CN102344905B

CN102344905B - 软骨细胞仿生培养模型及其制备方法

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Publication number: CN102344905B
Application number: CN201010245254.1A
Authority: CN
Inventors: 葛子钢
Original assignee: Peking University
Current assignee: Peking University
Priority date: 2010-08-04
Filing date: 2010-08-04
Publication date: 2014-04-23
Anticipated expiration: 2030-08-04
Also published as: CN102344905A

Abstract

本发明涉及一种软骨细胞仿生培养模型，其通过下述方法制备而成：1)制取中心带有钻孔的表层软骨骨块模型，用PBS清洗，用γ射线消毒；2)将1.1％-1.3％海藻酸钠加至细胞培养板，然后将步骤1得到的骨块模型放入细胞培养板各孔；3)向孔中和骨块模型周围加入0.1-0.15MCaCl₂溶液，使其凝固；4)吸出步骤3加入的CaCl₂溶液，用细胞培养液润洗。本发明的软骨细胞仿生培养模型能模拟体内微环境培养细胞，并且可以用来解决移植修复软骨缺损面临的瓶颈问题：缺乏体外研究细胞模型。

Description

软骨细胞仿生培养模型及其制备方法

技术领域

本发明涉及软骨细胞仿生培养领域，特别是，涉及一种软骨细胞仿生培养模型。

背景技术

对于关节软骨损伤，目前临床手术干预主要包括骨髓刺激方法(钻孔和微骨折)，自体软骨细胞移植，自体骨软骨移植，骨膜或软骨膜移植，以及多种形式生物材料的辅助应用。尽管上述方法都取得了一定程度的成功，但无论单独使用还是组合使用都不足以完全恢复具有多层解剖结构的骨软骨解剖功能，主要表现为新生软骨的力学性能不足，生化组成不良，与周围组织结合不良，直接导致了中远期临床治疗效果下降(see Hunziker EB.Osteoarthritis Cartilage2002；10(6)：432-63；Wang DA，et al.Nat Mater 2007；6(5)：385-92)。

目前软骨损伤的基础研究主要包括体外实验和动物实验两部分。体外研究方法包括平面培养，小球培养(pellet culture)和三维支架材料培养。其中平面培养能够大量增殖软骨细胞(可达1,000倍)，但同时软骨细胞会发生严重的退分化现象(dedifferentiation)(seeGoldring MB.Methods Mol Med 2004；100：37-52)。虽然退分化的软骨细胞有可能在软骨环境中再次分化成软骨细胞，但这还取决于退分化程度和体内局部微环境等诸多因素，增加了实验结果的不稳定性(seeHwang NS，et al.Tissue Eng 2006；12(9)：2695-706)。

小球培养(pellet culture)模仿了软骨形成早期的高细胞密度，低氧以及细胞与细胞之间紧密联结的环境(see Toh WS，et al.StemCells 2007；25(4)：950-60)，是最为广泛使用的体外模型。除了欠缺标准化操作外，两个主要缺陷限制了上述两种模型的广泛使用：

1)不能评价新生软骨与宿主软骨的结合；

2)不能评价周围软骨组织对新植入的软骨细胞和再生的软骨的调控作用。

三维支架材料辅助软骨再生取得了很大进步，但支架的结构和材料的物理化学性能多样性阻碍了它作为标准模型的使用(see Cao T，etal.Cloning Stem Cells 2008；10(1)：1-10)。

发明内容

本发明的目的是提供一个新的体外软骨细胞培养模型，不仅模仿微环境所面临的体内软骨再生环境，还可以评价软骨和骨的形成，以解决现有技术存在的缺陷。

本发明提供一种软骨细胞仿生培养模型，其通过下述方法制备而成：

1)制取中心带有钻孔的表层软骨骨块模型，用PBS清洗，用γ射线消毒；

2)将1.1-1.3％(g/dl，下同)海藻酸钠加至细胞培养板，然后将步骤1得到的骨块模型放入细胞培养板各孔；

3)向孔中和骨块模型周围加入0.1-0.15MCaCl₂溶液，使其凝固；

4)吸出步骤3加入的CaCl₂溶液，用细胞培养液润洗。

其中，所述步骤1中，表层软骨取自于比较大型的动物，如牛、猪马或羊等。

所述步骤2中，将1.2％海藻酸钠加至细胞培养板。

所述步骤3中，向孔中和骨块模型周围加入0.1MCaCl₂溶液。

所述步骤3中，凝固后，在4℃冰箱放置2h。

步骤4中，所述的细胞培养液通过下述步骤制成：向灭菌后的培养瓶中加入180mL DMEM原液，20mL融化的FBS，再加入1000X的PS 200μL，整个过程保持无菌环境。

所述PS是双抗，其组成为Penicillin和Streptomycin

本发明还提供制备上述软骨细胞仿生培养模型的方法，包括下述步骤：

2)将1.1％-1.3％海藻酸钠加至细胞培养板，然后将步骤1得到的骨块模型放入细胞培养板各孔；

3)向孔中和骨块模型周围加入0.1-0.15MCaCl₂溶液，使其凝固；

4)吸出步骤3加入的CaCl₂溶液，用细胞培养液润洗。

其中，步骤1中，钻透骨块的目的在于：利用海藻酸钠溶液与氯化钙的凝固作用使骨块固定，海藻酸钠凝胶为透明状，封底可以利用显微镜观察细胞在模型中的生长状况。

步骤2中，加海藻酸钠溶液至细胞培养板中，海藻酸钠溶液不没过模型，主要是为了固定骨块模型。

步骤3中，CaCl₂溶液钙离子会使海藻酸钠溶液凝固，从而固定骨块模型，而残余的CaCl₂溶液在下一步骤中吸出。

本发明还提供上述的仿生培养模型在培养软骨细胞中的应用。

所述应用包括下述步骤：

1)向培养模型中各孔加入P I代原代软骨细胞；

2)在37℃，5％CO₂培养箱中培养1h使细胞贴壁；

3)待细胞贴壁后，向细胞培养板的各孔中加入上述的细胞培养液，使其没过培养模型上层软骨，培养。

在制备本发明的仿生培养模型中，还需要注意如下几点：

1)切割胫骨平台时不易太薄，否则电锯产生热量会烧焦表面；

2)制作模型时按照标准化模式，模型大小基本保持一致；

3)制作好的模型在-20℃条件下保存，以免软骨降解；

4)培养细胞时细胞培养液要没过模型表面。

本发明方法具有以下有益效果：

1)由于它的标准化，可以避免批次的变化；

2)能模拟体内微环境培养细胞；

3)可以用来解决移植修复软骨缺损面临的瓶颈问题：缺乏体外研究细胞模型。

附图说明

图1为模具实验；

图2为实验步骤示意图；

图3为对照组与实施例1模型组的细胞增殖曲线图；

图4为对照组与实施例1模型组的细胞增殖柱状图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

1、试剂及器材

1)试剂：Alginate、CaCl₂、NaCl、KCl、Na₂HPO₄、KH₂PO₄、无水乙醇、DMEM、FBS、Penicillin、Streptomycin、II型胶原酶、Trypsin、EDTA。

2)器材：带锯、打孔机、电钻、游标卡尺、超净工作台、通风橱、电子天平、加样器、24孔细胞培养板、高速冷冻离心机、倒置显微镜。

2、溶液配制

1)1.2％海藻酸钠溶液

称取1.2g海藻酸钠溶于100mL去离子水中，高温高压灭菌后备用。

2)0.15MCaCl₂溶液

称取1.665g无水氯化钙，用100mL去离子水溶解。高温高压蒸汽灭菌后常温保存。

3)PBS

NaCl 4.0g，KCl 0.1g，Na₂HPO₄0.575g，KH₂PO₄0.1g，加去离子水400mL完全溶解，用1M HCl调节pH至7.20，配成0.01M PBS缓冲溶液。静置4℃冰箱保存。

4)细胞培养液

用加样器向灭菌后的培养瓶中加入180mL DMEM原液，20mL融化的FBS，再加入1000X的PS 200μL。整个过程均在灭菌后的超净工作台里操作，并保持无菌环境。

5)软骨消化液

软骨消化液含0.1％II型胶原酶的DMEM原液。具体方法：向15mL离心管中加入15mL DMEM原液，再加入0.015g II型胶原酶。37℃条件下使酶充分溶解。

6)传代消化液

称Trypsin 0.25g，EDTA 0.02g，溶解至100mL PBS缓冲液中，用无菌注射器吸取并通过过滤器过滤至无菌的100mL瓶中，静置4℃冰箱保存。

3、模具制作

制作图1模具，可以切割出7mm×7mm×Φmm(Φ＜2cm)的立方体模块。

4、仿生模型制作(见图2)

a)取牛的胫骨平台，用电锯将软骨层连同软骨下骨切割1-2cm；

b)用电钻在切取的骨上钻孔(直径3.5mm)，钻透；

c)以钻孔为中心，用模具切割出立方体块状结构；

d)用游标卡尺从表层软骨量取骨块5mm，其余部分用切去；

e)制作好的模型用PBS清洗，放入10cm细胞培养皿中；

f)用γ射线消毒(剂量1-2K)，-20℃冰箱保存。

5、仿生培养模型建立

a)将骨块模型从-20℃冰箱取出，解冻；

b)用PBS清洗骨块模型，每个洗三次；

c)用加样器吸取1.2％海藻酸钠300mL加至24孔细胞培养板；

d)用镊子夹着骨块模型放入细胞培养板各孔，调整位置和海藻酸钠凝胶良好接触；

e)向孔中和骨块模型周围加入0.1MCaCl₂溶液300mL，使其凝固。4℃冰箱放置2h；

f)吸出CaCl₂溶液，用细胞培养液反复润洗三次，备用。

6、细胞培养

a)人原代软骨细胞取自于医院关节病人病变软骨；

b)软骨样品处理：在超净台中用PBS将样品清洗2-3次，直至清洗液清澈为止。用灭菌的手术刀和镊子剥离并尽可能切碎软骨组织。切碎的软骨组织置于15mL离心管中，按每克组织5ml 0.1％II型胶原酶溶液的比例加入软骨消化液，37℃水浴消化20h；

c)收集培养：用200目铜网过滤消化液至培养皿中，再转移至15mL离心管中。在高速冷冻离心机中以1800rpm转速离心6mins，收集沉淀，重悬于培养基中，用血球计数板计数，记录。然后以4K/cm²的密度种于10cm培养皿中(其中，细胞培养液的制备同上：向灭菌后的培养瓶中加入180mL DMEM原液，20mL融化的FBS，再加入1000X的PS 200μL，整个过程保持无菌环境；如非特别说明，下述均同)；

d)P0代细胞培养：在细胞贴壁后第2天用PBS冲去培养皿及孔板底部的碎屑，以利于细胞生长，并且更换细胞培养液。第5天在显微镜下对培养皿细胞进行照相，并更换细胞培养液。第8天换液并继续培养。第十天对P0代细胞观察并记录；

e)传代至P1代细胞：在第11天时向P0代细胞培养皿中加入3ml传代消化液，置于培养箱消化3minutes。在显微镜下观察软骨细胞大部分悬浮，向培养皿中加入2倍体积传代消化液的的细胞培养液(6ml)，一齐转移至15mL离心管中。在高速冷冻离心机中以1500rpm转速离心3.5minutes，收集沉淀，重悬于细胞培养液中，用血球计数板计数。在细胞贴壁后第2天用PBS冲去培养皿及孔板底部的碎屑，以利于细胞生长，并且更换细胞培养液。第5天在显微镜下对培养皿细胞进行照相，并换液；

f)消化软骨细胞原代P1代细胞，用细胞计数板计数，向培养模型中各孔加入300个细胞；

g)在37℃，5％CO₂培养箱中培养1h使细胞贴壁；

h)待细胞贴壁后，24孔板中加入500mL细胞培养液，使其没过培养模型上层软骨，培养。

实验例

软骨细胞在仿生培养模型组中培养设为模型组(实施例1，)；在普通细胞培养皿中培养设为对照1组(培养皿未铺海藻酸钠凝胶)；在铺有海藻酸钠凝胶的细胞培养皿设为对照2组，三组中细胞培养液成分等均相同，区别就是在于模型组中使利用了骨块模型培养细胞。

对照1组和对照2组中。分别在3、6、9、12、15天五个时间点利用Hoechst33258能够和细胞DNA结合的并发出荧光的特点，检测荧光OD值，来获得相对细胞数。实验结果表明在任意阶段，利用模型组培养的细胞数目都大于对照1组和对照2组的细胞数。

利用统计学对同一时间点的模型组、对照1组和对照2组分析，结果表明，在任意时间点，在模型组(实施例1)培养的相对细胞数分别大于对照1组和对照2组，并存在显著性差异。(图3、4)

利用模型培养效果由于传统培养方法，可能的原因在于骨块能够为细胞提供仿生的三维生长环境，细胞直接与骨块结合可能产生一定的作用；此外可能由于骨块中有细胞体内生长需要的生长因子，促使细胞生长较为良好。

Claims

1.一种软骨细胞仿生培养模型，其特征在于，通过下述方法制备而成：

1）制取中心带有钻孔的表层软骨骨块模型，用PBS清洗，用γ射线消毒；

2）将1.2%海藻酸钠300mL加至细胞培养板各孔，然后将步骤1）得到的骨块模型放入细胞培养板各孔；

3）向孔中和骨块模型周围加入0.1-0.15M CaCl₂溶液，使海藻酸钠溶液凝固；

4）吸出步骤3）加入的CaCl₂溶液，用细胞培养液润洗；

所述带有钻孔的表层软骨骨块模型的大小为5mm×5mm，其中钻孔的直径为3.5mm；

所述PBS为：NaCl4.0g，KCl0.1g，Na₂HPO₄0.575g，KH₂PO₄0.1g，加去离子水400mL完全溶解，用1M HCl调节pH至7.20，配成0.01MPBS缓冲溶液。

2.根据权利要求1所述的仿生培养模型，其特征在于，所述步骤1）中，表层软骨取自于牛、猪马或羊。

3.根据权利要求1所述的仿生培养模型，其特征在于，所述步骤3）中，向孔中和骨块模型周围加入0.1M CaCl₂溶液。

4.根据权利要求1所述的仿生培养模型，其特征在于，所述步骤3）中，凝固后，在4℃冰箱放置2h。

5.根据权利要求1所述的仿生培养模型，其特征在于，步骤4）中，所述的细胞培养液通过下述步骤制成：向灭菌后的培养瓶中加入180mL DMEM原液，20mL融化的FBS，再加入1000X的PS200μL，整个过程保持无菌环境。

6.制备权利要求1-5任一项所述软骨细胞仿生培养模型的方法，包括下述步骤：

2）将1.2%海藻酸钠300mL加至细胞培养板，然后将步骤1）得到的骨块模型放入细胞培养板各孔；

3）向孔中和骨块模型周围加入0.1-0.15M CaCl₂溶液，使其凝固；

4）吸出步骤3）加入的CaCl₂溶液，用细胞培养液润洗；

7.权利要求1-5任一项所述的仿生培养模型在培养软骨细胞中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，包括下述步骤：

1）向培养模型中各孔加入原代PⅠ代软骨细胞；

2）在37℃，5%CO₂培养箱中培养1h使细胞贴壁;

3）待细胞贴壁后，向细胞培养板的各孔中加入权利要求5所述的细胞培养液，使其没过培养模型上层软骨，培养。