[S_1\]}_0+\mathrm{\α}{K}_{d1})}=\frac{{\[S_1\]}_0{K}_{d2}}{{\[S_2\]}_0{K}_{d1}}$

公式(XI)

从利用变构竞争性配体进行的ACE₅₀滴定所获得的响应率数据可被代入公式(IX)中，以获得滴定剂的K_d和协同系数α，已知的是配体K_d、总配体浓度[S₂]₀、总受体浓度[E]₀以及对滴定剂和配体而言的相对MS响应校准系数。对图10所示ACE₅₀响应率数据的非线性回归分析获得对NGD-28835而言的协同系数α＝8.3±0.7，K_d值为3.0±0.3μM。该K_d值与通过利用基础激酶进行的独立滴定试验测定的3.3±1.3μM的K_d值基本一致。

图11A-F显示了测定若干种Akt-1配体同时结合模式的结果。滴定剂星形孢菌素的饱和结合不能在数量上取代这些配体，且响应率曲线与滴定剂浓度是渐进有界关系，说明与ATP/星形孢菌素结合位点有关的所有结合均为变构结合。(图11a和11b)，与之相反，最近被报导的Akt-1配体M-1(Merck and Company)所参与的竞争对所述相同化合物混合物的各组分而言是正立体结合竞争。这些结果说明M-1化合物和直接与其竞争的配体所结合的位点与ATP/星形孢菌素结合位点不同。(图11c和11d)

为了独立评估该结论，在ATP浓度变化条件下检验M-1和星形孢菌素对Akt-1激酶活性的抑制，如图12a-d所示。星形孢菌素结合了ATP-结合位点，与该推论相符，递增的ATP浓度使纳摩尔抑制剂星形孢菌素的实测IC₅₀提高了50倍以上。在不希望受限于理论的情况下，星形孢菌素IC₅₀随着ATP浓度的递增而升高的主要原因是ATPK_m的增大。星形孢菌素对该反应的V_max的影响即使在高ATP浓度条件下也不大。这些结果证实星形孢菌素是ATP的正立体竞争剂。(图12a和12b)

尽管M-1的IC₅₀仅为微摩尔级，但与星形孢菌素的纳摩尔级IC₅₀相比，其IC₅₀在相同ATP浓度范围内是以较小的系数倍数提高的。M-1的IC₅₀随着ATP浓度递增而增大的原因是与K_m的较小提高相关联的V_max减少是对星形孢菌素所观测到的结果的5倍。这些结果显示M-1是Akt-1的混合非竞争性抑制剂，说明作用的生化机制包括ATP取代(ATP K_m增大)和Akt-1激酶活性减慢(V_max减小)，并证实M-1的结合位点在地形上与Akt-1的ATP-和星形孢菌素-结合套不同。(图12c和12d)该结论与ACE₅₀结果相符，说明M-1和星形孢菌素同时结合Akt-1，并阐明了ACE₅₀技术如何可以被用于评估配体混合物的正立体和变构结合机制。

除了阐明它们的Akt-1结合机制外，M-1滴定试验还可对所述混合物组分进行亲和力评级。NGD-28839具有最高的ACE₅₀值，说明它是该试验混合物中具有最高亲和力的配体，因为它需要最高浓度的滴定剂M-1将其取代。NGD-28839显示了所述混合物组分的最佳生化活性，浓度为50μM时，对Akt-1激酶活性的抑制为44±8％。图5所示NGD-28839的ACE₅₀值为4.1μM(95％c.i.3.4-5.0μM)，对应的K_d为3.5±0.7μM(95％c.i.1.5-10.2μM)，获得M-1的K_d为0.3±0.1。该混合物中的其它配体显示对Akt-1活性的抑制弱于NGD-28839，与通过ACE₅₀滴定所说明的它们具有较低亲和力的结果相符。

如图13a-b所示，利用毒_碱性乙酰胆碱受体M₂的配体的小文库GPCR，进一步证实了通过ACE₅₀法对化合物混合物的亲和力评级和亲和力优化。该配体集合包括通过对质量编码文库进行的以AS-MS为基础的高通量筛选所发现的若干种具有化学型代表性的化合物，以及若干NGD-3346的结构类似物。已知的M₂配体阿托品被用作滴定剂，在含有0.5μM各组分化合物集合的条件下滴定2.0μM M2。响应率曲线为线性，(图13b)说明所有被检配体均与阿托品正立体竞争。与该结果相符，独立生化试验显示所有被检配体，例如阿托品均是M₂的拮抗剂。ACE₅₀曲线说明亲和力存在显著差异，NGD-3350表现的亲和力比其结构同类物NGD-3348和NGD-3346高10倍。(图13a)独立生化活性测定证实了该结果：NGD-3350在以细胞为基础的cAMP试验中表现的IC₅₀为1.6μM，在以组织为基础分析M₂拮抗作用的试验中表现的IC₅₀为9.6μM。虽然其它化合物均在cAMP试验中表现出适度的M₂拮抗活性，仅NGD-3350在组织中显示了显著活性。这些结果突出了ACE₅₀法的下述用途，即可同时对若干种化合物，尤其是对通过组合化学技术所合成的结构类似物混合物进行亲和力评级，并鉴定那些亲和力比其前身提高了的化合物，例如，NGD-3350的亲和力与其亲本NGD-3346相比提高了。

平衡解离常数K_d描述了单位点平衡结合情况中产物和反应物的平衡浓度，也可被表达为解离速度常数k₂与结合速度常数k₁的比率，如下列公式(XII)所示。

$K_d=\frac{k_2}{k_1}=\frac{\[E\]\[S\]}{\[\mathrm{ES}\]}=\frac{\[E_0-\mathrm{ES}\]\[S_0-\mathrm{ES}\]}{\[\mathrm{ES}\]}$

公式(XII)

由该等式可以看出，已知结合速度常数k₁时，较低的解离速度常数k₂值将产生较小的K_d值，从而使预期蛋白质-配体复合物的平衡浓度也较高。

受体-配体复合物E·S(或更简化的ES)的浓度随时间变化的总反应速度dES/dt是其形成速度与其减少速度之间的微分(参见公式(XIII))。

$\frac{d\[\mathrm{ES}\]}{\mathrm{dt}}=k_1\[E\]\[S\]-k_2\[\mathrm{ES}\]$

公式(XIII)

ES的形成速度取决于结合速度常数k₁、受体E₀的总浓度和配体S₀的总浓度，而ES的解离速度取决于ES浓度和解离速度常数k₂。因此，可利用下列公式(XIV)对dES/dt建模，适用于受体与单一配体之间的单位点可逆结合。

$\frac{d\[\mathrm{ES}\]}{\mathrm{dt}}=k_1\[E_0-\mathrm{ES}\]\[S_0-\mathrm{ES}\]-k_2\[\mathrm{ES}\]$

公式(XIV)

还应注意的是，当dES/dt为0时，(通过定义，当体系处于平衡状态时)，公式(XIV)可归纳为公式(XII)形式的平衡表达式。

依此类推至上述单配体一单位点平衡，配体S和抑制剂配体I之间的竞争性结合如下所示。如公式(XV)所示，

公式(XV)

游离受体E可与游离配体S反应形成复合物ES，或者与游离抑制剂I反应形成复合物EI。蛋白质．配体复合物ES和EI的浓度变化总速度可分别通过公式(XVI)和(XVII)得以描述。

$\frac{d\[\mathrm{ES}\]}{\mathrm{dt}}=k_{s1}\[E_0-\mathrm{ES}-\mathrm{EI}\]\[S_0-\mathrm{ES}\]-k_2\[\mathrm{ES}\]$

公式(XVI)

$\frac{d\[\mathrm{EI}\]}{\mathrm{dt}}=k_{i1}\[E_0-\mathrm{ES}-\mathrm{EI}\]\[I_0-\mathrm{EI}\]-k_2\[\mathrm{EI}\]$

公式(XVII)

上述系统的行为可利用上述两个已知下列数值的等式的同步数解进行建模，即已知系统参数总受体浓度E₀、总配体S₀和总抑制剂I₀浓度、混合物中相互作用组分的结合和解离速度k_s1、k_s2、k_i1和k_i2，以及ES和EI的初始浓度。

ES的初始值不等于0时，公式(XVI)和(XVII)的联立解使人们可以在突然加入过量抑制剂的基础上对系统随时间的行为进行建模。过度大量的抑制剂I被加入ES溶液中时，E和S的结合速度k_s1可被估计为0。这是因为当受体-配体复合物ES解离时，受体将接着与抑制剂I结合，因为存在过度大量的I，使得ES复合物仅可实现解离，而关闭了E和S再结合的途径。因此，当S与I竞争结合E时，过度大量的抑制剂I基本上占据了E的所有结合位点。公式(XVIII)描述了当过度大量的抑制剂I被加入ES混合物中时公式(XVI)的解答。

[ES]＝[ES]_t＝0e^-ks2·t

公式(XVIII)

图14-17是数字建模试验的实例，该试验当抑制剂浓度变化及其它参数变动如图所示时模拟了对受体-配体复合物而言随时间变化而产生的响应，所述其它参数包括配体S和抑制剂I的结合和解离速度。对该等式的解答获得了受体-配体复合物的动力学解离速度k₂和半衰期。k_s2与t_1/2的关系如公式(XIX)所示。

半衰期t_1/2＝0.693÷k_s2

公式(XIX)

图14所示为特定系统的数学模型，该系统由具有典型结合和解离速度的5μM受体和1μM配体组成，该系统已加入过度大量的抑制剂，该抑制剂以1∶1的比率稀释了原始已平衡的受体-配体混合物，并同时保持总配体浓度恒定。如上所述，所述抑制剂与所述配体竞争受体时的速度取决于所述受体-配体复合物的解离速度和抑制剂与受体的结合速度；图14所示结果对应的是具有变化的结合速度的抑制剂。用特定的非结合抑制剂(k_i1＝0)稀释受体，可使受体和受体-配体复合物的总浓度最初降至其原始值的50％，随后(在缺乏有效抑制剂的条件下)体系本身恢复新的平衡，其中所述特定的非结合抑制剂含有特定浓度的配体，该配体的总浓度与平衡的受体-配体混合物的总浓度相等。不过，存在过量结合抑制剂的条件下(k_i1≠0)，所有游离受体均被该抑制剂快速猝灭，因此不会再次形成受体-配体复合物。同样，一旦所有受体-配体复合物自发解离，解离速度取决于k_s2，该游离受体被过量抑制剂猝灭。因此，加入过量抑制剂后，受体-配体复合物的可测浓度将随时间降低。即使采用结合极慢的抑制剂(k_i1＝0.001μM^-1秒^-1)，也可发现衰变曲线的斜率接近由纯解离动力学获得的理论衰变曲线[ES]₀e^-ks2·t的斜率(公式XVIII)。由于衰变是指数函数，在对数区比较曲线图时，试验衰变曲线和理论衰变曲线的相似性还要更为显著，如图15所示。

例如，当过量I被加入配体和受体的混合物中时，可根据相对意义测定多种配体的相对结合动力学。由于在I充分过量的情况下，可以假设配体一旦与受体解离便不会再次与受体结合，在配体混合物中信号响应降低最快的配体可被确定为具有最高的配体解离速度。

该方法的实例也如图16所述。该图通过数学方法演示了一个体系，该体系由具有典型受体-配体结合速度和变化的受体-配体解离速度的5μM蛋白质和1μM配体组成，该体系已加入过度大量的抑制剂，该抑制剂以1∶1的比率稀释了原始已平衡的受体-配体混合物，并同时保持总配体浓度恒定。各配体解离速度模型还显示了根据纯解离动力学获得的理论衰变曲线[E·Sub]₀e^-ksub2·t(公式(XVIII))。该模型说明受体-配体复合物的减少速度与绝对解离速度紧密相关。

图17评估了受体-配体复合物在建模竞争性结合试验中的衰变速度与根据纯解离速度的测定所预测的理论衰变曲线的准确相关性程度。所示建模衰变曲线的k_s1＝0.01秒^-1，所示理论曲线的解离速度±该值的10％。该结果说明实测解离速度在实际值的约10％范围内，与实际解离速度很接近，显示了该试验方法的简易性。

由于实验测定的衰变曲线与根据一级解离动力学所预期的指数衰变曲线十分近似，可采用有效的曲线逆合算法，诸如那些与MicrosoftExcel^_一起应用的算法，将试验数据代入纯指数衰变函数中，以获得与各配体有关的解离速度和半衰期信息。通过在将过量的竞争性抑制剂加入蛋白质和配体或被关注配体的平衡混合物中之后进行的连续试验，随时间变化测定获得一组蛋白质-配体复合物浓度值，各配体的解离速度可以被定量估计，混合物中多种配体的相对速度可以被定性评级。

术语“非竞争性配体”指与受体上除了活性部位以外的第二个位点结合的配体。非竞争性配体的结合与另一种配体的结合可同时发生(例如在酶的催化位点上)，或者可以单独结合受体，却仍影响该受体的响应。在某些情况下，非竞争性配体(例如酶的非竞争性配体)可通过降低受体的效率(例如降低酶的效率或改变受体构象，包括活性部位构象)而得以发挥作用。

配体为非竞争性配体时，一旦该配体与受体-配体复合物解离，加入过量抑制剂I将不会抑制该配体的再结合。因此，在加入过量抑制剂后，非竞争性配体的信号响应随着时间的推移仍将保持恒定。

还有另一种对具有理想结合特征的配体进行比较和鉴定的方法，包括比较“受体限制”和“受体过量”条件下的配体结合。对所含“初始”(例如已知)配体S_i和第二种“不同”(例如相关或改良)配体S_v的浓度在一个受体浓度范围内均固定不变的理论双组分混合物而言，下列公式(I)

$K_{\mathrm{di}}=\frac{({\[E\]}_0-\underset{i}{\mathrm{\Σ}}\[E{S}_i\])({\[S_i\]}_0-\[E{S}_i\])}{\[E{S}_i\]}$

公式(I)

的联立解生成如图18所示对受体-配体复合物浓度[ES_i]和[ES_v]的图解，其中的条件如注释。当总受体浓度[E]₀从[E]₀＜[Si]₀升高至[E]₀＞[S_i]₀时，所述试验条件则从“受体限制”转变为“受体过量”。当试验接近受体-限制条件时，较紧密配体的受体-配体复合物与较弱配体的受体-配体复合物的比率提高，说明较紧密配体比较弱配体更易竞争到有限量存在的受体。因此，对质量编码混合物中各配体的结合亲和力的评级是通过下述步骤实现的，即分别在受体限制和受体过量条件下，使包括初始(例如原始引导)化合物的配体混合物与受体接触；通过亲和力选择-质谱分析法对所获受体-配体复合物进行定量；并比较各配体的信号响应比率；该比率是1)受体缺乏条件下配体的信号响应与受体过量条件下各配体的信号响应之比和2)受体缺乏条件下配体的信号响应与受体限制条件下配体的信号响应之比。

本文所述方法可通过下述方法进行，即利用大小排阻层析分离混合物中的各组分，使未结合配体与受体和受体结合配体分离，接着进行液相层析。该液相层析可在受体与配体解离的条件下进行。解离受体可以接着通过质谱仪获得信号响应。

图19从左至右所示为，受体-配体复合物形式的配体所遵循的途径是利用本文所述方法在样品内得到鉴定的。使包括受体、配体和受体-配体复合物的样品通过大小排阻柱(SEC)，并利用UV检测器(UV1)监测洗脱液。样品接着进入进样环，在这里被转移至第二个分析装置，或者转向流出口(例如废液)，通过第二个UV检测器(UV2)可对其进行监测，如图19所示。

许多筛选和分析技术依赖于光吸收检测器(例如UV、荧光)以确定受体在液体样品中的缺乏或存在。UV检测器测定被通过该检测器的原料吸收的UV光。吸光度与时间的关系曲线被典型地标绘在记录纸上。原料是在通过大小排阻层析设备后被检测的，输出峰被生成在记录纸或监控器上。峰的大小(即体积)与样品或原料在特定波长条件下的吸光度程度对应。

用UV检测器检测样品原料之前，首先利用大小排阻层析使受体-配体复合物与未结合配体及其它混杂物分离。样品中的各分离组分在UV迹线中形成峰，被生成在记录纸上。具有大物理尺寸的分子是首先被大小排阻层析洗脱的，并形成早期的UV峰。例如，当样品所含受体为蛋白质，配体为小分子，且一部分受体和配体形成了受体-配体复合物的情况中，受体和受体-配体复合物将在洗脱液流的前部共同洗脱，这是因为与具有较小尺寸的小分子配体相比，蛋白质的尺寸相对较大。

术语“大小排阻层析”(SEC)指利用多孔颗粒以分离不同尺寸的分子。通常被用于分离生物分子，并测定高聚物的分子量和分子量分布。通常而言，小于孔径的分子可进入上述颗粒，并因而与不能进入该颗粒的较大分子相比，具有了较长的路径和较长的移行时间。大于该孔径的分子不能进入孔内，在层析图中以第一个峰的形式被共同洗脱。该情况被称为全排阻。可进入该孔的分子在颗粒中的平均停留时间取决于该分子的尺寸和形状。因此，不同分子通过该柱时的总移行时间不同。小于孔径的分子可进入所有孔内，在柱上的停留时间最长，在层析图中以最后一个峰的形式共同洗脱。

样品存在于SEC的洗脱液流(“SEC洗脱液”)中，该洗脱液流是经过UV检测器的。如图20A所示，SEC洗脱液10经过进样环1，(例如1、5、10、15、20、25、50、100、150、200、250或300μl的进样环)被加样在高速2-位6-通道选择阀门4上，并流进流出洗脱液12中，直到UV检测器(未显示)检测到包括受体-配体复合物的峰为止。进样环1和阀门4的初始位置被称为“加样”位置。

基于对受体-配体复合物的检测，与计算机(未显示)相连的控制器起动了被设定为预定时间长度的定时器，该预定时间长度足以使进样环1充满受体-配体复合物(例如2-5秒)。一旦该进样环充满受体-配体复合物，控制器将2-位6-通道选择阀门4中的进样环1旋转至图20B所示位置。相应地，充满的进样环包括样品中所有受体-配体复合物的代表性示图。

该位置被称为“注入”位。如图20B所示，SEC洗脱液10和流出口洗脱液12不再与进样环1相连，而是相反地，进样环1与被连接至分析装置的不同洗脱液流相连。分析装置洗脱液14a(例如溶剂)流入并经过进样环1，并以样品洗脱液14b的形式流出进样环1，该样品洗脱液14b流入分析装置(未显示)待鉴定(例如质谱分析)。

分析设备可经过调整以处理不同数量的样品，包括小或微量样品。对15μl进样环而言的样品参数如下：由SEC到多通道阀门4的连接管为35cm×75μm；进样环为84cm×150μm；从分析装置洗脱液14a到进样环的连接管为40cm×20μm；从进样环到分析装置(即样品洗脱液)14b的连接管为50cm×100μm；从进样环到流出口洗脱液12的连接管为45cm×75μm。被用于在SEC之后收集洗脱液的进样环由涂有高聚物的毛细管制成。预期长度(即具有预期体积)的毛细管接着被卷成环状，从而减少了其所占据的空间。

控制器可被例如观测UV峰检测和定时器的人员手动操纵。可选地，该控制器可与计算机连接并通过软件程序得以运行。例如，该软件程序可在利用UV检测器检测受体-配体复合物的基础上起动定时器，其中控制器在预定时间将进样环1从图20A所示加样位置旋转至图20B所示的注入位置。

在某些情况中，被用于操纵控制器的软件是围绕配备有数字和模拟输入的National Instruments数据采集(DAQ)仪表板建立的。大小排阻层析系统的接点闭合与上述数字输入之一连接。注入样品时，该接点闭合关闭，数字输入起动。这向控制器报告样品已开始流动。

本文所述方法可利用两个UV检测器，各检测器相对于样品的吸光度水平所输出的模拟信号范围是-1V到+1V。例如，第一个UV检测器可被置于SEC柱(即在SEC洗脱液10的液流中)与多通道阀门4之间。第二个UV检测器可被置于流出口洗脱液12的液流中。信号与控制器的两个模拟输入相连。利用仪表板上12位的模拟数字(A/D)转换器将信号转换为数字。利用该数字信号，控制器可接着追踪通过UV检测器的峰。

由于大小排阻层析的性质，流出UV检测器的第一个峰通常是含有受体-配体复合物和游离受体的峰。控制器等待信号的第一次升高并将其以峰的形式记录下来。对进样环中的峰(即样品)的捕获是基于从检测该峰开始起动的定时器。

可推动溶剂通过UV检测器的泵的流速可以恒定在2mL/分钟。该流速可用3.3秒充满100μL的进样环。因此，在峰鉴定之后使进样环1充满待检原料所需的时间延迟约为3.3秒。不过，由于从UV检测器到控制器可能存在信号延迟，时间延迟是通过试验方法针对各系统配置测定的(即对该系统进行校准并针对系统的各个变化重新校准)。由于从样品到样品的体积和流速不变，从UV检测器到进样环的移行时间上的任何变动仅因为溶剂泵所产生流速的任何不稳定性。因此，管件上的任何变化(例如系统被改变或其任意组成被替换或调整时)无疑均需要重新评估时间延迟。

两个UV检测器可被用于捕获旋转多通道阀门之前和之后的数据，该旋转将进样环中捕获的样品转移进诸如LC-MS的分析装置。根据这两个UV检测器提供的数据所作出的图直观地说明了与每一样品对应的样品捕获。一个检测器追踪受体-配体复合物，并通过控制器被用于记录旋转进样环和阀门的时间。第二个检测器则与被转向远离分析装置的样品流相连。由该检测器所获得的迹线显示了未被进样环捕获的物质。对两个迹线进行的比较说明了峰捕获的效率。

为了提高UV装置中样品检测的准确性，采用了特定算法收集并处理数据，并确定峰的存在(即受体-配体复合物的存在)。DAQ仪表板收集最大频率为20kHz的数据。但原始数据通常太不稳定，以至于不能用于峰鉴定。例如，由于信号噪声，可忽略低蛋白质浓度的样品。相应地，可采用特定算法处理数据并提供可靠的数据输出。

目前采用的算法收集并平均当前时间间隔的原始数据组。这些经过平均的数据组接着经过进一步的加工，生成可被控制器追踪并形成峰的数据的移动平均值。例如，取样速度为10kHz(每秒10,000个数据点)时，每50毫秒连续收集并平均含有500个原始数据点的数据组。最初7个组(各含500个原始数据点)被命名为A、B、C、D、E、F和G。数据组A到E经过平均后，生成数据点1.数据组B到F经过平均，生成数据点2.数据组C到G经过平均，生成数据点3，依此类推。控制系统对这些数据点作图并进行核查后，形成峰。

峰检测标准只定位三个数值升高超过初始阈值的连续数据点。该阈值是通过在最初2秒的数据捕获期间追踪数据点而得以确定的，在该时间段内，样品缓冲液仅通过了UV检测器。最高数据点被设定为阈值。这排除了因计算缓冲液的UV吸光度所产生的假阳性峰上的采样数以及由于线噪声导致的信号变动。使用者可任选地将该阈值提高额外的预设量。

图21所示为利用50mm大小排阻层析柱和磷酸盐缓冲液并以2mL/分钟流速分离并鉴定样品中的人血清白蛋白(HSA)和配体的代表性结果。UV1和UV2迹线的相对高度表明各峰均以可重现方式被切割了相同量(约60％相对峰面积)。尽管峰的保留时间实际上一致，但并非正确系统操作所必需的。峰检测和切割是相对于峰位置动态发生的，所以与保留时间无关。

改变峰切割时间易于进行，对HSA体系而言这样做的结果如图22A-22F所示。相应地，当利用所述方法，从注入口阀门的加样位置到注入位置的变化时机可根据使用者希望收集哪一部分的峰而进行调整。图22A所示为2秒后在进样环中捕获的峰部分。图22B所示为2.5秒后在进样环中捕获的峰部分。图22C-22F所示分别为3.0秒、3.5秒、4.0秒和4.5秒后在进样环中捕获的峰部分。由图22A-22F可知，通过控制器改变从检测到旋转进样环的延迟时间，可在进样环中捕获峰的不同部分(例如，检得受体-配体复合物的不同部分)。图中的垂直线约为被进样环捕获的100μL样品部分。在所示数据中，3秒(参见图22C)是延迟时间的最优值。

尽管预期样品移行时间是计算的，仍然必须校准阀门死体积和UV检测器流动池与额定值的偏离值。检测器输出的滞后时间也是需要考虑的因素。在各情况中，校准运行样品可测定因为上述原因产生的移行时间偏离值。

增大进样环尺寸以便捕获更多的样品峰部分。不过，该峰的前部通常是最为理想的部分，因为其仅含受体-配体复合物，而且极少可能含有贯穿的未结合配体。贯穿指表观质量远大于其真实质量的小分子被观测到通过了大小排阻层析柱，从而以具有蛋白质信号的未分离峰的形式出现的现象。

术语“信号响应”指分析装置或检测器(例如质谱仪、UV、荧光、HPLC、NMR、IR等)的输出，该输出以可测定方式与分析装置中存在的被关注物质的量相关。特定物质的信号响应取决于与该物质本身相关的许多因素(例如UV活性、电离潜能等)，以及与所述分析装置或检测器相关的因素(例如灵敏度)。物质的信号响应可与该物质的量线性相关。不过，信号响应并不一定与物质的量线性相关，更确切地说，唯一必要的是该信号响应以可测定方式取决于待评估物质的量。例如，该信号响应可与所述分析装置或检测器所分析物质的量存在对数或指数关系。

术语“校准”指通过测定或与标准进行比较，测定仪表或其它测量仪表所示各刻度的校正值。例如，分析或测量仪表(例如质谱仪)可通过测量或测定那些已知真实值的分析物的多个数值(例如配体浓度)而得以校准。该测量值可能是“绝对值”，即真实测量值，或者可能是“相对值”，即与测量值相关，该相对值说明测量值在特定范围内。

术语“质谱仪”指利用电离原子或分子的质荷比(m/e)差异将它们彼此分离的分析装置。因此，质谱分析法以便定量原子或分子，也以便测定与分子有关的化学和结构信息。分子具有的特殊断裂方式可提供以便鉴定结构组分的结构信息。质谱仪的常规操作如下：(a)生成气相离子；(b)基于离子的质荷比在空间或时间上分离它们；并(c)测定各质荷比的离子数量。质谱仪的离子分离能力是由其分辨率描述的。

本领域已知许多电离源，例如电喷射离子化(ESI)、电子电离化(EI)、快速原子轰击电离化(FAB)、基质辅助激光解吸质谱(MALDI)、电子俘获(有时被称为阴离子化学电离化或NICI)和气压化学电离(ApCI)。在上述任一电离化方法中产生的离子均通过质量分离器，典型的是磁场、四极电磁铁或飞行时间质量分离器，因而可以区分这些离子的质量并确定各质量水平的离子数量。

质谱分析法(MS)是被广泛用于表征和鉴定有机和无机化学方面的分子的技术。MS提供了与分子有关的分子量信息。分子的分子量是与鉴定分子混合物中特定分子方面有关的重要信息。MS分析法可被应用在，例如药物研发和生产、污染控制分析和化学制剂质量管理方面。

术语“配体”指与受体相联的分子(例如以共价或非共价方式相互作用)。在某些情况中，配体与受体的结合可以具有生物效应(例如促效或拮抗)。例如，配体可以是与生物分子(例如DNA分子)结合的多肽(例如蛋白质)，其中该蛋白质与该DNA的结合起动了mRNA合成。配体还可以是与酶(例如HIV蛋白酶)结合的有机分子(例如药物化合物)，其中该有机分子与该酶的结合抑制了酶活性。

术语“变异配体”指与原始配体相关但迥异于该配体的分子。例如，变异配体可具有与原始配体相同的核心结构，还具有与该核心结构相连的一个或多个不同的周围基团。这些不同基团可以稍稍发生变化，例如将甲基改变为乙基。可选地，这些不同基团可以更显著地发生变化，例如将酰胺基改变为芳族基。变异配体还可以包括从改变原始配体的核心结构而获得的配体，例如将苯环改变为吡啶环，等等。

术语“i”指介于1和受体配体混合物中所含配体数量(即具有独特结构的配体)之间的整数，其中“i”表示混合物中的个体配体。

术语“有机分子”指非肽化合物，其中该分子包括碳和氢，还可以包括其它元素，诸如氮、氧、磷、卤素或硫(例如药物化合物)。药学可接受盐(例如马来酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、乙酸盐、延胡索酸盐、水杨酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、扁桃酸盐、酒石酸盐和甲磺酸盐)也被包括在术语“有机分子”的意义内。

术语“抑制剂”指与受体相联，并且在与该受体相联时影响了该受体功能或干扰该受体与另一个配体结合的分子。在某些情况中，该抑制剂是以与配体竞争的方式结合受体。

术语“受体”指在与第二个分子结合的基础上才能够发挥或起动作用(例如生物活性或可检测信号)的分子。例如，受体可以是结合了特异性胞外信号分子(例如配体)并起动了在细胞中的响应的蛋白质。细胞表面受体的实例包括乙酰胆碱受体和胰岛素受体。胞内受体的实例包括可与扩散进入细胞穿过质膜的配体结合的激素。其它受体实例包括：多肽、蛋白质、酶、核酶、RNA、DNA和生物分子模拟物。

术语“生物分子”指对生物活性(例如代谢、拮抗、促效、发信号或转录)起作用的分子。虽然生物分子可存在于活生物体内，但术语生物分子并不限于天然存在的生物分子，还包括天然存在的生物分子的合成形式，及其片段和修饰。生物分子的实例包括：多肽、蛋白质、酶、核酶、RNA和DNA。

术语“多肽”指由多个氨基酸组成的高聚物。蛋白质可以是多肽的一个实例。

术语“酶”指可通过提高化学或生化反应的反应速度从而发挥(生物)催化剂作用的大分子，通常为蛋白质。通常，酶仅催化一类反应(即反应选择性)，并且仅针对一类底物发挥作用(即底物选择性)。底物分子均在相同部位被转化(区域选择性)，并且通常外消旋底物对中仅有一种手性底物被转化(对映选择性，一种特殊形式的立体选择性)。

术语“核酸”指由核苷酸亚单位组成的高聚物。该核苷酸亚单位可通过磷酸二酯键连接在一起。

术语“受体-配体结合对”指含有通常以可逆方式通过非共价相互作用(例如氢键结合、离子相互作用或疏水相互作用)结合在一起的受体和配体的复合物。

术语“滴定剂”指在滴定中定量地与分析物(例如受体)反应和/或相互作用的底物(例如配体)。该滴定剂通常是被小心地加入分析物中直到反应和/或相互作用结束的标准溶液。分析物的量是根据完成反应所需滴定剂的体积计算的。

术语“滴定”指下述操作，即其中一种溶液(例如具有已知K_d的配体溶液)被加入另一种溶液(例如底物和配体的混合物，其中K_d未知)，直到两种溶质(例如所述底物和具有估计K_d的配体)之间的相互作用结束，其中一种配体溶液的浓度已知，或大概已知(例如具有已知或估计K_d的配体的浓度)。

术语“平衡”指可逆化学和/或生化反应和/或相互作用的状态，在该状态下，反应物变成产物的速度与产物变回反应物的速度相同，各反应物和产物的量因而得以基本上保持恒定。

短语“破坏受体-配体结合对”指使受体-配体结合对解离成未结合的受体和配体。受体-配体结合对的破坏可通过多种方法实现，诸如利用层析法(例如在高温条件下进行的高分辨率反相层析法)；改变压力、pH、盐浓度、温度或有机溶剂浓度；或用已知配体竞争结合受体，或这些技术的任意组合。

术语“液相层析”指被用于分离溶解在溶剂中的离子和/或分子的分析层析技术。如果样品溶液是与第二种固或液相接触，不同溶质将由于吸附、离子-交换、分配或大小的差异而与另一个相相互作用至不同程度。通过利用这些差异确定溶质通过柱的移行时间，可使混合物中的各组分彼此分离。高效液相层析法(HPLC)是一种形式的液相层析法，可分离溶解在溶液中的化合物。HPLC设备由流动相储器、泵、注入器、分离柱和检测器组成。通过将一活塞的样品混合物注入到柱上，可对化合物进行。混合物中的不同组分以不同速度通过柱的原因是它们在流动液相和固定相之间的分配行为上存在差异。

术语“竞争性结合剂”指与受体结合在特异性位点(例如酶的催化位点)上，并在类似动态平衡的过程中与另一种配体在所述特异性位点上竞争结合的配体。

术语“质量编码的”指一组化合物(例如相关化合物、原始化合物及其变体或任意组合)的质量，其中该组化合物中至少大约90％的个体化合物所具有的分子量与该组其它所有化合物的分子量均不同。

术语“阈结合特征”指配体的所有明确特性，这些特性以便客观鉴定该配体与靶结合的能力。例如，阈结合特征可被定义为配体的特定K_d，例如＜50μM、＜20μM、＜10μM、＜1μM、＜0.5μM、＜0.1μM、＜0.01μM等。可以相对于使用者所选择或期望的其它已知配体，例如标准化合物，定性或定量地确定该阐结合特征。可选地，一种配体的阈结合特征可相对于其它配体而得以定性地确定，例如阈结合特征可被定义为混合物中的最佳结合配体，例如，阈结合特征可以是比所述混合物中1/2的配体结合还要紧密的配体，比混合物中3/4的配体结合还要紧密的配体或比混合物中的已知配体结合紧密的配体。相同类型的定量和相对结合特征也可被用于分析配体的k_off、半衰期、t_1/2或其它结合特征。

熟练技术人员可以意识到的是，合成适用于本发明的化合物的方法对本领域普通技术人员而言是显而易见的。此外，多个合成步骤可按照交替顺序或次序进行，以获得预期化合物。以便合成本文所述化合物的合成化学转化和保护基方法学(保护和脱保护)均是本领域已知的，包括，例如 R.Larock，Comprehensive Organic Transformation，VCH Publishers(1989)；T.W.Greene and P.G.M.Wuts，ProtectiveGroups in Organic Synthesis，2d.Ed.，John Wiley and Sons(1991)；L.Fieser and M.Fieser，Fieser and Fieser’s Reagents for OrganicSynthesis，John Wiley and Sons(1994)；和L.Paquette，ed.，Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis，John Wiley and Sons(1995)及它们的后续版本所描述的那些方法。此外，化合物和/或化合物文库可通过商业渠道采购获得。而且，可通过下述步骤制备化合物，即将购买的前体组合后，进行其它合成操作，从而获得预期化合物。

实施例

实施例1：对人血清白蛋白(HSA)和小分子苄丙酮香豆素的K_d的测定

对含有0.125pmol、0.25pmol、0.5pmol、1pmol、2pmol和4pmol苄丙酮香豆素的6个试验样品进行分析，以建立与苄丙酮香豆素的质谱信号相关的校准曲线。为提高校准的准确度，与0.125pmol样品对应获得2个数据点。

通过系列稀释制备7个含有已知浓度的苄丙酮香豆素[S]₀的试验样品。具体而言，对由80、40、20、10、5、2.5或1.0uM总[苄丙酮香豆素]组成的2uL样品重复测定与苄丙酮香豆素对应的校准信号强度。在上述各样品中加入恒量的HSA，其浓度已知标称但不精确。在该情况中，采用的是0.2uM标称[HSA]。将样品溶液一起温育特定时间，该时间足以使受体-配体(HSA-苄丙酮香豆素)复合物达到平衡，约为30分钟。

接着，使含有HSA、未结合的苄丙酮香豆素和HSA-苄丙酮香豆素复合物的溶液通过大小排阻层析，以基于分子尺寸将HSA外加HSA-苄丙酮香豆素复合物与未结合的苄丙酮香豆素分离，HSA外加HSA-苄丙酮香豆素复合物在洗脱液流的前部共同洗脱出来。

含有HSA外加HSA-苄丙酮香豆素复合物，而不含任何未结合的苄丙酮香豆素的洗脱液流部分被转移至反相层析阶段，进行脱盐并洗脱进质谱仪中。该反相层析基本上破坏了HSA-苄丙酮香豆素复合物。分离后，对苄丙酮香豆素的鉴定是基于其分子量或质谱-质谱断裂模式。随后通过测定苄丙酮香豆素的校准信号响应对其定量。

由于任意数量的未结合HSA的苄丙酮香豆素是通过大小排阻与HSA-苄丙酮香豆素复合物分离的，所有到达质谱仪的苄丙酮香豆素(即回收配体)均来自于HSA-苄丙酮香豆素复合物。因此，与苄丙酮香豆素对应的校准信号与开始大小排阻层析时存在的HSA-苄丙酮香豆素复合物的量相关。

[HSA-苄丙酮香豆素]和[苄丙酮香豆素]数据对被代入下列公式中：

$K_d=\frac{({\[E\]}_0-\[\mathrm{ES}\])({\[S\]}_0-\[\mathrm{ES}\])}{\[\mathrm{ES}\]}$

通过数字非线性回归技术，可获得与参数K_d和[HSA]₀对应的最适值。

上述试验的结果如图23所示。通过数字非线性回归技术估计的参数K_d和[HSA]₀分别为4.9uM和0.14uM。K_d值与文献值良好地一致；[HSA]₀的值显示约75％的标称蛋白质浓度是有效的，即在试验中能够结合配体。

实施例2：包括猪毒_碱受体(pM2R)的受体-配体系统

制备一系列的7个实验样品，含有恒定浓度(4.0μM)的猪毒_碱受体(pM2R)，恒定浓度1μM的配体Si混合物(参见下表1)和递增浓度(0、0.1、0.22、0.46、1.0、2.2、4.6、10、22、46和100μM)的另一种已知配体[S₁]₀(阿托品)。将这些样品温育特定时间。该时间足以使受体-配体复合物在各样品中形成反应并达到平衡，约为30分钟。

接着使含有pM2R、未结合配体和pM2R-配体复合物的溶液通过大小排阻层析，以基于分子尺寸将pM2R外加pM2R-配体复合物与未结合配体分离，该pM2R外加pM2R-配体复合物在洗脱液流的前部共同洗脱．含有pM2R外加pM2R-配体复合物而不含任何未结合配体的洗脱液流部分随后被转移至反相层析阶段，进行脱盐后洗脱进入质谱仪。读反相层析破坏并分离了所述受体一配体结合对。因此，在反相层析后，对配体进行质谱分析(MS)，基于其分子量或质谱-质谱断裂模式进行鉴定。

未结合pM2R的任意量配体是通过大小排阻步骤与pM2R-配体复合物分离的。因此，所有达到质谱仪的配体(即回收配体)均来自于对应的pM2R-配体复合物，与各配体S_i对应的质谱分析信号与开始大小排阻层析时存在的pM2R-配体复合物RL_i的量相关。

对含有恒定浓度的配体和pM2R和递增浓度的附加竞争剂阿托品的各试验样品标绘配体回收图，并测定混合物中各配体的50％抑制浓度点(ACE₅₀值)(参见图24)。定性的化合物亲和力是根据ACE₅₀值测定的。ACE₅₀值越高，K_d越低。

为定量测定K_d，将ACE₅₀值、初始pM2R受体浓度[E]₀、被研究混合物中化合物的初始配体浓度[S_i]以及竞争剂阿托品K_d代入图6所示等式中，该等式是公式(I)所示等式的解答。结果如图25所示。

表1：NGD结构表

实施例3：包括丝氨酸激酶Zap-70、NGD-6380和星形孢菌素的受体- 配体体系

制备含有9μM Zap-70和1μM NGD-6380的混合物并于室温温育30分钟，该时间足以使该混合物中的已结合和未结合组分达到平衡。向Zap-70和NGD-6380的混合物中加入含有100μM星形孢菌素和1μM NGD-6380的混合物(添加抑制剂以保持配体浓度不变)。表2所示为星形孢菌素和NGD-6380的结构。

以20、30、40、60、70、80和100分钟的时间间隔测定NGD-6380随时间变化发生的解离。NGD-6380的解离是以下述方式测定的。即使含有Zap-70、未结合NGD-6380和Zap-70-NGD-6380复合物的溶液的等分试样通过大小排阻层析，以基于分子尺寸将Zap-70外加Zap-70-NGD-6380复合物与未结合的NGD-6380分离，Zap-70外加Zap-70-NGD-6380复合物在洗脱液流的前部共同洗脱出来。含有Zap-70外加Zap-70-NGD-6380复合物而不含任何未结合NGD-6380的洗脱液流部分接着被转移至反相层析阶段，以进行脱盐并分离受体-配体结合对。因此，在反相层析后，对NGD-6380进行质谱分析(MS)，其中记录了信号响应。

未结合Zap-70的任意量NGD-6380是通过大小排阻步骤与Zap-70-NGD-6380复合物分离的。因此，所有到达质谱仪的NGD-6380(即回收配体)均来自于对应的Zap-70-NGD-6380复合物，与NGD-6380对应的质谱分析信号与开始大小排阻层析时存在的Zap-70-NGD-6380复合物的量相关。因此，由NGD-6380信号响应的量随时间降低可知Zap-70与Zap-70-NGD-6380复合物的解离。

将NGD-6380信号响应的减少与时间的函数关系标绘成图，并利用程序Mathematica^_(Wolfram Research Inc.，4.1版)将试验数据代入公式(XVIII)的指数衰减函数中。

[ES]＝[ES]₀e^-ks2·t

公式(XVIII)

解离速度k_s2和半衰期t_1/2的结果如图26所示。

表2：星形孢菌素和NGD-6380的结构表

实施例4：包括丝氨酸激酶Zap-70、NGD-746和星形孢菌素的受体- 配体体系

制备含有9μM Zap-70和1μM NGD-746的混合物，并于室温下温育30分钟，该时间足以使该混合物中已结合和未结合组分达到平衡。向含有Zap-70和NGD-746的混合物中加入含有100μM星形孢菌素和1μM NGD-746的混合物(通过加入抑制剂使配体浓度保持不变)。表3所示为星形孢菌素和NGD-746的结构。

如实例3所述，以20、30、40、50、60和90分钟的时间间隔测定NGD-746随时间变化产生的解离。将NGD-746信号响应的减少与时间的函数关系标绘成图，并利用程序Mathematica^_将试验数据代入公式8的指数衰减函数中。

[ES]＝[ES]₀e^-ks2·t

公式(XVII)

解离速度k_s2和半衰期t_1/2的结果如图26所示。

表3：星形孢菌素和NGD-746的结构表

实施例5：包括丝氨酸激酶Zap-70、配体混合物和星形孢菌素的受体 -配体体系

制备含有9μM Zap-70和1μM表3所示配体混合物的混合物，并于室温下温育30分钟，该时间足以使混合物中已结合和未结合组分达到平衡。向含有Zap-70和上述配体的混合物中加入含有100μM星形孢菌素和1μM上述配体的混合物(通过加入抑制剂使配体浓度保持不变)。

如实例3所述，以20、30、40、50、60、70、80、90、100、110和120分钟的时间间隔测定配体随时间变化产生的解离。将配体信号响应的减少与时间的函数关系标绘成图，并利用程序Mathematica^_将试验数据代入公式(XVIII)的指数衰变函数中。

[ES_i]＝[ES_i]₀e^-ks2·t

公式(XVIII)

半衰期t_1/2的结果如图27所示。解离速度k_s2如表4所示。

表4：星形孢菌素和NGD的结构表

实施例6：通过递增浓度的竞争剂配体与原始配体外加结构变体之间的竞争进行的以混合物为基础的亲和力选择-质谱分析法K_d评估。

对含有Zap-70激酶、通过高通量筛选技术发现的已知初始配体NGD-746，和NGD-746结构变体的质量编码混合物的蛋白质-配体模型体系进行下述步骤。

制备含有10μM标称浓度的受体Zap-70、包括原始配体NGD-746在内的恒定浓度(1μM)的配体混合物和递增浓度(0、0.22、0.46、1、2.2、4.6、10、22、46、100μM)的Zap-70配体星形孢菌素的试验样品。将这些样品温育特定时间，该时间足以使各样品中的受体-配体复合物形成反应并达到平衡，约为30分钟。

接着，使含有ZAP-70、未结合配体和ZAP-70-配体复合物的溶液通过大小排阻层析，以基于分子尺寸将ZAP-70外加ZAP-70-配体复合物与未结合配体分离，ZAP-70外加ZAP-70-配体复合物在洗脱液流的前部共同洗脱出来。含有ZAP-70外加ZAP-70-配体复合物而不含任何未结合配体的洗脱液流部分接着被转移至反相层析阶段，以进行脱盐，并被洗脱进质谱仪中。该反相层析破坏并分离了受体-配体结合对。因此，在反相层析后，对配体进行质谱分析(MS)，其中测定了信号响应，对配体的鉴定则是基于其分子量或质谱-质谱断裂模式。

未结合ZAP-70的任意量配体是通过大小排阻由ZAP-70-配体复合物分离而得。因此，到达质谱仪的任何配体(即回收配体)均来自于相应的ZAP-70-配体复合物，与各配体对应的质谱分析信号与开始大小排阻层析时存在的ZAP-70-配体复合物的量相关。

每种混合物组分和各试验样品中的竞争配体的标准化配体回收如图28所示。对备配体而言，将其响应降至在缺乏竞争剂条件下其值的一半所需要的竞争性配体星形孢菌素的浓度，即ACE₅₀值，与该配体的K_d逆相关。对混合物中各结构变体而言的ACE₅₀值和由各ACE₅₀值计算而得的K_d值也如图28所示。这些数据被用于鉴定具有被关注的结合特征的配体，和用于生成后续系列的优化混合物(例如变体化合物的新混合物)。

实施例7：原始配体NGD-746及其衍生物：NGD-6037、6367、6371、 6380、6390、6423、6432、6862的质量编码混合物的合成

将200mL冰醋酸中的5-Iodoisatin 1(10g，36.3mmol)和丙二酸(7.5g，72mmol)回流过夜。通过过滤收集沉淀，并用AcOH和丙酮进行洗涤。接着将固体与EtOH一起回流1小时。过滤并用EtOH和Et₂O洗涤后，获得产物6-碘-2-氧-1，2-二氢-喹啉-4-羧酸2，产量为8.8g(76％)。¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)：δ14.0(br s，1H)、12.13(s，1H)、8.56(d，1H，J＝8.1Hz)、7.83(dd，1H，J＝8.7，1.8Hz)、7.17(d，1H，J＝8.4Hz)、6.93(s，1H)。

在氩气和60℃条件下，将由6-碘-2-氧-1，2-二氢-喹啉-4-羧酸2(3.15g，10mmol)、3，4-(亚甲二氧基)苯基硼酸(2.49g，15mmol)、K₃PO₄(8.49g，40mmol)和Pd(OAc)₂(112mg，0.5mmol)在60mL脱气H₂O中形成的混合物加热2小时。冷却至室温后，通过过滤收集固体，用H₂O和丙酮洗涤。接着用20mL的1MHCl处理，再次对获得的黄绿色固体进行过滤，并用H₂O洗涤。利用P₂O₅真空干燥获得2.53g(82％)黄绿色产物3.¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)：δ14.0(br s，1H)、12.11(s，1H)、8.34(s，1H)、7.79(d，1H，J＝7.6Hz)、7.40(d，1H，J＝8.6Hz)、7.18(s，1H)、7.08(d，1H，J＝7.1Hz)、7.01(d，1H，J＝8.2Hz)、6.91(s，1H)、6.06(s，2H)。

室温下搅拌由酸3(2.0g，10.57mmol)、五氟苯酚(2.92g，15.85mmol)和EDC(3.04g，15.85mmol)在30mL NMP中形成的混合物6小时。过滤后，借助于NMP进行沉淀，将溶液倒入60mL冰水中。通过过滤收集获得的固体，用冰水和EtOAc洗涤后，在真空条件下干燥，获得酯4(2.80g，91％)，无需进一步纯化便可应用在下一步。

将溶于0.5mL DMF的酯4(12mg，0.025mmol)加入由吡咯烷子基吡咯烷(7.7mg，0.05mmol)和Amberlite^_碱性树脂(50mg)在1mL DMF中形成的混合物中。室温下搅拌该反应混合物12小时，加入异氰酸酯树脂(90mg)，继续搅拌3小时。接着通过过滤收集溶液，并于真空条件下浓缩后，获得产物NGD-746。MS m/z 446.2(M⁺+1)。

将6-苯并[1，3]间二氧杂环戊烯-5-基-2-氧-1，2-二氢-喹啉-4-羧酸3(1.0g，3.2mol)在10mL氯化氧磷中形成的溶液回流4小时后，冷却至室温。将该溶液浓缩至干燥状态，获得黄褐色固体。接着将该固体溶解在20mL二氯甲烷中。0℃条件下，将二异丙基乙胺(1.50g，11.5mmol)和2-(S)-吡咯烷基甲基吡咯烷(0.59g，3.84mmol)缓慢加入上述溶液中。室温条件下搅拌该混合物12小时。通过旋转蒸发除去溶剂后，使残余物溶解在乙酸乙酯中，用饱和NaHCO₃溶液和盐溶液洗涤。利用硫酸钠干燥有机相并将其浓缩。通过硅胶柱层析(Et₃N-AcOEt 5∶95)纯化残余物，获得(6-苯并[1，3]间二氧杂环戊烯-5-基-2-氯-喹啉-4-基)-(2-吡咯烷-1-基甲基-吡咯烷-1-基)-甲酮5(1.20g，81％)。MS m/z 464.2(M⁺+1)；¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)：δ 8.05(m，1H)、7.93(m，1H)、7.85(br s，1H)、7.41(s，1H)、7.13(m，1H)、7.11(s，1H)、6.92(m，1H)、6.03(s，1H)、4.58(m，1H)、3.92(m，0.5H)、3.75(m，0.5H)、3.38-3.13(m，2H)、2.94(m，3H)、2.35-2.15(m，2H)、2.04(m，3H)、2.01-1.85(m，4H)、1.83(m，1H)。

将含有2-氯喹啉5(20mg，0.0425mg)和N-甲基苄胺(0.1275mmol，3equiv)的0.3mL NMP在120℃条件下加热12小时。通过LC-MS分析指出反应的结束。接着将该反应混合物溶解在1mLDMSO/CH₃CN(3∶1)中，通过制备型LC进行纯化，以获得NGD-6073。MS m/z 549.3(M⁺+1)。

将含有2-氯喹啉5(20mg，0.0425mg)和3’-氟苄胺(0.1275mmol，3equiv)的0.3mL NMP在120℃条件下加热12小时。通过LC-MS分析指出反应的结束。接着将该反应混合物溶解在1mL DMSO/CH₃CN(3∶1)中，通过制备型LC进行纯化，以获得NGD-6367。MS m/z 553.3(M⁺+1)。

将含有2-氯喹啉5(20mg，0.0425mg)和4’-氯苄胺(0.1275mmol，3equiv)的0.3mL NMP在120℃条件下加热12小时。通过LC-MS分析指出反应的结束。接着将该反应混合物溶解在1mL DMSO/CH₃CN(3∶1)中，通过制备型LC进行纯化，以获得NGD-6371。MS m/z 569.2(M⁺+1)。

将含有2-氯喹啉5(20mg，0.0425mg)和4’-三氟甲基苄胺(0.1275mmol，3equiv)的0.3mL NMP在120℃条件下加热12小时。通过LC-MS分析指出反应的结束。接着将该反应混合物溶解在1mLDMSO/CH₃CN(3∶1)中，通过制备型LC进行纯化，以获得NGD-6380。MS m/z 603.3(M⁺+1)。

将含有2-氯喹啉5(20mg，0.0425mg)和2-甲基苯乙基胺(0.1275mmol，3equiv)的0.3mL NMP在120℃条件下加热12小时。通过LC-MS分析指出反应的结束。接着将该反应混合物溶解在1mLDMSO/CH₃CN(3∶1)中，通过制备型LC进行纯化，以获得NGD-6390。MS m/z 563.2(M⁺+1)。

将含有2-氯喹啉5(20mg，0.0425mg)和N-乙基苄胺(0.1275mmol，3equiv)的0.3mL NMP在120℃条件下加热12小时。通过LC-MS分析指出反应的结束。接着将该反应混合物溶解在1mLDMSO/CH₃CN(3∶1)中，通过制备型LC进行纯化，以获得NGD-6423。MS m/z 563.2(M⁺+1)。

将含有2-氯喹啉5(20mg，0.0425mg)和N-甲基-3’，4’-二氯苄胺(0.1275mmol，3equiv)的0.3mL NMP在120℃条件下加热12小时。通过LC-MS分析指出反应的结束。接着将该反应混合物溶解在1mL DMSO/CH₃CN(3∶1)中，通过制备型LC进行纯化，以获得NGD-6432。MS m/z 617.2(M⁺+1)。

将含有6-碘-2-氧-1，2-二氢-喹啉-4-羧酸2(5.97g，18.93mmol)的20mL氯化氧磷加热至100℃，持续4小时后冷却至室温。将该溶液浓缩至干燥状态，获得黄褐色固体。接着将该固体溶解在100mL二氯甲烷中。在0℃条件下，将二异丙基乙胺(20ml，大约100mmol)和2-(S)-吡咯烷基甲基吡咯烷(3.5g，22.7mmol)缓慢加入上述溶液中。室温条件下搅拌该混合物过夜。用二氯甲烷(200ml)稀释该混合物，用水(2×40ml)、饱和NaHCO₃溶液和盐溶液洗涤。

利用Na₂SO₄干燥有机相，将其浓缩后获得粗制品6(6.5g)。通过LC-MS的分析，该混合物的纯度足以使其能够应用在下一步中，且无需任何纯化便可直接应用。MS m/z 470.0(M⁺+1)。

将含有2-氯喹啉化合物6(3.12g，6.64mg)和p-三氟苄胺(5.81g，33mmol)的NMP(20ml)在120℃条件下加热36小时。通过LC-MS分析指出反应的结束。接着将该反应混合物冷却至室温，并用乙酸乙酯(200ml)稀释。用水和盐溶液洗涤有机相，并利用Na₂SO₄干燥。浓缩后获得粗制品，并通过硅胶柱层析(Et₃N-CH₂Cl₂-MeOH 2∶95∶5)纯化残余物，获得预期产物7(3.2G)。MS m/z 609.1(M⁺+1)。

将含有6-碘喹啉7(607mg，1.0mmol)的DMSO(6mL)溶液加入25ml圆底锥形瓶中，该瓶已装有双(pinacolato)二硼(279mg，1.1mmol)、KOAc(294，3.0mmol)和PdCl₂(dppf)(24.5mg，0.03mmol)。可选地，通过将该锥形瓶与真空和氩气相连，使该混合物彻底脱气。接着在80℃条件下加热该混合物过夜，用EtOAc(40mL)稀释并借助Celite(硅藻土)进行过滤。将所获产物8应用在下一步，且无需在浓缩后进行进一步的纯化。MS m/z 609(M⁺+1)。

在氩气条件下，将6-硼酸盐8(15mg，0.025mmol)在二_烷(2.0mL)中形成的溶液加入已装有Pd(dppf)Cl₂(2mg)、Cs₂CO₃(17mg，0.055mmol)和3，4-乙烯基二氧碘代苯(15mg，0.057mmol)的锥形瓶中。可选地，通过将该锥形瓶与真空和氩气相连，使该混合物完全脱气。将所获溶液加热至70℃，并搅拌过夜。冷却至室温后用EtOAc进行稀释。通过利用Celite过滤，以除去固体物质，并用若干EtOAc进行洗涤。浓缩有机相以除去溶剂。通过制备型LC纯化浓缩后所获的残余物，获得产物9(NGD-6862)。MS m/z 617(M⁺+1)。

根据下述试验的需要，将不同浓度的NGD-6037、6367、6371、6380、6390、6423、6432和NGD-6862混合，简单地制备上述NGD化合物的质量编码混合物。本领域技术人员也可利用本领域已知的以混合物为基础的合成或可选方法直接制备相同混合物。

实施例8：通过进样环从SEC转移至MS的样品

将人血清白蛋白与多种配体组合，并使所获混合物在缓冲溶剂中温育特定时间，该时间足以使受体-配体复合物达到平衡。一旦该混合物达到平衡，将该混合物注入到大小排阻柱上。当受体-配体复合物从该大小排阻柱中洗脱时，通过UV检测器对其进行检测。根据检测结果，由计算机管理的控制器起动定时器，该定时器被校准为特定时间，该时间足以使与2-位-6-通道选择阀门相连的进样环充满代表性的受体-配体混合物样品。一旦该进样环充满受体配体复合物，控制器将选择阀门中的进样环位置转换，以将受体-配体复合物上样至反相液相层析(RP-LC)装置上。通过RP-LC的运行，破坏了所述受体-配体复合物，使受体与配体解离了。从RP-LC洗脱后，将解离配体转移至质谱仪，对其进行鉴定。

本文引用的所有参考文献，无论是印刷、电子、计算机可读记录或其它形式，均被完整引入作为参考，包括但不限于摘要、论文、期刊、出版物、教科书、论文集、互联网站、数据库、专利和专利出版物。

本文已描述了本发明的大量实施方案。不过，仍应理解的是，可在不悖离本发明精神和范畴的前提下对其进行多处改动。相应地，其它实施方案属于下述权利要求的范畴。

Claims (65)

1.分析在含有受体E、配体S_i和受体-配体结合对ES_i的多种混合物中受体与配体的结合亲和力的方法，该方法包括：

(a)提供多种混合物，每种混合物均含有受体[E]₀、配体[S_i]₀和滴定剂T，其中E、S_i、T这三种物质中的一种或多种的浓度是选定的，以便测定T取代S的相对能力；

(b)使多种混合物中的每一种达到平衡；

(c)使多种混合物中的每一种中的受体-配体结合对ES_i与未结合的配体S_i分离；

(d)确定从分析装置获得的多种混合物中的每一种中的受体-配体结合对ES_i的信号响应；并

(e)评价从步骤(d)获得的受体-配体结合对ESi的信号响应，以确定配体S_i与受体E的结合亲和力。

2.权利要求1的方法，其中的每种混合物是选定的，使得T相对于[E]₀和[S_i]₀的浓度是选定的，以便比较S_i取代T的相对能力。

3.权利要求1的方法，包括提供多种混合物，每种混合物含有初始浓度的受体[E]₀、初始浓度的配体[S_i]₀和已知浓度的滴定剂，其中[E]₀和[S_i]₀在多种混合物中的每一种中始终恒定，[S_i]₀在多种混合物中的每一种中大致相同，滴定剂浓度在多种混合物中是变动的。

4.权利要求1的方法，其中的多种混合物中的每一种含有多种配体S_i、多种受体-配体结合对ES_i，其中的信号响应是针对至少两个受体-配体结合对ES_i测定的，并且测定了受体-配体结合对ES_i的相对结合。

5.权利要求4的方法，其中在所述多种配体Si中至少有大约90％具有独特的分子量。

6.权利要求1的方法，其中的每种混合物是选定的，使得T相对于[E]₀和[S_i]₀的浓度是选定的，从而使第一种配体S₁的结合亲和力可与第二种配体S₂的结合亲和力进行比较，以获得S₁对E与S₂对E的相对结合亲和力的测量值。

7.权利要求1的方法，其中的结合亲和力是相对结合平衡常数K_dis。

8.权利要求1的方法，步骤(e)包括计算ACE₅₀，即当受体-配体对的信号响应值是其在滴定剂浓度为0时信号响应值的50％时的滴定剂浓度。

9.权利要求8的方法，其中多种配体的相对K_ds是测定的，使得具有最低ACE₅₀值的配体具有配体混合物的最高K_d，而具有最高ACE₅₀值的配体则具有配体混合物的最低K_d。

10.权利要求1的方法，步骤(e)包括通过将多种混合物中的每一种中受体-配体结合对的浓度[ESi]变化作为滴定剂浓度的函数代入公式(I)所示等式或公式(I)的推导等式中，以计算多种混合物中受体-配体结合对ES_i的Kd_i

$K_{\mathrm{di}}=\frac{({\left[E\right]}_0-\underset{i}{\mathrm{\Σ}}[{\mathrm{ES}}_i\left]\right)({\left[S_i\right]}_0-[{\mathrm{ES}}_i\left]\right)}{\left[{\mathrm{ES}}_i\right]}$

                    公式(I)。

11.权利要求10的方法，其中测定多种配体S_i的相对K_dis。

12.权利要求1的方法，其中受体的初始浓度[E]₀是已知的，并且配体的初始浓度[S_i]₀是已知的。

13.权利要求1的方法，其中的受体浓度[E]₀远大于配体浓度[Si]₀的总和。

14.权利要求1的方法，进一步确定配体S_i是否以竞争方式、变构方式或非竞争方式与受体E结合。

15.权利要求14的方法，其中如果多种混合物中的每一种中的受体配体对ES_i保持相对恒定的信号响应，则配体S_i以非竞争方式与受体E结合。

16.权利要求14的方法，包括测定多种混合物中的每一种中受体配体对ES_i的信号响应与受体-滴定剂对的响应之比率相对于滴定剂浓度的变分，其中如果多种混合物中的每一种的该比率与滴定剂浓度为线性关系，则配体S_i以竞争方式与受体结合，而如果多种混合物中的每一种的该比率与滴定剂浓度为非线性关系，则配体S_i以变构方式与受体结合。

17.权利要求1的方法，其中的受体为生物分子。

18.权利要求1的方法，其中的受体为多肽。

19.权利要求1的方法，其中的受体为酶。

20.权利要求1的方法，其中的受体为核酸。

21.权利要求1的方法，其中的配体为有机分子。

22.权利要求1的方法，其中的配体为多肽。

23.权利要求1的方法，其中的多种混合物达到了受体-配体结合对ES_i、未结合受体和未结合配体的平衡。

24.权利要求1的方法，进一步包括利用液相层析。

25.权利要求1的方法，其中的受体结合配体是通过大小排阻层析与多种混合物中的每一种分离的。

26.权利要求1的方法，其中的受体结合配体是通过超滤与多种混合物中的每一种分离的。

27.权利要求1的方法，其中的信号响应是利用质谱分析法确定的。

28.权利要求1的方法，进一步包括破坏所述受体-配体结合对ES_i。

29.权利要求1的方法，其中受体-配体结合对ES_i的信号响应是通过测定在多种混合物中的每一种中的受体-配体结合对ES_i中配体S_i的相对量而得以确定的。

30.权利要求1的方法，其中配体S_i的相对量是通过评价由质谱仪获得的信号响应而得以确定的。

31.测定受体-配体结合对的平衡解离常数K_d的方法，该方法包括：

(a)提供根据所述受体-配体结合对中的配体校准的质谱仪；

(b)提供多种混合物，每种混合物包括受体[E]₀和配体[S]₀，其中E₀和S₀中的一种或多种的浓度是选定的，以便测定S与E的结合亲和力；

(c)使多种混合物中的每一种达到已结合受体-配体结合对ES、未结合受体和未结合配体的平衡；

(d)使受体结合配体与多种混合物中的每一种分离；

(e)确定由质谱仪获得的多种混合物中的每一种中的受体-配体结合对的信号响应；并

(f)利用在步骤a-e中已知、测定或获得的信息，将多种混合物中的每一种的受体-配体对浓度[ES]、初始已知配体浓度[S]₀代入公式(I)所示等式中

$K_d=\frac{({\left[E\right]}_0-[\mathrm{ES}\left]\right)({\left[S\right]}_0-[\mathrm{ES}\left]\right)}{\left[\mathrm{ES}\right]}$

                       公式(I)

获得所述受体-配体结合对的K_d。

32.权利要求31的方法，其中的多种混合物中的每一种包括初始浓度的受体[E]₀和初始已知浓度的配体[S]₀，其中[E]₀在多种混合物中的每一种中大致相同，[S]₀在多种混合物中的每一种中是变动的。

33.权利要求31的方法，进一步包括测定步骤(b)所述混合物中的初始受体浓度[E]₀。

34.权利要求31的方法，其中的受体为生物分子。

35.权利要求31的方法，其中的受体为多肽。

36.权利要求31的方法，其中的受体为酶。

37.权利要求31的方法，其中的受体为核酸。

38.权利要求31的方法，其中的配体为有机分子。

39.权利要求31的方法，其中的配体为多肽。

40.权利要求31的方法，其中的多种混合物达到了已结合受体-配体结合对、未结合受体和未结合配体的平衡。

41.权利要求31的方法，其中的受体结合配体是通过大小排阻层析与所述混合物分离的。

42.权利要求31的方法，进一步包括利用液相层析。

43.权利要求31的方法，进一步包括破坏所述受体-配体结合对ES。

44.权利要求31的方法，其中所述受体-配体结合对浓度[ES]是通过在步骤(e)中测定在多种混合物中的每一种中的受体-配体结合对ES中配体的量而得以确定的。

45.分析受体-配体结合对的结合动力学的方法，该方法包括：

(a)提供一种包括受体[E]₀和配体[S_i]₀的混合物；

(b)使该混合物达到受体[E]、配体[S_i]和受体-配体结合对[ES_i]的平衡；

(c)用过量的竞争性抑制剂I处理该混合物；

(d)通过下述步骤，在多个时间点上测定受体-配体结合对的减少；

(i)使受体-配体结合对与未结合配体分离；并

(ii)利用分析装置测定在上述多个时间点上，受体-配体结合对的信号响应；并

(e)利用从步骤(a)-(d)已知、测定或获得的信息，评估所述受体-配体结合对的结合动力学。

46.权利要求45的方法，其中所述受体-配体结合对的信号响应是利用分析装置测定的。

47.权利要求45的方法，其中步骤(a)所述混合物包括多种配体S_i。

48.权利要求45的方法，其中所述多种配体S_i中的至少90％具有独特分子量。

49.权利要求45的方法，其中所述结合动力学是通过下述方法评估的，即利用从步骤(a)-(d)已知、测定或获得的信息，通过将所述受体-配体结合对的信号响应随时间的变化代入公式(XVIII)所示等式或其推导式，以计算所述受体-配体结合对的解离速度K_s2

                   [ES]＝[ES]_t＝0e^-ks2·t

                    公式(XVIII)。

50.权利要求45的方法，包括鉴定以非竞争方式结合的配体，其中如果所述配体-受体结合对的浓度在上述各时间点保持相对恒定，则该配体以非竞争方式与受体结合。

51.权利要求45的方法，其中比较了所述多种配体S_i中至少两种配体的结合动力学。

52.权利要求45的方法，其中的受体为生物分子。

53.权利要求45的方法，其中的受体为多肽。

54.权利要求45的方法，其中的受体为酶。

55.权利要求45的方法，其中的受体为核酸。

56.权利要求45的方法，其中的配体为有机分子。

57.权利要求45的方法，其中的配体为多肽。

58.权利要求45的方法，其中的竞争性抑制剂为有机分子。

59.权利要求45的方法，其中的竞争性抑制剂为多肽。

60.权利要求45的方法，进一步包括对所述受体结合配体进行液相层析。

61.权利要求45的方法，其中所述受体结合配体是通过大小排阻层析与未结合配体分离的。

62.权利要求45的方法，其中的信号响应是通过质谱分析法测定的。

63.权利要求45的方法，进一步包括破坏所述受体-配体结合对。

64.权利要求45的方法，其中所述受体-配体结合对的信号响应是通过测定配体在所述受体-配体结合对中的相对量而得以确定的。

65.权利要求45的方法，进一步包括测定所述受体-配体结合对的半衰期t_1/2。

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