JP6159930B2 - 筋幹細胞又は筋芽細胞、及びそれを用いた代謝変換に関与する物質のスクリーニング方法、並びにスクリーニング方法によって得られた物質を含む医薬組成物 - Google Patents
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Description
サルコペニアは骨格筋でおこるものである。骨格筋は、主として遅筋線維、及び速筋線維の2つの線維から構成され、これらの線維が各々の筋ごとに一定の割合でモザイク状に配列している。遅筋線維は有酸素的なエネルギー発揮能力に優れ、収縮速度は遅いが疲労耐性が高いという特性を持つことから、持久的な運動に適していると考えられている。一方、速筋線維は無酸素的なエネルギー発揮能力に優れ、発揮する張力も高いことから、瞬発的な運動に適した能力を持つと考えられている。
本発明は、こうした知見に基づくものである。
従って、本発明は、
[1]ミオシン重鎖I遺伝子及び蛍光又は発光タンパク質遺伝子が結合したミオシン重鎖I融合遺伝子、ミオシン重鎖IIa遺伝子及び蛍光又は発光タンパク質遺伝子が結合したミオシン重鎖IIa融合遺伝子、ミオシン重鎖IId/x遺伝子及び蛍光又は発光タンパク質遺伝子が結合したミオシン重鎖IId/x融合遺伝子、及びミオシン重鎖IIb遺伝子及び蛍光又は発光タンパク質遺伝子が結合したミオシン重鎖IIb融合遺伝子からなる群から選択される1つ以上のミオシン重鎖融合遺伝子を含む筋幹細胞又は筋芽細胞、
[2]前記細胞が不死化細胞である、[1]に記載の筋幹細胞又は筋芽細胞、
[3]ミオシン重鎖I遺伝子に結合した蛍光又は発光タンパク質遺伝子、ミオシン重鎖IIa遺伝子に結合した蛍光又は発光タンパク質遺伝子、ミオシン重鎖IId/x遺伝子に結合した蛍光又は発光タンパク質遺伝子、及びミオシン重鎖IIb遺伝子に結合した蛍光又は発光タンパク質遺伝子が、それぞれ異なる蛍光又は発光タンパク質遺伝子である、[1]又は[2]に記載の筋幹細胞又は筋芽細胞、
[4]前記蛍光又は発光タンパク質が、Sirius、EBFP、SBP2、EBP2、Azurite、mKalama1、TagBFP、mBlueberry、mTurquoise、ECFP、Cerulean、mCerulean、TagCFP、AmCyan、mTP1、MiCy(Midoriishi Cyan)、TurboGFP、CFP、AcGFP、TagGFP、AG(Azami−Green)、mAG1、ZsGreen、EmGFP(Emerald)、EGFP、GP2、T−Sapphire、HyPer、TagYFP、mAmetrine、EYFP、YFP、Venus、Citrine、PhiYFP、PhiYFP−m、turboYFP、ZsYellow、mBanana、mKO1、KO(Kusabira Orange)、mOrange、mOrange2、mKO2、Keima570、TurboRFP、DsRed−Express、DsRed、DsRed2、TagRFP、TagRFP−T、DsRed−Monomer、mApple、AsRed2、mStrawberry、TurboFP602、mRP1、JRed、KillerRed、mCherry、KeimaRed、HcRed、mRasberry、mKate2、TagFP635、mPlum、egFP650、Neptune、mNeptune、egFP670及びルシフェラーゼからなる群から選択される少なくとも1つの蛍光又は発光タンパク質である、[1]〜[3]のいずれかに記載の筋幹細胞又は筋芽細胞、
[5][1]〜[4]のいずれかに記載の筋幹細胞若しくは筋芽細胞又はそれらの細胞から分化誘導された筋管細胞と、試験物質とを接触させる工程;及び前記細胞におけるミオシン重鎖I遺伝子、ミオシン重鎖IIa遺伝子、ミオシン重鎖IId/x遺伝子、及びミオシン重鎖IIb遺伝子からなる群から選択される1つ以上のミオシン重鎖遺伝子の発現を分析する工程、を含む、代謝変換に関与する物質のスクリーニング方法、
[6]前記ミオシン重鎖遺伝子の発現の分析が、蛍光又は発光タンパク質を発現している細胞の量又は細胞増殖の分析である、[5]に記載の代謝変換に関与する物質のスクリーニング方法、
[7]前記代謝変換に関与する物質が、遅筋の減少を伴う疾患の治療又は予防剤、遅筋の増加を伴う疾患の治療又は予防剤、速筋の減少する疾患の治療又は予防剤、速筋の増加を伴う疾患の治療又は予防剤、抗癌剤、免疫抑制剤、及び生活習慣病の治療又は予防剤からなる群から選択される薬剤である、[5]又は[6]に記載のスクリーニング方法、
[8]ラパマイシン又はその誘導体を有効成分として含む、骨格筋の筋力低下、筋萎縮又は筋損傷を伴う疾患の治療又は予防用医薬組成物、
[9]前記骨格筋の筋力低下、筋萎縮又は筋損傷を伴う疾患が、廃用性筋萎縮、運動神経損傷、カヘキシー、慢性閉塞性肺疾患、クローン病、サルコペニア肥満症、筋萎縮を伴う動脈硬化症、脳血管障害に伴う筋萎縮、又はI型若しくはII型糖尿病性筋萎縮症である、[8]に記載の医薬組成物、
[10]前記骨格筋の筋力低下、筋萎縮又は筋損傷を伴う疾患が、筋損傷、外傷、筋ジストロフィー、遠位性型ミオパチー、先天性ミオパチー、糖原病、ミトコンドリアミオパチー、ステロイドミオパチー、炎症性ミオパチー、内分泌性ミオパチー、脂質蓄積障害性ミオパチー、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、廃用性筋萎縮、慢性心不全症、サルコペニア(加齢性筋肉減少症)、自己免疫性重症筋無力症、多発性筋炎、皮膚筋炎、封入体筋炎、ギラン・バレー症候群、先天性筋無力症候群、又は外科治療後の筋組織再建であり、前記医薬組成物がそれらの疾患に対する間葉系幹細胞、筋幹細胞、又は筋芽細胞の移植治療において投与される、[8]に記載の医薬組成物、
[11]ラパマイシン又はその誘導体を有効成分として含む、筋管細胞への分化能を有する細胞から筋管細胞への分化誘導剤、
[12]前記筋管細胞への分化能を有する細胞が、間葉系幹細胞、筋幹細胞、又は筋芽細胞である、[11]に記載の筋管細胞分化誘導剤、
[13](1)配列番号1又は配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである線維芽細胞増殖因子21、又は(2)配列番号1又は配列番号2で表されるアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、しかも筋管細胞への分化能を有する細胞から筋管細胞への分化誘導能を示すポリペプチド、を有効成分として含む、骨格筋の筋力低下、筋萎縮又は筋損傷を伴う疾患の治療又は予防用医薬組成物、
[14]前記骨格筋の筋力低下、筋萎縮又は筋損傷を伴う疾患が、廃用性筋萎縮、運動神経損傷、カヘキシー、慢性閉塞性肺疾患、クローン病、サルコペニア肥満症、筋萎縮を伴う動脈硬化症、脳血管障害に伴う筋萎縮、又はI型若しくはII型糖尿病性筋萎縮症である、[13]に記載の医薬組成物、
[15]前記骨格筋の筋力低下、筋萎縮又は筋損傷を伴う疾患が、筋損傷、外傷、筋ジストロフィー、遠位性型ミオパチー、先天性ミオパチー、糖原病、ミトコンドリアミオパチー、ステロイドミオパチー、炎症性ミオパチー、内分泌性ミオパチー、脂質蓄積障害性ミオパチー、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、廃用性筋萎縮、慢性心不全症、サルコペニア(加齢性筋肉減少症)、自己免疫性重症筋無力症、多発性筋炎、皮膚筋炎、封入体筋炎、ギラン・バレー症候群、先天性筋無力症候群、又は外科治療後の筋組織再建であり、前記医薬組成物がそれらの疾患に対する間葉系幹細胞、筋幹細胞、又は筋芽細胞の移植治療において投与される、[13]に記載の医薬組成物、
[16](1)配列番号1又は配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである線維芽細胞増殖因子21、又は(2)配列番号1又は配列番号2で表されるアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、しかも筋管細胞への分化能を有する細胞から筋管細胞への分化誘導能を示すポリペプチド、を有効成分として含む、筋管細胞への分化能を有する細胞から筋管細胞への分化誘導剤、
[17]前記筋管細胞への分化能を有する細胞が、間葉系幹細胞、筋幹細胞、又は筋芽細胞である、[16]に記載の筋幹細胞分化誘導剤、
[18]β3受容体アゴニスト又はその誘導体を有効成分として含む、骨格筋の筋力低下、筋萎縮又は筋損傷を伴う疾患の治療又は予防用医薬組成物、
[19]前記骨格筋の筋力低下、筋萎縮又は筋損傷を伴う疾患が、廃用性筋萎縮、運動神経損傷、カヘキシー、慢性閉塞性肺疾患、クローン病、サルコペニア肥満症、筋萎縮を伴う動脈硬化症、脳血管障害に伴う筋萎縮、又はI型若しくはII型糖尿病性筋萎縮症である、[18]に記載の医薬組成物、
[20]前記骨格筋の筋力低下、筋萎縮又は筋損傷を伴う疾患が、筋損傷、外傷、筋ジストロフィー、遠位性型ミオパチー、先天性ミオパチー、糖原病、ミトコンドリアミオパチー、ステロイドミオパチー、炎症性ミオパチー、内分泌性ミオパチー、脂質蓄積障害性ミオパチー、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、廃用性筋萎縮、慢性心不全症、サルコペニア(加齢性筋肉減少症)、自己免疫性重症筋無力症、多発性筋炎、皮膚筋炎、封入体筋炎、ギラン・バレー症候群、先天性筋無力症候群、又は外科治療後の筋組織再建であり、前記医薬組成物がそれらの疾患に対する間葉系幹細胞、筋幹細胞、又は筋芽細胞の移植治療において投与される、[18]に記載の医薬組成物、
[21]β3受容体アゴニスト又はその誘導体を有効成分として含む、筋管細胞への分化能を有する細胞から筋管細胞への分化誘導剤、及び
[22]前記筋管細胞への分化能を有する細胞が、間葉系幹細胞、筋幹細胞、又は筋芽細胞である、[21]に記載の筋幹細胞分化誘導剤、
に関する。
更に、本明細書は、
[23][1]〜[4]のいずれかに記載の筋幹細胞若しくは筋芽細胞又はそれらの細胞から分化誘導された筋管細胞を含む、代謝変換に関与する物質のスクリーニングキット、
[24]前記代謝変換に関与する物質が、遅筋の減少を伴う疾患の治療又は予防剤、遅筋の増加を伴う疾患の治療又は予防剤、速筋の減少する疾患の治療又は予防剤、速筋の増加を伴う疾患の治療又は予防剤、抗癌剤、免疫抑制剤、及び生活習慣病の治療又は予防剤からなる群から選択される薬剤である、[23]に記載のスクリーニングキット、
[25][1]〜[4]のいずれかに記載の筋幹細胞若しくは筋芽細胞又はそれらの細胞から分化誘導された筋管細胞の、代謝変換に関与する物質のスクリーニングキットの製造への使用、
[26]前記代謝変換に関与する物質が、遅筋の減少を伴う疾患の治療又は予防剤、遅筋の増加を伴う疾患の治療又は予防剤、速筋の減少する疾患の治療又は予防剤、速筋の増加を伴う疾患の治療又は予防剤、抗癌剤、免疫抑制剤、及び生活習慣病の治療又は予防剤からなる群から選択される薬剤である、[25]に記載の代謝変換に関与する物質のスクリーニングキットの製造への使用、
[27][1]〜[4]のいずれかに記載の筋幹細胞若しくは筋芽細胞又はそれらの細胞から分化誘導された筋管細胞の、代謝変換に関与する物質のスクリーニングツールとしての使用、
[28]前記代謝変換に関与する物質が、遅筋の減少を伴う疾患の治療又は予防剤、遅筋の増加を伴う疾患の治療又は予防剤、速筋の減少する疾患の治療又は予防剤、速筋の増加を伴う疾患の治療又は予防剤、抗癌剤、免疫抑制剤、及び生活習慣病の治療又は予防剤からなる群から選択される薬剤である、[27]に記載の代謝変換に関与する物質のスクリーニングツールとしての使用、
を開示する。
また、本発明の医薬組成物は、骨格筋の筋力低下、又は骨格筋の筋萎縮を伴う疾患の治療又は予防することができる。
本発明の筋幹細胞又は筋芽細胞は、ミオシン重鎖I遺伝子及び蛍光又は発光タンパク質遺伝子が結合したミオシン重鎖I融合遺伝子、ミオシン重鎖IIa遺伝子及び蛍光又は発光タンパク質遺伝子が結合したミオシン重鎖IIa融合遺伝子、ミオシン重鎖IId/x遺伝子及び蛍光又は発光タンパク質遺伝子が結合したミオシン重鎖IId/x融合遺伝子、及びミオシン重鎖IIb遺伝子及び蛍光又は発光タンパク質遺伝子が結合したミオシン重鎖IIb融合遺伝子からなる群から選択される1つ以上のミオシン重鎖融合遺伝子を含む。
本発明の筋幹細胞又は筋芽細胞は、限定されるものではないが、前記ミオシン重鎖I融合遺伝子、ミオシン重鎖IIa融合遺伝子、ミオシン重鎖IId/x融合遺伝子、及びミオシン重鎖IIb融合遺伝子からなる群から選択される1つ以上の遺伝子がノックインされたマウスから取得することができる。
前記ノックインマウスは、公知の方法によって作成することができる。具体的には、融合タンパク質のターゲッティングベクターをマウスES細胞に導入し、相同組換えを起こしたESクローンを選択する。そのESクローンを用いてキメラマウスを作成し、正常なマウスとの交配で得られた産仔から遺伝子が生殖系列に組み込まれたノックインマウスを選択することによって、得ることができる。
例えば、ミオシン重鎖遺伝子及び蛍光又は発光タンパク質遺伝子の結合した融合遺伝子を含むターゲティングベクターは、以下のように作成することができる。雄性C57BL/6JマウスのBACクローンから、標的とするミオシン重鎖遺伝子のゲノム配列をサブクローニングする。一方、蛍光又は発光タンパク質遺伝子は、それを含むベクターからPCRで取得することができる。この蛍光又は発光タンパク質遺伝子をミオシン重鎖遺伝子の翻訳開始配列(ATG)とコドンのフレームを合わせて5’側に挿入する。得られたターゲティングベクターを直鎖状にし、そしてエレクトロポレーションでマウスES細胞に導入する。PCRとサザンブロットで相同組換えを起こしたESクローンを同定し、そのESクローンを用いてアグリゲーション法によりキメラマウスを作製する。雌性のC57BL/6との交配で得られた産仔のジェノタイピングを行って生殖系列への移行を確認することによって、ミオシン重鎖遺伝子と、蛍光又は発光タンパク質遺伝子とが結合した融合遺伝子が導入されたノックインマウスを得ることができる。
ノックインマウスには少なくとも1つ以上の融合遺伝子が含まれていればよい。すなわち、ノックインマウスは、ミオシン重鎖I遺伝子及び蛍光又は発光タンパク質遺伝子が結合したミオシン重鎖I融合遺伝子、ミオシン重鎖IIa遺伝子及び蛍光又は発光タンパク質遺伝子が結合したミオシン重鎖IIa融合遺伝子、ミオシン重鎖IId/x遺伝子及び蛍光又は発光タンパク質遺伝子が結合したミオシン重鎖IId/x融合遺伝子、及びミオシン重鎖IIb遺伝子及び蛍光又は発光タンパク質遺伝子が結合したミオシン重鎖IIb融合遺伝子からなる群から選択される1つ以上のミオシン重鎖融合遺伝子を含む。しかしながら、前記4つの融合遺伝子を含むノックインマウスが好ましい。
更に、ノックインマウスは、人工ヌクレアーゼZFN(zinc-finger nuclease)、TALEN(transcription activator-like effector nuclease)あるいはRNA誘導型ヌクレアーゼCRISPR/Casシステム(clustered regulatory interspaced short palindromic repeats, CRISPR-associated)の技術を用いて作成することができる。
本発明の筋幹細胞又は筋芽細胞は、限定されるものではないが、前記ノックインマウス又はトランスジェニックマウスからFACS(fluorescence activated cell sorting)により、サテライト細胞として、取得することが可能である。本発明の筋幹細胞又は筋芽細胞は、限定されるものではないが、ノックインマウス又はトランスジェニックマウスから分離され、継代培養された細胞が好ましい。
前記ノックインマウス又はトランスジェニックマウスの骨格筋から、コラゲナーゼ処理により細胞を取得する。得られた細胞を、内皮細胞のマーカーであるCD31、造血系の細胞マーカーであるCD45、及び線維芽細胞及び脂肪細胞に分化する細胞のマーカーであるSca1によりネガティブ選択をする。そして、サテライト細胞のマーカーであるVCAM又はSM/C−2.6により、ポジティブ選択することによって、筋幹細胞(サテライト細胞)を分離することが可能である。
本発明の筋幹細胞又は筋芽細胞は、本発明のスクリーニング方法に用いることができる。すなわち、前記の方法によってノックインマウス又はトランスジェニックマウスから分離された初代継代培養細胞を用いて、本発明のスクリーニング方法を行うことができる。しかしながら、本発明の筋幹細胞又は筋芽細胞は、限定されるものではないが、不死化細胞であるものが好ましい。不死化細胞であることによって、実験ごとにノックインマウス又はトランスジェニックマウスからの筋幹細胞又は筋芽細胞の分離が不要になる。すなわち、筋幹細胞の長期間の培養が可能になり、本発明のスクリーニング方法迅速に、効率的に用いることができる。
本発明の筋幹細胞又は筋芽細胞は、前記ZFN、TALEN及びCRISPR/Casシステムの技術を用いて、作製することができる。すなわち、筋幹細胞又は筋芽細胞のミオシン重鎖I遺伝子、ミオシン重鎖IIa遺伝子、ミオシン重鎖IId/x遺伝子、又はミオシン重鎖IIb遺伝子に、蛍光タンパク質遺伝子又は発光タンパク質遺伝子を、ZFN、TALEN及びCRISPR/Casシステムの技術によって挿入することができる。これによって、本発明の筋幹細胞又は筋芽細胞を作製することができる。
本発明の筋幹細胞(サテライト細胞)は筋芽細胞へと分化し、更に筋管細胞(筋線維細胞)へと分化する(図2)。
筋幹細胞及び筋芽細胞は増殖可能な細胞であり、筋管細胞(筋線維細胞)は多数の筋芽細胞が融合した多核細胞である
筋幹細胞から筋芽細胞への分化誘導は、限定されるものでないが、以下のように行うことができる。細胞培養液(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)に10%の胎児牛血清を加えて筋幹細胞を継代維持培養して、分化誘導時には胎児血清の代わりに2%馬血清を加えて培養することで分化を誘導する。
更に、筋芽細胞から筋管細胞(筋線維細胞)への分化誘導も限定されるものではないが、以下のように行うことができる。筋芽細胞を、2%馬血清を含む細胞培養液(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)で継続して培養することで筋管細胞(筋線維細胞)へ分化を誘導する。
なお、前記のImmortmouseとの交配によって得られた不死化細胞においては、32℃から37℃への温度シフトにより、温度感受性SV40 large T抗原の分解を行うことによって、筋芽細胞又は筋管細胞(筋線維細胞)へ分化誘導可能である。
本発明の筋幹細胞又は筋芽細胞に含まれる融合遺伝子に含まれる発光タンパク質遺伝子は、特に限定されるものではなく、本分野において通常使用されている発光タンパク質をコードしている遺伝子を用いることができる。具体的な発光タンパク質としては、ルシフェラーゼを挙げることができるが、ルシフェラーゼの由来も限定されるものではなく、ホタルルシフェラーゼ、ウミホタルルシフェラーゼ、バクテリアルシフェラーゼ、渦鞭毛藻類ルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、又はヒカリコメツキルシフェラーゼを挙げることができる。
しかしながら、筋幹細胞又は筋芽細胞が2つ以上の融合遺伝子を含んでいる場合は、それぞれのミオシン重鎖に結合する蛍光タンパク質遺伝子等は、それぞれ異なる蛍光タンパク質遺伝子等であることが好ましい。筋管細胞(筋線維細胞)に発現しているミオシン重鎖遺伝子の種類を、蛍光タンパク質等の色調により判断することができるからである。なお、ミオシン重鎖遺伝子の発現を蛍光タンパク質等の色調により判断することができるのは、一般的に筋芽細胞の後期から筋管細胞(筋線維細胞)に分化誘導された時期である。
本発明の代謝変換に関与する物質のスクリーニング方法は、前記筋幹細胞若しくは筋芽細胞又はそれらの細胞から分化誘導された筋管細胞と、試験物質とを接触させる工程;及び前記筋幹細胞ミオシン重鎖I遺伝子、ミオシン重鎖IIa遺伝子、ミオシン重鎖IId/x遺伝子、及びミオシン重鎖IIb遺伝子からなる群から選択される1つ以上のミオシン重鎖遺伝子の発現を分析する工程、を含む。
生体細胞は細胞増殖、分化、炎症反応、ストレス、栄養状態、固有機能(例えば、骨格筋、脂肪細胞又は免疫)に適合するためにエネルギー産生の効率の変換(例えば、解糖系からミトコンドリア系への変換、又はミトコンドリア系から解糖系への変換)又は生合成の機構の変換(例えば、同化(anabolic)作用から異化(catabolic)作用への変換、又は異化(catabolic)作用から同化(anabolic)作用への変換)を行う。これらの変換を代謝変換と称するが、本発明のスクリーニング方法は、これらの代謝変換に関連する物質をスクリーニングすることができる。
本発明のスクリーニング方法における接触工程は、筋幹細胞若しくは筋芽細胞又はそれらの細胞から分化誘導された筋管細胞と、試験物質とを接触させる工程である。
試験物質は、代謝変換に関連する可能性のある物質、又はそのような物質を含むものである限りにおいて限定されるものではないが、例えば、ケミカルファイルに登録されている種々の公知化合物(ペプチドを含む)、コンビナトリアル・ケミストリー技術(Terrett,N.K.ら,Tetrahedron,51,8135−8137,1995)によって得られた化合物群、あるいは、ファージ・ディスプレイ法(Felici,F.ら,J.Mol.Biol.,222,301−310,1991)などを応用して作成されたランダム・ペプチド群、又は低分子化合物を用いることができる。また、微生物の培養上清、細胞の培養上清、生体内の体液、植物若しくは海洋生物由来の天然成分、又は動物組織抽出物などもスクリーニングの試験物質として用いることができる。
接触工程における細胞と試験物質との接触のタイミング、すなわち、試験物質の添加の時期は、特に限定されるものではなく、筋幹細胞、筋芽細胞、又は筋管細胞のいずれの時期でもよい。特に、細胞増殖に影響を与えない試験物質の場合は、いずれの時期でも代謝変換に関与する物質のスクリーニングが可能である。しかし、細胞増殖に影響を与える試験物質の場合は、筋芽細胞、又は筋管細胞に分化した後が好ましい。
例えば、筋幹細胞に試験物質を添加する場合、限定されるものでないが、培養開始時〜培養開始4日後程度に添加してもよく、好ましくは培養開始1〜3日後である。筋芽細胞、又は筋管細胞に試験物質を添加する場合、限定されるものでないが、筋芽細胞への分化誘導開始時〜分化誘導3日後に添加してもよく、好ましくは分化誘導12時間後〜36時間後である。
接触工程における培地も、筋幹細胞、筋芽細胞、又は筋管細胞が培養される限りにおいて、限定されるものではないが、例えば10%の胎児牛血清、あるいは2%馬血清を含む細胞培養液(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)を挙げることができる。
本発明における分析工程は、ミオシン重鎖I遺伝子、ミオシン重鎖IIa遺伝子、ミオシン重鎖IId/x遺伝子、及びミオシン重鎖IIb遺伝子からなる群から選択される1つ以上のミオシン重鎖遺伝子の発現を分析する工程である。
遺伝子の発現の分析は、特に限定されるものではないが、例えばmRNAの合成量を分析してもよく、mRNAから翻訳されるタンパク質量を分析してもよい。mRNAの発現の検出方法は、公知の方法を用いることが可能であり、例えばmRNAを直接測定するノザンブロット分析、ドットブロット法、及びRNAseプロテクション法並びにmRNAからcDNAを合成し分析するRT−PCR法(例えば、リアルタイムPCR法)、DNAマイクロアレイ法、DNAチップ法、ノザンブロット分析法を挙げることができるが、最も好ましくは、RT−PCR法、DNAマイクロアレイ法、及びDNAチップ法である。また、タンパク質の発現を測定する方法としては、ウエスタンブロット法、ドットブロット法、スロットブロット法、又は固相酵素免疫定量法(ELISA法)を挙げることができる。しかしながら、本スクリーニング系では、蛍光タンパク質の発現量を蛍光又は発光で分析できるため、蛍光又は発光タンパク質量の分析が、容易で正確に分析可能である。すなわち、試験物質を添加してない(陰性)コントロールと比較して、特定の蛍光タンパク質の蛍光量が増加していれば、その蛍光タンパク質等が結合しているミオシン重鎖を発現している細胞が増加していると判断され、特定の蛍光タンパク質の蛍光量が減少していれば、その蛍光タンパク質等が結合しているミオシン重鎖を発現している細胞が減少していると判断される。また、ミオシン重鎖を発現している細胞数の増加又は減少が無い場合に、蛍光タンパク質の蛍光量が増加又は減少している場合には、1つの細胞におけるミオシン重鎖の発現が増加又は減少していると考えられる。本発明のスクリーニング方法は、1つの細胞におけるミオシン重鎖の発現を増加又は減少させる代謝変換に関与する物質をスクリーニングすることもできる。蛍光タンパク質の量は、例えば蛍光顕微鏡、共焦点レーザー顕微鏡、又は多光子レーザー顕微鏡で測定することが可能である。
更に、それぞれの蛍光タンパク質を発現した細胞数を計測することによって、ミオシン重鎖Iを発現する遅筋線維、ミオシン重鎖IIa、ミオシン重鎖IId/x、又はミオシン重鎖IIbを発現する速筋線維細胞数を測定することもできる。また、顕微鏡写真における、それぞれの筋線維を発現している細胞の面積を、蛍光を測定することによって計算し、細胞数に代えることも可能である。従って、本明細書においては、細胞数及び細胞の面積を、纏めて「細胞の量」と称することがある。また、筋管細胞の時期などの細胞が増殖していない時期において、例えば「ミオシン重鎖Iを発現する細胞の量が増加している」とは、細胞が分化していることを意味している。本発明のスクリーニング方法においては、1つの細胞のミオシン重鎖の発現を経時的に観察することできる。更に、1つの細胞において、2つ以上のミオシン重鎖が発現していることを確認することができる。すなわち、細胞の分化は、細胞単位で起こるが、本発明のスクリーニング方法では、細胞レベルでの変化を経時的に、観察することが可能である。この理由は、本発明においては、細胞を培養しながら観察できるためである。抗体などを用いたミオシン重鎖の発現の観察では、細胞内部に存在するミオシン重鎖を染色するため、細胞を固定する必要があり、生きた細胞の継時的な観察が困難である。
また、ミオシン重鎖Iタンパク質を増加させる試験物質は、速筋の割合が増加し、そして遅筋が減少することによる筋力低下、筋萎縮又は筋損傷を伴う疾患の治療又は予防に有用である。すなわち、速筋の増加を伴う疾患、及び/又は遅筋の減少を伴う疾患の治療又は予防に有用である。ミオシン重鎖Iタンパク質を増加させる試験物質は、例えば廃用性筋萎縮、運動神経損傷、カヘキシー、慢性閉塞性肺疾患、クローン病、サルコペニア肥満症、筋萎縮を伴う動脈硬化症、脳血管障害に伴う筋萎縮、又はI型若しくはII型糖尿病性筋萎縮症の治療薬として用いることができる。これらの疾患は、遅筋が減少しており、ミオシン重鎖Iタンパク質を増加させることのできる物質、すなわちミオシン重鎖I筋線維細胞を増加させることのできる物質は、直接これらの疾患の治療又は予防剤として用いることができる。
更に、筋損傷、外傷、筋ジストロフィー、遠位性型ミオパチー、先天性ミオパチー、糖原病、ミトコンドリアミオパチー、ステロイドミオパチー、炎症性ミオパチー、内分泌性ミオパチー、脂質蓄積障害性ミオパチー、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、廃用性筋萎縮、慢性心不全症、サルコペニア(加齢性筋肉減少症)、自己免疫性重症筋無力症、多発性筋炎、皮膚筋炎、封入体筋炎、ギラン・バレー症候群、先天性筋無力症候群、又は外科治療後の筋組織再建の治療を目的とした間葉系幹細胞、筋幹細胞、及び/又は筋芽細胞の選択的な移植治療薬に有用である。ミオシン重鎖Iタンパク質を増加させる物質は、ミオシン重鎖I線維細胞を増加させることができるが、移植治療においては、間葉系幹細胞、筋幹細胞、及び/又は筋芽細胞から、遅筋線維細胞、及び速筋線維細胞をバランスよく分化誘導することが重要である。ミオシン重鎖Iタンパク質を増加させる物質は、遅筋線維細胞の分化誘導能によって、筋線維細胞の分化誘導に効果的に用いることができる。
なお、本明細書において、筋力低下を伴う疾患とは、廃用性筋萎縮、運動神経損傷、カヘキシー、慢性閉塞性肺疾患、クローン病、サルコペニア肥満症、筋萎縮を伴う動脈硬化症、脳血管障害に伴う筋萎縮、I型若しくはII型糖尿病性筋萎縮症、筋損傷、遠位性型ミオパチー、先天性ミオパチー、糖原病、ミトコンドリアミオパチー、ステロイドミオパチー、炎症性ミオパチー、内分泌性ミオパチー、脂質蓄積障害性ミオパチー、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、廃用性筋萎縮、慢性心不全症、サルコペニア(加齢性筋肉減少症)、自己免疫性重症筋無力症、多発性筋炎、皮膚筋炎、封入体筋炎、ギラン・バレー症候群、先天性筋無力症候群、筋ジストロフィー、又は外科治療後の筋組織再建、を意味する。
また、本明細書において、筋萎縮を伴う疾患とは、廃用性筋萎縮、運動神経損傷、カヘキシー、慢性閉塞性肺疾患、クローン病、サルコペニア肥満症、筋萎縮を伴う動脈硬化症、脳血管障害に伴う筋萎縮、I型若しくはII型糖尿病性筋萎縮症、筋損傷、遠位性型ミオパチー、先天性ミオパチー、糖原病、ミトコンドリアミオパチー、ステロイドミオパチー、炎症性ミオパチー、内分泌性ミオパチー、脂質蓄積障害性ミオパチー、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、廃用性筋萎縮、慢性心不全症、サルコペニア(加齢性筋肉減少症)、自己免疫性重症筋無力症、多発性筋炎、皮膚筋炎、封入体筋炎、ギラン・バレー症候群、先天性筋無力症候群、筋ジストロフィー、又は外科治療後の筋組織再建、を意味する。
更に、本明細書において、筋損傷を伴う疾患とは運動神経損傷、又は外傷及び外科治療後の筋組織再建を意味する。
また、ミオシン重鎖IIaタンパク質を増加させる試験物質は、速筋の割合が増加し、そして遅筋が減少することによる筋力低下、筋萎縮、又は筋損傷を伴う疾患の治療又は予防に有用である。すなわち、速筋の増加を伴う疾患、及び/又は遅筋の減少を伴う疾患の治療又は予防に有用である。ミオシン重鎖IIaタンパク質を増加させる試験物質は、例えば廃用性筋萎縮、運動神経損傷、カヘキシー、慢性閉塞性肺疾患、クローン病、サルコペニア肥満症、筋萎縮を伴う動脈硬化症、脳血管障害に伴う筋萎縮、又はI型若しくはII型糖尿病性筋萎縮症の治療薬として用いることができる。ミオシン重鎖IIaタンパク質を増加させる試験物質は、ミオシン重鎖IIa線維を増加させることによって、直接これらの疾患の治療又は予防剤として用いることができる。
更に、筋損傷、遠位性型ミオパチー、先天性ミオパチー、糖原病、ミトコンドリアミオパチー、ステロイドミオパチー、炎症性ミオパチー、内分泌性ミオパチー、脂質蓄積障害性ミオパチー、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、廃用性筋萎縮、慢性心不全症、サルコペニア(加齢性筋肉減少症)、自己免疫性重症筋無力症、多発性筋炎、皮膚筋炎、封入体筋炎、ギラン・バレー症候群、先天性筋無力症候群、筋ジストロフィー、外傷又は外科治療後の筋組織再建の治療を目的とした間葉系幹細胞、筋幹細胞及び/又は筋芽細胞の選択的な移植治療に有用である。ミオシン重鎖IIaタンパク質を増加させる物質は、ミオシン重鎖IIa線維細胞を増加させることができるが、移植治療においては、間葉系幹細胞、筋幹細胞、及び/又は筋芽細胞から、遅筋線維細胞、及び速筋線維細胞をバランスよく分化誘導することが重要である。ミオシン重鎖IIaタンパク質を増加させる物質は、ミオシン重鎖IIa線維細胞の分化誘導に効果的に用いることができる。
また、ミオシン重鎖IId/xタンパク質を増加させる試験物質は、速筋の減少する疾患の治療又は予防に有用である。具体的には、サルコペニア(加齢性筋肉減少症)の予防薬及び治療薬、又はALSの治療薬として用いることができる。
更に、筋損傷、遠位性型ミオパチー、先天性ミオパチー、糖原病、ミトコンドリアミオパチー、ステロイドミオパチー、炎症性ミオパチー、内分泌性ミオパチー、脂質蓄積障害性ミオパチー、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、廃用性筋萎縮、慢性心不全症、サルコペニア(加齢性筋肉減少症)、自己免疫性重症筋無力症、多発性筋炎、皮膚筋炎、封入体筋炎、ギラン・バレー症候群、先天性筋無力症候群、筋ジストロフィー、外傷又は外科治療後の筋組織再建の治療を目的とした間葉系幹細胞、筋幹細胞、及び/又は筋芽細胞の選択的な移植治療薬に有用である。ミオシン重鎖IId/xタンパク質を増加させる物質は、ミオシン重鎖IId/x線維細胞を増加させることができるが、移植治療においては、間葉系幹細胞、筋幹細胞、及び/又は筋芽細胞から、遅筋線維細胞、及び速筋線維細胞を対象となる骨格筋の特性に合わせて分化誘導することが重要である。ミオシン重鎖IId/xタンパク質を増加させる物質は、ミオシン重鎖IId/x線維細胞の分化誘導に効果的に用いることができる。
また、ミオシン重鎖IIbタンパク質を増加させる試験物質は、速筋の減少する疾患の治療又は予防に有用である。具体的には、サルコペニア(加齢性筋肉減少症)の予防薬及び治療薬、又はALSの治療薬として用いることができる。
更に、筋損傷、筋ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、廃用性筋萎縮、慢性心不全症、サルコペニア(加齢性筋肉減少症)自己免疫性重症筋無力症、多発性筋炎、皮膚筋炎、封入体筋炎、ギラン・バレー症候群、外傷又は外科治療後の筋組織再建の治療を目的とした間葉系幹細胞、筋幹細胞及び/又は筋芽細胞の選択的な移植治療に有用である。ミオシン重鎖IIbタンパク質を増加させる物質は、ミオシン重鎖IIb線維細胞を増加させることができるが、移植治療においては、間葉系幹細胞、筋幹細胞、及び/又は筋芽細胞から、遅筋線維細胞、及び速筋線維細胞を対象となる骨格筋の特性に合わせて分化誘導することが重要である。ミオシン重鎖IIbタンパク質を増加させる物質は、ミオシン重鎖IIb線維細胞の分化誘導能によって、筋線維細胞の分化誘導に効果的に用いることができる。
本発明のスクリーニング方法によって得られる代謝変換に関与する物質は、筋幹細胞、及び/又は筋芽細胞から、筋管細胞(筋線維細胞)への分化を誘導することができるが、間葉系幹細胞から、筋幹細胞、筋芽細胞、そして筋管細胞(筋線維細胞)への分化を誘導することも可能である。
間葉系幹細胞としては、特に限定されるものではないが、間葉系に属する細胞への分化誘導能を有するものであり、骨細胞、心筋細胞、軟骨細胞、腱細胞、骨格筋細胞、又は脂肪細胞などに分化することができる。間葉系幹細胞は、間葉系組織に存在すると考えられているが、骨髄由来間葉系幹細胞、歯髄由来間葉系幹細胞、脂肪由来間葉系幹細胞、胎盤由来間葉系幹細胞、羊膜由来間葉系幹細胞、臍帯および臍帯血由来間葉系幹細胞を用いることができる。前記代謝変換に関与する物質は、例えば上記の間葉系幹細胞を筋幹細胞、筋芽細胞、そして筋管細胞(筋線維細胞)に分化誘導することができる。従って、前記代謝変換に関与する物質は、細胞の代謝変換に関与する受容体のリガンド、アゴニスト、又はアンタゴニストのことがある。すなわち、本発明のスクリーニング方法は、骨格筋以外の細胞の代謝変換を誘導する物質をスクリーニングすることも可能である。
実施例3に記載のように、本発明のスクリーニング方法によって、骨格筋の速筋を増加させることが知られているT3(トリヨードサイロニン)をスクリーニング可能であった。すなわち、本発明のスクリーニング方法は、速筋の減少を伴う疾患の治療薬をスクリーニングすることができる。更に、実施例4に示すように、本発明のスクリーニング方法によって、遅筋においてI型線維の増加を示し、そして速筋においてII型筋線維の増加を示すIL−15をスクリーニングすることが可能であった。すなわち、本発明のスクリーニング方法は、遅筋の減少を伴う疾患、及び速筋の減少を伴う疾患の治療薬をスクリーニングすることができる。また、本発明のスクリーニング方法は、直接的に、遅筋線維又は速筋線維の発現の増減を検出していることから、速筋の減少を伴う疾患、速筋の増加を伴う疾患の治療薬、遅筋の増加を伴う疾患の治療薬、又は遅筋の減少を伴う疾患の治療薬のスクリーニングが可能である。
本発明の代謝変換に関与する物質のスクリーニング方法は、抗癌剤のスクリーニングに用いることが可能である。
また、実施例3に記載のように、本発明のスクリーニング方法によって、抗癌作用を有するラパマイシンをスクリーニングすることが可能であった。ラパマイシンは、Mammalian target of rapamycin(以下、mTORと称する)を抑制することによって、抗癌作用を示すmTOR阻害剤である。mTORが恒常的に活性化された癌細胞が知られており、そのような癌細胞は、ラパマイシンによって抑制されると考えられる。更に、ラパマイシンは実施例5に記載のように筋幹細胞(サテライト細胞)の増殖を抑制する。mTORは細胞外シグナル(例、インシュリン及びインシュリン様成長因子)で活性化された受容体から、細胞内のセリンスレオニンキナーゼ(PI3キナーゼ、AKT)を介して制御される。また、このmTORシグナル経路はAMP活性化プロテインキナーゼからも制御を受けて、細胞の生存および増殖を制御する。本発明のスクリーニング方法は、mTORシグナル経路に関連するセリンスレオニンキナーゼ又はAMP活性化プロテインキナーゼなどの複数の因子を、抑制又は亢進する化合物をスクリーニングすることも可能である。そして、スクリーニングされた化合物は、mTOR阻害剤と同じように、抗癌剤としての作用を有することが期待される。従って、mTORに結合するラパマイシン以外にも、本発明のスクリーニング方法によって、抗癌剤をスクリーニングすることが可能である。更に、本発明のスクリーニング方法によって、mTORシグナル経路に関連して抗癌作用を示す化合物以外の抗癌剤をスクリーニングすることもできる。すなわち、本発明のスクリーニング方法は、抗癌剤のスクリーニングに用いることができる。
本発明の代謝変換に関与する物質のスクリーニング方法は、免疫抑制剤のスクリーニングに用いることが可能である。
また、実施例3に記載のように、本発明のスクリーニング方法によって、免疫抑制作用を有するラパマイシンをスクリーニングすることが可能であった。ラパマイシンは、mTORを抑制することによって、免疫抑制作用を示すmTOR阻害剤である。mTORは細胞外シグナル(例、インシュリン及びインシュリン様成長因子)で活性化された受容体から、細胞内のセリンスレオニンキナーゼ(PI3キナーゼ、AKT)を介して制御される。また、このmTORシグナル経路はAMP活性化プロテインキナーゼからも制御を受けて、細胞の生存および増殖を制御する。本発明のスクリーニング方法は、mTORシグナル経路に関連するセリンスレオニンキナーゼ又はAMP活性化プロテインキナーゼなどの複数の因子を、抑制又は亢進する化合物をスクリーニングすることも可能である。そして、このような化合物は、mTOR阻害剤と同じように、免疫抑制剤としての作用を有することが期待される。従って、mTORに結合するラパマイシン以外にも、本発明のスクリーニング方法によって、免疫抑制作用を有する化合物をスクリーニングすることが可能である。更に、本発明のスクリーニング方法によって、mTORシグナル経路に関連して免疫抑制作用を示す化合物以外の免疫抑制剤をスクリーニングすることもできる。すなわち、本発明のスクリーニング方法は、免疫抑制剤のスクリーニングに用いることができる。
本発明の代謝変換に関与する物質のスクリーニング方法は、生活習慣病の治療剤のスクリーニングに用いることが可能である。
また、実施例3及び4に記載のように、本発明のスクリーニング方法によって、白色脂肪細胞を褐色脂肪細胞に分化させる効果を有するFGF21及びβ3受容体アゴニスト(CL316243)をスクリーニングすることが可能であった。褐色脂肪細胞は、白色脂肪細胞と比較すると、脂肪及び糖を燃焼させて大量の熱を産生することが可能である。従って、褐色脂肪細胞が増加すれば、脂肪が消費され生活習慣病の大きな原因である肥満症の治療に有効である。そして、肥満症が改善されれば、糖尿病、高血圧、動脈硬化、脳血管障害、又は心血管障害などの生活習慣病の治療にも効果を有する。従って、FGF21及びβ3受容体アゴニスト(CL316243)は、白色脂肪細胞を褐色脂肪細胞に分化させることによって、生活習慣病の治療剤として用いることが可能である。
また、本発明のスクリーニング方法によって、FGF21及びβ3受容体アゴニスト(CL316243)以外にも、白色脂肪細胞を褐色脂肪細胞に分化させることのできる物質、すなわち生活習慣病の治療剤をスクリーニングすることが可能であった。すなわち、本発明のスクリーニング方法は、生活習慣病の治療剤のスクリーニングに用いることができる。
更に、実施例4に示すように、本発明のスクリーニング方法によって、肥満症に効果(内臓脂肪細胞の減少)のあるIL−15をスクリーニングすることが可能であった。従って、白色脂肪細胞を褐色脂肪細胞に分化させる効果以外の機構により、肥満症に効果を有する化合物を、本発明のスクリーニング方法によって、スクリーニングすることも可能である。
或いは、本発明のスクリーニングキットは、ミオシン重鎖Iタンパク質又はそれに結合した蛍光又は発光タンパク質、ミオシン重鎖IIaタンパク質又はそれに結合した蛍光又は発光タンパク質、ミオシン重鎖IId/xタンパク質又はそれに結合した蛍光又は発光タンパク質、又はミオシン重鎖IIbタンパク質又はそれに結合した蛍光又は発光タンパク質を検出する試薬を含んでもよい。具体的には、抗体、及び酵素などを含んでもよい。
更に、本発明のスクリーニングキットは、蛍光又は発光タンパク質量を測定するための試薬を含んでもよい。具体的には、発光用ルシフェリンなど、あるいは発色用ホースラディッシュペルオキシダーゼ、又はアルカリフォスファターゼなどを挙げることができる。
(1)ラパマイシン又はその誘導体を含む医薬組成物
本発明の骨格筋の筋力低下、筋萎縮又は筋損傷を伴う疾患の治療又は予防用医薬組成物は、ラパマイシン又はその誘導体を含む。ラパマイシンは、下記式(1)
更に、筋損傷、外傷、筋ジストロフィー、遠位性型ミオパチー、先天性ミオパチー、糖原病、ミトコンドリアミオパチー、ステロイドミオパチー、炎症性ミオパチー、内分泌性ミオパチー、脂質蓄積障害性ミオパチー、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、廃用性筋萎縮、慢性心不全症、サルコペニア(加齢性筋肉減少症)、自己免疫性重症筋無力症、多発性筋炎、皮膚筋炎、封入体筋炎、ギラン・バレー症候群、先天性筋無力症候群、又は外科治療後の筋組織再建の治療を目的とした間葉系幹細胞、筋幹細胞、及び/又は筋芽細胞の選択的な移植治療において、筋幹細胞及び/又は筋芽細胞の分化増殖を促進させるために用いることができる。また、本発明のラパマイシンを含む医薬組成物は、リハビリテーション(運動療法)及び栄養療法と併用することが有効である。
本発明の骨格筋の筋力低下、筋萎縮又は筋損傷を伴う疾患の治療又は予防用医薬組成物は、線維芽細胞増殖因子21(以下、FGF21と称することがある)を含む。線維芽細胞増殖因子21は、配列番号1又は配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質であり、線維芽細胞増殖因子ファミリー(FGFファミリー)に属するタンパク質である。FGF21は、全身性の作用を示すことが知られている。FGF21が、ミオシン重鎖Iを増加させることは知られていなかった。なお、配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、マウスの線維芽細胞増殖因子21であり、配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、ヒトの線維芽細胞増殖因子21である。本発明の医薬組成物の有効成分として用いることのできる線維芽細胞増殖因子21は、筋幹細胞の代謝変換の機能を有する限りにおいて、マウス又はヒトの線維芽細胞増殖因子21に限定されるものではない。例えば、マウスの線維芽細胞増殖因子21(配列番号1)又はヒトの線維芽細胞増殖因子21(配列番号2)のアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、しかも筋管細胞への分化能を有する細胞から筋管細胞への分化誘導能を示すポリペプチドが含まれる。具体的には、例えばウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ラット、イヌ、又はネコの線維芽細胞増殖因子21を用いることができる。
更に、筋損傷、外傷、筋ジストロフィー、遠位性型ミオパチー、先天性ミオパチー、糖原病、ミトコンドリアミオパチー、ステロイドミオパチー、炎症性ミオパチー、内分泌性ミオパチー、脂質蓄積障害性ミオパチー、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、廃用性筋萎縮、慢性心不全症、サルコペニア(加齢性筋肉減少症)、自己免疫性重症筋無力症、多発性筋炎、皮膚筋炎、封入体筋炎、ギラン・バレー症候群、先天性筋無力症候群、又は外科治療後の筋組織再建の治療を目的とした間葉系幹細胞、筋幹細胞、筋芽細胞の選択的な移植治療において、間葉系幹細胞、筋幹細胞及び/又は筋芽細胞の分化増殖を促進させるために用いることができる。また、本発明の線維芽細胞増殖因子21を含む医薬組成物は、単独、又は運動療法及び栄養療法と併用することで、骨格筋の持久力の回復が期待できる。
本発明の骨格筋の筋力低下、筋萎縮又は筋損傷を伴う疾患の治療又は予防用医薬組成物は、β3受容体アゴニスト又はその誘導体を含む。β3受容体アゴニストは、β3アドレナリン受容体の作動薬である限りにおいて限定されるものではないが、下記式(2)
更に、筋損傷、外傷、筋ジストロフィー、遠位性型ミオパチー、先天性ミオパチー、糖原病、ミトコンドリアミオパチー、ステロイドミオパチー、炎症性ミオパチー、内分泌性ミオパチー、脂質蓄積障害性ミオパチー、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、廃用性筋萎縮、慢性心不全症、サルコペニア(加齢性筋肉減少症)、自己免疫性重症筋無力症、多発性筋炎、皮膚筋炎、封入体筋炎、ギラン・バレー症候群、先天性筋無力症候群、又は外科治療後の筋組織再建の治療を目的とした間葉系幹細胞、筋幹細胞、及び/又は筋芽細胞の選択的な移植治療において、筋幹細胞及び/又は筋芽細胞の分化増殖を促進させるために用いることができる。
これらの経口剤は、例えば、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、澱粉、コーンスターチ、白糖、乳糖、ぶどう糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、デキストリン、ポリビニルピロリドン、結晶セルロース、大豆レシチン、ショ糖、脂肪酸エステル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、ケイ酸マグネシウム、無水ケイ酸、又は合成ケイ酸アルミニウムなどの賦形剤、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、希釈剤、保存剤、着色剤、香料、矯味剤、安定化剤、保湿剤、防腐剤、又は酸化防止剤等を用いて、常法に従って製造することができる。
例えば、注射剤の調製においては、有効成分の他に、例えば、生理食塩水若しくはリンゲル液等の水溶性溶剤、植物油若しくは脂肪酸エステル等の非水溶性溶剤、ブドウ糖若しくは塩化ナトリウム等の等張化剤、溶解補助剤、安定化剤、防腐剤、懸濁化剤、又は乳化剤などを任意に用いることができる。
また、本発明の医薬組成物は、徐放性ポリマーなどを用いた徐放性製剤の手法を用いて投与してもよい。例えば、本発明の医薬組成物をエチレンビニル酢酸ポリマーのペレットに取り込ませて、このペレットを治療又は予防すべき組織中に外科的に移植することができる。
本発明の医薬組成物を用いる場合の投与量は、例えば、使用する有効成分の種類、病気の種類、患者の年齢、性別、体重、症状の程度、又は投与方法などに応じて適宜決定することができ、経口的に又は非経口的に投与することが可能である。
また、投与形態も医薬品に限定されるものではなく、種々の形態、例えば、機能性食品や健康食品(飲料を含む)、又は飼料として飲食物の形で与えることも可能である。
(1)ラパマイシン又はその誘導体を含む筋管細胞分化誘導剤
本発明の筋管細胞分化誘導剤は、ラパマイシン又はその誘導体を有効成分として含み、筋管細胞への分化能を有する細胞から筋管細胞を分化誘導することができる。ラパマイシンの誘導体としては、前記の「医薬組成物」に記載の誘導体を用いることができる。
前記筋管細胞への分化能を有する細胞は、特に限定されるものではなく、例えば筋芽細胞、筋幹細胞、間葉系幹細胞、胚性幹細胞(Embryonic stem cells;ES細胞)、又は人工多能性幹細胞(induced pluripotent stem cells;iPS細胞)を挙げることができる。
本発明の筋管細胞分化誘導剤は、例えば筋損傷、外傷、筋ジストロフィー、遠位性型ミオパチー、先天性ミオパチー、糖原病、ミトコンドリアミオパチー、ステロイドミオパチー、炎症性ミオパチー、内分泌性ミオパチー、脂質蓄積障害性ミオパチー、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、廃用性筋萎縮、慢性心不全症、サルコペニア(加齢性筋肉減少症)、自己免疫性重症筋無力症、多発性筋炎、皮膚筋炎、封入体筋炎、ギラン・バレー症候群、先天性筋無力症候群、又は外科治療後の筋組織再建の患者への筋芽細胞、筋幹細胞、及び/又は間葉系幹細胞の移植治療において、in vitroでこれらの細胞を分化誘導することができる。そして誘導された筋芽細胞、筋幹細胞、及び/又は間葉系幹細胞を患者の体内に移植することによって、これらの疾患を治療することができる。
ラパマイシンを含む筋管細胞分化誘導剤は、特に遅筋線維細胞の誘導能に優れている。
本発明の筋管細胞分化誘導剤は、線維芽細胞増殖因子21を有効成分として含み、筋管細胞への分化能を有する細胞から筋管細胞を分化誘導することができる。
前記筋管細胞への分化能を有する細胞は、特に限定されるものではなく、例えば筋芽細胞、筋幹細胞、間葉系幹細胞、胚性幹細胞(Embryonic stem cells;ES細胞)、又は人工多能性幹細胞(induced pluripotent stem cells;iPS細胞)を挙げることができる。
本発明の筋管細胞分化誘導剤は、例えば筋損傷、外傷、筋ジストロフィー、遠位性型ミオパチー、先天性ミオパチー、糖原病、ミトコンドリアミオパチー、ステロイドミオパチー、炎症性ミオパチー、内分泌性ミオパチー、脂質蓄積障害性ミオパチー、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、廃用性筋萎縮、慢性心不全症、サルコペニア(加齢性筋肉減少症)、自己免疫性重症筋無力症、多発性筋炎、皮膚筋炎、封入体筋炎、ギラン・バレー症候群、先天性筋無力症候群、又は外科治療後の筋組織再建の患者への筋芽細胞、筋幹細胞、及び/又は間葉系幹細胞の移植治療において、in vitroでこれらの細胞を分化誘導することができる。そして誘導された筋芽細胞、筋幹細胞、及び/又は間葉系幹細胞を患者の体内に移植することによって、これらの疾患を治療することができる。
線維芽細胞増殖因子21を含む筋管細胞分化誘導剤は、特に遅筋線維細胞の誘導能に優れている。
本発明の筋管細胞分化誘導剤は、β3受容体アゴニスト又はその誘導体を有効成分として含み、筋管細胞への分化能を有する細胞から筋管細胞を分化誘導することができる。β3受容体アゴニストの誘導体としては、前記の「医薬組成物」に記載の誘導体を用いることができる。
前記筋管細胞への分化能を有する細胞は、特に限定されるものではなく、例えば筋芽細胞、筋幹細胞、間葉系幹細胞、胚性幹細胞(Embryonic stem cells;ES細胞)、又は人工多能性幹細胞(induced pluripotent stem cells;iPS細胞)を挙げることができる。
本発明の筋管細胞分化誘導剤は、例えば筋損傷、外傷、筋ジストロフィー、遠位性型ミオパチー、先天性ミオパチー、糖原病、ミトコンドリアミオパチー、ステロイドミオパチー、炎症性ミオパチー、内分泌性ミオパチー、脂質蓄積障害性ミオパチー、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、廃用性筋萎縮、慢性心不全症、サルコペニア(加齢性筋肉減少症)、自己免疫性重症筋無力症、多発性筋炎、皮膚筋炎、封入体筋炎、ギラン・バレー症候群、先天性筋無力症候群、又は外科治療後の筋組織再建の患者への筋芽細胞、筋幹細胞、及び/又は間葉系幹細胞の移植治療において、in vitroでこれらの細胞を分化誘導することができる。そして誘導された筋芽細胞、筋幹細胞、及び/又は間葉系幹細胞を患者の体内に移植することによって、これらの疾患を治療することができる。
β3受容体アゴニストを含む筋管細胞分化誘導剤は、特に遅筋線維細胞の誘導能に優れている。
本作成例では、ミオシン重鎖I融合遺伝子、ミオシン重鎖IIa融合遺伝子、ミオシン重鎖IId/x融合遺伝子、及びミオシン重鎖IIb融合遺伝子の導入されたノックインマウスを作成した。ミオシン重鎖I遺伝子と、蛍光タンパク質YFPの結合した融合遺伝子が導入されているMyHCI−YFPノックインマウス(National Institute of Health)に、ミオシン重鎖IIa遺伝子及び蛍光タンパク質Sirius遺伝子が結合した融合遺伝子、ミオシン重鎖IIb遺伝子及び蛍光タンパク質mCherry遺伝子が結合した融合遺伝子、及びミオシン重鎖IId/x遺伝子及び蛍光タンパク質mCerulean遺伝子が結合した融合遺伝子を導入した。
ノックインマウスのターゲティングベクターを作製するため、BACPAC Resourcesから、雄性C57BL/6JマウスのBACクローンであるRP24−149P22、RP24−374D24を購入し、MyHCIIa遺伝子、MyHCIIb遺伝子、及びMyHCIId/xの標的とするゲノム配列をそれぞれサブクローニングした。BAC配列のサブクローニングにはRed/ETrecombination BAC subcloning kit(Gene Bridges)を使用し、ネガティブ選択用のマーカー(MC1−TK)が挿入されたプラスミド(PL253)に約10kbのゲノムDNAを導入した。紫外線領域蛍光タンパクであるSirius、赤色蛍光タンパクであるmCherry、及び青色蛍光タンパク質であるmCeruleanのcDNA配列をPCRでクローニングし、それぞれMyHCIIa、IIb、及びIId/x遺伝子の翻訳開始配列(ATG)とコドンのフレームを合わせて5’側に挿入した。また、FRT配列で挟んだPGK-gb2-Neomycin cassette(Gene Bridges)をポジティブ選択用のマーカーとしてターゲティングベクターに挿入した(図1)。直鎖状にしたターゲティングベクターをエレクトロポレーションでマウスES細胞に導入し、G418でポジティブ選択を行った後、PCRとサザンブロットで相同組換えを起こしたESクローンを同定した。同定したESクローンを用いてアグリゲーション法によりキメラマウスを作製し、雌性のC57BL/6との交配で得られた産仔のジェノタイピングを行って生殖系列への移行を確認した。
本実施例では、作成例1で作成したノックインマウスから、筋幹細胞(サテライト細胞)のFACSによる、ネガティブ選択及びポジィティブ選択により分離した。
マウスから単離した筋に2倍量の0.2%コラゲナーゼを添加し37℃で1時間撹拌する。18Gの注射針を用い溶液をトリチュレーション後、37℃で30分撹拌。40μmセルストレーナーを通し1500rpm、10分間、4℃で遠心し、上清を除去し赤血球除去用塩化アンモニウム溶液を添加し、氷上30秒静置して溶血させた。2%FBS/PBSを加え1500rpm、5分間、4℃で遠心した。上清を除去し、沈殿をSM/C−2.6−biotin(x200)、2%FBS/PBSで懸濁、氷上で30分静置した。2%FBS/PBSを加え、1500rpm、5分間、4℃で遠心し、上清を除去し沈殿をCD31−FITC(x400)、CD45−FITC(x800)、Sca1−PE(x400)、Streptavidin−APC(x400)2%FBS/PBSで懸濁した。氷上で30分静置後、2%FBS/PBSを加え1500rpm、5分間、4℃で遠心した。上清を除去し、沈殿を2%FBS/PBSで懸濁した。セルストレーナーを通し1mg/mLのPI(x500)を添加し、FACS解析で解析しながら筋幹細胞(サテライト細胞)を分離した。
本実施例では、筋幹細胞(サテライト細胞)の不死化細胞の取得を行った。不死化細胞の取得のために、IFN−γで誘導されるH−2Kb−promoter及び温度感受性SV40 large T抗原を有するImmortmouseを用いた。Immortmouseは、IFN−γによりSV40 large T抗原が発現し、細胞の不死化を誘導することができる。
作成例1で作成したノックインマウスと、Immortmouseとを交配させて、産仔を取得した。得られた産仔から、実施例1の方法に従って、筋幹細胞(サテライト細胞)を分離した。分離した筋幹細胞を、33℃、10ng/mLのIFN−γ存在下で培養することにより、不死化の誘導を行った。得られた細胞を、37℃で培養することにより、温度感受性SV40 large T抗原を分解し、不死化筋幹細胞(サテライト細胞)を取得した。
本実施例では、実施例2で作成した不死化筋幹細胞を用いて、27種の試験化合物についての、代謝変換スクリーニングを行った。
不死化筋幹細胞1x105の細胞を60mm dishあるいは2x103の細胞を96ウェルプレートに播種した。20%FBS、10ng/mLのbFGF、10ng/mLのIFNγ含有DMEM培地で1日間33℃で培養後、5%HS含有DMEM培地で3日間37℃で培養する。その後、2日間5%ウマ血清含有DMEMに適当な希釈倍率に段階希釈した試験物質をそれぞれのdishに添加して処理をした後、蛍光顕微鏡によって生細胞の状態で、YFP、Sirius、mCherry、及びmCeruleanの蛍光を観察し、それぞれの蛍光を発現している細胞数を測定した。図3Aにミオシン重鎖I遺伝子に結合したYFPが発現した筋管細胞及びミオシン重鎖IIa遺伝子に結合したsiriusが発現した筋管細胞の写真を示し、そして図3Bにミオシン重鎖IId/x遺伝子に結合したmCeruleanが発現した筋管細胞及びミオシン重鎖IIb遺伝子に結合したmCherryが発現した筋管細胞の写真を示す。
前記スクリーニング方法により、ミオシン重鎖タンパク質Iを発現した細胞が増加し、ミオシン重鎖タンパク質IIbを発現した細胞が減少した試験物質であるラパマイシンの結果を図4に示す。「nega」は、ラパマイシンを添加していない陰性コントロールである。ラパマイシンは、陰性コントロールと比較して、YFPの蛍光を発光する筋管細胞数が増加し、mCherryの蛍光を発光する筋管細胞数が減少していた。具体的には、前記筋管細胞に4nMのラパマイシンを接触させることにより、ミオシン重鎖タンパク質Iを発現した細胞面積が25.3%から60.9%に増加し、ミオシン重鎖タンパク質IIbを発現した細胞面積が41.8%から8.4%に減少した。
すなわち、ラパマイシンは骨格筋の代謝機能を向上させることができるため、骨格筋の筋力低下、筋萎縮又は筋損傷を伴う疾患の治療剤として用いることができる。特には、ラパマイシンは遅筋が減少する疾患の治療剤として有効である。
また、前記スクリーニング方法により、ミオシン重鎖タンパク質Iを発現した細胞が増加したマウス線維芽細胞増殖因子21(FGF21)の結果を図5に示す。「nega」は、マウス線維芽細胞増殖因子21(FGF21)を添加していない陰性コントロールである。線維芽細胞増殖因子21では陰性コントロールと比較して、YFPの蛍光を発色する筋管細胞数が増加していたが、mCherryの蛍光を発色する筋管細胞数は変化しなかった。具体的には、前記筋管細胞に1nM、10nM及び100nMのマウス線維芽細胞増殖因子21を接触させることにより、ミオシン重鎖タンパク質Iを発現した細胞面積が28.4%からそれぞれ40.6%、48.0%及び54.9%に増加した。
すなわち、FGF21は骨格筋の代謝機能を向上させることができるため、骨格筋の筋力低下、筋萎縮又は筋損傷を伴う疾患の治療剤として用いることができる。特には、FGF21は遅筋が減少する疾患の治療剤として有効である。
更に、ミオシン重鎖タンパク質IIbを発現した細胞が増加した試験物質T3(トリヨードサイロニン)の結果を図6に示す。前記筋管細胞に100nM、及び500nMのT3(トリヨードサイロニン)を接触させることにより、ミオシン重鎖タンパク質IIbを発現した細胞面積が44.5%からそれぞれ71.3%、及び70.0%に増加した。すなわち、T3は骨格筋の機能を向上させることができるため、骨格筋の筋力低下、筋萎縮又は筋損傷を伴う疾患の治療剤として用いることができる。特には、T3は速筋が減少する疾患の治療剤として有効である。T3(トリヨードサイロニン)は、骨格筋の速筋を増加させることが知られており、本実施例の結果は、従来の知見と一致するものであり、本発明のスクリーングシステムが、有用であること示している。
本実施例では、実施例2で作成した不死化筋幹細胞を用いて、更に試験化合物についての、実施例3の操作を繰り返して、代謝変換スクリーニングを行った。
前記スクリーニング方法により、ミオシン重鎖タンパク質Iを発現した細胞が増加し、ミオシン重鎖タンパク質IIbを発現した細胞も増加した試験物質であるIL−15の結果を図7に示す。「nega」は、IL−15を添加していない陰性コントロールである。IL−15は、陰性コントロールと比較して、YFPの蛍光を発症する筋管細胞数が増加し、mCherryの蛍光を発色する筋管細胞数も増加していた。具体的には、前記筋管細胞に100ng/mL又は500ng/mLのIL−15を接触させることにより、ミオシン重鎖タンパク質Iを発現した細胞面積が19.5%から35.0%又は36.1%に増加し、ミオシン重鎖タンパク質IIbを発現した細胞面積が36.2%から53.0%に増加した。
すなわち、IL−15は骨格筋の代謝機能を向上させることができるため、骨格筋の筋力低下、筋萎縮又は筋損傷を伴う疾患の治療剤として用いることができる。特には、IL−15は遅筋及び/又は速筋が減少する疾患の治療剤として有効である。
また、前記スクリーニング方法により、ミオシン重鎖タンパク質Iを発現した細胞が増加したβ3受容体アゴニスト(CL316243)の結果を図8に示す。「nega」は、β3受容体アゴニスト(CL316243)を添加していない陰性コントロールである。β3受容体アゴニスト(CL316243)では陰性コントロールと比較して、YFPの蛍光を発色する筋管細胞数が増加していたが、mCherryの蛍光を発色する筋管細胞数は変化しなかった。具体的には、前記筋管細胞に1nM、10nM及び100nMのβ3受容体アゴニスト(CL316243)を接触させることにより、ミオシン重鎖タンパク質Iを発現した細胞面積が28.4%からそれぞれ49.3%、53.8%及び57.8%に増加した。
すなわち、β3受容体アゴニストは骨格筋の代謝機能を向上させることができるため、骨格筋の筋力低下、筋萎縮又は筋損傷を伴う疾患の治療剤として用いることができる。特には、β3受容体アゴニストは遅筋が減少する疾患の治療剤として有効である。
本実施例では、実施例3の代謝変換スクリーニングで得られたラパマイシンについて、サテライト細胞を用いて、増殖抑制スクリーニングによってスクリーニングされるか否かを検討した。
不死化筋幹細胞1x104の細胞を35mm dishに播種した。20%FBS、10ng/mLのbFGF、10ng/mLのIFNγ含有DMEM培地で、1日間33℃で培養後、20%FBS含有DMEMに5nMに希釈したラパマイシンをdishに添加して処理をした後、5日間培養し、細胞数を測定した。図9Aに5日間培養後の不死化筋幹細胞の顕微鏡写真を示し、図9Bに細胞数の増加のグラフを示す。「Control」は、ラパマイシンを添加していない、陰性コントロールである。ラパマイシンを添加することによって、サテライト細胞の増殖が抑制された。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
Claims (13)
- ミオシン重鎖I遺伝子及び蛍光又は発光タンパク質遺伝子が結合したミオシン重鎖I融合遺伝子、ミオシン重鎖IIa遺伝子及び蛍光又は発光タンパク質遺伝子が結合したミオシン重鎖IIa融合遺伝子、ミオシン重鎖IId/x遺伝子及び蛍光又は発光タンパク質遺伝子が結合したミオシン重鎖IId/x融合遺伝子、及びミオシン重鎖IIb遺伝子及び蛍光又は発光タンパク質遺伝子が結合したミオシン重鎖IIb融合遺伝子からなる群から選択される1つ以上のミオシン重鎖融合遺伝子を含む単離された筋幹細胞又は筋芽細胞。
- 前記細胞が不死化細胞である、請求項1に記載の筋幹細胞又は筋芽細胞。
- ミオシン重鎖I遺伝子に結合した蛍光又は発光タンパク質遺伝子、ミオシン重鎖IIa遺伝子に結合した蛍光又は発光タンパク質遺伝子、ミオシン重鎖IId/x遺伝子に結合した蛍光又は発光タンパク質遺伝子、及びミオシン重鎖IIb遺伝子に結合した蛍光又は発光タンパク質遺伝子が、それぞれ異なる蛍光又は発光タンパク質遺伝子である、請求項1又は2に記載の筋幹細胞又は筋芽細胞。
- 前記蛍光又は発光タンパク質が、Sirius、EBFP、SBP2、EBP2、Azurite、mKalama1、TagBFP、mBlueberry、mTurquoise、ECFP、Cerulean、mCerulean、TagCFP、AmCyan、mTP1、MiCy(Midoriishi Cyan)、TurboGFP、CFP、AcGFP、TagGFP、AG(Azami−Green)、mAG1、ZsGreen、EmGFP(Emerald)、EGFP、GP2、T−Sapphire、HyPer、TagYFP、mAmetrine、EYFP、YFP、Venus、Citrine、PhiYFP、PhiYFP−m、turboYFP、ZsYellow、mBanana、mKO1、KO(Kusabira Orange)、mOrange、mOrange2、mKO2、Keima570、TurboRFP、DsRed−Express、DsRed、DsRed2、TagRFP、TagRFP−T、DsRed−Monomer、mApple、AsRed2、mStrawberry、TurboFP602、mRP1、JRed、KillerRed、mCherry、KeimaRed、HcRed、mRasberry、mKate2、TagFP635、mPlum、egFP650、Neptune、mNeptune、egFP670及びルシフェラーゼからなる群から選択される少なくとも1つの蛍光又は発光タンパク質である、請求項
1〜3のいずれか一項に記載の筋幹細胞又は筋芽細胞。 - 請求項1〜4のいずれか一項に記載の筋幹細胞若しくは筋芽細胞と、試験物質とを接触させる工程;及び
前記細胞におけるミオシン重鎖I遺伝子、ミオシン重鎖IIa遺伝子、ミオシン重鎖IId/x遺伝子、及びミオシン重鎖IIb遺伝子からなる群から選択される1つ以上のミオシン重鎖遺伝子の発現を分析する工程、
を含む、代謝変換に関与する物質のスクリーニング方法。 - 前記ミオシン重鎖遺伝子の発現の分析が、蛍光又は発光タンパク質を発現している細胞の量又は細胞増殖の分析である、請求項5に記載の代謝変換に関与する物質のスクリーニング方法。
- 前記代謝変換に関与する物質が、遅筋の減少を伴う疾患の治療又は予防剤、遅筋の増加を伴う疾患の治療又は予防剤、速筋の減少を伴う疾患の治療又は予防剤、速筋の増加を伴う疾患の治療又は予防剤、抗癌剤、免疫抑制剤、及び生活習慣病の治療又は予防剤からなる群から選択される薬剤である、請求項5又は6に記載のスクリーニング方法。
- ラパマイシンを有効成分として含む、筋管細胞への分化能を有する細胞から筋管細胞へのin vitro分化誘導剤。
- 前記筋管細胞への分化能を有する細胞が、間葉系幹細胞、筋幹細胞、又は筋芽細胞である、請求項8に記載のin vitro分化誘導剤。
- (1)配列番号1又は配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである線維芽細胞増殖因子21、又は
(2)配列番号1又は配列番号2で表されるアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、しかも筋管細胞への分化能を有する細胞から筋管細胞への分化誘導能を示すポリペプチド、
を有効成分として含む、筋管細胞への分化能を有する細胞から筋管細胞へのin vitro分化誘導剤。 - 前記筋管細胞への分化能を有する細胞が、間葉系幹細胞、筋幹細胞、又は筋芽細胞である、請求項10に記載のin vitro分化誘導剤。
- CL316243を有効成分として含む、筋管細胞への分化能を有する細胞から筋管細胞へのin vitro分化誘導剤。
- 前記筋管細胞への分化能を有する細胞が、間葉系幹細胞、筋幹細胞、又は筋芽細胞である、請求項12に記載のin vitro分化誘導剤。
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