附图简述
图1A-D示出了膀胱扩大支架的例子。
图2A-D示出了膀胱替换支架的例子。
图3A示出了尿流改道或导管支架的例子。图3B-C示出了尿流改道结构的例子,所述尿流改道结构具有不同类型的横截面区域、以及潜在的开口位置,所述开口可以被设置为连接到输尿管。图3C显示了多种尿流改道结构(A:开放的要求卵形;B:开放的要求卵形容器,C:封闭的卵形容器和三管)。
图4A-D示意了尿流改道或者导管构建的不同应用。
图5A-B示出了肌肉等价支架的例子。
图6描绘了多种肌肉等价支架的图像,以补丁或条带的形式。
图7描绘了不同的肌肉等价支架和代表性的移植方法。
图7A描绘了支架平薄片的形成。图7B描绘了适合于腹腔镜的支架,它可以在植入的时候卷起、并馈通过腹腔镜管道、以及在所述腹腔中展开。图7C描绘了适合于腹腔镜的支架薄片以卷起的形态形成,以促进通过腹腔镜管道的插入,然后在所述腹腔中展开。图7D描绘了适合于腹腔镜的支架薄片以折叠的形态或者手风琴折叠式形成,促进通过管道的插入,然后它在所述腹腔中展开。图7E描绘了肌肉等价支架的移植的可能的手术方法。图7F描绘了在空虚的和充盈的膀胱中的植入位点。图7G描绘了具有手术切口的泌尿膀胱模型,示出了创建在切片表面的椭球。
图8描绘了预折叠的手风琴式支架薄片,以促进通过腹腔镜端口的插入。
图9A描绘了预切割成条带的支架,然后缝合在一起,以允许堆积和插入到所述腹腔镜端口中,并且在所述腹腔中固定到位。图9B描绘了一个18.7cm长、2.0cm宽的支架,其具有2个折叠。图9C描绘了一个13.3cm长、2.8cm宽的支架,其具有3个折叠。图9D描绘了一个9.7cm长、4.0cm宽的支架,其具有4个折叠。图9E描绘了一个支架,由2个薄片,每个薄片有2个折叠、9.7cm长、2.0cm宽.
图10A-C描绘了GI组织支架。
图11A-B示出了植入导管结构的形态的例子。
图12描绘了植入的新泌尿导管支架的两种可选择的形态(A和B)。
图13示出了永久尿流改道结构的植入元件的例子。
图14描绘了所述尿流改道结构的其它应用。
图15示出了测试动物在植入泌尿导管结构后的固定后组织(在长度上一分为二)。
图16A-D示出了来自肺脏肺泡形成单元的Clara细胞分泌蛋白(A)和前表面活性蛋白C(prosurfactantProteinC)(B-D)的表达。
图17描绘了来自肺脏肺泡形成单元的Clara细胞蛋白的表达。
图18描绘了来自肺脏肺泡形成单元的KRT18、SCGB1A1、和SFTPA1的表达。
图19示出了接合素43染色的大鼠肺脏AFU的聚焦图像。
图20描绘了在明胶海绵和PLGA支架上的AFU,有或没有预接种Ad-SMC(顶部左侧平板-明胶海绵预接种Ad-SMC,然后接种分离的肺脏细胞;顶部右侧平板-明胶海绵没有接种Ad-SMC,然后接种分离的肺脏细胞;底部左侧平板-明胶海绵预接种Ad-SMC,然后接种分离的肺脏细胞;底部右侧平板-明胶海绵没有预接种Ad-SMC,然后接种分离的肺脏细胞;箭头描绘了明显的AFU在预接种Ad-SMC的支架上形成。
图21示出了在顶部左侧平板中,明胶海绵(-)Ad-SMC,用抗Clara细胞蛋白的抗体染色;顶部右侧平板示出了明胶海绵(-)Ad-SMC时相图;底部左侧平板示出了明胶海绵(+)Ad-SMC用抗Clara细胞蛋白的抗体染色;以及底部右侧平板示出了明胶海绵(+)Ad-SMC时相图。
图22在顶部左侧平板中示出了用抗表面活性蛋白C(SurfactantProteinC)的抗体染色的明胶海绵(-)Ad-SMC;顶部右侧平板示出了明胶海绵(-)Ad-SMC时相图;底部左侧平板示出了用抗表面活性蛋白C的抗体染色的明胶海绵(+)Ad-SMC;以及底部右侧平板示出了明胶海绵(+)Ad-SMC时相图(在底部平板的箭头描绘了明显的AFU形成)。
图23在顶部左侧平板中描绘了用抗Clara细胞蛋白的抗体染色的PLGA支架(+)Ad-SMC;顶部右侧平板-PLGAscaffold(+)Ad-SMC时相图;以及底部左侧平板示出了荧光免疫和时相图的合并(在顶部平板的箭头描绘了明显的AFU形成)。
图24示出了用抗表面活性蛋白C的抗体染色的明胶海绵支架(+)Ad-SMC;顶部右侧平板示出了明胶海绵支架(+)Ad-SMC时相图;底部左侧平板示出了荧光免疫和时相图的合并(在平板中的箭头描绘了在所述明胶海绵中的空腔)。
图25A-C示出了平滑肌细胞在多种生物材料上的粘附/增殖。
图26示出了沉积在多种生物材料上的平滑肌细胞的活着的/死亡的分析结果。
图27A-B示出了接种源自脂肪平滑肌细胞(Ad-SMC),在培养基介质中孵育后的支架。
图27C-E示出了上皮细胞从食管组织到支架的迁移程度,所述支架包括没有预接种Ad-SMC的支架(C)、以及预接种Ad-SMC的支架(D)。图27E示出了没有食管组织的支架。
图28示出了源自食管的细胞培养物。
图29A上皮细胞标记物在食管组织和培养的食管细胞中的基因表达。图29B示出了培养的食管细胞的细胞角蛋白8、18、9的免疫染色。
图30示出了评估细胞迁移的实验设计。
图31示出了食管细胞的迁移。
图32出了食管细胞的迁移。
图33A示出了所述手术创建的食管缺损和后续的结构移植。
图33B示出了植入结构在移植后1天的组织学。
图34示出了在植入位点的新生血管化(血管生成)。
图35示出了植入结构在移植后8天的组织学。
图36示出了植入结构在移植后8天的组织学。
图37A示出了食管结构在移植后10周的合并。图37B示出了第1切片(横向的)的更多细节。图37C示出了第2切片(横向的)的更多细节。图37D示出了第3节(横向的)的更多细节。
图38示出了接种到编织网格的Ad-SMC。
图39A-C示出了植入的小肠(SI)结构。
图40A-C示出了在植入后8周(A)和16周(B-C)的SI补丁结构。
图41示出了在植入后10周的SI管状结构。
图42示出了在植入5个月的SI管状结构。
图43示出了在支架上的源自大鼠脂肪的SMC的活着的/死亡的染色。
图44示出了外周血细胞的细胞形态。
图45示出了在外周血细胞上的内皮标记物的RT-PCR分析。
图46示出了源自脂肪细胞的细胞形态。
图47示出了在源自脂肪细胞的内皮标记物的RT-PCR分析。
图48示出了在含有10%FBS的DMEM中培养的源自脂肪细胞的内皮细胞基因表达分析。
发明详述
本发明涉及细胞群体(所述细胞群体源自与本文所描述的所述受试者再生、重建、扩大或替换的器官或组织构造不同的来源),分离此细胞的方法,接种此细胞(结构)的新器官/组织构造支架或模型,以及制备所述相同的方法,以及使用这种新器官/组织构造结构治疗有需要的患者的方法。
1.定义
除非另有定义,本文所使用的技术和科学术语具有相同的含义,如通常可被本发明所属的本技术领域的普通技术人员所理解。组织工程原理,2007年,第3版。(RLanza,RLanger,&JVacanti编辑),为本领域的技术人员在目前应用中使用的术语提供了基本指南。
本领域的技术人员将认识到许多的方法和材料类似或等同于本文所描述的,可用于本发明的所述实践中。事实上,本发明不限制所述的方法和材料。对于本发明的目的,所述术语定义如下。
本文所述术语“平滑肌细胞”或“SMC”是指源自与天然器官或组织不同或相同的来源的收缩细胞,所述天然器官或组织属于所述受试者使用本文所述的结构和方法再生、重建、扩增或替换的。本发明所提供的所述平滑肌细胞,一旦接种并培养在如本文所述的支架或本文所描述的模型上,能够形成在中空器官(例如,膀胱、腹腔、胃肠道、等)壁中发现的所述非横纹肌,其特征在于有能力收缩和放松。那些本领域的普通技术人员可理解平滑肌细胞的其它属性。
此处使用的本文所述术语“细胞群体”是指直接从合适的组织来源(通常是哺乳动物)分离的一些细胞。所述分离的细胞群体可随后在体外培养。那些在本领域的普通技术人员将理解分离培养细胞群体,以及在细胞群体中不同数量的细胞的各种方法,这可能是适合于在本发明中使用。所述细胞群体可源自自体或非自体。SMC群体可来自脂肪、血液或膀胱,其特征在于可与平滑肌细胞相联系表达标记物。所述SMC群体也可能为纯化的细胞群体。
本文所使用的术语“源自脂肪的平滑肌细胞群体”或“Ad-SMC群体”是指源自脂肪的平滑肌细胞群体(SMC),其基本上没有脂肪细胞或非贴壁脂肪细胞。所述Ad-SMC群体,其特征在于可与平滑肌细胞相联系表达标记物。所述Ad-SMC群体也可以是纯化的细胞群体。所述Ad-SMC群体可源自自体的来源。所述Ad-SMC可源自SVF,含有血管组织。因此,所述Ad-SMC可源自所述脂肪衍生的血管床的毛细血管、小动脉和小静脉,或SMC可源自含有周细胞的血管周围微环境。
所述术语“胃肠道细胞群体”或“GI细胞群体”是指是源自胃肠道组织的细胞群体,包括但不限于:食管、小肠、大肠、胃、结肠,或肛门括约肌组织。例如,所述GI细胞群体可能为源自食管组织的异种的细胞群体。
所述术语“食管细胞群体”或者“食管细胞群体”是指源自于食管组织的细胞群体。它可以是异种的细胞群体,其包括上皮细胞、平滑肌细胞、以及其任意的组合。食管细胞群体可以源自食管活检或者源自整个食管组织。选择性地,所述食管群体可以源自体外培养的细胞群体,所述细胞群体从食管组织活检或者整个食管组织建立。所述食管细胞群体的特征在于,与上皮细胞、平滑肌细胞和其任意组合相关的标记物的表达。所述食管细胞群体可以是纯化的细胞群体。
所述术语“呼吸细胞群体”是指细胞群体,它是源自呼吸组织(例如肺脏)的、异种的细胞群体。所述呼吸细胞群体可以包括细支气管细胞、上皮细胞、肺泡细胞和其任意的组合。呼吸细胞群体可以源自肺活检或者整个肺组织。作为选择,所述呼吸细胞群体可以源自在体外培养的细胞群体,所述细胞群体从肺活检或者整个肺组织建立。所述呼吸细胞群体的特征可以在于,与细支气管细胞、上皮细胞、肺泡细胞和其任意的组合相关的标记物的表达。所述呼吸细胞群体可以是纯化的细胞群体。
所述术语“自体的”是指源自相同个体的或从相同的个体转化的。本文所描述的自体的细胞群体源自需要再生、重建、扩大或替换天然器官或组织构造的受试者。自体细胞群体源自这种受试者,其是本文所描述的结构的接受者。
所述术语“非自体”是指源自供体或者从供体转化的,所述供体不是本文所描述的可植入结构的接收者。这种非自体来源包括同种异体的、同基因的(自体的或同基因的)、及其任意组合的来源。如本文所使用的,非自体细胞群体是源自与本文所描述的所述受试者非自体的来源的细胞群体。
所述术语“标记物”或“生物标记物”通常是指DNA、RNA、蛋白、碳水化合物或者基于糖脂类的分子标记物,它们在培养的细胞群体中表达或存在,可以通过标准方法检测(或者本文公开的方法),并且与在所述培养的细胞群体(成为特定的细胞类型)中的一个或多个细胞一致。总之,所述术语细胞“标记物“或者”生物标记物“是指在本文所描述的细胞群体中表达的分子,所述分子通常通过天然细胞表达。所述标记物可以是由所述细胞或者在染色体上可识别的物理位点(如基因、限制性核酸酶切识别位点或者天然细胞表达的编码多肽的核酸(如mRNA)表达的多肽。所述标记物可以是基因的表达区域,称为“基因表达标记物”、或者不具有已知编码功能的一些DNA片段。
所述术语“平滑肌细胞标记物”通常是指标记物,其在培养的细胞群体中的表达或存在可以通过标准方法(或本文公开的方法)检测,并且它和成为平滑肌细胞的培养细胞群体中的一个或多个细胞一致。总之,所述术语平滑肌细胞(SMC)“标记物”或者“生物标记物”是指通常由天然平滑肌细胞表达的分子。通过本发明考虑的这种标记物包括但不限于,一种或多种以下的:心肌素、α-平滑肌肌动蛋白、调宁蛋白、肌球蛋白重链、BAALC、肌间线蛋白、肌成纤维细胞抗原、SM22、和其任意的组合。
所述术语“呼吸细胞标记物”通常是指DNA、RNA、蛋白质、碳水化合物或者基于糖脂的分子标记物,他们在培养细胞群体中的表达或存在可以通过标准方法(或者本文公开的方法)检测,并且其与培养的细胞群体(将成为呼吸细胞)中的一个或多个细胞一致。总之,所述术语呼吸细胞“标记物”或者“生物标记物”是指通常由天然呼吸细胞表达的分子。所述标记物可以是由所述细胞或者在染色体上可识别的物理位点(如基因、限制性核酸酶切识别位点或者所述SMC表达的编码多肽的核酸)表达的多肽。所述标记物可以是基因的表达区域,称为“基因表达标记物”、或者不具有已知编码功能的一些DNA片段。由本发明考虑到的这种标记物包括但不限于,一种或多种以下的:Clara细胞分泌蛋白(CCSP);前表面活性蛋白C(ProsurfactantProteinC)(PPC);KRT18;分泌球蛋白、家族1A、成员1(子宫球蛋白或者SCGB1A1);表面活性蛋白A1(SFTPA1);及其任意的组合。
所述术语“胃肠道细胞标记物”通常是指DNA、RNA、蛋白质、碳水化合物或者基于糖脂的分子标记物,他们在培养细胞群体中的表达或存在可以通过标准方法(或者本文公开的方法)检测,并且其与培养的细胞群体(将成为胃肠道细胞)中的一个或多个细胞一致。总之,所述术语胃肠道细胞“标记物”或者“生物标记物”是指通常由天然胃肠道细胞表达的分子。所述标记物可以是由所述细胞或者在染色体上可识别的物理位点(如基因、限制性核酸酶切识别位点或者所述胃肠道细胞表达的编码多肽的核酸)表达的多肽。所述标记物可以是基因的表达区域,称为“基因表达标记物”、或者不具有已知编码功能的一些DNA片段。这些现有技术中普通技术人员可以理解到合适的胃肠道细胞标记物。
所述术语“食管道细胞标记物”通常是指DNA、RNA、蛋白质、碳水化合物或者基于糖脂的分子标记物,他们在培养细胞群体中的表达或存在可以通过标准方法(或者本文公开的方法)检测,并且其与培养的细胞群体(将成为食管细胞)中的一个或多个细胞一致。总之,所述术语食管细胞“标记物”或者“生物标记物”是指通常由天然食管细胞表达的分子。所述标记物可以是由所述细胞或者在染色体上可识别的物理位点(如基因、限制性核酸酶切识别位点或者所述食管细胞表达的编码多肽的核酸)表达的多肽。所述标记物可以是基因的表达区域,称为“基因表达标记物”、或者不具有已知编码功能的一些DNA片段。这些标记物可以是食管平滑肌细胞标记物,包括但不限于,一种或多种以下的:心肌素,α-平滑肌肌动蛋白、调宁蛋白、肌球蛋白重链、BAALC、肌间线蛋白、肌成纤维细胞抗原、SM22、及其任意的组合。这种标记物可以是食管上皮细胞标记物,包括但不限于一种或多种以下物质:KRT8(角蛋白8),vWF(vonWillebrand因子),细胞角蛋白8、18、19,及其任意的组合。
所述术语“源自脂肪的平滑肌细胞标记物”或者“Ad-SMC标记物”是指在本文所描述的细胞群体中,在基因和/或蛋白质水平表达的标记物。基于观察到的蛋白质表达,所述细胞群体可以具有特定的细胞表面标记物性能,其中标记物被指定为阳性或阴性(对于在所述细胞表面上的蛋白表达)。对于阳性标记物,蛋白表达可以被观察到在约80%、约90%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%或者约100%。对于阴性标记物,蛋白表达可以被被观察到在约20%、约15%、约10%、约5%、约4%、约3%、约2%、约1%或者约0%。
所述术语“差异表达基因”、“差异基因表达”和他们交换使用的同义词,是指这种基因:他们在第一细胞或细胞群体中的表达被激活到较高或较低的水平(相对于它们在第二细胞或细胞群体中的表达)。所述术语也包括这种基因:它们在培养中的第一或第二细胞的传代过程中、随时间推移的不同阶段的表达被激活到较高或较低的水平所述术语。也可以理解:差异表达基因可以是在核酸水平或蛋白质水平的被激活的或者被抑制的,或者可能会经历可变剪接而导致不同的表型产物。这种差异的表现可能是:mRNA水平、表面表达、分泌或者其它多肽分割的变化。差异基因表达可以包括比较在两种或多种基因之间或者他们的产物之间的表达,或者比较在两种或多种基因或者他们的产物之间的表达比率,或者甚至比较相同基因两个不同的加工产物(其在所述第一细胞和所述第二细胞之间具有变化)。差异表达包括定量的以及定性的差异,在时间上或细胞表达模式上,在基因或者它的表达产物之间,例如所述第一细胞和所述第二细胞之间。为了本发明的目的,“差异基因表达”被认为存在,当存在至少约1倍,至少约1.5倍,至少约2倍,至少约2.5倍,至少约3倍,至少约3.5fold,至少约4倍,至少约4.5倍,至少约5倍,至少约5.5倍,至少约6倍,至少约7倍,至少约8倍,至少约9倍,至少约10倍,至少约10.5倍,至少约11倍,至少约11.5倍,至少约12倍,至少约12.5倍,至少约13倍,至少约13.5倍,至少约14倍,至少约14.5倍,或者至少约15倍的差异,在给定基因在所述第一细胞和所述第二细胞之间的表达,或在培养细胞的传代过程中的不同阶段。所述标记物的表达差异可以是在源自脂肪的细胞(所述第一细胞)中相对于在间质干细胞或MSC(所述第二细胞)中的表达。
所述术语“抑制”、“下调”、“下表达(under-express)”被可交换使用,并且意思是:基因的表达、RNA分子或者编码一种或多种蛋白质或蛋白质亚单位的等价RNA分子的水平、或者一种或多种蛋白质或蛋白质亚单位的活性,相对于一种或多种对照(例如,一种或多种阳性和/或隐性对照)被降低。所述下表达可以是在源自脂肪的细胞中(相对于在MSC中的表达)。
使用的所述术语“上调”或者“过表达(over-express)”意思是基因的表达,或者RNA分子的水平或者编码一种或多种蛋白质或蛋白质亚单元的等价RNA分子的水平、或者一种或多种蛋白质或蛋白质亚单元的活性,相对于一种或多种对照(例如一种或多种阳性的和/或阴性的对照)被提高。所述过表达可以是在源自脂肪的细胞中(相对于在MSC中的表达)。
所述术语“收缩功能”是指平滑肌细胞收缩功能,涉及滑动肌动蛋白和肌球蛋白丝的相互作用,它是由肌球蛋白的钙激活的磷酸化所引发,从而完成依赖细胞内钙水平的收缩。
所述术语“协调有节奏的收缩功能”或者"CRCF″是指细胞或者细胞群体的收缩功能,其特征在于周期性的收缩和放松模式。这种协调有节奏的收缩可以在本文所描述呼吸组织结构中观察到,例如在本文所描述的培养条件下的维持所述结构以后。
所述术语“接触依赖性抑制”是指当两个或多个细胞彼此接触时,细胞生长停止。与在转化的细胞培养物中的集落形成相似,可以观察到细胞生长没有被接触抑制的细胞在彼此的顶部上堆积,不能在这种细胞培养物中观察到“接触依赖性抑制”的属性。骨髓间充质干细胞不具有这个属性。与此相反,具有接触-依赖性抑制性的细胞将在培养时不会被观察到在彼此的顶部上堆积。
所述术语“外周血”通常是指在整个身体循环的血液。
所述术语“脂肪组织”或者脂肪,通常意思是松散结缔组织,其主要由脂肪细胞组成。脂肪组织可以从在身体中的多个位点获得,所述位点包括但不限于,皮肤下方(皮下脂肪)和周围的内脏器官(内脏脂肪)。
所述术语“管腔器官”或“组织构造”通常是指器官或其部分,其特征具有外的、外部的侧面和内部的、管腔的侧面。所述器官或组织构造可以是层状地组织地。例如,所述泌尿膀胱的壁包括大量层状组织的层。它具有移行上皮黏膜组成的内衬、称为黏膜下层的第二层(支持具有弹性纤维的结缔组织组成的黏膜)、以及称为由平滑肌组成的肌层的第三层。在另一个实施例中,天然血液血管具有多层的或层状的结构。动脉具有三层:最内层称为内膜(intima),包括排列在管腔表面的血管内皮细胞;中间层称为中膜(media),包括多层平滑肌细胞的薄片;以及最外层,称为外膜(adventia),其含有松散结缔组织、较小的血管和神经。所述内膜和中膜通过基底膜分离。在现有技术中的本领域技术人员将能理解不同的管腔器官和组织构造。
所述术语“结构”是指至少一个细胞群体,其沉积在支架或模型的第一表面上或其中,所述支架或模型由合成的或者天然发生的生物材料组成。所述细胞群体可以是支架或模型在体内或在体外结合。
所述术语“管腔器官结构”或者“管腔器官组织构造结构”是指至少一个细胞群体,其沉积在支架或者模型的表面上,所述支架或者模型由一种或多种合成的或天然发生的生物材料组成。在一个实施方案中,所述支架或者模型被形成以符合受试者天然管腔器官或组织构造的至少部分。所述受试者可以是需要重建、再生、扩大或替换天然管腔器官或组织构造的。所述细胞群体可以是平滑肌细胞群体(例如源自脂肪SMC群体或者源自外周血的SMC群体)。所述细胞群体可以在体内或者在体外与支架或者模型结合。
所述术语“呼吸组织结构”是指由支架和一种或多种细胞群体(例如源自脂肪的SMC群体和/或呼吸细胞群体)组成的结构。所述结构可以是在至少一种细胞群体的沉积后进行培养,并且在沉积第二细胞群体后进一步培养。所述第二细胞群体可以接触所述支架和/或所述沉积的第一细胞群体。
所述术语“样品”和或“患者样本”或“生物样本”通常意思是从个体、人体液体、人体组织、细胞系、组织培养物或其它来源获得的生物样品。所述术语包括人体液体,如血液(如外周血或静脉血)、尿液和或其它生物来源的液体(例如脂肪组织)样品;以及固体组织活检,例如活检样本(例如脂肪组织活检),或组织培养物或来源其的细胞,以及它们的后代。所述定义也包括样品,其在它们从来源获得后以任意的方式被操作,例如通过试剂处理、溶液化或者某种成分的富集(例如蛋白质或者聚核苷酸)。所述定义也包括临床样品,也包括在培养基、细胞悬浮液、细胞裂解液、血清、血浆、生物液体和组织样品中的细胞。所述样品的来源可以是固体组织,例如来自新鲜的、冻结的和/或贮存的器官或组织样品或活检或抽吸物,血液或任意血液成分;人体液体,例如脑脊髓液、羊水、腹膜液、或间质液;来自所述受试者发育中任何时间的细胞。所述生物样品可以含有不是天然存在的复合物,具有或在组织中存在:如防腐剂,抗凝血剂,缓冲液,固色剂,营养物,抗生素,或类似的化合物。所述样品可被用于诊断或监测分析。用于从哺乳动物获取样本的方法在本领域中公知的。如果所述术语“样品”单独使用,它仍然意味着“样品”是“生物样品”或“患者样品”,即,所述术语可以互换使用。样品也可能是测试样品。
所述术语“测试样品”是指来自在植入本文所描述的结构后的受试者的样品。所述测试样品可以来源于多种在所述哺乳动物受试者中的来源,包括但不限于血液、血清、尿液、精液、骨髓、黏膜、组织等。
所述术语“对照”或者“对照样品”是指阴性对照,其中预期的阴性结果有助于联系在所述测试样品中的阳性结果。可选择地,所述对照可以是阳性对照,其中预期的阳性结果有助于与在所述测试样品中的阴性结果联系。适合本发明的对照包括,但不限于,已知具有正常水平的细胞因子的样品,从已知没有被植入本文所述结构的哺乳动物受试者获得的样品,以及从已知正常的哺乳动物受试者获得的样品。对照也可以是从在植入本文所描述的结构之前的受试者获得的样品。另外,所述对照可以是含有正常细胞的样品,其与在所述测试样品中含有的细胞具有相同的来源。本领域技术人员可以理解其它适合于本发明的对照。
所述术语“受试者”的意思是任意单个的人体受试者,包括符合治疗条件的患者,其正在经历或具有一种或多种体症、症状或其它缺陷器官功能或故障的迹象,包括缺陷、损坏或者非功能性器官。这种受试者包括,但不限于,最新诊断或预先诊断的受试者,并且现在正经历重发或复发,或不管何种原因正处于缺陷器官功能或故障的危险期。所述受试者可以已经预先治疗缺陷器官功能或故障相关的疾病,或者没有被治疗。
所述术语“患者”是指任意单个的动物,更优选的,需要治疗的哺乳动物(包括非人类动物,例如狗、马、兔、动物园动物、牛、猪、羊和非人类灵长类)。最优选的,所述患者是人类。
所述术语“尿流改道”或者“导管”是指最终器官或组织构造,所述最终器官或组织构造由所述受试者在一段时间内与植入的尿流改道结构、吻合的输尿管和任选的附加的内腔相互作用而产生。所述内腔是与连接房室的前部,其允许尿液通过所述腹壁,并且可以由腹膜包裹的最前部的管道样的部分制备,将所述结构的尾端(定位在所述腹腔内部)与所述皮肤连接。
所述术语“尾端的”和“颅端的”是关于尿生产和流体的描述性术语。所述术语“尾端的”是指所述尿流改道结构在植入后接近所述造口的一端,同时,所述术语“颅端的”是指所述尿流改道结构在植入后接近所述肾脏和输尿管的一端。所述尾端的可以指植入结果的所述“造口端的”或者“流出的”一端。
所述术语的“碎屑(detritis)”是指在植入尿流改道结构后发生的愈合和再生过程中形成的碎片。碎屑可以由脱落的组织细胞、炎性渗出物和支架生物降解物组成。如果所述导管被这些碎片阻塞(不当流出),那么所述淤塞的碎片在所述导管的管腔形成碎屑或半固体团块。
所述术语“清创术”是指手术的或者非手术的去除外源物质、或者来自导管撕裂的、衰弱的、污染的或者死亡的组织,以防止感染、防止阻塞和促进所述愈合过程。所述清创术可以包括碎屑的去除。
所述术语“造口”是指手术创建的开口,用于尿液从尿流改道结构的排泄外流端通过流到人体的外部。所述尿液通常在体外的蓄水库收集。
所述术语“造口端口”或者“造口纽扣”是指意思是,例如用于维持所述造口开口完整的装置。在一个实施方案中,所述造口端口促进尿液从尿流改道结构的排泄外流端通过流出到所述受试者身体的外部。在另一个实施方案中,所述造口端口的管腔可以用来连接与支架(支架系带)连接的缝合股,所述缝合股设置在一个或两个输尿管中,如此以避免支架迁移,并允许稍后去除支架。
本文使用的所述术语“扩大”或“放大”是指增加存在的层状组织的管腔器官或组织构造的尺寸。例如,在本发明一方面中,所述存在的层状组织的管腔器官或组织构造可以放大,以百分之10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、或29。在本发明的另一方面中,所述存在的层状组织的管腔器官或组织构造可以放大,以增加所述存在的层状组织的管腔器官或组织构造的容积。
本文所是使用的所述术语“容积”是指能够容纳在限定的区域内的液体的数量。
“再生预后”或者“再生的预后”通常是指预期或者预测植入本文所描述的结构后可能的过程或结果。如本文所使用的,再生预后包括预期或预测功能性器官或组织构造在植入本文所描述结构后的发育或完善。如本文所使用的,“预后再生”意思是提供植入新器官或者组织构造后可能的过程或结果的预期或预测。
“再生组织”指的是新的器官或组织构造的组织,其在植入本文所描述的结构后发育。
2.细胞群体
本发明提供的平滑肌细胞的群体,用于重建、再生、扩大或替换一个或多个以下:层状组织管腔器官或组织构造,其中所述平滑肌细胞不是源自器官或组织构造,所述器官或组织构造属于所述受试者再生、重建、扩增或替换的;呼吸组织,其中所述平滑肌细胞不是源自呼吸组织;胃肠道组织,其中所述平滑肌细胞不是源自GI组织;血管,其中所述平滑肌细胞不是源自天然血管。所述SMC群体其特征在于收缩功能以及对一个或多个平滑肌细胞标记物为阳性。
如本文所讨论的,组织工程原理已被成功地应用于提供可植入的细胞接种模型,用于层状组织管腔器官和组织构造的重建、扩大或替代,如膀胱或膀胱元件,通常由尿路上皮和平滑肌层组成。(Becker等Eur.Urol.51,1217-1228(2007);Frimberger等Regen.Med.1,425-435(2006);Roth等Curr.Urol.Rep.10,119-125(2009);Wood等Curr.Opin.Urol.18,564-569)。平滑肌细胞可源自所述患者自身组织或合适供体的所述组织。不过,也有依赖于来自主要器官位点的细胞培养系统的发育与维持相关的挑战,例如在癌变膀胱组织的治疗过程中,用于发育新器官和健康工程组织的所述基本单元。显然,来自患者的癌细胞不适合于增殖可植入的新膀胱支架或模型。此外,来自供体的细胞供应及获取活检的难易程度可以为限制因素。
本发明提供的细胞群体源自与所述器官或组织构造不同的来源,所述器官或组织构造为所述重建、扩大或替换的所述受试者的。在一个实施方案中,所述来源为非自体来源。所述非自体来源可能为同种异体的、同源的(自体或同基因的)、或其任意组合。在另一实施方案中,所述来源为自体的来源。
在另一方面中,所述细胞群体表达标记物与平滑肌细胞群体一致或其典型。
在一方面中,所述来源为外周血。在一个实施方案中,所述外周血来源的平滑肌细胞群体来自合适的供体。所述供体样本可能为静脉血液。
在一方面中,所述来源为脂肪组织。在一个实施方案中,所述脂肪组织来源的平滑肌细胞群体来自合适的供体样品。所述供体样品可能为腹部去脂术或脂肪吸收过程中除去的脂肪组织。
在又一其它实施方案中,所述分离的本发明的细胞群体,培养后,可以发育各种平滑肌细胞,其特征包括但不限于,丘陵和山谷形态,表达一个或多个平滑肌肉细胞标记物,收缩功能,形成纤维,和细胞因子的合成。
在一方面中,所述培养的细胞群体的特征在于其丘陵和山谷形态。所述细胞具有丘陵和山谷的形态,可能具有各种特性,包括但不限于,细长的,扁平的和传代后的成纤维样的,加长的和平行布置的,“陀螺”的增长外观,及其任意组合。在一个实施方案中,在适当的培养基中培养后,所述细胞群体发育出了“丘陵和山谷形态”,其为典型培养的平滑肌细胞。
另一方面,所述培养的细胞群体其特征在于,存在一个或多个平滑肌细胞标记物。在一个实施方案中,在适当的介质中培养所述细胞群体后,开发检测平滑肌细胞的标记物,包括但不限于一个或多个下列:心肌素、α-平滑肌肌动蛋白、调宁蛋白、肌球蛋白重链、BAALC、结蛋白、肌成纤维细胞抗原、SM22,及其任意组合。
在另一方面中,所述培养的细胞群体的特征在于存在一个或多个细胞表达一个或多个细胞表面标记物。在一个实施方案中,在适当的培养基中培养的所述细胞群体后,包含一个或多个对细胞表面标记物为阳性的细胞,包括但不限于,一个或多个下列的:CD73、CD90、CD105、CD166、CD31、CD54、CD56、CD117,及其任意组合。对细胞表面标记物为阳性的细胞群体,可能在基因表达水平和/或蛋白表达水平(见实施例3)上为阳性。例如,所述细胞群体可能证明CD73在所述基因水平上表达,但不在蛋白质水平上表达,而CD45可能证明在基因和蛋白水平上表达。在另一实施方案中,在适当的培养基中培养的所述细胞群体包含一个或多个细胞,其为:CD45+、CD31+、CD54+、CD56+、CD90+,和CD105+。在另一实施方案中,所述细胞群体具有细胞表面标记物配置,其为:CD31+、CD73-、CD90+、CD105+、CD117+,CD133-。所述细胞表面标记物配置还可以包括一个或多个CD45+、CD166+、CD54+,和/或CD56+。
在另一方面,所述培养的细胞群体其特征在于存在一个或多个具有收缩功能的细胞。在一个实施方案中,在适当的培养基中培养的所述细胞群体发育收缩功能。在另一实施方案中,所述收缩功能是钙依赖的。在一个其它的实施方案中,通过钙离子螯合剂抑制收缩来证实其所述钙依赖性收缩功能。在另一实施方案中,所述钙离子螯合剂为EDTA。那些在本技术领域的普通技术人员将会理解,在本领域中已知的其它螯合剂可能是合适的。
在另一方面中,所述培养的细胞群体的特征在于丝的形成。在一个实施方案中,在丝形成后,在适当的培养基中培养所述细胞群体。
在一方面中,该细胞群体的包括表达一个或多个细胞因子的至少一个细胞。在一个实施方案中,所述细胞因子选自MCP-1、制瘤素M、IL-8,和GRO。
在一方面中,本发明的所述细胞群体在分离后具有有限的的培养增殖寿命。在其它实施方案中,该细胞群体具有的寿命约1代,约2代,约3代,约4代,约5代,约6代,约7代,约8代,约9代,约10代,约11代,约12代,13代,14代,约15代,约16代,约17代,或18代。在一个优选的实施方案中,该细胞群体具有不超过5代的培养寿命。所述脂肪来源的SMC在每代之间一般可以培养3-5天,而且血液来源的SMC在所述第一代之前,一般可以培养14天,然后附加代(更多详细信息,见实施例1)可以培养3-5天。
在一方面中,本发明提供了再生细胞群体,当沉积在如本文所述的支架或模型上时含有至少一个再生细胞,并植入到需要的受试者中,为所述器官或组织构造提供了再生效果,所述器官或组织构造为本文所述重建、扩大、或替换的所述受试者的。再生细胞群体具有植入有需要的患者后激发或启动层状组织管腔器官或组织构造再生的能力。在一般情况下,所述器官或组织构造的再生,其特征在于通过所述细胞成分,组织组成和体系结构、功能和调节发育的恢复。另外,再生的细胞群体最大限度地减少趋向于发生在植入的细胞接种管腔器官或组织构造结构部位的不完整或疾病。在所述植入部位的组织破坏可表现自身为增加胶原蛋白沉积和/或形成瘢痕组织,可以通过使用再生细胞群体使其每一个被最小化。此外,某些细胞活动指示的再生过程。在使用本文所述的细胞群体和支架来再生膀胱或膀胱部分所述情况下,再生器官或组织构造由平滑肌实质的维管组织(辐射围绕众多微血管延伸朝向管腔表面)组成,以及基质元素具有发达的血管与黏膜表面对齐(见Jayo等(2008)RegenMed3,671-682)。再生膀胱或膀胱部分,其的特征还在于存在纺锤/间充质细胞和αSMA阳性肌前体细胞。在一个实施方案中,在新基质组织和多个新血管(动脉)周围观察到所述αSMA阳性纺锤细胞。
所述再生细胞群体有能力刺激或引发不同器官或组织构造再生,包括但不限于,胃肠器官或组织构造,如食管、小肠、大肠、胃、结肠、或肛门括约肌;呼吸器官或组织构造,例如,肺,肺组织包括肺泡和细支气管组织;血管。在一个实施方案中,所述再生的细胞为脂肪来源的平滑肌细胞,其利于细胞成分、组织的组织和体系结构、和/或器官或组织构造的功能的恢复。在另一实施方案中,所述再生的细胞不是干细胞。
在另一方面中,所述再生细胞群体提供了再生的作用,其特征在于所述适应性调节还原的层状组织管腔器官或组织构造的大小。在一个实施方案中,所述再生细胞群体的再生作用是建立对受试者具有特异性的适应性调节,所述受试者接收接种所述再生细胞群体的所述支架或模型。在一个实施方案中,所述适应性调节使用本文所述的结构替换或扩大受试者的膀胱,使得所述新膀胱生长和发育到与受试者身体大小成正比的尺寸。
在一个实施方案中,所述细胞群体能够再生刺激MCP-1产生细胞群体,其中包含至少一个表达所述趋化因子的细胞产生MCP-1。所述细胞因子MCP-1为膀胱逼尿肌细胞的正常产物。在主动脉平滑肌细胞中,它在再生中起到了重要作用,及其招募单核细胞的能力是众所周知的。然而,它不止是趋化因子;它也是一种有效的血管平滑肌细胞增殖的有丝分裂原以及招募循环单核细胞到血管损伤区域。单核细胞通常转化为巨噬细胞,其可以作为细胞因子和生长因子的储藏。巨噬细胞和肌肉前体细胞二者目标为MCP-1信号。此细胞因子在体内有牵连的干细胞和祖细胞招募,可能有助于再生过程。在一个实施方案中,能够再生刺激的所述细胞群体为产生MCP-1的细胞群体,其中包含至少一个细胞表达趋化因子产物MCP-1。MCP-1再生刺激,其特征在于招募某些类型的细胞到所述植入部位。在一个实施方案中,MCP-1招募肌肉祖细胞到所述植入部位以在所述新膀胱内增殖。在另一实施方案中,MCP-1招募单核细胞到植入部位,进而产生各种细胞因子和/或趋化因子,以促进再生过程。在一个实施方案中,MCP-1诱导的大网膜细胞发育成肌肉细胞。
在一方面中,本发明提供了使用特定的细胞因子,如MCP-1,作为替代标记物用于组织再生。这样的标记物在功能是否被改组的基础上可用于结合评估再生。在再生过程中的时间内监测替代标记物,也可以作为再生的预后指标。
在另一实施方案中,所述细胞群体为纯化的细胞群体。如本文所述的纯化细胞群体,其特征在于基于一个或多个形态的表型,标记物的所述表达,和功能。所述表型包括但不限于,一个或多个丘陵和山谷形态,表达一个或多个平滑肌细胞标记物,细胞因子的表达,培养中有限的增殖寿命,收缩功能,以及诱导长丝形成的能力。所述表型可包括本文所述的其他功能或那些在本技术领域的普通技术人员所知的。在另一实施方案中,所述纯化群体基本上为均匀的平滑肌细胞群体,如本文所述。纯化的群体,其基本上是均匀的,通常至少约90%是均匀的,如根据一个或多个形态,标记物的表达,和功能来判断的。在其它实施方案中,所述纯化的群体至少约95%是均匀的,至少约98%是均匀的,或至少约99.5%是均匀的。
在另一实施方案中,所述平滑肌细胞群体直接源自人类脂肪组织,其特征在于差异表达以下的一个或多个:骨桥蛋白、Oct4B、生长分化因子5(GDF5)、肝细胞生长因子(HGF)、白血病抑制因子(LIF)、黑色素瘤细胞粘附分子(MCAM)、血管细胞粘附分子1(VCAM1)、PECAM、vWF、FLK-1、runt-相关转录因子2(RUX2)、骨形态发生蛋白6(BMP6)、CD44,和IL-IB,相对其在人骨髓源的间充质干细胞(MSC)的表达水平。在另外一个实施方案中,所述SMC群(a)低量表达一个或多个GDF5、HGF、LIF、MCAM、RUNX2、VCAM1、PECAM,vWF和Flk-1和/或(b)过量表达的一个或多个Oct4B、骨桥蛋白、BMP6、CD44,和IL-IB,相对于其在人骨髓来源的MSCs的表达水平。在另外一个实施方案中,所述SMC群(a)低量表达所有的GDF5、HGF、LIF、MCAM、RUNX2、VCAM1,PECAM和vWF,和Flk-1和/或(b)过量表达的所有的Oct4B、骨桥蛋白、BMP6,CD44和IL-IB,相对于其在人骨髓来源的间充质干细胞的表达水平。
在另一实施方案中,所述平滑肌细胞群体直接源自于脂肪组织,所述平滑肌细胞群体包括一个或多个CD45+细胞和/或一个或多个CD117+细胞。
在其它实施方案中,本发明提供了平滑肌细胞群体,直接源自人体脂肪组织,比人类骨髓来源的MSC具有较短的增殖寿命。在另一实施方案中,所述SMC群在培养中显示出接触依赖性抑制增殖。在另外一个实施方案中,所述SMC群直接源自脂肪组织,其特征在于下调至少一个平滑肌细胞(SMC)标记以响应血栓素A2模拟物。在其它实施方案中,所述SMC标记选自心肌素和肌球蛋白重链-平滑肌同种型(SMMHC)。在另一实施方案中,所述心肌素和SMMHC是下调的,以响应血栓素A2模拟物。
在所有的实施方案中,所述SMC群源自自体来源或非自体来源。
在另一实施方案中,本发明的所述细胞群体可施用于具有疾病的受试者而不使用支架,如移植。那些在本领域的普通技术人员将理解移植的合适方法。
本发明提供平滑肌细胞群体从与所述管腔器官或组织构造不同的来源分离,所述管腔器官或组织构造为所述再生,重建,扩大或替换的受试者的。所述管腔器官或组织构造可能为膀胱或膀胱的部分,呼吸器官或组织构造,胃肠道器官或组织构造,血管器官或组织构造,例如,血管,或眼组织构造。因此,所述平滑肌细胞群体可能源自非膀胱、非呼吸、非胃肠道、非血管、或非眼来源。
本发明还提供了GI组织细胞群体,如源自所述食管的食管细胞群体。所述食管来源可能为自体源。在一个实施方案中,该细胞群体为异源性细胞群体。在另一实施方案中,所述异源细胞群体包括上皮细胞和/或平滑肌细胞。在另一实施方案中,所述食管细胞群体的特征在于存在一个或多个生物标记物。在另一实施方案中,该细胞群体具有可检测的上皮细胞标记物,包括但不限于,一个或多个以下:KRT8(角蛋白8)、vWF(vonWillebrand因子)、细胞角蛋白8、18、19,及其任何组合。在一个实施方案中,该细胞群体具有可检测的平滑肌细胞标记物,包括但不限于,一个或多个以下:心肌素、α-平滑肌肌动蛋白、调宁蛋白、肌球蛋白重链、BAALC、结蛋白、肌成纤维细胞抗原、SM22、及其任意组合。
本发明还提供了呼吸组织细胞群体,如源自肺(例如,全肺或肺活检)的细胞群体。所述来源可能为自体或非自体来源。在一个实施方案中,该细胞群体为异源性的细胞群体。在另一实施方案中,所述异源细胞群体可包括细支气管细胞、上皮细胞、肺泡细胞、Clara细胞,或其任意组合。所述呼吸细胞群体的特征在于细支气管细胞、上皮细胞、肺泡细胞、及其任意组合相关标记的表达。所述标记物包括一个或多个以下物质:Clara细胞分泌蛋白(CCSP)、Prosurfactant蛋白C(proSPC)、表面活性蛋白C(SPC)、KRT18、Secretoglobulin、家族1A、成员1(胚泡激肽)(SCGB1A1),和表面活性蛋白A1(SFTPA1)。(见实施例6-9)CCSP为为细支气管上皮细胞标记物,以及proSPC为肺泡上皮细胞标记物。KRT18为肺特异性细胞角蛋白和上皮细胞标记物。SCGB1A1(分泌球蛋白,家族1A,成员1(子宫球蛋白))为Clara细胞标记物。SFTPA1为肺泡上皮细胞标记物。所述呼吸细胞群体也可以为纯化的细胞群体。
本发明还提供了内皮细胞(EC)群体。此EC群体可用于血管的重建、扩大或替换。目前,直接从静脉或动脉获得细胞群体,以构建血管移植(Yang等AnnalsofPlasticSurgery:March2009-Volume62-Issue3-pp297-303)。内皮细胞可以从所述主动脉获得(CascadeBiologicis,C-006)。然而,获得合适的用于分离细胞群体的血管片段,从血管获得细胞的困难性,以及从每活检体获得的细胞的数目,为限制因素。这是有利的:从身体的其他部位获得细胞群体,其中细胞更丰富,更容易获得更大的数量。本发明提供的细胞群体源自非血管来源。所述来源可能为自体或非自体。所述细胞群体可能为平滑肌细胞(SMC)群体或内皮细胞(EC)群体。所述非血管来源可以为脂肪组织或外周血。所述SMC群体可以源自患者样本。所述患者样本可能为脂肪组织或静脉血。在一个实施方案中,所述非血管源可能为腹部去脂术或脂肪吸收过程中除去的脂肪组织。本发明考虑内皮细胞(EC)群体的使用来自非血管来源,其特征在于表达的基因为EC群体或与其一致。所述EC群体其特征可在于一个或多个所述下列CDH5/VECAD、vWF、PECAMl、FLT1/VEGFR、KDR/FLK1、TEK,及其任何组合中的差异表达。所述差异表达的基因可能为EC标记物。在另一实施方案中,在适当的培养基中培养的所述细胞群体开发的可检测的EC标记物,包括但不限于,一种或多种所述下列CDH5/VECAD、vWF、PECAMl、FLT1/VEGFR、KDR/FLK1、TEK,及其任何组合。在一方面中,所述培养的EC群体,其特征在于内皮形态。所述细胞表现出缩短的、圆形的或长方体形状。在实施例17中更详细地描述了EC群体。
在另一方面,本发明涉及源自膀胱组织的平滑肌细胞群体,用于层状组织管腔器官或组织构造重建、再生、增强或替换,其中所述平滑肌细胞源自非自体来源。所述非自体来源可能为异基因的或同基因的。
3.分离细胞群体的方法
自体细胞群体直接源自需要治疗的受试者。非自体细胞群体可能源自合适的捐赠者。所述源组织一般与需要治疗的器官或组织构造不同。细胞群体可以源自患者自身组织或供体组织,例如,脂肪或外周血。所述细胞可被分离活检。此外,所述细胞可以在使用前冻结或扩大。
为了准备构建细胞接种支架,从含有平滑肌细胞的合适的供体中获得的样品,被分解成合适的细胞悬液。已发行的美国专利号5,567,612(其全部内容通过引用的方式纳入本文)对分离和培养细胞的方法进行了讨论。分解所述细胞形成所述单细胞的阶段对于初始原代培养而言是没有必要的,因为一段时间后可得到单细胞悬浮液,例如,在体外培养一星期。可通过机械和酶破坏细胞外模型和将细胞维持一体的细胞间连接来进行组织分离。非自体细胞可以在体外培养,如果需要的话,可用于增加接种在支架上的细胞数。
可在接种遗传物质之前进行细胞转染。可在聚合物接种之前对平滑肌细胞转染特定的基因。所述细胞聚合物结构可携带遗传信息(所述宿主或所述组织工程新器官长期存活所需要)。
可以制备细胞培养物,带或不带细胞分级分离步骤。可以使用的细胞分级分离技术是那些在本技术领域技术人员已知的。也可以根据细胞的大小、DNA含量、细胞表面抗原、和生存能力进行细胞分级分离。例如,可从脂肪组织中富集平滑肌细胞,同时减少内皮细胞和脂肪细胞来收集平滑肌细胞。虽然也可以使用细胞分级分离,其没有必要用于本发明的所述实践中。
本文所述方法的另一种任选步骤为冷冻保存。低温保存可能是有用的,例如,减少多个侵入性外科手术的需要。取自受试者活体检查或样品的细胞可能被放大,而且所述放大细胞的一部分可以使用,而另一部分可低温法保藏。扩增并保存细胞的所述能力,可最大限度地减少外科手术所需的数量。低温保存效用的另一个例子为在组织库中。非自体细胞可以被存储,例如,在供体组织库中。由于新的器官或组织构造需要细胞,可以根据需要使用所述冷冻保存的细胞供应。可以初步确定合适的供体而且一个或多个活检可低温保藏。以后,如果受体的器官或组织构造在一些治疗方式下失败后,可解冻所述低温保存完好的非自体细胞并用于治疗。例如,如果经治疗后,肿瘤在受试者新的器官或组织构造中重新出现,低温保藏的细胞可用于重建所述器官或组织构造,而不需要源自供体的额外活检标本。
根据以下常规协议,平滑肌细胞可从脂肪或外周血中分离。可以得到合适的重量(例如,以克为单位)和/或面积(例如,平方厘米)的脂肪活检标本。在所述计划植入新的器官或组织的构造结构之前,可以得到适当体积的(例如,ml)外周血。
以下为协议的具有代表性的例子,其适合从脂肪的所述基质血管部分(SVF)(代表由多种类型细胞组成的异质细胞群体,包括内皮细胞和平滑肌细胞以及由国际细胞治疗协会(ISCT)标准(Domini等2006Cytotherapy8:4,315-317)定义的类MSC)分离平滑肌细胞。可通过活检并用PBS(例如,3次)洗涤,用解剖刀和剪刀切碎,转移到50mL锥形管中,并在胶原酶(例如,0.1至0.3%)(Worthington)溶液和1%BSA的DMEM-HG中37°C下温育60分钟,来获得脂肪组织合适的克重量(例如,7-25g)。可不断地震荡或定期摇动所述锥形管,以利于消化。可以在600g下进行10分钟离心分离,沉淀所述SVF,再悬浮于DMEM-HG+10%FBS中。然后,基质血管部分可用于接种零代。
以下为协议的具有代表性的例子,其适合从外周血中分离平滑肌细胞。合适体积的外周血(如25ml)可1:1稀释在PBS中,并在50mL锥形管中,用25ml的Histopaque-1077(Sigma)分层。在离心分离(如,800g,30分钟)后,可收集所述单核部分,用PBS洗涤一次,并再悬浮于α-MEM/10%胎牛血清(Invitrogen)中,以接种零代。
另一方面,本发明涉及从膀胱组织分离平滑肌细胞群体的方法,其用于重建、再生、扩大或替换层状组织管腔器官或组织构造,其中所述平滑肌细胞(SMC)源自非体源。所述非自体源可能为异基因或同基因的。那些在本领域的普通技术人员将理解从膀胱组织中分离SMC的协议。例如,示例性协议中见于:Bertram等,美国专利号7,918,897;Atala,美国专利号6,576,019;KimBS和AtalaA:Mesenchymalcellculture:smoothmuscle.In:MethodsofTissueEngineering.由AAtala和RPLanza.SanDiego编辑的:AcademicPress2002;pp287-292;以及LaiJY和AtalaA:Epithelialculture:urothelium.In:MethodsofTissueEngineering.由AAtala和RPLanza编辑的.SanDiego:AcademicPress2002;pp243-246,其中每一个的全部内容通过引用方式纳入本文。
那些本领域的普通技术人员将会理解用于分离平滑肌细胞的额外的方法。
在另一方面中,本发明提供了分离食管细胞群体的方法。以下为适合从所述食管组织中分离食管细胞的代表性的协议实施例。获得食管组织,并放置在DMEM+5μg/mL的庆大霉素(洗涤液(WashSolution))中并涡旋震荡5分钟。然后,将所述组织放入新鲜的洗涤液中。在将组织切碎至均匀大小之前,重复此过程1到5次。然后放置所述切碎的组织到含有消化溶液(DigestSolution)(具有300U/mL胶原蛋白酶TypeIV-Worthington/Dispase-Stem细胞在DMEM中;20mL/lg组织)的50mL离心管中。消化在37°C下进行30分钟。用20%FBS,在KSFM培养基中实现酶中和。然后混合所述消化的组织,并通过一个100uMSteriflip过滤器过滤,以确保没有大的组织片段转入。然后,所述材料在300g下离心5分钟以沉淀所述细胞。然后用KSFM洗涤所述细胞沉淀。然后计数所述细胞并铺板在生长培养基(KSFM+2%FBS或KGM(50:50的KSFM与附加物+DMEM10%FBS,含有Anti/Anti,1XITS)上(参见实施例12)。
另一方面,本发明提供分离呼吸道细胞群体的方法。实施例6提供了适合从肺组织分离呼吸道细胞的代表性的协议实施例。那些在本技术领域的普通技术人员将理解分离平滑肌、食管、呼吸道和胃肠细胞群体的附加方法。
在一方面中,本发明提供了从SVF分离平滑肌细胞群体的方法,而不需要诱导分化成平滑肌细胞的条件。在一个实施方案中,所述方法包括:a)获得脂肪组织,b)消化所述脂肪组织,c)离心所述消化的脂肪组织,提供基质血管部分(SVF),d)培养所述SVF,而不需要诱导分化成平滑肌细胞的条件,和e)从源自SVF的脂肪组织中分离平滑肌细胞群体。在一个实施方案中,所述培养步骤包括洗涤所述SVF,重新悬浮细胞培养基中的所述SVF,并平板涂覆重新悬浮的SVF。在另一实施方案中,所述培养步骤包括提供细胞群体,其粘结到所述细胞培养支持物,如板或容器。在另一实施方案中,所述方法进一步包括扩大培养的细胞群体。在其它实施方案中,所述方法进一步包括分析所述平滑肌细胞群体的平滑肌细胞特性。在一个实施方案中,所述脂肪组织源自非自体来源。
在一个实施方案中,所述培养条件不需要使用细胞培养成分诱导源自SVF脂肪组织的细胞群体分化成平滑肌细胞。Jack等,JBiomaterials30(2009)3529-3270报道,在含有肝素的诱导培养基上培养源自SVF的未分化的脂肪干细胞6个星期,以将干细胞分化成平滑肌细胞(见Rodriguez美国专利号7,531,355)。由Jack等报道的所述干细胞并不需要在此孵育期分裂。在另一实施方案中,所述培养条件不需要使用诱导介质,包括含有肝素的诱导介质。在另一个实施方案中,本发明的所述方法包括使用的培养条件不需要使用外源性生长因子将细胞群体分化成平滑肌细胞或用于培养和扩大细胞群体。
与其它报道的方法相比,本发明方法的优点包括删除了将脂肪干细胞分化成平滑肌细胞的步骤,从而减少在获得脂肪活检和从中分离平滑肌细胞群体之间的时间间隔。此外,删除了其它诱导分化的细胞培养基成分,如外源性生长因子,对于成本方面是有利的。
在另一方面,本发明提供了分离和培养平滑肌细胞群体的方法,其含有至少一个具有收缩功能的细胞,并且对一个或多个平滑肌细胞标记物为阳性。在一个实施方案中,所述方法包括以下步骤:从合适的供体中获得样品,其中所述样本不能从所述管腔内脏器官或组织构造中获得,所述管腔内脏器官或组织构造为在有需要其的受试者中重建、扩增或替换的所述目标。在另一实施方案中,所述方法包括从捐赠样本中获得平滑肌细胞的所述步骤。在另外一个实施方案中,所述管腔内脏器官或组织构造为膀胱或膀胱部分。在一个实施方案中,所述示例为非自体样品。在另一实施方案中,所述样品为外周血液样本。在又一实施方案中,所述样品为脂肪组织样品。所述脂肪组织可能为腹部去脂术过程中从受试者除去的组织。
在另一实施方案中,所述获得步骤之后为分离步骤。在外周血样品的情况下,所述分离步骤包括将所述样品与密度梯度材料接触,离心所述样品来确定具有单核部分的密度梯度,从所述密度梯度中提取单核部分。所述分离步骤之后为培养步骤,在该步骤中对所述提取部分的细胞进行培养。
在所述脂肪组织样品的实例中,所述纯化步骤包括用胶原酶消化样品,离心消化的样品,将离心样品混合以从原代脂肪细胞中分离基质细胞,离心分离所述混合样品获得基质血管部分,可以重新悬浮用于随后的培养。
在一个方面中,本发明提供了未经使用诱导细胞培养基提供分离平滑肌细胞(SMC)群体的方法。在一个实施方案中,该方法包括以下步骤:a)获得脂肪组织活检,b)酶促消化所述脂肪组织,c)离心所述消化的脂肪组织,以提供一种包含异质性细胞群体的基质血管部分(SVF),d)洗涤和平板涂覆所述异质性细胞群体,e)未经使用平滑肌细胞分化诱导介质,培养所述细胞群体,f)从所述培养的细胞中分离出完全分化的SMC群体。
在另一实施方案中,所述培养步骤e)包括选择贴壁于细胞培养支持物的细胞。在另一实施方案中,所述培养步骤e)不包括使用含有外源性生长因子的细胞培养基。在一个实施方案中,所述培养方法包括使用的细胞培养基含有最小必需培养基(例如,DMEM或-MEM)和胎牛血清(例如,10%FBS),由本领域那些普通技术人员已知的标准条件。在另一个实施方案中,所述平滑肌细胞群体不是来源自脂肪的干细胞群体。在一个其它实施方案中,平滑肌细胞群体不是间充质干细胞群体。
在另一个方面中,本发明提供了分离和培养内皮细胞群体的方法。EC群体的特征在于,存在的细胞表现出缩短的内皮样形态、圆形的或长方体形状。所述EC群体含有的细胞对一个或多个内皮细胞标记物为阳性。在一个实施方案中,所述方法包括以下步骤:从有需要重建、扩增或替换血管的患者获得样品,其中样品从非血管源获得。在另一实施方案中,内皮细胞源自患者身上获得的样品。在一个实施方案中,所述样品对患者为自体或非自体。在另一实施方案中,所述样品为外周血样品。在又一实施方案中,所述样品为脂肪组织样本。所述脂肪组织可以是腹部去脂术过程中从受试者除去的组织。
在另一实施方案中,所述获得步骤之后为分离步骤。在外周血样品的所述实例中,所述分离步骤包括将所述样品与密度梯度材料接触,离心样品来确定单个分离频带中产生的细胞的密度梯度,从密度梯度中提取和洗涤细胞的分离频带。所述分离步骤之后为培养步骤,在该步骤中对所述提取部分的细胞进行培养。在脂肪组织样本的实例中,所述纯化步骤包括用胶原酶消化所述样品,离心消化的样品,混合离心样品以从原代脂肪细胞中分离基质细胞,离心所述的混合样品以获得基质血管部分,其可以重新悬浮用于随后的培养。
在一方面中,本发明提供了分离内皮细胞(EC)群体的方法。已成功地从外周血和脂肪源分离出内皮细胞(Daiju等,2005.Circulation111:926-931;Shepherd等,2006.TheFASEBJ.20:El124-El132;melero-MartinJM等,2007.Blood109(11):4761-4768;Kern等,1983.J.Clin.Invest.71:1822-1829;Planat-benardV等,2004.Circulation109:656-663)。
在一个实施方案中,本发明提供了从非血管源分离EC的方法。所述血管源可以是外周血,而且实施例17提供了用于获得EC的示例性协议。所述非血管源可以是脂肪组织,在其实例中,所述方法可以包括一个或多个以下步骤:a)获得脂肪组织活检,b)酶消化所述脂肪组织,c)离心分离所述消化脂肪组织以提供基质血管部分(SVF),其包含异质性群体的细胞,d)洗涤和平板涂覆所述异质性细胞群体,e)在细胞培养基中以VEGF培养细胞群体,f)从所述培养的细胞中分离EC群体。在另外一个实施例中,所述培养步骤e)包括选择贴壁于细胞培养支持物的细胞。以下的实施例17提供了从脂肪组织中分离内皮细胞示例方法的附加信息。
在一个实施方案中,所述培养方法包括:使用含有最小必需培养基(例如,DMEM、α-MEM、或EGM-2(CambrexBioScience))和胎牛血清(例如,10%FBS的细胞培养基),由本领域那些普通技术人员已知的标准条件。在另一实施方案中,所述内皮细胞群体不是脂肪来源的干细胞群体。在另外一实施方案中,内皮细胞群体不是间充质干细胞群体。实施例17描述了获得EC群体的示例性协议。
4.支架
如Atala美国6576019(其全部内容通过引用的方式纳入本文)中描述的,支架或聚合物模型可以由各种不同的材料组成。一般地,生物相容材料及尤其是可生物降解材料是本文所述的构建支架的优选材料。所述支架为可植入的、生物相容的、合成的或天然的聚合物模型,至少具有两个独立的表面。所述支架被形成以符合有需要或治疗的管腔器官或组织构造的至少部分。所述生物相容性材料为可生物降解的。
生物相容性是指对生物学功能不具有毒或有害影响的材料。可生物降解是指材料可被患者身体吸收或降解。可生物降解材料的实例包括,例如,可吸收缝合线。用于形成支架的代表性材料包括天然的或合成聚合物,例如,胶原蛋白,聚(α-羟基酯),如聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚原酸酯和聚酐及其共聚物,其被以可控制的速率水解降解和被再吸收。这些材料为可降解性,可管理性,大小和配置提供了最大程度的控制。优选的可生物降解的聚合物材料包括:聚乙醇酸和丙交酯乙交酯共聚酯/物纤维(polyglactin),开发的如可吸收的合成缝合材料。聚乙醇酸和丙交酯乙交酯共聚酯/物纤维可由生产商提供。其它支架材料包括纤维素醚、纤维素、纤维素酯、氟化聚乙烯、聚-4-甲基戊烯、聚丙烯腈、聚酰胺、聚酰胺酰亚胺、聚丙烯酸酯、聚苯并恶唑、聚碳酸酯、聚芳醚腈、聚酯、聚酯碳酸酯、聚醚、聚醚醚酮、聚醚酰亚胺、聚醚酮、聚醚砜、聚乙烯、聚氟烯烃、聚酰亚胺、聚烯烃、聚恶二唑、聚苯醚、聚苯硫醚、聚丙烯、聚苯乙烯、聚硫化物、聚砜、聚四氟乙烯、聚硫醚、聚三唑、聚氨酯、聚氯乙烯、聚偏二氟乙烯、再生纤维素、硅树脂、脲-甲醛,或共聚物或这些材料的物理共混物。所述材料可浸渍合适的抗微生物剂,并可被颜色添加剂着色以增加能见度以帮助手术过程。
其它支架为可生物降解的材料,包括由EthiconCo.(EthiconCo.,Somerville,N.J.)制造的合成缝合材料,如MONOCRYLTM(乙交酯和ε-己内酯共聚物),VICRYLTM或Polyglactin910(涂覆有Polyglactin370和硬脂酸钙的丙交酯和乙交酯的共聚物),和PANACRYLTM(涂覆有己内酯和乙交酯共聚物的丙交酯和乙交酯共聚物)。(CraigP.H.,WilliamsJ.A.,DavisK.W.,等:ABiologicalComparisonofPolyglactin910andPolyglycolicAcidSyntheticAbsorbableSutures.Surg.141;1010,(1975))和聚乙醇酸。这些使用材料可由生产商提供。
在又一实施方案中,可以使用天然脱细胞器官部件创建所述模型或支架。可通过从器官中除去全部细胞和组织内容物来对生物结构或器官部件进行脱细胞处理。脱细胞处理方法包括:一系列的连续提取。该提取过程的一个关键特性为恶劣提取,其可能扰乱或破坏生物结构的复杂基础结构,可避免。第一步涉及除去细胞碎片以及溶解细胞膜。其后为溶解核细胞质组分和核组分。
优选地,所述生物结构,例如,器官的一部分,通过使用温和机械破碎方法去除包围器官的细胞膜和细胞碎片来脱细胞。所述柔和的机械破碎方法必须足以破坏细胞膜。然而,在所述脱细胞的过程中,应避免损坏或干扰所述生物结构的复杂基础结构。温和机械破碎方法包括刮擦所述器官部分的表面,搅动所述器官部分,或在合适量的流体中,例如,蒸馏水中搅拌器官。在一个优选的实施方案中,所述温和的机械破碎方法包括在合适体积的蒸馏水中搅拌所述器官部分,直到所述细胞膜被破坏,以及细胞碎片已经从所述器官移除。
在所述细胞膜被移除后,所述生物结构的细胞核和细胞质组件都被删除。这可以在通过溶解所述细胞和核部件,而不扰乱所述基础结构的情况下进行。也可使用非离子型洗涤剂或表面活性剂溶解所述核成分。非离子型洗涤剂或表面活性剂的实例包括但不限于,所述Triton系列,可由RohmandHaasofPhiladelphia,Pa.,提供,其中包括的TritonX-100、TritonN-101、TritonX-114、TritonX-405、TritonX-705和TritonDF-16,可由许多供应商市售提供;所述Tween系列,如单月桂酸酯(Tween20)、单棕榈酸酯(Tween40)、单油酸酯(Tween80)和聚氧乙烯-23-月桂基醚(Brij.35)、聚氧乙烯醚W-1(Polyox),及类似物、胆酸钠、脱氧胆酸盐、CHAPS、皂草苷、n-正癸基-D-glucopuranoside、n-正庚基-D-吡喃葡萄糖苷、n-正辛基-D-吡喃葡糖苷和NonidetP-40。
本领域技术人员将理解属于在上述分类的化合物的描述,和可从市售得到的供应商以及可能在“ChemicalClassification,EmulsifiersandDetergents”,McCutcheon's,EmulsifiersandDetergents,1986,NorthAmericanandInternationalEditions,McCutcheonDivision,MCPublishingCo.,GlenRock,N.J.,U.S.A.andJudithNeugebauer,AGuidetothePropertiesandUsesofDetergentsinBiologyandBiochemistry,Calbiochem.R.,HoechstCelaneseCorp.,1987.在一个优选的实施方案中,所述非离子型表面活性剂为所述Triton系列,优选TritonX-100。
所述非离子型洗涤剂的所述浓度取决于被脱细胞的生物结构类型,可能会改变。例如,对于脆弱组织,例如,血管,所述洗涤剂的所述浓度应降低。非离子型洗涤剂优选的浓度范围可从约0.001至2.0%(w/v)。更优选地,约0.05至1.0%(w/v)。甚至更优选地,约0.1%(w/v)至0.8%(w/v)。这些范围内的优选的浓度为约0.001至0.2%(w/v),特别优选地,约0.05至0.1%(w/v)。
所述细胞骨架成分,其中包括所述致密的细胞质细丝网络,胞间配合物和根尖的微孔结构,可使用碱性溶液,如氢氧化铵溶解。也可以使用由铵盐或其衍生物组成的其它碱性溶液,以溶解细胞骨架成分。其它合适的铵溶液实例包括硫酸铵、醋酸铵和氢氧化铵。在一个优选的实施方案中,使用氢氧化铵。
所述碱性溶液的浓度,如氢氧化铵,取决于被脱细胞的生物结构类型,可能会被改变。例如,对于脆弱的组织,例如,血管,洗涤剂的浓度应降低。优选的浓度范围可从约0.001至2.0%(w/v)。更优选地,约0.005%至0.1%(w/v)。甚至更优选地,约0.01%(w/v)至0.08%(w/v)。
所述脱细胞,干冻结构可在合适的温度下存储,直到需要使用。在使用之前,所述脱细胞结构可在合适的等渗缓冲剂或细胞培养基中平衡。合适的缓冲剂包括但不限于,磷酸缓冲盐水(PBS)、生理盐水、MOPS、HEPES、Hank's平衡盐溶液及类似物。合适的细胞培养基包括但并不限于,RPMI1640、Fisher's,Iscove's,McCoy's、Dulbecco's培养基中,及类似物。
而且,可以使用的其它生物相容性材料包括不锈钢、钛、有机硅、金和硅橡胶。
可以加强所述聚合物模型或支架。例如,在合成模型或支架的形成过程中可以添加加强材料或在植入前连接所述天然的或合成模型。用于形成所述加强的代表性材料包括天然或合成聚合物,例如,胶原蛋白,聚(α-羟基酯)如聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚原酸酯和聚酐及其聚物,其在控制的速率下水解降解和被再吸收。这些材料对可降解性、易处理性、大小和配置提供了最大程度的的控制。
所述可生物降解的聚合物,其特征在于,关于机械性能,如拉伸强度使用Instron测试仪,聚合物分子量使用凝胶渗透色谱法(GPC)、玻璃化、转变温度使用差示扫描量热法(DSC)以及键结构使用红外(IR)光谱学;关于毒理学,初步筛选测试包括Ames实验及体外致畸性试验和植入动物的免疫原性,炎症反应,释放和降解研究。可利用扫描电子显微镜、组织学和放射性同位素定量评估对体外细胞附着和可行性进行评估。
所述生物降解性材料其特征在于,重视材料植入在患者体内后所必需的降解时间量。通过改变所述结构,例如,厚度和网目尺寸,所述可生物降解材料可在约2年,或2个月之间基本上生物降解,优选地在约18个月和4个月之间,最优选地约15个月和8个月之间,最优选地约12个月和10个月之间。在另外一个实施方案中,可构建所述支架在较短的时间框架内降解,包括但不限于,在约1个月内、约2个月内、约3个月内、约4个月内、约5个月内、约6个月内、在7个月内、约8个月内、约9个月内、约10个月内、约11个月内,或约12个月内。如果有必要,可以构建的所述生物降解性材料,在约3年,或约4年,或约5个或更长年内基本上不被降解。本文所述的涂层也可被用于调解所述降解速率。例如,有涂层(例如,聚-丙交酯-共-乙交酯的共聚物)的模型或支架,可能比未经涂层的模型或支架降解更慢。
所述聚合物模型或支架可由如上所述的具有可控的孔隙结构制作。所述孔的大小可用于确定细胞分布。例如,所述聚合物模型或支架上的所述孔可以大到使细胞从一个表面迁移到所述相对的表面。另外,所述孔可以小到,使所述聚合物模型或支架(但不是细胞)双方之间无法实现流体连通。实现这一目标的合适孔隙尺寸可以为约0.04微米至10微米的直径,优选为约0.4微米至约4微米的直径。在一些实施方案中,聚合物模型或支架的表面可包括的孔足够大,允许附件和迁移的细胞群体进入所述孔隙。在聚合物模型或支架内部,所述孔径大小可以减小,以防止细胞从聚合物模型或支架的一侧迁移至相反侧。孔径减小的聚合物模型或支架的一个实施方案为,夹在两个大孔材料之间小孔材料层叠结构。聚碳酸酯膜是特别合适的,因为其可以在很好受控的孔径下制造,例如,约0.01微米、约0.05微米、约0.1微米、约0.2微米、约0.45微米、约0.6微米、约1.0微米、约2.0微米、约4.0微米。在所述亚微米级水平,聚合物模型或支架可能对细菌、病毒和其它微生物不可渗透。
以下所述特点或标准,其中包括,考虑到在每个离散模型或其部分的所述设计中:(i)形状,(ii)强度,(iii)刚度和刚性,及(iv)缝合能力(所述模型的所述程度,或其中一部分,容易缝合或以其它方式连接到相邻的组织)。如本文所用的,由所述弹性模量定义的模型或支架的刚度,系数表示在每单位面积作用于支架变形的应力与由其导致的变形量之间的比率。(例如,HandbookofBiomaterialsevaluation,Scientific,Technical,andClinicalTestingofImplantMaterials,第二版,由AndreasF.vonRecum编辑,(1999);Ratner,等,BiomaterialsScience:AnIntroductiontoMaterialsinMedicine,Academic出版社(1996))。支架的所述刚性是指给定支架表现出的弹性(或缺乏其)的程度。
这些标准的每一个是可变的,其可以改变(通过,除其他外,材料和制造过程的所述选择)以允许所述模型、或其部分放置至最好,并调整以解决其意图的医疗指示和生理功能。例如,所述材料包括所述模型或支架用于膀胱更换、重建和/或扩大,必须足够坚固,以支持缝线而不会撕裂,同时足够兼容,以便适应波动的尿量。
理想情况下,所述模型或支架应成形,使在它生物降解后,最终重建的膀胱当空虚时是可以以和天然膀胱相似的方式折叠的,并且所述输尿管不被堵塞,同时泌尿导管已经被从新的器官或组织构造中删除(不留泄漏点)。生物工程膀胱结构可以作为单件生产,或每个部件可以单独地生产,或所述部分的组合可以作为特定的部件生产。可以生产具有特定功能的每个特定的模型或支架部分。否则,特定部分可能会容易制造地生产。特定部分可以由特定材料构建,并且可以被设计为提供特定的属性。特定部分的属性可以包括类似于天然组织(例如,输尿管)的0.5至1.5MPa.sup.2的抗拉强度,30至100%的极限伸长率,或拉伸强度的范围可以从0.5至28MPa.sup.2,最终伸长率范围可为10-200%,压缩强度可以是<12。
所述聚合物模型或者支架可以具有三维(3-D)形状。所述3-D形状可以是管状的、半管状的、或半圆柱形状的。所述3-D形状可以是凹形状的。所述聚合物模型或者支架可以具有平面形状。所述平面形状的聚合物模型或者支架可以具有允许更多的弹性的预处理区域。在某些实施方案中,所述预处理区域被涂覆在产生折缝的区域中。在一个实施方案中,所述聚合物模型或者支架具有足够的延展性,以被卷起、被折叠或者其它的形状,以适合通过腹腔镜管道和/或端口植入。在这种实施方案中,所述聚合物模型或者支架具有足够的延展性,不被卷起、不折叠的或者相反的回到(通过腹腔镜管道和/或端口)插入后的形状。这些本领域技术人员可以理解其它的形状的支架,适合在本发明中使用。
由纤维形成的网眼状结构是优选的,它可以是圆形的、扇形的、扁平的、星形的,单独的或与其他纤维缠绕的。分支纤维的使用是基于相同的原则,其性质已经被用来解决增加表面面积,使其与体积成比例增大的问题。所有的多细胞生物利用这种重复的分支结构。分支系统代表器官之间,以及个别器官的功能单元之间的通信网络。接种和植入具有细胞的此配置,允许植入大量的细胞,其中每个被暴露于宿主环境,以提供营养物质和废物的自由交换,同时新生血管形成得以实现。该聚合物模型或支架可以制成柔性或刚性的,这取决于所需的最终形式、结构和功能。
在一个优选的实施方案中,所述聚合物模型或者支架由平均纤维直径15μm的聚乙醇酸形成,并且使用4-0polyglactin910缝合线配置成膀胱形状的模具。所述最终的构造用液化的共聚物涂覆,例如聚-DL-丙交酯-共-乙交酯50:50,80毫克每毫升二氯甲烷,以提供一定的好处,包括,但不限于,以延缓涂覆的模型或支架的降解,以获得足够的机械特性,并设定其形状。在一个实施方案中,提供所述支架包括涂层,使得其沉降或积聚在所述支架纤维之间的接合处。
在进一步的实施方案中,本发明的所述支架用生物相容性和可生物降解性的形状可设置材料涂覆。在一个实施方案中,所述形状可设置的材料含有聚-丙交酯-共-乙交酯的共聚物。在另一实施方案中,所述形状可设置的材料是液化的。在其它实施方案中,所述聚-丙交酯-共-乙交酯包括源自以下成分的丙交酯部分:L-丙交酯、D-丙交酯、DL-丙交酯、以及D-丙交酯和L-丙交酯两种组合。在另一实施方案中,所述有聚-丙交酯-共-乙交酯包括源自以下成分的丙交酯部分:L-丙交酯(以形成聚-L-丙交酯-共-乙交酯),D-丙交酯(以形成聚-D-丙交酯-共-乙交酯),或DL-丙交酯,或D-丙交酯和L-丙交酯两种的组合(以形成聚-DL-丙交酯-共-乙交酯)。所述涂层可以是聚-丙交酯-共-乙交酯(PLGA)50:50,其以在每mL的二氯甲烷中约20、约25、约30、约35、约40、约45、约50、约55、约60、约65、约70、约75或者约80mg。在一个优选的实施方案中,所述PLGA50:50可以是在约42.5mg/mL二氯甲烷中。在示例性的协议中,PLGA被溶解在溶剂(例如二氯甲烷)中,以作为液体溶液形成涂层,被施加到所述支架。
在另一实施方案中,所述涂层被提供所述模型或支架的约40%w/w至60%w/w、约41%w/w至59%w/w、约42%w/w至58%w/w、约43%w/w至57%w/w、约44%w/w至56%w/w、约45%w/w至55%w/w、约46%w/w至54%w/w、约47%w/w至53%w/w、约48%w/w至52%w/w、或约49%w/w至51%w/w。在另一实施方案中,所述涂层被提供所述模型或支架的约40%w/w、约41%w/w、约42%w/w、约43%w/w、约44%w/w、约45%w/w、约46%w/w、约47%w/w、约48%w/w、约49%w/w、约50%w/w、约51%w/w、约52%w/w、约53%w/w、约54%w/w、约55%w/w、约56%w/w、约57%w/w、约58%w/w、约59%w/w、或约60%w/w。
在另一方面中,本发明的所述支架在植入前(在所述聚合物模型或支架接种细胞之前或之后)可用添加剂或药物处理,例如,以促进在植入后新组织的所述再生。因此,例如,生长因子、细胞因子、细胞外模型或支架组件,和其它生物活性材料可以被添加到所述聚合物模型或支架中,以促进新组织的接枝愈合和再生。一般地,将根据被重建、替换或扩大的所述器官或组织来选择这样的添加剂,以确保适当的新组织在所述嫁接的器官或组织中形成(用于促进骨愈合的此添加剂的例子,参见,例如,Kirker-Head,C.A.Vet.Surg.24(5):408-19(1995))。例如,当聚合物模型(任选接种内皮细胞)用于增强血管组织,血管内皮生长因子(VEGF),(参见,例如,美国专利号5654273)可用于促进新生血管组织的所述再生。可以加入过量的生长因子和其它添加剂(例如表皮生长因子(EGF)、肝素结合表皮样生长因子(HBGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、细胞因子、基因、蛋白质,等)任何数量此生长因子(如有的话),其可通过将细胞接种于所述聚合物模型来生产,如果使用添加的细胞。优选这些添加剂提供足够的量,以促进适合于组织或器官(需要重建、替换或扩大(例如,通过诱导或加速渗透宿主细胞进入嫁接))的新组织的再生。其它有用的添加剂包括抗菌剂(例如抗生素)。
一个优选的支持模型或支架由交叉纤维组成,一旦所述细胞植入后,其可以通过短距离之间的营养物质的扩散让细胞生存。所述细胞支持模型或支架被血管化,与植入后细胞团的扩展一致。
在植入前,在体外构建三维构造结构,可便于体内植入后的再生事件,并可能将对于所述模型炎症反应的风险降到最低,从而避免嫁接挛缩和收缩。
在使用前,可以使用任何已知的方法对该聚合物模型或支架进行消毒。所用的方法取决于所述聚合物模型所使用材料。灭菌方法的实例包括蒸汽、干热、辐射、气体(如环氧乙烷)、气体和煮沸。
可以使用的方法,如,例如,溶剂浇铸、压缩成形、长丝牵伸、啮合、浸出、编织和涂层成形使组成支架的所述合成材料成形。在溶剂浇铸中,一种或多种聚合物溶液为适当的溶剂(如二氯甲烷),浇铸为分支类型的浮雕结构。溶剂蒸发后,得到薄膜。在压缩成形中,在高达每平方英寸30,000磅压力下,聚合物被压成适当的类型。长丝牵伸涉及从所述熔融聚合物牵伸,以及编织涉及通过压缩纤维成毡状材料以形成网状。在浸出中,含有两种材料的溶液扩散成接近最终形式结构的形状。接下来,使用溶剂以溶解掉组分之一,导致孔的形成(见Mikos,美国专利号5514378,通过引用纳入本文)。在成核中,支架形状的薄膜暴露于放射性裂变产物中,以创建辐射破坏材料的轨道。接下来,用酸或碱对所述聚碳酸酯板进行蚀刻,将辐射损坏的材料轨道转入孔中。最后,可使用激光来塑造和灼烧单个洞,通过许多材料以形成具有均匀孔径大小的结构。涂层是指涂层或用材料渗透聚合物结构,例如,液化的共聚物(聚-DL-丙交酯-共-乙交酯50:50,80mg/ml二氯甲烷),以改变其机械性能。可以进行一层或多层涂层,直到达到所述所需的机械性能。这些成型技术也可以组合采用,例如,可以将聚合物模型或支架编织,压缩成形,并粘合在一起。此外可通过不同的工序对不同的聚合物材料形状连接在一起,以形成复合材料形状。所述复合物的形状可以是层状结构。例如,聚合物模型或支架可以连接到一个或多个聚合物模型上,以形成多层的聚合物模型或支架结构。该附件也可以通过液体聚合物胶合或缝合进行。此外,可以通过激光或其它标准加工技术使该聚合物模型或支架形成固体块和形状,达到其所需的最终形式。激光整形是指使用激光除去材料的工序。
在一个优选实施方案中,由非编织聚乙醇酸(PGA)毛毡和聚(乳酸-共-乙醇酸)聚合物(PLGA)形成支架。
在Bertram等,美国出版申请号20070276507(其全部内容通过引用纳入本文)中所述,本发明的所述聚合物模型或支架材料可以被形成任何数目的所需构型,以满足整体系统,几何或空间限制的任何数量。该模型可以为三维模型形状,以符合层状组织管腔器官或组织构造的尺寸和形状。例如,所述聚合物用于膀胱重建模型,可以使用适合的三维模型以符合膀胱的全部或部分的尺寸和形状。当然,所述聚合物模型可以为不同大小和形状,适合于符合患者的不同尺寸的膀胱。任选地,所述聚合物模型应是合适的,在其生物降解后,所述所得的重建膀胱为可折叠的,其排空的方式类似于自然膀胱。所述聚合物模型也可以形成其它方式,以适应所述患者的特殊需要。例如,先前受伤或残疾的患者,可能具有不同的腹腔,并可能需要膀胱替换支架、膀胱扩大支架、膀胱导管支架、和逼尿肌等价支架适于装配。在一方面中,本发明考虑适合用于本文所述的平滑肌细胞群体的额外支架。例如,提供适合用于植入到眼睛的支架。
A.扩增或替换支架
在另一方面中,所述聚合物模型或支架被形成以符合膀胱的部分。在一个实施方案中,所述成型的模型符合替代至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%、或至少约95%的接受者现有膀胱。在另一方面中,所述聚合物模型或支架被形成以符合100%的或全部的膀胱。
在一个实施方案中,所述聚合物模型包括第一植入的、生物相容的、合成的或天然的聚合物模型或支架(其具有至少两个单独的表面),以及第二植入的、生物相容的、合成的或天然的聚合物模型或支架(其具有至少两个独立的表面);它们适于相互匹配,并且当匹配时被形成以符合需要治疗的管腔器官或组织构造的至少部分。所述第一和第二聚合物模型,可以由一个整体单元细分成两个或更多个不同的部分形成,或由两个或多个不同的部分形成,适于匹配。在一些实施方案中,所述第一和第二聚合物模型一旦匹配,可用于管腔器官或组织构造的重建、扩大,或替换。
在一些实施方案中,所述第一和第二聚合物模型都是对称的,而在其它实施方案中,所述第一和第二聚合物模型是不对称的。在一个实施方案中,所述第一聚合物模型或支架具有半球形或准半球形的形状(具有一个封闭的、半球形的端口和开放的赤道边界),并且所述第二聚合物模型或支架为圈形,适于与所述第一聚合物模型的赤道边界相匹配。在另一实施方案中,所述第一和第二聚合物模型分别为半球形或准半球形的形状(具有封闭的、半球形的端口和开放的赤道边界)。在又一实施方案中,每一个所述第一和第二聚合物模型包括圆形或半圆形的底座,并有至少2个花瓣沿径向每个底座延伸。在这个实施方案中,所述第一和第二聚合物模型的所述底座和花瓣形状部分适合于匹配,以建立中空的球形或准球形模型或支架,如此使得在匹配的聚合物模型的一侧创建带凸缘的纵向、椭圆形的开口,以及在所述纵向开口的相反一侧上创建圆形的开口。在另一实施方案中,所述第一和第二聚合物模型由3个部分组成,包括顶部、正面和侧部,适于匹配。在本实施方案中,至少使用3个,最好是四个垂直的接缝来匹配所述3个不同的部分,从而形成冠形的新膀胱结构。所述冠形结构优选作为装置单独使用,用于管腔器官的重建、扩大,或替换。在一个实施方案中,所述结构为指膀胱扩大支架。一个膀胱增大支架的实施例见图1A-D所示。在另一实施方案中,所述结构为膀胱替换支架。一个膀胱替换支架的实施例见图2A-D所示。
此外,所述第一聚合物模型,所述第二聚合物模型,或两者,可含有至少一个容器或端口,以适于接收管状容器或插入物(其中所述结构连接到天然容器或管道是必要的)。所述容器或插入为其本身,例如,圆柱形或管状聚合物模型,每一个具有至少一个位于圆筒形聚合物第一端的凸缘。所述容器或插入物,优选地,包括所述相同的生物相容性材料作为第一或第二聚合物模型。在一些实施方案中,所述容器或插入物还包含垫圈,以适于适应周围的所述圆筒状或管状容器或插入聚合物模型。例如,所述垫圈为水凝胶。所述圆筒状或管状容器或插入物可以任选地包含垫圈。所述垫圈可能为水凝胶。此外,所述圆筒状或管状插入物可以自稳定。
在另一实施方案中,所述容器或端口适于接收管状容器或插入物,其中所述支架或模型(一旦接种细胞)与天然容器或管道的连接是必要的,也适用于其它以下讨论的所述模型。
在一方面中,所述支架为器官或组织构造替换支架,其包括至少两个模型。在一个实施方案中,所述支架包括的具有第一表面的第一模型,以及具有第一表面的第二模型。所述第一模型和所述第二模型可以被配置或适于匹配。在另一实施方案中,所述第一模型和所述第二模型匹配时可适合于符合管腔器官的至少部分。所述第一和第二模型可包括生物相容性材料。所述生物相容材料可包括可生物降解的材料。
在一个实施方案中,所述第一模型可具有半球形状,封闭端和开放的赤道边界,及所述第二模型可具有圈形的,其被配置或适于与所述第一模型的赤道边界匹配。所述封闭端可能会呈拱形。在另一实施方案中,每一个所述第一模型和所述第二模型可具有半球形状,具有封闭端和开放的赤道边界。所述封闭端可能会呈拱形。在又一实施方案中,所述第一模型可进一步包括沿所述第一模型的至少一个边界的带凸缘的区域。所述第二模型可进一步包括沿所述第二模型的至少一个边界的带凸缘的区域,并且其中所述第二模型的所述凸缘区域适于与所述第一模型的所述凸缘区域匹配。
在一个实施方案中,所述支架包括第一、生物相容的模型和第二、生物相容的模型,其中所述第一和第二模型均可以包括底座,并可以被配置或适于匹配。在一个实施方案中,所述第一和第二的模型匹配时可被形成以符合管腔器官的至少部分。在另一实施方案中,所述第一和第二模型可进一步包括至少两个从每个底座径向延伸的花瓣。
在另外一个实施方案中,每个所述第一和第二模型可最初源自一包括一底座和至少四个花瓣的模板。在一个配置中,一对相对的花瓣的长度可能比其它花瓣更短。在另一实施方案中,所述第一和第二模型可以是两个不同的单元,适于匹配。
在一个实施方案中,所述第一和第二模型底座适于配合。在一些实施方案中,所述第一和第二模型通过所述第一和第二模型的花瓣形状部分相匹配。
在其它实施方案中,所述第一和第二模型可以被配置或适于形成中空的球形或准球形形状(在所述第一和第二模型之间的第一匹配点具有纵向开口,以及在所述第一和第二模型之间的第二匹配点具有圆形开口(其相对于纵向开口相反)。所述支架结构可进一步包括至少一个翼片,其纳入所述第一或第二模型的底座。在另一实施方案中,所述纵向开口具有一凸缘和至少一个翼片被设置在纵向开口的唇上。
另一方面,所述模型或模型能够连接到天然容器。在一个实施方案中,所述第一个模型、所述第二模型、或两者,每个被配置或适于接收天然容器。在另一实施方案中,所述第一模型、所述第二模型、或两者,进一步包括至少一个插座。所述至少一个插座可以被配置或适于接收管状插入物。所述管状插入物可以被布置在插座之内。在一些实施方案中,所述管状插入物具有端。所述插入物可具有位于此端中的至少一个凸缘。在另一实施方案中,所述管状插入物可配置或适于连接到天然容器。在进一步的实施方案中,所述支架围绕所述管状插入物具有表面和垫圈。所述垫圈可配置的或适于在所述结构的所述凸缘和所述表面之间形成不漏水的密封。在一些实施方案中,所述垫圈包括水凝胶。
图1和图2提供了支架配置代表性的描述,其包括至少两个模型。
在一方面中,所述支架为器官或组织构造扩大支架,包括一个或多个模型。在一个实施方案中,所述支架包括第一模型,其具有底座和多个凹口,其中所述第一模型适于形成半形状,在组装时以符合管腔器官的至少一部分。在另一实施方案中,所述支架包括第二个和第三模型,其中所述第一、第二和第三模型可被配置或适于匹配,并在匹配时形成以符合管腔器官的至少一部分。所述第一、第二和第三聚合物模型可源自一模板,包括三个细分的部分。在另一实施方案中,第一、第二和第三的模型来自三个不同的模板,并可能被配置或适应配合。在另外一个实施例中,所述第一、第二、和/或第三个模型包括生物相容性材料。所述生物相容性材料可包括可生物降解的材料。
在另一方面,所述支架由具有不同形状或配置的部分组成。在一个实施方案中,所述支架可以包括第一、第二和第三聚合物模型,其分别对应顶部部分、正面部分和侧面部分,使得当一起匹配时形成头冠形状。在另一实施方案中,所述正面部分和所述侧面部分可以每个包括第一边缘和第二边缘。所述正面部分的第一边缘可以连接到所述侧面部分的所述第一边缘。所述正面部分的所述第二边缘可以连接到所述侧面部分的所述第二边缘。在一个其它实施方案中,所述第一边缘可以由缝合线连接和/或所述第二边缘可以由缝合线连接。在其它实施方案中,所述正面边缘可以包括具有第一边缘和第二边缘的凹口。所述第一和第二边缘可以被连接,例如通过缝合线。在另一实施方案中,所述顶部部分可以具有第一边缘,所述侧面部分可以具有第三边缘,所述正面部分可以具有第三边缘。所述顶部部分的所述第一边缘可以连接到所述侧面部分的第三边缘,和/或所述顶部部分的第一边缘可以连接到所述正面部分的所述第三边缘。所述第一和第三边缘可以通过缝合线连接。在另一实施方案中,每个凹口可以具有第一边缘和第二边缘。这些边缘可以连接,例如通过缝合线连接。在其它实施方案中,所述侧面部分可以包括至少一个翼片。
在所有的实施方案中,在支架中每个单独的模型或者所有的模型可以包括生物可降解材料。所述材料可以选自:聚乙醇酸、聚乳酸、以及乙酸醇和乳酸的共聚物。在其它实施方案中,所述模型或者模具包括聚乙醇酸、以及乙酸醇和乳酸的共聚物。
在一个实施方案中,所述管腔器官是管道形的或者中空的器官。所述器官可以是泌尿生殖器官。在另一实施方案中,所述泌尿生殖器官选自:膀胱、输尿管和尿道。在一个其它实施方案中,所述泌尿生殖器官是膀胱或者膀胱区段。在某些实施方案中,所述使用的支架被配置或者适合于体内形成再生膀胱组织,其具有天然膀胱组织的相容性。
在一个实施方案中,所述匹配的模型和沉积的细胞形成可植入式的结构。在另一实施方案中,所述至少第一细胞群体包括本文描述的肌肉细胞群体。所述肌肉群体可以是平滑肌细胞群体。
在另一实施方案中,所述支架可以具有至少第一细胞群体,其沉积在所述模型的第一表面上或其中,所述第二模型的第一表面上或其中,或两者上或其中。在一个其他实施方案中,所述支架可以进一步包括第二细胞群体,其沉积在所述第一模型的第二表面上或其中,第二模型的第二表面上或其中,或两者上或其中。所述第二细胞群体包括尿道上皮细胞。
本文所述的扩大和替换支架,以及制作方法和相同的使用,参见在Bertram等,美国公开专利申请号20070276507(其全部内容通过引用方式纳入本文)进一步描述。
B.泌尿导管支架
本发明提供了新的尿流改道或导管支架,其可以接种细胞,并用作为受试者所述尿流改道结构中胃肠道组织的替换。例如,遭受回肠循环分流的患者经根治性膀胱切除术治疗后,可应用本文所述的新尿流改道。在一方面中,本发明考虑的导管支架或模型适用于作为有需要的受试者的尿流改道,从本文所述的方法形成。所述导管支架的一端可被连接到一个或多个输尿管,而且其另一端可被连接到所述受试者的身体外部的储尿器。在一个实施方案中,所述导管可通过造口退出受试者的身体。在另一实施方案中,该聚合物模型包括第一植入的、生物相容的合成聚合物模型或提供的管状形式支架。在一些实施方案中,所述管状支架包括第一端配置以连接到所述受试者的输尿管。在另一实施方案中,所述第一支架进一步包括第二端配置以在所述受试者中形成造口或括约肌。在另一实施方案中,所述第一支架进一步包括至少一个侧部开口配置以连接到的至少一个输尿管。在一些实施方案中,所述第一支架包括第一侧开口配置以连接到第一输尿管和第二侧开口(被配置为连接到第二输尿管)。
在一方面中,所述支架被设计为弹性的,以附着到所述受试者的一个或两个输尿管。在一个实施方案中,所述支架可以具有一个或多个开口用于在所述管状结构的一侧连接输尿管。在另一实施方案中,所述支架可在管状结构的一端具有开口用于连接输尿管。连接输尿管到所述结构的一端而不是一侧,如果在所述北连接的输尿管端部和所述支架端部之间的距离小于所述输尿管端部和所述支架侧面之间的距离,可使在所述输尿管上存较小的应变。一般情况下,所述支架、或其部分,被配置以连接所述受试者身体部分,例如:输尿管、腹壁,皮肤等,而且这样的配置结构包括但不限于,所述管状模型开放的或封闭的端部,配置缝合的端部或侧开口(或以其它方式连接到受试者的输尿管、腹壁、皮肤等)。那些在本技术领域的普通技术人员将会理解,不同的配置将取决于所述接受者所述腹腔的特定尺寸。
在一方面中,所述管状导管支架包括所述管道的一个端部,其作为尿液的流出端,所述来自一个或两个输尿管的尿液经过所述管状支架,最终所述接收者流出。在一个实施方案中,所述支架的流出端被配置,在所述接收者的腹腔壁结束。图12(平板A)解释了所述支架的示例性形态。
在另一实施方案中,所述支架的流出端被配置经过所述腹壁(即经腹的)延伸,并且直接与所述皮肤造口(即经皮肤的)的皮下层连接。图12(平板B)解释了所述支架的示例性形态。
在一个其他实施方案中,所述管状结构包括第一端(所述第一端包括平坦边缘),以及第二端(所述第二端包括不均匀或不平坦的边缘)。所述不均匀的边缘可以包括圆形底座和大量花瓣(从所述底座径向延伸)。所述花瓣的数量可以是1、2、3、4、5或6。所述不平坦边缘可以包括一系列的花瓣,例如在图3A中所示的。在一个实施方案中,所述管状结构可以具有适合于在有需要的患者中的尿流改道系统或者导管使用的形式。在另一实施方案中,所述系统将尿液(来自一个或两个输尿管)转移至腹壁部分,例如在膀胱造口术的情况下。在其它实施方案中,所述系统将膀胱连接至所述尿道。在又一实施方案中,第一系统可以将来自一个或多个输尿管的尿液转移到腹壁部分,并且第二系统可以将来自膀胱的尿液转移至腹壁部分。在所有实施方案中,所述系统可以将来自一个或多个输尿管的尿液转移至腹壁部分,例如形成造口。
在另一实施方案中,所述管状模型或者支架是尿流改道或者导管支架。在一个实施方案中,所述尿流改道系统的管状构造是矩形的、圆形的或者三角形横截面面积。图3B解释了本文考虑的一些不同横截面的形态。
在另一实施方案中,管状构造保留足够的刚性以在植入后维持开放。在一个其他实施方案中,所述管状构造的刚性被保留,使用或不使用在所述管腔中的导管。当使用导管时,它可以放置在所述管状构造的腔内空间中以提供附加的开放性。
在一个其它实施方案中,所述导管支架可以进一步包括第二支架,其以圆形或卵圆形的连接器形式,所述连接器配置以将所述第一支架的所述第一端连接到输尿管。在又一实施方案中,所述导管支架可以进一步包括第三支架(其以垫圈环的形式配置以形成造口或括约肌),和所述第一管状支架的第二端在受试者中创建造口。图3C解释了多种尿流改道结构(A:开放的要求卵形;B:开放的要求卵形容器,C:封闭的卵形容器和三管)。
在一些实施方案中,所述管状构造可以进一步包括垫圈构造(其连接到组织、器官或者身体部分),以实现在创建节制的造口或括约肌时吻合。在另一实施方案中,所述垫圈具有的厚度约小于1mm、约小于1.5mm、约小于2mm、约小于2.5mm、约小于3mm、约小于3.5mm、约小于4mm、约小于4.5mm、或者约小于5mm。
在一个实施方案中,所述尿流改道或导管支架被形成的形态示于图3A中。在一个其他实施方案中,所述管状构造包括第一端(包括平坦边缘)和第二端(包括不均匀或不平坦边缘)。所述不均匀边缘可以包括一个或多个固定件,其被配置以连接到所述受试者的外部区域,例如在所述受试者外部形成造口。在一个实施方案中,所述管状构造的所述第一和第二端的形式可以在图3A中解释。所述固定件的数量可以是1、2、3、4、5或6。
图4A描绘了人类泌尿系统的正常解剖的部分。
在一个实施方案中,所述管状构造具有的形式适合在有需要的患者中作为尿流改道或者导管使用。在另一实施方案中,所述导管将来自一个或多个输尿管的尿液转移到腹壁部分,例如,在输尿管造口术的情况下(图4B,4D)。在其它实施方案中,所述导管将来自所述膀胱的尿液转移至腹壁部分,例如在膀胱造口术的情况下(图4C)。在又一其它实施方案中,所述导管将所述膀胱连接到所述尿道(图4D)。在又一实施方案中,第一导管可以将来自一个或多个输尿管的尿液转移至腹壁部分,第二导管将来自膀胱的尿液转移至腹壁部分。在所有实施方案中,所述导管将来自一个或多个输尿管的尿液转移至腹壁部分(图4B)。在所有实施方案中,所述导管可以被配置以形成造口。
在一个实施方案中,所述尿流改道或者导管支架的管状构造的横截面是矩形的、圆形的、或者三角形的。在另一实施方案中,所述管状构造保持足够的刚性,以在植入后保持开放。在一个其他实施方案中,所述管状构造的刚性被保留,使用或者不使用在管腔中的导管。在某些实施方案中,尿流改道支架进一步包括导管,所述导管被配置以放置在植入后管状构造的管腔空间。在一个实施方案中,所述导管是Foley-like气囊式导管。当使用导管时,它可以放置在管状构造的管腔空间中,以提供附加的开放性。这些本领域普通技术人员可以理解,其它适合在本发明中使用的现有技术中已知的导管。
在另一实施方案中,所述支架管道壁的厚度小于约2mm、小于约2.5mm、小于约3.5mm、小于约4mm、小于约4.5mm、小于约5mm、小于约5.5mm、或者小于约6mm。
在一些实施方案中,所述支架可以具有变化的外部和内部直径。在一个实施方案中,所述支架的端部可以是扩口的、非-扩口的、密封的或者圆形的。
在其它实施方案中,所述支架是可以渗透尿液的。在一个实施方案中,所述支架的孔尺寸大约大于约0微米至约500微米。在另一实施方案中,所述孔尺寸从约100微米至约200微米。在另一实施方案中,所述孔尺寸从约150微米至约200微米。在其它实施方案中,所述孔尺寸约100微米、约110微米、约120微米、约130微米、约140微米、约150微米、约160微米、约170微米、约180微米、约190微米、或者约200微米。在一些实施方案中,所述孔尺寸约100微米、约200微米、约300微米、约400微米、约500微米、或者约600微米。在其它实施方案中,所述支架包括孔结构,其实单一的孔尺寸分布,多种孔尺寸分布,或者孔梯度分布。
在另一实施方案中,所述支架材料是可缝合的,并且可以和组织形成抗泄漏的连接。
在其它实施方案中,选择所述管状支架材料,以维持在整个植入使用期间的开放性,支持细胞连接和宿主组织的生长,和保持弹性。在另一实施方案中,所述材料具有胀破强度,超过对胀破强度的所述压力时,它将会暴露在正常的体内液体循环中。在其它实施方案中,所述材料具有的降解时间与宿主组织生长时间相称。
C.肌肉等价支架
在一方面中本发明的所述聚合物模型或支架是肌肉等价支架。在一个实施方案中,所述肌肉等价支架是逼尿肌肌肉等价支架。在另一实施方案中,所述支架适合于腹腔镜植入。
在一方面中,所述聚合物模型包括聚合物模型或支架,其被形成以符合在需要所述治疗的所述器官或组织构造的至少部分,以及充分的尺寸以用于腹腔植入。在某些实施方案中,本发明所述聚合物模型或者支架的长度在约3和约20cm之间。在一个实施方案中,所述聚合物模型或支架的最大长度是约20cm。在另一实施方案中,所述聚合物模型或支架最大长度约15cm。在另一实施方案中,所述聚合物模型或支架最大长度约10cm。在另一实施方案中。所述聚合物模型或支架最大长度约8cm。在另一实施方案中,所述聚合物模型或支架最大长度约4cm。在又一实施方案中,所述聚合物模型或支架最大长度约3cm。在某些实施方案中,本发明所述聚合物模型或支架的宽度在约1和约8cm之间。在一些实施方案中,所述聚合物模型或支架最大宽度约4cm。在其它实施方案中,所述聚合物模型或支架最大宽度约3cm。在又其它的实施方案中,所述聚合物模型或支架最大宽度约5cm。
在一个实施方案中,所述聚合物模型或支架具有三维(3-D)形状。在另一实施方案中,所述聚合物模型或支架具有平面形状。在一个实施方案中,所述平面形状的聚合物模型或支架包括预处理区域,以允许更多弹性。在某些实施方案中,所述预处理区域涂覆在具有折缝的区域中。在一个实施方案中,所述聚合物模型或支架具有充分的延展性,以被卷起的、被折叠的或者相反的适合于通过腹腔镜管道和/或端口植入的形状。在这种实施方案中,所述聚合物模型或支架具有充分的延展性,以非卷起的、非折叠的或者相反的恢复到在通过腹腔镜管道和/或端口插入后的形状。在一个实施方案中,所述聚合物模型或支架在通过腹腔镜管道和/或端口植入之前,被切成2、3、4、5、6、7、8、9或10个条带。在某些实施方案中,在通过腹腔镜管道和/或端口植入之前,所述2、3、4、5、6、7、8、9或10个条带是匹配的。所述2、3、4、5、6、7、8、9或10个条带可以是(使用粘着剂、钉书钉、缝合线或其它本领域技术人员已知的技术)匹配的。在这种实施方案中,所述2、3、4、5、6、7、8、9或10个匹配的条带是折叠的和/或堆叠的,以穿过腹腔镜导管和/或端口。在这种实施方案中,所述2、3、4、5、6、7、8、9或10个条带(在通过腹腔镜导管和/或端口插入后)是非折叠的和/或者非堆叠的。在一些实施方案中,所述预先放置的匹配的意思是(在通过腹腔镜导管和/或端口插入后)适当紧密的。
在一个实施方案中,所述聚合物模型包括第一可植入的、生物相容的、合成的或天然的聚合物模型或者支架,其具有补丁的形式或者条带的形式。在一个实施方案中,所述补丁具有合适的形式,适合作为逼尿肌肌肉等价物在有需要的患者膀胱中使用。在一个其他实施方案中,所述补丁具有合适的形式,适合于增加有需要的患者的现有膀胱的体积容量。在某些实施方案中,所述补丁增加所述膀胱的尺寸,在约50mL和约500mL之间。在一些实施方案中,所述补丁将增加膀胱尺寸,增加量约50mL。在一些实施方案中,所述补丁使所述膀胱尺寸增加约50mL。在一个实施方案中,表面积增加30cm2,使200ml的膀胱的容积增加至250ml。在另一实施方案中,表面积增加25cm2,使350ml的膀胱的容积增加至400ml。在一个实施方案中,所述支架具有约30cm2的二维表面积。在另一实施方案中,所述支架具有约25cm2的二维表面积。在一个实施方案中,所述补丁是条带的、盘状的、方形的、椭球形的或者其它合适的形态。在其它实施方案中,所述补丁具有预折叠的形式,例如像手风琴。
图5A-B示出了肌肉等价支架或者聚合物模型的例子。在一个实施方案中,所述聚合物模型或支架是双楔形状,例如,在图5A所示的形状。在另一实施方案中,所述聚合物模型成形为图6-9中所示的形态之一。
在所有实施方案中,所述聚合物模型或支架被成形以使对所述膀胱和模型或支架的应力最小。
在另一实施方案中,所述聚合物模型包括第一可植入的、生物相容的、合成的或者天然聚合物模型或支架(具有补丁的形式或条带的形式)。在一个实施方案中,所述补丁具有合适的形式,以作为逼尿肌肌肉等价物在有需要的患者的膀胱中使用。在一个其它实施方案中,所述补丁具有合适的形式,以增加有需要患者的所述现有膀胱的容积容量。在一些实施方案中,所述补丁将增加膀胱尺寸,增量50ml。在一个实施方案中,所述补丁的形式是条带、盘状的、方形的、椭球形的或者其它合适的形态。在其它实施方案中,所述补丁具有预折叠的形式,例如像手风琴。
在一个实施方案中,所述聚合物模型被成型,以符合至少部分的所述泌尿系统的管腔器官或者组织构造,例如在图1-9中显示的形态之一。在所有实施方案中,用于这些模型或者支架的所述生物相容性材料,例如是生物可降解性的。在所有实施方案中,所述生物相容性材料可以是聚乙醇酸。
在所有实施方案中,所述聚合物模型或支架被涂覆有生物相容的和生物可降解性的形状可设置材料。在一个实施方案中,所述形状可设置材料可以包括液态共聚物。在另一实施方案中,所述液态共聚物可以包括液化的丙交酯/乙交酯共聚物。在一个实施方案中,所述液态共聚物可以包括聚-丙交酯-共-乙交酯。所述液态共聚物可以包括聚-D-丙交酯-共-乙交酯、聚-L-丙交酯-共-乙交酯、或者聚-DL-丙交酯-共-乙交酯。
D.肠道组织支架
本发明提供的支架适合形成胃肠道组织结构,例如,食管组织或肠支架。在一方面中,本发明的所述聚合物模型或支架适合用于在所述部分胃肠道、或其上或其内部植入。在一方面中,所述聚合物模型包括聚合物模型或支架,被形成以符合至少部分的有需要治疗的所述胃肠(GI)道。合适的所述GI部分,包括但不限于,食管、小肠、大肠、胃、结肠、或肛门括约肌组织。
在一个优选的实施方案中,所述GI支架由非编织的polygycolicacid(PGA)/聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)聚合物、VICRYLTM编织网、和编织PGA形成。在一个优选的实施方案中,所述PLGA/PGA聚合物支架为规则的(例如,3毫米厚)的或薄的(例如,0.5毫米厚)。
在一个实施方案中,所述GI聚合物模型包括第一植入的、生物相容的、合成的或天然的聚合物模型或支架,其具有补丁的形式、或条带的形式。在一个实施方案中,所述补丁具有适合用作GI组织支架的形式,用于有需要的患者的GI组织中。在另外一个实施方案中,所述补丁具有的形式适合用于在有需要的患者中现有的GI组织的再生、替换、扩大,或重建。在一个实施方案中,所述补丁的形式为条带、盘状的、方形的、椭球形,或任何其它适当的形态。在其它实施方案中,所述补丁具有预先折叠的形式,例如,类似于手风琴。
在所有的实施方案中,用于GI模型或支架的所述生物相容性材料,例如,可生物降解的。在所有的实施方案中,所述生物相容性材料可以是聚乙醇酸。在一些实施方案中,所述聚合物GI模型或支架涂有生物相容性的和生物可降解性的形状可设置材料,如本文所述。
本发明考虑将表面褶皱/波纹的静电管状复合材料应用于GI组织或器官的再生、重建、扩大或替换。所述复合材料可能为静电,其模仿GI组织的外形。其中所述GI组织天然为管腔的,所述外形可模仿所述管腔表面或所述外部,非管腔表面。管状复合材料的外表面最初为褶皱静电,其可能适合用作为GI组织支架。如果所述复合材料由内而外反转,这提供了用于内部或管腔侧上褶皱的放置。这种定向模仿了所述小肠管腔绒毛特性的组织结构。提供单一的管状复合材料,其外形特征再现了GI组织(例如,食管或小肠),这提供了策略,以促进在本文所述的所述GI结构在GL相关疾病的应用。所述GI代表同心组织的管状复合材料,其具有组织学亚结构和根据空间位置而变化的外形特征的。用于再生所述GI组件的组织工程方法一般集中于使用材料(如SIS,硅树脂,或聚偏氟乙烯)替换或扩大,所述材料通常没有接种SMC、上皮细胞、或其它细胞类型。这种方法的成功具有有限性或多变性,如再生的同心组织的肌肉组织和上皮层所测量的(Jwo等2008,Brit.J.Surgery95:657-663;JansenPL等,2004,EurSurgRes36:104-111;UenoT等,2007,JGastrointestSurg11:918-922;HoeppnerJ等,2009,JGastrointestSurg13:113-119;KaiharaSetal,,2000,69(9):1927-1932;NakaseY等,2008supra;TakimotoY等,1993,ASAIOJ39:M736-739;LopesMF等,2006,DisEsophagus19:254-259;Gonzalez-SaezLA等,2003,EurSurgRes35:372-376;AnsaloniL等,2006,Trans.Proc38:1844-1848;PekmezciS等,1997,TurkJMedRes15;SaxenaAK等,2009,JPedSurg44:896-901;GreikscheitTC等,2004,AnnSurg240)。与此相反,本发明设想利用的平滑肌细胞接种生物材料为基础的平台的所述胃肠道的再生途径,已证明在所述膀胱和膀胱衍生物(JayoMJ等,2008:RegenMed3:671-682)的再生是成功的。静电纺丝为使用带电的聚合物溶液(RamakrishnaS,等,2005:Anintroductiontoelectrospinningandnanofibers.WorldScientificPublishingCo.)射流制作生物材料的工艺。众多可生物降解的和非生物降解聚合物可能为静电纺丝进入管状复合材料,所述管状复合材料适合应用于管状器官系统(包括胃肠道,例如,食管、小肠、结肠,或肛门括约肌的组件)再生。这种聚合物的例子包括但不限于,PGA,PLCL和聚氨酯。已经熟知这样的材料可支持细胞的迁移和增殖(RamakrishnaS,等,2005supra)。
基于迭代静电纺丝协议(见Rapoport等,美国专利申请公开号:20090227026,其全部内容通过引用并入本文),已经开发了策略用于某些器官系统局部特征的重组。简而言之,二进制静电纺丝方法可用于:第一轮的静电纺丝用于创建管道,所述管道围绕限定直径的芯轴。然后通过插入多个额外的芯轴强行扩大这种管状结构,以提高其工作直径数倍。然后以所述扩展的管状结构为模板进行第二轮的静电纺丝。从所述管状复合材料的管腔去除所有芯轴,然后导致所述管状结构复归到其原始直径。因此,来自所述第二层的过量的静电材料被折叠成一系列从所述外部,所述管状复合材料非管腔表面突出的褶边或波纹。这样的管状构造可能适合于在例如所述食管或小肠再生中的应用,如图10A-C中所示。
管状结构的倒置重新定位了所述表面褶皱朝向所述内部的、管腔表面的,以创建管腔局部,概述了所述小肠的所述管腔表面的绒毛特性。在这种方式下,单一的静电管状复合物可以具有食管或小肠再生的双重应用,基于是否其局部特征面向管腔或外部表面。可能由内向外翻转所述具有外部褶皱的管道,以创建类似于小肠绒毛的管腔表面波纹。因此,单一的管状复合物与表面褶皱可能至少被应用朝向于食管(外部表面上的褶皱,如在图10C中示出)或小肠(内部、管腔的表面上的褶皱,如在图10B中示出的)的再生。
E.呼吸组织支架
本发明提供的支架适合于形成呼吸组织结构,例如,肺组织支架。在一方面中,本发明的所述聚合物模型或支架适合植入在肺的部分上或其内部。在一方面中,所述聚合物模型包括聚合物模型或支架,其被形成以符合至少部分的需要治疗的天然呼吸组织。合适的天然呼吸组织包括但不限于,肺、肺泡组织、和细支气管组织。
在所有实施方案中,所述呼吸组织支架是可植入的,例如,植入到肺部中。在所有的实施方案中,所述支架是可生物降解的。在所有实施方案中,所述支架具有生物相容性。所述支架适合接种第一细胞群体和/或第二细胞群体。在所有的实施方案中,所述第一细胞群体为源自脂肪的平滑肌细胞群体。在所有的实施方案中,所述第二细胞群体为源自呼吸道的细胞群体。在所有的实施方案中,所述第二细胞群体源自肺。在所有实施方案中,所述结构为呼吸组织构造。在所有的实施方案中,所述结构对至少一个平滑肌细胞标记物为阳性。在所有的实施方案中,所述结构对至少一个呼吸组织标记物为阳性。在所有的实施方案中,所述呼吸组织标记物为下列中的一个或多个:细支气管标记、肺泡标记、和上皮标记。在所有的实施方案中,所述结构包括一个或多个肺泡形成单元(AFU)。在所有实施方案中,所述结构包括具有协调节奏的收缩功能的细胞。在所有的实施方案中,在植入后,所述结构适于形成呼吸组织。在所有的实施方案中,所述呼吸组织为肺组织。在所有的实施方案中,所述肺组织包括肺泡组织和/或细支气管组织。
F.血管支架
如Rapoport等,美国公开申请号20090227026(其全部内容通过引用的方式并入本文)所述,天然血管具有的多层层状构造和特定的结构特征(起伏,褶皱,扭结),促进了在不同应力的不同程度上机械接合的的胶原蛋白和弹性纤维层的平行排列。典型观察天然动脉在弹性层中为褶皱,但周围的胶原蛋白层中没有褶皱。此一般构建的例外记录为在长须鲸中记录的独特结构,其中在胶原组分中存在新的结缔组织设计,其恰好为拉伸元素,具有很高的褶皱(Gosline&Shadwick(1998)AmericanScientist86:535-541))。如Rapoport等所述,组织工程支架和方法同样可以采取通常见于天然动脉的逆向方法,即所述支架的所述拉伸层具有褶皱,但不是所述弹性层。这种方法是有利的,因为相比在弹性层中以赋予它们的而言,其更容易在拉伸层内赋予褶皱。
适用于本发明中的血管支架可具有多层状的或层叠的结构。在一个实施方案中,所述支架包括(a)第一管状元件,其包含弹性元件,外表面和内部管腔表面;和(b)第二管状元件,其包含拉伸元件,与所述第一管状元件外表面连接的外表面和内部管腔表面。
在另一实施方案中,所述第二管状元件是褶皱的。存在于本文描述的所述组织工程支架的所述褶皱在Rapoport等.美国公布的申请号20090227026中示例,显示了其在所述支架所述外表面上的外观。
在其它实施方案中,所述褶皱的第二管状元件具有纤维网,其中所述纤维方向为朝向圆周方向。
可以在所述第一和第二管状元件上添加额外的管状元件。
所述第一管状元件的所述管腔表面和所述第二管状元件的所述外表面都可以进行进一步的操作,如,例如,形成组织工程的血管(TEBV)。如本文所述,本发明的所述血管支架可用于通过将一种或多种细胞群体纳入支架制作TEBV。所述支架所述的层状结构提供了更天然的容器形态,其可能有助于所述预期细胞群体分区,如平滑肌细胞、血管内皮细胞和成纤维细胞等。
本文所述支架的所述弹性元件赋予的支架有应对大规模的变形应力的能力,所述变形是完全可回收和可重复的。所述弹性体元件具有的弹性组分,可能为天然组分、人工合成的组分、一种以上的天然组分的混合物、一种以上的合成组分的混合物,天然的和合成组分的混合物,或其任意组合。在一般情况下,有机或天然组分为蛋白质,通常存在于天然组织构造中,或可源自天然组织构造,或可以重组产生或基于已知的编码所述蛋白质和/或其氨基酸序列的核酸序列来合成。例如,弹性蛋白天然存在于动脉并可作为自然组分用于本发明的所述血管支架。天然组分可以是血管支架和/或TEBV的一部分,如本文所述,还包括或不包括的合成组分。
在一些实施方案中,所述第一管状元件的所述弹性元件包括有机或天然组分,例如弹性蛋白,包括但不限于弹性蛋白、面筋、麦醇溶蛋白、abductin、蛛丝,和节肢弹性蛋白或预节肢弹性蛋白(Elvin等,(2005)自然.Oct12:437(7061):999-1002)。那些在本领域的普通技术人员将会理解其它天然弹性蛋白质,其可适合用于在本发明的所述支架。
当所述完整的血液支架被诉诸于进一步操作,为了构建组织工程血管的目的,使用天然材料具有优势。例如,当特定的细胞群体被培养,在或者接种在所述支架上,存在于所述支架中的所述天然弹性蛋白,促进了适当的细胞与所述支架相互作用。
在其它实施方案中,所述弹性元件包括合成组分。合成弹性元件的例子包括但不限于:乳胶、聚氨基甲酸乙酯(PU)、聚已酸内酯(PCL)、聚-L-丙交酯酸(PLLA)、polydiaxanone(PDO)、聚(L-丙交酯-共-己内酮)(PLCL)和聚(etherurethaneurea)(PEUU)。
在一个实施方案中,本发明考虑了第一管状元件,其中所述弹性元件包括天然弹性组份和合成弹性组分。
本发明所述支架的拉伸元件赋予了所述支架刚性或可拉伸性,以允许所述支架在应对应力时能抗延伸。所述拉伸元件具有的拉伸组分,可以是天然组分、合成组分、一种以上天然组分的混合物、一种以上合成组分的混合物、天然和合成组分的混合物、或其任意组合。
在另一实施方案中,所述第二管状元件的拉伸元件包括有机或天然组分,例如纤维状蛋白质,包括但不限于:胶原、纤维素、丝和角蛋白。本领域普通技术人员可以理解到其它的适合于本发明支架中使用的天然纤维状蛋白质。在其它实施方案中,所述拉伸元件是合成组分。合成拉伸组分的例子,包括但不限于:尼龙、(聚对苯二甲酸乙二酯(PET))(聚四氟乙烯)、聚酯、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸-共-乙醇酸(PLGA)和poly(etherurethaneurea)(PEUU)。在一个实施方案中,本发明考虑了第二管状元件,其中所述拉伸元件包括天然拉伸组分和合成拉伸组分
所述支架的弹性和拉伸元件可以含有天然和合成组分的不同组合。例如,支架可以含有天然弹性组份和/或天然拉伸组分、以及合成弹性组分和/或合成拉伸组分。
在本发明一方面中,所述TE支架不限于在第一管状元件上具有第二管状元件的两层结构,如上文所述的。在一些实施方案中,所述支架包括额外的管状元件,例如在第二管状元件上的第三管状元件,在第三管状元件上的第四管状元件,在第四管状元件上的第五管状元件等等。另外,如本文所描述的,所述额外的管状元件可以含有弹性元件(例如天然的和/或合成的)或拉伸元件(例如天然的和/或合成的)。所述额外的管状元件可以通过本文所描述的技术结合。
在一方面中,在所述弹性元件含有的弹性组分和在所述拉伸元件中含有的拉伸组分,每个都具有不同的弹性模量。在一个实施方案中,所述弹性元件的弹性组分的弹性模量具有第一弹性模量,并且所述拉伸元件的拉伸组分具有第二弹性模量。在优选的实施方案中,所述第二弹性模量比所述第一弹性模量大至少约一个数量级。在一个实施方案中,所述第二弹性模量比所述第一弹性模量大约一个数量级,约2个数量级,约3个数量级,约4个数量级,或额外的数量级。例如,Rapoport等,美国出版申请号20090227026的实施例1示出了所述拉伸组分PDO和Vicryl分别具有3GPa和9-18Gpa的弹性模量,与之相比的,所述弹性组分乳胶的弹性模量为0.3Mpa至0.5Mpa。
另一方面,本发明的所述TE支架具有的构造和功能性能,基本上与在天然血管中发现的相似。本领域普通技术人员将理解到所述众多的参数,可以用于表明本发明的所述支架模仿或者接近类似于天然血管,包括但不限于包括但不限于:对应力和应变的响应、顺应性、杨氏模量、孔隙度、强度等。在一个实施方案中,本发明的所述支架特征在于,具有以各向异性的方式对应力和应变机械响应的能力。本领域普通技术人员将可以理解,在现有技术中大量公认的参数对于表征组织工程支架的行为是有效的的(Rapoport等,美国出版申请号20090227026)。这种参数对于表征本发明的组织工程支架(并且特别地,在测定所述支架是否具有与天然血管相似的基本性能)是有效的。
表1提供了表征规范,基于所述项目的文献,以提供支架或TEBV的机械性能(其与天然血管相似)。本发明涉及组织工程支架,其特征在于表1中的数值,并具有与天然血管相似的机械性能,优选的(i)对应力和应变的机械响应,由J-形应力/应变曲线;(ii)抗压裂;(iii)粘弹性;(iv)(i)-(iii)的任意组合。另外,所述支架特征在于可以获得多种细胞类型,为了接种细胞以形成TEBV的目的。
表1
在一个实施方案中,本发明的组织工程支架表现的J-形应力/应变曲线特性归属于(i)约0.1MPa至约0.5Mpa的圆周管道弹性模量1,(ii)约3.0MPa至约6.0Mpa的圆周管道弹性模量2;以及(iii)约0.57至约1.12的圆周向模量转换,及其任意的组合。在另一实施方案中,所述圆周管道弹性模量1为约0.1MPa、0.13MPa、约0.15MPa、约0.17MPa、约0.2MPa、约0.22MPa、约0.25MPa、约0.27MPa、约0.3MPa、约0.32MPa、约0.35MPa、约0.37MPa、约0.4MPa、约0.42MPa、约0.45MPa、约0.47MPa、或者约0.5Mpa。在另一实施方案中,所述圆周管道弹性模量2为约3.0MPa、约3.2MPa、约3.5MPa、约3.7MPa、约4.0MPa、约4.2MPa、约4.5MPa、约4.7MPa、约5.0MPa、约5.2MPa、约5.5MPa、约5.7MPa、或者约6.0Mpa。在另一实施方案中,所述圆周向模量转换is约0.57、约0.59、约0.61、约0.63、约0.65、约0.67、约0.69、约0.71、约0.73、约0.75、约0.77、约0.79、约0.81、约0.83、约0.85、约0.87、约0.89、约0.91、约0.93、约0.95、约0.97、约0.99、约1.01、约1.03、约1.05、约1.07、约1.09、约1.11、或者约1.12。
在另一实施方案中,利于抗断裂性的性能为(i)约0.45MJ/m3至1.0MJ/m3的圆周向管道韧性;(ii)约0.1MJ/m3至0.5MJ/m3的轴向管道韧性;或(iii)(i)和(ii)的组合。生物材料的所述韧性是一个参数,该参数有利于测定其的抗断裂性。显然,抗断裂或撕裂是TE支架所期望的特征,因为其有助于确保源自其的任何TEBV或血管移植物的通畅。支配天然血管受变形以响应于循环载荷流体的所述应力和应变。因此,其在纵向或轴向方式和/或圆周方式的分裂或断裂是危险的。类似于天然血管,所述源自本发明的所述TE支架和TEBV的血管移植物也有断裂的风险。本发明涉及发现特定的轴向韧性和/或特定的圆周韧性,有助于TE支架抗断裂或撕裂。在一个实施方案中,所述圆周向管道韧性为约0.45MJ/m3,约0.50MJ/m3,约0.55MJ/m3,约0.60MJ/m3,约0.65MJ/m3,约0.70MJ/m3,约0.75MJ/m3,约为0.80MJ/m3,约0.85MJ/m3,约0.90MJ/m3,约0.95MJ/m3,约1.0MJ/m3。在另一实施方案中,所述轴向管道韧性为约0.1MJ/m3、约0.15MJ/m3,约0.20MJ/m3,约0.25MJ/m3,约0.30MJ/m3,约0.35MJ/m3,约0.40MJ/m3,约0.45MJ/m3,或约0.50MJ/m3。在另一实施方案中,本发明的所述TE支架,其特征在于以下的一种或多种:i)支架,其对应力和应变的机械响应以J-形应力/应变曲线为特征;ii)抗断裂支架;和iii)粘弹性支架。
在另一实施方案中,所述TE支架的粘弹性性能其特征在于(i)角正切约0.05至0.3;(ii)储存模量约400MPa至0.12MPa;或(iii)(i)和(ii)的组合。粘弹性材料呈现出响应于变形的粘性和弹性特性。同时,当施加应力时粘性材料的抗拉性与时间线性相关,弹性材料即刻响应应力,而且一旦应力除去迅速恢复到其原始状态。粘弹性材料对应力响应呈现出时间依赖性的应变,其通常在无定形材料内涉及原子或分子的扩散。作为天然血管显示粘弹性以应对流体的所述循环加载,此特征对本发明的TE支架是可取的,将被用于创建TEBV或血管移植。本发明涉及本发明TE支架所述粘弹性的所述发现,其特征在于特定的角正切和/或特定的储存模量值。在一个实施方案中,所述角正切约0.05、约0.06、约0.07、约0.08、约0.09、约0.10、约0.11、约0.12、约0.13、约0.14、约0.15、约0.16、约0.17、约0.18、约0.19、约0.20、约0.21、约0.22、约0.23、约0.24、约0.25、约0.26、约0.27、约0.28、约0.29、或约0.30。在另一实施方案中,所述储存模量为约400MPa、约350MPa、约300MPa、约250MPa、约200MPa、约150MPa、约100MPa、约90MPa、约80MPa、约70MPa、约60MPa、约50MPa、约40MPa、约30MPa、约20MPa、约10MPa、约9MPa、约8MPa、约7MPa、约6MPa、约5MPa、约4MPa、约3MPa、约2MPa、约1MPa、约0.9MPa、约0.8MPa、约0.7MPa、约0.6MPa、约0.5MPa、约0.4MPa、约0.3MPa、约0.2MPa、约0.19MPa、约0.18MPa、约0.17MPa、约0.16MPa、约0.15MPa、约0.14MPa、约0.13MPa、或约0.12MPa。
有几种本技术领域的普通技术人员公知的技术适合用于识别和表征本发明所述支架的理想性能。这些技术包括但不限于,胀裂压力测试;在圆周方向上(应力/应变图中提供的结果)的准静态机械测试(又名拉伸试验);测定孔隙率和孔的大小(例如,通过水银压入法);细胞附件检测;和降解速率;移植顺应性的压力/容积曲线测量。
5.结构
在一方面中,本发明提供了一种或多种聚合支架或模型,其接种至少一种细胞群体。这种已接种细胞群体的支架,并可在本文中称为“结构”。在一个实施方案中,所述细胞接种的聚合物模型或模型形成结构,所述结构被形成或适于符合需要此结构的受试者天然管腔器官或组织构造的至少部分。所述天然管腔器官或组织构造可为层状组织的。
细胞接种的聚合物模型或模型可以形成选自所述组(包括:膀胱替换结构、膀胱增大结构、膀胱导管结构,和逼尿肌等价结构)的新膀胱结构。此外,提供其它的细胞接种的聚合物模型,其形成选自所述组(包括:呼吸组织构造、胃肠道组织构造、新血管结构,和眼组织构造)的结构。
那些在本领域的技术人员将理解,可通过本领域中已知的各种方法来接种或沉积本文所述的一种或多种细胞群体。例如,生物反应器孵化和培养,(Bertram等,美国出版申请20070276507;McAllister等,美国专利号7,112,218;Auger等,美国专利号5,618,718;Niklason等,美国专利号6,537,567));压力诱导接种(Torigoe等,(2007)细胞移植.,16(7):729-39;Wang等,(2006)生物材料.May;27(13):2738-46);和静电接种(Bowlin等,美国专利号5,723,324,其全部内容通过引用纳入本文)也可使用。此外,最近的技术,同时覆盖细胞静电纤维气溶胶可适合于接种或沉积(Stankus等,(2007)生物材料,28:2738-2746)。
在另一方面中,本发明为本文所述的任意结构提供了以任何特定细胞密度的细胞接种的支架。在一个实施方案中,支架接种平滑肌细胞群体的细胞密度约20x106至约30x106。在另一实施方案中,所述细胞密度约1x106至约40x106,约1x106至约30x106,约1x106至约20x106,约1x106至约10x106,或约1x106至约5x106。在进一步的实施方案中,所述密度约20x106至约98x106。在另一实施方案中,所述密度约21x106至约97x106,约22x106至约95x106,约23x106至约93x106,约24x106至约91x106,约25x106至约89x106,约26x106至约87x106,约28x106至约85x106,约29x106至约83x106,约30x106至约80x106,约35x106至约75x106,约40x106至约70x106,约45x106至约65x106,或者约50x106至约60x106。在一优选实施方案中,所述密度约24x106至约91x106。在另一实施方案中,所述密度约2.5x106至约40x106,约5x106至约40x106,约7.5x106至约35x106,约10x106至约30x106,约15x106至约25x106,和约17.5x106至约22.5x106。在另一实施方案中,所述细胞密度约1x106,约2x106,约3x106,约4x106,约5x106,约6x106,约7x106,约8x106,约9x106,约10x106,约11x106,约12x106,约13x106,约14x106,约15x106,约16x106,约17x106,约18x106,约19x106,约20x106,约21x106,约22x106,约23x106,约24x106,约25x106,约26x106,约27x106,约28x106,约29x106,约30x106,约31x106,约32x106,约33x106,约34x106,约35x106,约36x106,约37x106,约38x106,约39x106,约40x106,约41x106,约42x106,约43x106,约44x106,约45x106,约46x106,约47x106,约48x106,约49x106,约50x106,约51x106,约52x106,约53x106,约54x106,约55x106,约56x106,约57x106,约58x106,约59x106,约60x106,约61x106,约62x106,约63x106,约64x106,约65x106,约66x106,约67x106,约68x106,约69x106,约70x106,约71x106,约72x106,约73x106,约74x106,约75x106,约76x106,约77x106,约78x106,约79x106,约80x106,约81x106约82x106,约83x106,约84x106,约85x106,约86x106,约87x106,约88x106,约89x106,约90x106,约91x106,约92x106,约93x106,约94x106,约95x106,约96x106,约97x106,约98x106,或约99x106。
在进一步的实施方案中,本发明提供了以支架中特定细胞密度(每cm2)的细胞接种的支架。在一个实施方案中,所述密度约3,000细胞/cm2至约15,000细胞/cm2,约3,500细胞/cm2至约14,500细胞/cm2,约4,000细胞/cm2至约14,000细胞/cm2,约4,500细胞/cm2至约13,500细胞/cm2,约5,000细胞/cm2至约13,000细胞/cm2,约4,500细胞/cm2至约13,500细胞/cm2,约5,000细胞/cm2至约13,000细胞/cm2,约5,500细胞/cm2至约12,500细胞/cm2,约6,000细胞/cm2至约12,000细胞/cm2,约6,500细胞/cm2至约11,500细胞/cm2,约7,000细胞/cm2至约11,000细胞/cm2,约7,500细胞/cm2至约10,500细胞/cm2,约8,000细胞/cm2至约10,000细胞/cm2,约7,500细胞/cm2至约9,500细胞/cm2,或约8,000细胞/cm2至约9,000细胞/cm2。在优选实施方案中,所述浓度约3,000细胞/cm2至约7,000细胞/cm2,或约9,000细胞/cm2至约15,000细胞/cm2。在优选实施方案中,所述浓度约9.5x104细胞/cm2,约10x104细胞/cm2,约10.5x104细胞/cm2,约11x104细胞/cm2,约11.5x104细胞/cm2,约12x104细胞/cm2,约12.5x104细胞/cm2,约13x104细胞/cm2,约13.5x104细胞/cm2,约14x104细胞/cm2,约14.5x104细胞/cm2,或约15x104细胞/cm2。
在一个实施方案中,细胞的所述沉积包括使支架与细胞附着增强蛋白接触的步骤。在另一实施方案中,所述增强蛋白质为以下中的一种或多种:纤维连接蛋白、胶原蛋白,和MATRIGELTM。在另一实施方案中,所述支架不含有细胞附着增强蛋白。在另一实施方案中,细胞的沉积包括在使支架与细胞群体接触后的所述培养步骤。在又一实施方案中,所述培养可包括在生物反应器的脉动和/或稳流条件。
如本文所述的从脂肪或外周血中分离的平滑肌细胞群体,然后可以接种于如本文所述的支架上,形成结构。
以下为用于在支架上接种细胞协议的具有代表性的实施例。源自脂肪或外周血的平滑肌细胞可扩展至最多7周,以产生接种支架所需足够的所述细胞数量。适于接种支架的所述细胞密度描述如下。在收获细胞用于接种支架以产生结构之前,源自脂肪的平滑肌细胞有可能扩大2代。在用于收获接种之前,源自外周血的平滑肌细胞培养中可能会扩大3-4代。准备细胞接种的支架:可削切合适的材料(例如,PGAfelt)成一定尺寸,缝合成适当的形状,并涂以材料(例如,PLGA)。然后采用合适的方法(例如,环氧乙烷)对所述支架材料进行灭菌。在细胞接种前的一天,可用饱和度60%乙醇/40%的D-PBS、100%的D-PBS、D-MEM/10%FBS或α-MEM/10%FBS连续对所述灭菌的支架进行预润湿,随后在室温下,用D-MEM/10%FBS或α-MEM/10%FBS进行过夜孵育。然后,所述支架可以接种源自脂肪或外周血的成熟平滑肌细胞,而且所述接种的结构在5%CO2的37°C潮湿培养箱中成熟,直到植入到受试者中(例如,7天前)。那些在本领域的普通技术人员将理解用于制备细胞接种支架和接种细胞到支架的附加方法。
在一方面中,本发明提供了在较短时间期限内制备结构的方法,其对所述受试者等待植入结构有利。据报道,源自SVF的未分化的脂肪干细胞在分化成平滑肌细胞(Jack等,2009supra)之前,必须在诱导培养基上孵育6周。在一个实施方案中,该方法包括以下步骤:a)获得人体脂肪组织样本;b)从所述样品中分离完全分化的平滑肌细胞群体;c)培养所述细胞群体;和d)使所述细胞群体与成型聚合物模型细胞结构接触,其中步骤a),b),c)和d)在约45天或更短的时间内进行。在另一实施方案中,进行所述分离步骤没有进行细胞选择。在另一实施方案中,获得步骤a)后,所述分离步骤b)在约72小时或更短的时间内进行。在又一个实施例中,所述培养步骤c)在约4星期或更短的时间内进行。在其它实施例中,所述接触步骤d)在约10天或更短的时间内进行。在另一实施方案中,步骤a),b),c)和d)在约28天或更短的时间内进行。在另一实施方案中,在获得步骤a)后,所述分离步骤b)在约48小时或更短的时间内进行。在一个实施方案中,所述培养步骤c)在约2周或更短的时间内进行。在另一实施方案中,所述步骤d)在约5天或更短的时间内进行。在所有的实施方案中,所述人体脂肪组织样品从非自体来源获得。在另一实施方案中,所述方法进一步包括检测表达平滑肌细胞标记物的所述步骤。在另一实施方案中,表达为mRNA表达。在进一步的实施方案中,所述表达为多肽表达。在一个实施方案中,所述多肽表达由细胞内免疫荧光检测。
在一个实施方案中,所述支架包括如本文所述的细胞群体。在另一实施方案中,所述支架基本上由如本文所述的细胞群体组成。在另一实施方案中,所述支架由如本文所述的细胞群体组成。
A.泌尿系统结构
本发明提供了用于所述泌尿系统天然管腔器官或组织构造的重建、更换、扩增、或再生的结构。所述泌尿系统的所述器官或组织构造,也可以被称为泌尿生殖器或泌尿生殖器官或组织构造。所述天然器官或组织构造可为层状组织。
在另一实施方案中,含有所述模型和细胞的所述结构不含任何其它细胞群体。在一个优选的实施方案中,所述结构不含上皮细胞。
这些结构用于提供有需要的受试者管腔器官或组织构造,如生殖泌尿器官,包括例如,所述膀胱、输尿管和尿道。所述受试者可能需要重建、扩增或替换此器官或组织。在一个实施方案中,所述管腔器官或组织构造为膀胱或其部分,并且所述聚合物模型或支架在所述模型表面具有平滑肌细胞沉积。所述结构也可以用于提供尿流改道或导管、或逼尿肌肌肉等价物。
在一方面中,本发明提供了接种如本文描述的细胞群体的支架或模型。
如本文所述,本文所述的所述膀胱扩增或替代支架可包括至少一个、或至少两个模型。所述模型可能为聚合物和/或生物相容性。所述第一聚合物模型或所述第二聚合物模型,如果有的话,或两者,在所述第一聚合物模型第一表面或内部,在所述第二聚合物模型的第一表面,或在两者上至少具有一种细胞群体沉积,以形成模型结构或支架细胞,其中,至少一种细胞群体基本上包括肌肉细胞群体。所述肌肉细胞群体,例如,平滑肌细胞群体。在另一实施方案中,所述第一表面和所述第二表面每个都为第一和第二聚合物模型的外表面。
形成膀胱导管、尿流改道或泌尿导管结构的所述支架或模型将接种本文所述的细胞群体。这种支架已接种细胞群体,并在本文中可称为“结构”。在一个实施方案中,所述尿流改道或膀胱导管结构由如本文所述的一个或多个支架和如本文所述的一个或多个所述支架表面沉积的细胞群体组成。
用于形成肌肉等价结构的支架或模型可用于增强有需要的受试者现有的管腔器官或组织构造,如生殖泌尿器官,包括例如,所述膀胱。所述受试者可能需要扩张或治疗这样的器官或组织。在一个实施方案中,所述管腔器官或组织构造为膀胱或其一部分,及所述聚合物模型或支架,在所述模型表面具有平滑肌细胞的沉积。在一个实施方案中,所述结构用于提供逼尿肌肌肉等价物。
那些在本领域的普通技术人员将理解用于在模型或支架上沉积细胞群体的几种合适方法。
在一方面中,所述结构适合于在有需要的受试者中植入新的器官或组织构造。在一个实施方案中,所述结构包括产生所述细胞因子MCP-1的细胞群体。在另一实施方案中,所述MCP-1诱导迁移所述受试者或接受者的天然间充质干细胞到植入部位。在一个实施方案中,所述迁移接受者的骨髓间充质干细胞有助于所述新器官或组织构造的再生。
在一方面中,本发明的所述结构适于提供植入后所述受试者的特定特征。在一个实施方案中,所述结构适于为所述受试者提供植入后的再生。在另一实施方案中,所述结构适于促进受试者在所述植入位点的再生。例如,在植入后,再生组织可以在植入位点形成所述结构本身。在另一实施方案中,所述结构可以对植入后的所述受试者赋予功能属性。例如,尿分流结构可适于允许所述受试者的尿液从第一输尿管(例如,第一侧开口部)到所述支架的所述管状内部通过,和/或适于提供临时存储和尿液(例如,管状支架)离开受试者的通道。在一个实施方案中,尿流改道结构可适于在植入物上提供上皮黏膜。在另一实施方案中,结构可适用于在受试者中提供新的器官或组织构造发育的稳态调节。
在一方面中,本发明提供了适于在尿流改道结构管状支架的第一端部和腹壁部分之间的连接位点植入的网状构造,如本文所述。在一个实施方案中,在植入如本文所述的尿流改道结构后,所述网状构造适于方便形成新泌尿导管。在另一实施方案中,所述网状构造适于在皮下脂肪和骨骼肌之间植入。在另一实施方案中,所述网状构造适于提供造口的通畅。在另一实施方案中,所述网状构造位于辅助腹壁的开口(例如,造口门位置)的位置。在一个优选的实施方案中,所述网状构造为疝气补丁,更优选为皮下疝补丁。
用于与泌尿系统器官或组织构造的所述结构可以接种如本文所述的平滑肌细胞群体。所述SMC群可从来源(例如脂肪或外周血)获得,所述来源不是(属于所述重建、替换、扩大、或再生的所述受试者的)所述器官或组织构造,例如对于需要所述结构的受试者而言,其中来源为自体或非自体(例如,同种异体的或同源的)。
在另一方面,本发明涉及的结构用于泌尿系统的天然管腔器官或组织构造的重建、替换、扩大、或再生,其含有源自膀胱来源的平滑肌细胞(SMC),其为非自体来源。所述非自体来源可以是同种异体的的或同源的。所述非自体膀胱源的SMC可能会根据本文所述的协议接种在合适的支架上。在一个优选的实施方案中,所述结构从支架和膀胱来源的SMC形成,但不含尿道上皮细胞。所述膀胱来源的SMC可接种到膀胱扩大、膀胱更换、泌尿导管,或肌肉等价支架上,以形成结构。
B.胃肠道组织构造
在一方面中,本发明提供了一个或多个接种细胞群体的胃肠道(GI)相关的聚合物支架或模型。此GI支架已至少接种一种细胞群体,并且本文中可称为“结构”。在一个实施方案中,所述支架接种不是源自胃肠道(GI)组织源的细胞群体。所述非GI源可以是脂肪或外周血。在另一实施方案中,所述细胞群体为SMC群体。所述支架可基本上无其他细胞群体,包括,例如,胃肠道细胞群体。所述支架材料可包括,组成,或基本上由一个细胞群体(例如,不是源自GI组织的SMC群体)组成。在另一实施方案中,所述支架可以是GI组织支架,例如,食管组织或肠道支架。
在一个实施方案中,可以从有需要的受试者的脂肪组织或外周血中分离出自体SMC细胞群体。所述细胞群体可以接种到支架上适合植入到受试者所述GI系统内的位点。本发明所述细胞群体的优点为:如果所述受试者具有GI系统缺陷的话,该适当的SMC可能不提供源自所述受试者胃肠道系统的来源,例如,所述GI系统癌症。所述细胞群体可用于受试者胃肠道系统部分或全部被除去的情况,如食管癌的情况。当受试者的食管或食管的一部分除去后,自体SMC群体可以从脂肪活检中分离、培养、在合适的支架上接种,并植入到受试者中,以提供新的食管或新的食管组织构造。
在另一方面中,本发明提供了一种或多种聚合物支架或模型,其接种SMC群体和GI细胞群体。在一个实施方案中,所述细胞接种的聚合物模型或模型形成了胃肠道(GI)组织结构或新的GI结构。在另一方面中,通过使用所述SMC群体,本发明涉及的结构适于促进所述沉积或接种的GI细胞群体。已经发现,在GI支架上或其内部沉积或者接种脂肪来源的SMC群体可能提高GI细胞群体随后的接种或沉积。在一个实施方案中,所述结构具有事先沉积的SMC群体,以方便GI细胞群体在支架表面上或内部迁移或接种。在另一实施方案中,预先沉积SMC群体的结构有利于GI细胞群体的迁移,以使所述支架和/或所述沉积SMC群体接触。GI细胞群体的所述迁移可能是在体外或在体内。在另外一个实施方案中,所述GI细胞群体源自其中之一:食管、小肠、大肠、胃、结肠,或肛门括约肌。
根据本文所述的协议,细胞可接种于GI支架上。实施例11和13提供了在GI支架上接种细胞群体的示例性方法。那些在本领域的普通技术人员将会理解用于制备接种细胞的支架和在支架上接种细胞的附加方法。
在一个实施方案中,所述GI支架包括如本文所述的细胞群体。在另一实施方案中,所述GI支架包括脂肪源的SMC群体和GI细胞群体。所述GI的细胞群体可能为食管细胞群体或小肠细胞群体。在另一实施方案中,所述接种基本上由如本文所述的脂肪来源的SMC群体和GI细胞群体组成。在另一实施方案中,所述支架由如本文所述的脂肪来源的SMC群体和GI细胞群体组成。
另一方面,本发明提供的结构只接种平滑肌细胞群体。在一个实施方案中,所述结构只接种脂肪来源的或血液来源的SMC群体。此结构没有任何其它胃肠道细胞群体,包括但不限于,食管细胞群体(例如,食管上皮细胞群体)、小肠细胞群体、大肠的细胞群体、胃细胞群体,结肠细胞群体,或肛门括约肌细胞群体。在另一实施方案中,所述结构没有成纤维细胞群体(例如,皮肤成纤维细胞群体)。
在另一实施方案中,所述SMC(仅)结构选自:食管、小肠、大肠、胃、结肠,或肛门括约肌。在另外一个实施方案中,所述结构包含,由以下或基本上由支架和平滑肌细胞群体(例如,脂肪或血液源的SMC群体)组成。
在另一方面,本发明的所述结构科具有的某种结构和功能特性使其特别有利地用于本文所述的治疗方法。在一个实施方案中,所述结构由作为模型提供的支架组成,所述模型具有第一表面、和直接接种在所述第一表面上或其中的细胞群体。所述结构可只有一种细胞群体。在一个实施方案中,所述一种细胞群体为平滑肌细胞群体。所述支架在其外表面或管腔表面可以具有褶皱,如上所述。在另一实施方案中,所述结构由接种了平滑肌细胞(SMC)群的支架组成,其中所述结构具有吸引或促进另一细胞群体向的所述SMC接种的结构迁移的能力。实施例13提供了此功能能力的论证。所述迁移细胞群体可能为食管细胞群体、小肠细胞群体、大肠细胞群体、胃细胞群体、结肠细胞群体、或肛门括约肌细胞群体。
在另外一个实施方案中,所述迁移的细胞群体可能为食管上皮细胞群体。完整的、天然的食管由上皮细胞层的管腔层组成。这是有利的,对于没有接种上皮细胞的SMC接种的结构,使其具有吸引或促进来自食管组织的上皮细胞(在植入受试者之前)迁移到所述结构上或所述结构中的功能性能力。
在另一实施方案中,第一支架或聚合物模型(和/或第二支架或聚合物模型,如果有,或两者)包括至少一种沉积于所述第一聚合物的模型(和/或所述第二聚合物模型的第一表面,或两者)的第一表面上的SMC群体,以形成模型或支架加细胞的结构,其中,至少一种细胞群体包括SMC群体。所述SMC为脂肪或血液来源的平滑肌细胞群体。
在一方面中,本文所述的结构,在植入后适于或能够为受试者提供再生的GI器官或GI组织。所述再生/再生GI器官或GI组织方面,见实施例8(食管)和9(小肠)所述。
在一方面中,本发明提供了用于治疗有需要的受试者的胃肠(GI)疾病,和使用所述相同的治疗方法。在一个实施方案中,所述结构包括(a)支架;(b)沉积在所述支架第一表面上或其内部的,并且不是源自胃肠道组织的第一细胞群体;和(c)源自胃肠道组织的第二细胞群体。所述第一细胞群体可源自脂肪。所述第一细胞群体可以是平滑肌细胞群体。在另一实施方案中,所述SMC群体至少对一个平滑肌细胞标记物为阳性。在另外一个实施方案中,所述第二细胞群体源自从食管、小肠、大肠、胃、结肠、或肛门括约肌。
在又一实施方案中,所述结构对至少一个GI标记物为阳性。所述GI标记物可以为上皮细胞标记物。
在一个实施方案中,所述第二细胞群体在所述支架的第二表面上沉积。在另一实施方案中,所述第二细胞群体与沉积的第一细胞群体接触。
在另一实施方案中,所述结构包括具有协调节奏收缩功能的细胞。在另一实施方案中,所述结构植入后适于形成胃-肠道组织。所述GI组织可能为食管、小肠、大肠、胃、结肠、或肛门括约肌。
在另一实施方案中,所述结构在植入时形成再生的GI组织。在一个实施方案中,所述再生GI组织为食管、小肠、大肠、胃、结肠,或肛门括约肌组织。在另一实施方案中,所述再生的组织为食管组织。所述再生食管组织可能具有管腔黏膜表面和/或固有层和黏膜肌层。在一个优选的实施方案中,所述再生GI组织为食管组织。在另一实施方案中,所述结构在植入时适合于形成表皮管腔黏膜表面。
在所有实施例中,所述支架为GI支架。在所有的实施方案中,所述GI组织支架为食管组织支架、小肠组织支架、大肠组织支架、胃组织支架、结肠组织支架、或肛门括约肌组织支架。在所有实施方案中,所述结构为GI组织构造。在所有的实施方案中,所述GI组织结构为食管组织结构、小肠组织结构、大肠组织结构、胃组织结构、结肠组织结构、或肛门括约肌组织结构。
C.呼吸组织结构
在一方面中,本发明提供了接种本文所述的细胞群体的呼吸组织结构。这种支架已接种了细胞群体,并在本文中可称为“结构”。在一个实施方案中,所述呼吸组织结构由如本文所述的一个或多个支架和沉积在如本文所述的一个或多个支架的一个或多个表面上的细胞群体组成。所述支架接种的平滑肌细胞(SMC)群体源自自体或非自体来源。在一个实施方案中,可以从有需要的受试者的所述脂肪组织或外周血中分离出自体SMC细胞群体。可以接种所述细胞群体到适于植入到所述受试者肺内的位点的支架上。本发明的所述细胞群体的优点在于:如果受试者的呼吸系统有缺陷,如肺癌,那么将不能获得源自所述受试者的肺脏的合适的SMC。所述细胞群体可用于受试者的肺部分或全部被除去的情况,如在肺癌的情况。取出受试者的肺或肺组织的部分后,自体SMC群体可从活检中分离、培养、接种于合适的支架上,并植入到受试者中,以提供新肺或新的肺组织构造。
本发明还提供了呼吸组织结构,其包括支架,在所述支架第一表面上或其内部沉积的、并且不是源自呼吸组织的第一细胞群体;和源自呼吸组织的第二细胞群体。在一个实施方案中,所述第一细胞群体源自脂肪。在另一实施方案中,所述第一细胞群体为平滑肌细胞群体(SMC)。所述SMC群体可能被接种在支架上,如本文所描述的每个协议,在这之后所述呼吸细胞群体可接种于预接种SMC的所述支架上。那些在本领域的普通技术人员将会理解,不同的方法可能合适用于接种细胞群体。
在另外一个实施方案中,所述结构对至少一个平滑肌细胞标记物为阳性。在又一实施方案中,所述结构对一个或多个以下的SMC标记物为阳性:心肌素、α-平滑肌肌动蛋白、调宁蛋白、肌球蛋白重链、BAALC、肌间线蛋白、肌成纤维细胞抗原,SM22、和其任意组合。在一个实施方案中,所述第二细胞群体源自肺。在另一实施方案中,所述结构对至少一个呼吸组织标记物为阳性。在又一实施方案中,所述呼吸标记物为下列中的一个或多个:细支气管标记物、肺泡标记物、和上皮标记物。在另外一个实施方案中,所述结构对一个或多个以下的呼吸组织标记为阳性:Clara细胞分泌蛋白(CCSP)、Prosurfactant蛋白C(ProSP-C)、KRT18、分泌球蛋白,家族1A,成员1(子宫球蛋白或SCGB1A1)、表面活性剂蛋白Al(SFTPA1)、和其任意组合。在一个实施方案中,所述细支气管标记物为CCSP和/或SCGB1Al,所述肺泡标记物为proSP-C和/或SFTPA1,及所述上皮标记物为KRT18。在另一实施方案中,所述第二细胞群体在所述支架的第二表面上或其内部沉积。在另一实施方案中,所述第二细胞群体与沉积的第一细胞群体接触。在又一实施方案中,所述结构包括一个或多个肺泡形成单位(AFU)。在一个实施方案中,所述结构包括的细胞具有协调节奏收缩的功能。在另一实施方案中,所述结构植入后适于形成呼吸组织。在其它实施方案中,所述呼吸组织为肺组织。所述肺组织可包括肺泡组织和/或细支气管组织。
这些结构用于给有需要的受试者提供组织构造,如肺组织构造。所述受试者可能需要重建、扩增或替换的呼吸组织。在一个实施方案中,所述呼吸组织为肺或其部分,并且所述聚合物模型或支架在所述模型的表面上具有平滑肌细胞沉积。
在一方面中,本发明的所述呼吸组织结构适于提供植入受试者后的特定特征。在一个实施方案中,所述结构适于提供植入受试者后的再生。在另一实施方案中,所述结构适于促进受试者所述植入位点的再生。例如,植入后,再生组织可以在植入位点形成所述结构本身。在另一实施方案中,所述结构具有植入受试者后的功能属性。在一个实施方案中,所述结构可适于在植入位点形成肺泡形成单元(AFU)。
在一方面中,本发明涉及使用脂肪来源的平滑肌细胞接种的支架作为基板接种肺细胞悬浮液,以使得肺泡形成单元(AFU)数目的增加(与尚未接种脂肪来源的平滑肌细胞支架相比)。就本文所述的本领域的当前情况,其对于肺组织再生而言,为潜在的深远改善。再生医学基础的方法使用完整特征的自体分化细胞类型比非自体细胞类型更加具有优势,例如,同种异基因胎儿源(Andrade等,2007supra)或未分化的,多能的,干/祖细胞(Shigemura等,2006supra)。脂肪来源的平滑肌细胞相比其他细胞有一定的优势,在文献中已经描述(BasuandLudlow,TrendsBiotechnol.2010Oct;28(10):526-33.Epub2010Aug25)。本发明涉及的呼吸组织结构适于通过使用SMC群体来促进呼吸细胞群体的沉积或接种。已经发现,在呼吸组织支架上或其内部沉积或接种脂肪来源的SMC群体可能提高随后的所述接种或沉积呼吸细胞群体。在一个实施方案中,所述结构事先沉积SMC群体有利于在支架上或在表面内迁移或接种呼吸细胞群体。在另一实施方案中,结构事先沉积SMC群体有利于呼吸细胞群体的所述迁移以使所述支架和/或所述沉积SMC群体接触。所述呼吸细胞群体的所述迁移可能是在体外或在体内。
在另一方面,本发明提供了一种或多种聚合物支架或模型,其接种了SMC群体和呼吸细胞群体。在一个实施方案中,所述细胞接种的聚合物模型或模型形成呼吸系统组织结构。
在一方面中,本发明提供了肌肉等价结构,可用于给有需要的受试者增强现有的呼吸器官或组织构造,如肺。所述受试者可能需要扩张或治疗这样的器官或组织。在一个实施方案中,所述呼吸组织为肺或其部分,并且所述聚合物模型或支架,其具有在所述模型表面沉积的平滑肌细胞。
D.血管结构
本发明涉及血管支架和制作所述相同的方法。操作所述支架以形成血管结构。在一方面中,本发明涉及血管结构。在一个实施方案中,所述结构包括:a)具有第一和第二表面的生物相容性管状支架;以及b)源自非血管源的第一细胞群体,其在所述支架第一表面上或其内部沉积。在另一实施方案中,所述第一细胞群体为平滑肌细胞群体。在另外一个实施方案中,所述第二细胞群体可源自非血管源。所述第二细胞群体可在支架第二表面上或内部沉积。在另一实施方案中,所述第二细胞群体为内皮细胞群体。在所有的实施方案中,所述非血管源为脂肪组织。在所有的实施方案中,所述非血管源为外周血。在另一实施方案中,所述管状支架的所述第一表面为外表面。在一个优选的实施方案中,外表面为褶皱的。在另外一个实施方案中,所述管状支架的所述第二表面为内部的、管腔表面。在所有的实施方案中,所述支架可包括合成材料。在所有的实施方案中,所述支架可包括天然材料。
在另一实施方案中,所述第一细胞群体为平滑肌细胞群体。在另一个实施方案中,所述第二细胞群体可源自非血管源。所述第二细胞群体可以沉积在所述支架的第二表面上或其内部。在另一实施方案中,所述第二细胞群体为内皮细胞群体。在所有实施方案中,非血管源为脂肪组织。在所有的实施方案中,所述非血管源为外周血。在另一实施方案中,所述管状支架的所述第一表面为外表面。在一个优选的实施方案中,所述外表面为褶皱的。在另外一个实施方案中,所述管状支架的所述第二表面为内部的、管腔表面。在所有的实施方案中,所述支架可包括合成材料。在所有的实施方案中,所述支架可包括天然材料。在一个实施方案中,用于获取所述第一或第二细胞群体的非血管源为所述受试者自体的。在另一实施方案中,用于获得所述第一或第二细胞群体的非血管源为受试者非自体的。
另一方面,本发明提供了源自本发明支架的血管结构。鉴于其大量相似的天然血管,所述支架特别适合于修饰以创建所述结构,又可作为血管旁路移植术用于心血管疾病的治疗。血管旁路移植术包括动静脉(AV)分流。在一个优选的实施方案中,本发明的所述支架可以用来创建血管结构,其具有较小的直径,通常小于6毫米,用于治疗心血管疾病。
如本文所讨论的,所述支架的某些实施方案已经显示表现出J形应力/应变曲线为特征对应力和应变的机械响应,其归因于弹性模量和模量转换的范围及其任意组合。除了所述模量参数,也所述支架所表现出的其他属性,使其具有在血管移植中使用的吸引力。在一方面中,本发明的所述支架显示出一定的特性,使它们特别适合制作血管结构,起初用于血管移植,并确保植入的血管移植保持通畅。这些性质包括但不限于,那些允许在支架上接种的所述细胞,那些提供抗断裂性的支架,和那些提供粘弹性的支架。
在一个实施方案中,所述性能有利于在支架上接种所述细胞,其归因于孔隙梯度,其中所述孔直径从所述外膜或外部侧的约100微米逐渐减小到管状元件的所述管腔或内侧的约5至约15微米。孔隙直径为在支架上或支架内接种细胞成功的重要因素,这是在本领域中公知的。例如,孔隙直径必须足够大,使各种细胞类型的迁移到所述支架的表面并通过支架,使它们可以与其它迁移细胞以体内观察到的类似的方式相互作用。本发明涉及所述发现特定的孔梯度有助于细胞的成功接种。在一个实施方案中,所述孔梯度使得所述支架易通过细胞,从而提高其细胞接种容量。在另一实施方案中,孔梯度为约100微米(外侧)至约5微米(内侧),约(外侧)100微米至约6微米(内侧),约100微米(外侧)至约7微米(内侧),约100微米(外侧)至约8微米(内侧),约100微米(外侧)至约9微米(内侧),或约100微米(外侧)至约10微米(内侧)。
在一方面中,所述孔梯度提供的结构,其有利于在所述管腔上、TE支架内侧接种细胞,以及在外部的、TE支架外部、外膜侧接种所述细胞。在一个实施方案中,在所述管腔的、内表面上的较小的孔尺寸,适合于在所述内部表面内接种内皮细胞;在所述外部的、外膜侧的较大的孔尺寸适合于在外部表面内接种平滑肌细胞。在另一实施方案中,接种所述内皮细胞以在所述TE支架内部、管腔表面形成单层或平薄片状结构,和/或在所述TE支架所述外部的、外膜表面上和/或其内接种所述平滑肌细胞。
在一些实施方案中,超出一定孔径,接种于所述TE支架上及整个内部、管腔表面的所述内皮细胞,无法朝向外部、外膜表面迁移。在优选的实施方案中,所述孔的大小约15至约20微米。在另优选的实施方案中,所述孔的大小约15微米、约16微米、约17微米、约18微米、约19微米,或约20微米。
另一方面,本发明提供了本文所述的源自血管支架的血管结构。作为结果,所述结构表现出基本上类似于天然血管那些已发现的的结构和功能特性。在一个实施方案中,本发明的所述TEBV特点为有能力以各向异性的方式机械响应应力及应变。在另一实施方案中,所述TEBV具有(i)有利于所述支架抗断裂的特征;和/或(ii)有利于所述支架粘弹性的特征。
另一方面,本发明的所述组织工程血管(TEBV)可调节某些与以下植入后观察到的血管移植相关并发症。在一个实施方案中,所述TEBV调节植入后的顺应性差异(compliancemismatch)。在另一实施方案中,所述调节包括一个或多个以下:抗动脉瘤形成、耐扩张、抗断裂、抗血栓形成、抗吻合口增生、和耐内膜增生。那些本领域的技术人员将会理解由所述TEBV调节的额外因素。
在一方面中,本发明提供的血管结构含有如本文所述的支架和细胞群体。在一个实施方案中,支架可被操纵以形成血管结构,其适合于移植到有需要的哺乳动物。例如,支架可通过如本文所述的方法添加一种或多种细胞群体操纵。那些本领域的普通技术人员将会理解,本发明的所述血管结构可能适用于许多类型的血管,包括但不限于,颈动脉、锁骨下动脉、腹腔干、肠系膜动脉、肾动脉、髂动脉、小动脉、毛细血管、小静脉、锁骨下静脉、颈内静脉、肾静脉,髂总静脉,腔静脉。
所述血管结构的第二管状元件的内部和/或所述结构的第二管状元件的外部表面上可具有第一细胞群体。在优选实施方案中,所述第一细胞群体为平滑肌细胞群体。那些在本技术领域的技术人员将会理解,不同类型的平滑肌细胞(SMC)可适合用于本发明(见Bertram等,美国出版申请20070190037和Ludlow等,美国出版申请号20100131075,二者的全部内容通过引用纳入本文),包括但不限于,人主动脉平滑肌细胞、人脐动脉平滑肌细胞、人肺动脉平滑肌细胞、人类冠状动脉平滑肌细胞、人支气管平滑肌细胞、人类桡动脉平滑肌细胞,以及人类隐静脉或颈内静脉平滑肌细胞。如上文Bertram等人所述,所述平滑肌细胞可从各种来源分离,包括例如,源自活受试者的活检及从尸体恢复的整个器官。如上文Ludlow等所述,所述SMC可从脂肪组织或外周血中获得。所述SMC可能为需要所述结构治疗的受试者的自体细胞并从所述受试者分离的活检中分离,预期为结构的接受者。所述SMC可能为需要治疗的受试者的非自体,并从合适供体获得的活检中分离。
在一个实施方案中,接种于支架上的所述平滑肌细胞群体源自非血管源。在另一实施方案中,本发明的所述结构没有源自血管源的细胞。在本发明的所述血管结构可包括,基本上由,或由源自非血管源的平滑肌细胞群体组成。所述SMC群体可源自脂肪组织或外周血。
在另一实施方案中,所述结构在所述内部或管腔表面包含第二细胞群体。在优选的实施方案中,所述第二细胞群体为内皮细胞群体。那些本领域的技术人员将理解,不同类型的内皮细胞(EC)可能适合用于本发明(见美国出版申请20070190037,其全部内容通过引用纳入本文),包括但不限于,动脉和静脉EC,如人类冠状动脉内皮细胞、人类主动脉内皮细胞、人类肺动脉内皮细胞、真皮微血管内皮细胞、人脐静脉内皮细胞、人脐静脉血管内皮细胞、人隐静脉内皮细胞、人颈内静脉内皮细胞、人体桡动脉内皮细胞和人乳内动脉内皮细胞。EC可从各种来源分离,包括但不限于,脂肪组织、外周血、血管软组织、循环内皮细胞和内皮细胞的前体(如骨髓祖细胞,外周血干细胞和胚胎干细胞)(见Bischoff等,美国出版申请20040044403和Raffi等,美国专利6,852,533,其中每个其全部内容通过引用纳入本文)。
那些本领域的技术人员将理解,可以通过本领域中已知的各种方法接种或沉积本文所述的一种或多种细胞群体。例如,也可使用生物反应器孵化和培养,(Bertram等,美国出版申请20070276507;McAllister等,美国专利7,112,218;Auger等,美国专利5,618,718;Niklason等,美国专利6,537,567);压力诱导接种(Torigoe等,(2007)CellTransplant.,16(7):729-39;Wang等,(2006)Biomaterials.May;27(13):2738-46);和静电接种(Bowlin等,美国专利号5,723,324)。此外,最新技术,以细胞的气溶胶同步涂覆静电纺纤维可适合于接种或沉积(Stankus等,(2007)Biomaterials,28:2738-2746)。
在一个实施方案中,细胞的所述沉积包括将管状支架与细胞附着增强蛋白接触的步骤。在另一实施方案中,所述增强蛋白质为以下一个或多个:纤维连接蛋白、胶原蛋白、和MATRIGELTM。在另一实施方案中,所述管状支架不含有细胞附着增强蛋白。在另一实施方案中,细胞的沉积包括使管状支架与一种或多种细胞群体接触后的培养步骤。在又一实施方案中,所述培养可包括由通过脉动和/或稳流在生物反应器中的调控。
E.眼睛组织结构
另一方面,本发明考虑本文所述的SMC群体用于眼部疾病治疗的应用。眼部疾病为所述受试者具有眼睛缺陷,由于所述眼部肌肉功能不正常造成。在所述眼睛中,平滑肌作为睫状肌存在并控制所述眼睛适应于对不同距离物体的观察,及调节通过巩膜静脉窦的水状液体的所述流量。然后平滑肌也存在于所述眼睛的虹膜中。发生如老花眼和远视眼疾病的个体可受益于这些SMC群体。在一个实施方案中,可从有需要的受试者中的脂肪组织或外周血中分离非自体SMC细胞群体。所述细胞群体可以接种到支架上适合于植入所述受试者所述眼睛内部的位点。本发明所述细胞群体的优点是,合适的SMC可能不能获得,对于用于源自所述受试者的眼睛的来源,如果所述受试者的眼睛有缺陷或由于眼睛组织的有限获得性或由于难以进行活体检查。非自体SMC群体可从活检中分离、培养、接种在合适的支架上,并植入到受试者中以提供新的眼睛组织。在另一实施方案中,本发明的所述平滑肌细胞群体可以从非眼睛来源获得并施用于具有眼睛疾病的受试者中,而无需使用支架。那些在本领域的普通技术人员将理解合适的植入方法。所述非眼睛来源可能为自体或非自体。
6.使用方法
A.使用管腔器官和组织构造结构
在一方面中,本发明考虑用于给有需要治疗的受试者提供层状组织管腔器官或组织构造的方法。在一个实施方案中,所述受试者可能需要重建、再生、扩大或替换器官或组织。在一个实施方案中,所述方法包括提供生物相容的合成或天然聚合物模型被成形以符合在有需要器官或组织构造中的至少部分的器官或组织构造。所述提供步骤可随后进行沉积至少一种所述受试者的非自体细胞群体,并且所述细胞群体不是源自所述重建,再生,扩大或替换的受试者相应的器官或组织构造。所述沉积步骤可包括在所述聚合物模型上培养所述细胞群体。在所述模型上沉积所述细胞群体以提供结构之后,它可以在治疗位点植入到患者体内,以形成所述所需的层状组织管腔器官或组织构造。
在另一方面,本发明提供了用于给有需要的受试者提供层状组织管腔器官或组织构造的方法。在一个实施方案中,所述方法包括以下步骤:a)提供生物相容的合成或天然聚合物模型,其被形成以符合在需要治疗的器官或组织构造的至少部分;b)在所述聚合物模型第一区域上或内部沉积所述受试者非自体的细胞群体,而且所述细胞群体不是源自新的器官或组织构造相应的器官或组织;和)在所述受试者中植入成型的聚合物模型细胞结构以形成层状组织管腔器官或组织构造。
本发明还提供了用非天然器官或人造器官替换天然管腔器官或组织构造的方法。所述替换器官为非天然或人造,在这个意义上,它不是所述天然器官的原始形式,但仍然能够有相同或大致类似方式的功能。受试者的所述天然器官或组织构造可能通过植入本文所述的构造以形成非天然器官或人造器官,而被非天然器官或人造器官替换。所述非天然器官或人造器官包括所述受试者接受所述结构的自体或非自体细胞。在植入的初始阶段和以后有限时间内,所述结构由可生物降解支架接种的细胞组成,但所述支架降解后,非天然器官或人造器官将不包含合成成分,如支架。所述非天然器官或人工器官已形成所述植入结构。在另外一个实施方案中,非天然器官或人造器官形成的植入结构,包括但不限于,膀胱扩大结构、膀胱替换结构、泌尿导管结构、肌肉等价结构、呼吸组织构造、胃肠组织构造、或血管结构。
在所有实施方案中,本发明的所述方法进一步包括将所述管腔器官或组织构造用所述受试者的网膜、肠系膜、肌肉筋膜、和/或腹膜包装的步骤,以允许血管形成。
在一个实施方案中,所述支架、细胞群体、以及本文所描述的方法还可进一步用于本文所述疾病的治疗中有用药物的所述制备。所述疾病包括受试者中所需的层状组织管腔器官或组织构造的再生、重建、增加或替换的任何病症。
在另一实施方案中,在植入结构上沉积的所述细胞产生MCP-1,并在植入位点释放,刺激天然骨髓间充质干细胞(MSC)向植入位点迁移。在另一实施方案中,所述天然骨髓间充质干细胞促进和/或增强在所述植入位点的所述植入构造的再生。
如上所述,本发明的所述结构可含有需要治疗的受试者的非自体细胞群体。此外,在不使用支架的情况下,本发明的所述细胞群体可以给有疾病的受试者施用。那些在本领域的普通技术人员将理解合适的植入方法。所述非自体细胞群体可能为同种异体的或同源的。
在一个实施方案中,在不需要免疫抑制剂的情况下,任何含有非自体细胞的结构和/或细胞本身可以给有需要的受试者施用。所述免疫抑制剂,包括但不限于,硫唑嘌呤、环磷酰胺、咪唑立宾、环孢素、他克莫司水合物、苯丁酸氮芥、氯苯扎利二钠、金诺芬、前列地尔、盐酸胍立莫司(GusperimusHydrochloride)、biosynsorb、鼠单克隆抗体、alefacept、喷司他丁、达利珠单抗、西罗莫司、霉酚酸酯、leflonomide、巴利昔单抗、dornaseα、bindarid、克拉屈滨、吡美莫司、伊洛白介素、西利珠单抗、依法利珠单抗、依维莫司、阿尼莫司、gavilimomab、法拉莫单抗、氯法拉滨、雷帕霉素、siplizumab、saireito、LDP-03、CD4、SR-43551、SK&F-106615、IDEC-114、IDEC-131、FTY-720、TSK-204、LF-080299、A-86281、A-802715、GVH-313、HMR-1279、ZD-7349、IPL-423323、CBP-101、MT-1345、CNI-1493、CBP-2011、J-695、LJP-920、L-732531、ABX-RB2、AP-1903、IDPS、BMS-205820、BMS-224818、CTLA4-lg、ER-49890、ER-38925、ISAtx-247、RDP-58、PNU-156804、LJP-1082、TMC-95A、TV-4710、PTR-262-MG,和AGI-1096(见美国专利号7563822)。那些在本领域的普通技术人员将会理解其它不需要的免疫抑制剂。
在另一方面中,本发明提供了在植入新器官或组织构造后的预后评价方法。在一个实施方案中,本发明包括下述步骤(a)检测在从所述受试者获得的测试样品中的MCP-1的表达水平;(b)测定MCP-1表达在测试样品中相对于对照样品(或者对照参考值)的表达水平;以及(c)基于对MCP-1表达水平的测定,预测所述患者的再生的预后,其中MCP-1在所述测试样品中有较高水平的表达,相对于所述对照样品(或对照参考值),是在所述受试者中再生的预后。
在另一方面中,本发明提供了患者的预后评价方法(在所述患者中植入新的器官或组织构造后),所述方法包括:(a)获得患者生物样品;以及(b)检测在所述生物样品中的MCP-1表达,其中MCP-1表达是在所述患者中再生的预后。在一些实施方案中,在所述患者生物样品中相对于对照样品(或对照参考值)增加的MCP-1表达,是在所述患者中再生的预后。在一些实施方案中,在所述患者样品中相对于所述对照样品(或对照参考值)降低的MCP-1表达,与所述患者中再生的预后无关。所述患者样品可能是包括体液,例如血液或者尿液。
在一些实施方案中,所述测定步骤包括利用由合适的处理器为以下所述目的而执行的软件程序:(i)测量在测试样品和对照中的MCP-1表达的差异水平;和/或(ii)对从在测试样品和对照中测量的MCP-1表达差异水平进行分析。在现有技术中已知的合适的软件和处理器是可以商业获得的。所述程序可以体现储存在有形媒介上的软件中,所述有形媒介例如CD-ROM、软盘、硬盘驱动器、DVD或者与所述处理器关联的存储器,但是本领域普通技术人员可以理解所述整个程序或者其部分可以选择性地由处理器以外的其它装置执行,和/或体现在固件中,和/或以已知的方式体现在硬件中。
在所述测定步骤后,所述测量结果、发现、诊断、预期和/或治疗建议通常被记录和传达给技术人员,例如医生和/或患者。在某些实施方案中,计算机将被用于将这种信息传递给有关各方,如患者和/或主诊医生。在一些实施方案中,执行试验或试验结果的分析在国家或司法管辖区(其与所述结果或诊断被传达的国家或司法管辖区不同)进行。
在优选的实施方案中,根据在测试受试者中测量的所述MCP-1表达水平而作出的预后、预期和/或治疗建议尽可能快地传达给所述受试者,在完成所述分析以及形成所述预后和/或预期后。所述结果和/或相关信息可以通过所述受试者的治疗医生传达给所述受试者。可选择地,所述结果可以直接传达给测试受试者,通过任何传达方式,包括书面、电子形式的通讯(如电子邮件,或电话)。通过使用计算机(例如电子邮件通信),可以促进通信。在某些实施方案中,含有预后测试结果、和/或来自所述测试的结论、和/或基于所述测试的治疗建议的通信,可以形成和自动传递给所述受试者,使用计算机硬件和软件,这对在电信学领域的技术人员是熟悉的。医疗保健为主的通信系统的一个实施例的描述参见于美国专利号6,283,761;尽管如此,本发明不限于利用这种特定通信系统的方法。在本发明方法的某些实施方案中,本方法步骤的所有的或者一些,包括样品检测、再生的预后和/或预期,并且检测结果或预后的通信,可以在不同的司法权管辖区(例如外国)进行。
在另一方面中,本文描述的所述预后方法给所述移植成功的各相关方提供了信息、以及再生的康复/治疗方案。在一个实施方案中,所述方法包括检测在来自所述受试者的测试样品中的MCP-1表达水平的步骤;(b)测定在所述测试样品中,MCP-1表达相对于对照样品(或者对照参考值)的表达水平;以及(c)基于所述MCP-1表达水平的测定,预测所述患者再生的预后,其中在所述测试样品中MCP-1表达的较高水平(相对于所述对照样品(或对照参考值)),是新呼吸组织再生的指示状态。
如本文所描述的,“再生预后”或者“再生的预后”,通常是指植入本文所描述的结构后的可能过程或结果的预测或预期。在一个实施方案中,再生预后包括以下的一种或多种的预测或预期:在通过植入本文所描述的结构以替换膀胱或扩大膀胱后的膀胱功能的发育或改善;在植入本文所描述的结构后,膀胱容量或者改良后的膀胱容量的发育;或者在植入本文所描述的结构后膀胱顺应性或改良后的膀胱顺应性的发育;在植入本文所描述的组织结构后(在重建、扩大或者替换的胃肠道组织后),胃肠道(GI)功能或者GI容量的发育;在通过植入本文所描述的结构以替换或扩大呼吸组织后,功能性肺脏的发育或完善;或者在植入本文所描述结构后肺脏容量或者改良的肺脏容量的发育。
如本文所描述的,“再生的组织”是指新组织构造的所述组织,其在植入本文所描述的结构后发育。所述再生的结构可以是膀胱或者膀胱的部分、尿道管、胃肠组织、或者全肺或肺部分。所述再生的组织可以包括具有基本的平滑肌的连续尿道上皮。
在所有的实施方案中,本发明涉及的方法为有需要的受试者提供了新的器官或组织构造,包括植入后监测步骤。在一个实施方案中,为如本文所描述的有需要治疗的受试者提供器官或组织构造的方法可以包括如本文所描述的再生的预后评价的植入后步骤。在另一个实施方案中,监测植入后结构的所述功效和性能,例如通过在植入后不同时间点的超声成像、肾盂造影、以及尿液和血液分析。
在一个实施方案中,所述支架、细胞群体、结构和本文所描述的方法可以进一步用于制备药物,所述药物用于本文所描述疾病的治疗。所述疾病包括在受试者中需要再生、重建、扩大或者替换天然管腔器官或组织构造的任何病情。所述器官或组织构造可以是层状组织的。
B.使用泌尿系统器官和组织构造结构
本发明提供用于所述泌尿系统的天然管腔器官或组织构造的重建、替换、扩大,或再生的结构的使用方法。所述泌尿系统的所述器官或组织构造,也可以被称为为泌尿生殖道或泌尿生殖道器官或组织构造。所述天然器官或组织构造可能为层状组织。
在另一方面,本发明提供了为有需要的受试者提供新膀胱其部分的方法。在一个实施方案中,所述方法包括:a)提供生物相容性合成的或天然的聚合物模型,其被形成以符合膀胱或其部分;b)在所述聚合物模型第一区域上或其内部,沉积所述受试者的非自体细胞群体,并且所述细胞群体不是源自所述受试者的膀胱;以及c)在受试者中植入合适的聚合物模型细胞结构以形成新膀胱或其部分。在另一实施方案中,本方法所述步骤b)的所述细胞群体,其含有一种或多种具有收缩功能的外周血来源的平滑肌细胞,其对平滑肌细胞的标记物为阳性,或步骤b)所述的细胞群体,其含有一种或多种具有收缩功能的脂肪组织来源的平滑肌细胞,其对平滑肌细胞的标记物为阳性。在另外一个实施例中,所述收缩功能的细胞群体是钙依赖性的。
在所有的实施方案中,本发明的所述方法利用植入结构基于膀胱替换支架、膀胱增大支架、膀胱导管支架,或逼尿肌等价支架,其已经接了种本文所述的细胞群体。
在所有实施方案中,本发明的所述方法进一步包括用所述受试者的网膜、肠系膜、肌肉筋膜,和/或腹膜将所述植入结构包裹的步骤,以允许血管形成。当植入本文所描述的任何泌尿系统结构时,可使用所述包裹步骤。
所述器官或组织构造为膀胱或膀胱的部分。在另外一个实施方案中,形成所述层状组织管腔器官或组织构造在体内表现出天然膀胱组织的顺应性。
在另一方面,本发明提供了用于为有需要的受试者中有缺陷膀胱提供尿流改道或导管的方法。在一个实施方案中,为有需要的受试者提供尿流改道的方法包括下列步骤:(a)提供生物相容性导管支架;(b)在所述支架的第一区域上或其内部,沉积所述受试者非自体的第一细胞群体,所述第一细胞群体基本上为肌肉细胞群体;及(c)在所述受试者中植入步骤(b)中的所述支架,并可以形成管道,允许尿液从所述受试者排出。在另一实施方案中,所述生物相容性材料是可生物降解的。在其它实施方案中,所述生物相容材料为聚乙醇酸。在又一实施方案中,所述第一细胞群体基本上为平滑肌细胞群体。
在一个实施方案中,所述方法包括如本文所述的提供尿流改道或导管支架的步骤。在其它附加的实施方案中,所述尿流改道或导管支架在多个部分中提供,如本文所述的第一、第二,和第三支架。在另一实施方案中,所述方法进一步包括沉积细胞群体的步骤,其不是源自所述有缺陷的膀胱以形成尿流改道或导管结构。在另一实施方案中,所述沉积步骤可包括在所述支架上培养所述细胞群体。在一些实施方案中,所述方法进一步包括在有需要的患者中植入所述尿流改道结构的步骤。在另一实施方案中,所述植入在所述有缺陷膀胱的所述部位。
在一个实施方案中,所述结构的开口端(例如,配置连接到腹壁的第一端)与所述皮肤(造口)相吻合,通过所述腹部或耻骨壁,以形成造口或括约肌。在另一实施方案中,通过造口开口插入导管并进入所述结构的管腔以提供尿液流出。
图11A-B示出了植入的导管结构的形态。
在另一实施方案中,本发明的所述方法进一步包括所述步骤:在植入尿流改道结构后,监测所述导管阻塞物的存在。所述阻塞物可能由所述积聚的碎屑引起。所述方法可进一步包括以下步骤:如果检测到阻塞物,从所述导管的管腔中除去阻塞物(例如,清创术)。
在一方面中,本发明在临时的基础上为有需要的受试者提供了尿流改道。在一个实施方案中,临时尿流改道或导管结构被植入到受试者体内,以形成造口开口,而且暂时通过造口将导管或其它设备插入到所述导管结构的管腔。临时管道提供了允许尿液从受试者排除的优势为,同时也尝试了长期解决有缺陷的膀胱问题。例如,可在植入接种有细胞群体(例如,见Bertram等,同上文)的新膀胱结构之前、之后或同步进行导管结构的所述植入。图11B显示了植入临时尿流改道结构组分的实施例。
在一个实施方案中,本发明的所述方法进一步包括用所述受试者的网膜、肠系膜、肌肉筋膜,和/或腹膜将所述植入的尿流改道包裹的步骤,以允许血管形成。
在一方面中,本发明为有需要的受试者提供了永久性基础上的尿流改道。图13示出了永久性尿流改道结构的所述植入组分的实施例。
在一个实施方案中,本文所述的结构可用于前列腺尿道替换和尿流改道。对于需要根治性前列腺切除术以去除前列腺尿道的受试者而言,此过程是必要的。在其它实施方案中,所述结构可用做经皮导流管,以形成阀样扭结的可控导管。在一个额外的实施方案中,所述结构可用于膀胱颈部吊索和包裹材料,所述包裹材料在膀胱颈手术和具有可控渠道或导尿开口的泌尿出口中使用。此实施方案中的实施例见图14中所示。
尿液通过尿道口离开身体,所述尿道口为独特结构,其包含防止开口发生局部和/或上行性感染的功能,在女性阴道前庭及男性舟状窝排空。具体而言,此区域的所述皮肤黏膜为非角化的复层鳞状上皮,包含糖原丰富的细胞,以提供保护的内源性底物乳酸菌菌群。另外,作为所述上皮接近所述皮肤,其与酸磷酸酶活性和溶菌酶等免疫反应性相联系,指示分泌杀菌化合物(HolsteinAF等,(1991)CellTissueRes264:23)的巨噬细胞的存在。
在一方面中,本文所述的尿流改道或新的泌尿导管(NUC)结构可导致形成尿道黏膜和皮肤上皮之间的天然过渡,其具有在天然尿道中观察到的上皮黏膜区的结构特点。所述过渡区域可作为上皮黏膜。在一个实施方案中,所述结构适于在植入体上以形成上皮黏膜。在一个实施方案中,所述上皮黏膜包括前庭区和上皮黏膜区。在另一实施方案中,所述前庭区与上皮黏膜区相邻。在另一实施方案中,所述上皮黏膜区位于所述结构的基质端部,连接到所述受试者的腹壁和皮肤。在一般情况下,天然存在的上皮黏膜区的特征在于:存在黏膜和皮肤,以及通常存在于身体孔的附近,其中所述外部皮肤端和黏膜覆盖所述身体开始的所述内部。在将尿流改道的第一末端植入到所述受试者后,由本发明方法和所述构建体提供的上皮黏膜形成。在进一步的实施方案中,所述上皮黏膜的特征在于:存在上皮细胞,其第一次出现在所述前庭区并通过所述上皮黏膜区朝所述结构的造口端逐渐扩大或增大。在另一实施方案中,所述上皮细胞的特征在于:表达上皮细胞标记物。在进一步的实施方案中,所述上皮细胞标志为细胞角蛋白。所述细胞角蛋白为一个或多个本领域中已知的细胞角蛋白,包括但不限于,细胞角蛋白1至19。在另外一个实施方案中,用anti-pancytokeratin(AE-1/AE3)抗体和/或细胞角蛋白7(CK-7)的抗体来检测所述细胞角蛋白。
表5.4和图15显示植入的尿流改道或导管实施例的不同区域。第5和6切片对应于(i)所述颅端:所述导管的造口、颅、和中间部分,及(ii)所述尾端:分别为所述导管剩余中间部分和所述左/右输尿管导管联接处。在又一实施方案中,上皮覆盖所述导管尾节的管腔表面,其对为CK-7阳性,如抗-CK-7抗体(例如,第6切片)检测到的。在一个其它的实施方案中,上皮覆盖颅的管腔表面和所述导管的中间方面,其对CK-7为阴性,如抗-CK-7抗体(例如,第5切片)检测到的。在一个实施方案中,上皮覆盖所述导管尾部分的管腔表面,其对AE1/AE3(例如,第6切片)为阳性。在另一实施方案中,上皮细胞覆盖所述导管的颅和中间方面的管腔表面,其对AE1/AE3为阴性,如抗AE1/AE3抗体(例如,第5切片)检测到的。另一方面,所述尿流改道,其特征在于由平滑肌细胞(SMC)标记物表达。在一个实施方案中,所述SMC标记物为α-平滑肌肌动蛋白(SMA)和/或调宁蛋白。在另一实施方案中,所述SMC标记用抗α-平滑肌肌动蛋白(SMA)抗体和/或抗调宁蛋白抗体检测。在另外一个实施方案中,在所述导管的尾部区域的所述导管壁或外表面组分对SMA为阳性,如抗-SMA的抗体(例如,第6切片)检测的。在另一实施方案中,(在所述颅端的和中间的导管节的)所述导管壁或外表面组分对SMA为阴性,如抗-SMA抗体(例如,第5切片)检测到的。在另外一个实施方案中,在所述导管的尾部区域的所述导管壁或外表面组分对调宁蛋白为阳性,如抗调宁蛋白的抗体(例如,第6切片)检测的。在一个其它的实施方案中,在所述颅端的和中间的导管节的导管壁或外表面组分对调宁蛋白为阴性,如抗调宁蛋白抗体(例如,第5切片)检测的。
本文所述结构有能力形成上皮黏膜,提供了通过腹壁造口实现尿流改道的重大挑战的解决方案。经皮设备的所述寿命往往受出口部位感染(KnabeC等(1999)Biomaterials20:503)而受到妨碍,这是可以接受的。经皮设备,如导管、插管,假肢附件和葡萄糖传感器,无论其拟定的医疗目标如何,渗透所述皮肤,破坏其保护屏障,并产生细菌入侵(IsenhathSN等(2007)JBiomedMaterResA83:915)的窦道。因愈合不良,缺乏的生物相容性,或机械应力分布损坏产生的皮肤表皮,可能会导致更多的失败风险(vonRecumAFandParkJB.(1981)CritRevBioeng5:37)。
另一方面,所述尿流改道结构通过与接受者的组织相互作用,再生管状类器官。在一个实施方案中,与所述接受者组织的相互作用的所述结构是通过经腹放置进行的。在另外一个实施方案中,所述管状类器官允许尿液从所述输尿管流出接受者体外。尿液流出接受者体外的同时保持天然的功能特性,所述天然的功能特性在膀胱、尿道和造口(即,尿道口或开口)中发现的。所述黏膜皮肤联接处类似于在所述在前尿道开口发现的联接处;分别在所述人类女性的所述阴道前庭和男性的舟状窝。这些天然的联接处被黏膜区覆盖,关键的湿-干表面可以提供防止上行性感染的保护。这些黏膜区域的所述鳞状上皮为1)糖原丰富的,2)分泌的(能够释放酶和杀菌剂),和3)噬菌的;并能迅速迁移到受伤表面。
在一方面中,本发明为有需要的受试者提供了皮肤黏膜联接(MCJ)的方法。所述MCJ类似于天然存在的上皮黏膜区,其特征在于,存在黏膜和皮肤,其通常存在于所述身体的孔口附近,其中所述外部皮肤两端和所述黏膜覆盖所述身体开始的内部。在一个实施方案中,所述方法包括所述步骤:提供由本文所述的支架和本文描述的细胞群体组成的结构。在另一实施方案中,所述方法进一步包括所述步骤:给有需要所述结构的受试者施用适于暴露于空气的第一部分(例如,管状结构的第一端)和不暴露于空气中的第二部分(例如,管状结构的第二端),使得植入所述结构后形成MCJ。
可以根据实施例中所述的方法或根据本领域认可的方法移植支架至器官或有待扩大的组织。通过将所述移植材料缝合到所述靶器官,可以将所述模型或支架移植到所述受试者的器官或组织。
在所有的实施方案中,所述方法提供了尿流改道或导管结构,进一步包括施用网状构造。在另一实施方案中,所述施用步骤包括在皮下脂肪层和骨骼肌之间插入网状构造。在一个实施方案中,所述网状构造皮下植入。在另一实施方案中,在所述第一端和所述腹壁节之间的所述结合位点植入所述网格结构。在另一实施方案中,植入本文所述的尿流改道结构后,所述网状构造有利于形成新的泌尿导管。在另外一个实施方案中,所述网状构造提供了造口的通畅。在一个优选的实施方案中,所述网状构造为疝气补丁,优选为皮下疝补丁。在另外一个实施方案中,所述网状构造适于施用于有肠症风险的受试者。例如,如果所述小肠的一部分位于选定的腹壁开口上,由于与通过所述肠道的食物通路蠕动相关,所述肠道可能突出朝向或通过所述开口。本技术领域的普通技术人员可以根据检查所述腹壁开口的所述选定位置和所述受试者的肠道,来评估所述受试者是否有肠道突起的风险。进行这样的评估之后,本领域的普通技术人员的人可以确定所述受试者是否应该被施用本文所述的尿流改道结构和网状构造。
在一方面中,本发明提供有需要的受试者用于治疗泌尿系统疾病的方法。合适的受试者包括任何单一的人类受试者,如患者,符合治疗,其正在经历或经历过一种或多种症状、病症、或其它器官功能缺陷或失效的指标,包括有缺陷的、损坏的或无功能泌尿系统。在一般情况下,所述受试者为需要再生、重建、扩大,或替换层状组织的管腔器官或组织构造的受试者。此受试者包括但不限于,新诊断的或先前诊断及现在遇到复发或再发,或有缺乏器官功能或失效的风险,无论所述原因如何。所述受试者可能先前已经接受器官功能不足或失效病症的治疗,或未经治疗。受试者可能为尿流改道的候选人,包括但不限于,患有膀胱癌而需要膀胱切除术的的受试者,患有神经性膀胱功能障碍而影响肾功能的受试者,患有辐射损伤到所述膀胱的受试者,和患有顽固性失禁的受试者。所述受试者可能被新诊断为需要尿流改道,或先前诊断为需要尿流改道而现在遇到并发症,或有缺陷、损坏或非功能性泌尿系统的风险,无论所述原因如何。所述受试者以前可能已治疗过泌尿系统相关的缺陷、损坏或无功能病症,或未经治疗。本文所述的所述细胞群体所述受试者的非自体。
所述技术也可以用于扩大需要这种治疗的患者现有的层状组织管腔器官或组织构造。例如,可通过提供聚合物模型或支架来扩大现有的层状组织管腔器官或组织构造,其被成形以符合需要治疗的器官或组织构造的至少一部分,并具有足够的腹腔镜的植入大小;在所述聚合物模型的第一区域上或其内部,沉积所述受试者非自体的细胞群体,而且其不是源自相应的器官或组织构造,;以及腹腔镜植入所述成形的聚合物模型结构腹腔镜到所述受试者所述治疗部位,使得现有的层状组织管腔器官或组织构造扩大。
图7e描述了用于本文所述的植入肌肉等价支架可能的手术方法。图7f描述了在空虚的和完整膀胱的植入部位。图7g描述了具有手术切口的膀胱模型,示出了在切片表面创建的椭球体。塑料管可用做所述有限空间的模型,以适于通过本发明的折叠或卷的聚合物模型或支架。
所述技术也可以用于增加需要这种治疗的患者的膀胱容积。例如,可通过提供生物相容性合成的或天然的聚合物模型来增加膀胱容积,被成形以符合需要所述治疗的器官或组织构造的至少一部分,并具有足够的腹腔镜的植入大小;在所述聚合物模型的第一区域上或其内部,沉积所述受试者非自体的细胞群体,并且其不是源自相应的器官或组织构造(其属于增加容量的所述受试者);以及腹腔镜植入所述合适的聚合物模型结构腹腔镜到所述受试者所述治疗部位,使得膀胱容积增加。在一个实施方案中,所述即时发明的所述模型或支架适合于增加膀胱容积容量约50mL。在其它实施方案中,所述即时发明的所述模型或所述支架适合增加膀胱容积容量约100mL。在其它实施方案中,所述即时发明的所述模型或支架适合于增加膀胱容积容量约60、约70、约80,或约90mL。
所述的技术还可进一步用于需要这种治疗的患者膀胱切口部位的扩大。例如,可通过提供生物相容性合成的或天然的聚合物模型来扩大膀胱切口部位,被成形以符合需要所述治疗的器官或组织构造的至少一部分,并具有足够的腹腔镜的植入大小;b)在所述聚合物模型的第一区域上或其内部,沉积所述受试者非自体的细胞群体,并且其不是源自相应的器官或组织构造(其属于增加容量的所述受试者);和c)腹腔镜植入所述合适的聚合物模型结构腹腔镜到所述受试者所述治疗部位,使得所述膀胱切口部位膨胀。
本发明的另一非限制性使用包括:在需要此治疗的患者中,用于所述治疗尿失禁的方法。例如,可通过提供生物相容性合成的或天然的聚合物模型来治疗尿失禁,被成形以符合需要所述治疗的器官或组织构造的至少一部分,并具有足够的腹腔镜的植入大小;在所述聚合物模型的第一区域上或其内部,沉积所述受试者非自体的细胞群体,并且其不是源自相应的器官或组织构造(其属于治疗的所述受试者);以及腹腔镜植入所述合适的聚合物模型结构腹腔镜到所述受试者所述治疗部位,使得膀胱容量增加。
在另一方面中,本发明涉及用于天然管腔器官或包含非自体来源膀胱源的平滑肌细胞(SMC)的泌尿系统的重建、更换、扩大、或再生的结构的使用方法。所述天然器官或组织构造可为层状组织。非自体的源可以为同种异体源或同源的。在一个优选的实施方案中,所述治疗的方法包括使用结构形成支架和膀胱源的SMC,但无上皮细胞。所述膀胱源的SMC可接种到膀胱扩大、膀胱更换、泌尿导管、或肌肉等价支架上,以形成结构。所述结构包含非自体膀胱源的SMC,可用于本文所述的治疗方法。
在另一方面,本发明提供的植入到有需要的受试者后的新膀胱再生方法,其基于生物机械刺激或循环。在一方面中,所述方法适合促进已植入的新膀胱膀胱的所述再生,用于膀胱或膀胱部分的所述扩增或替代。在一个实施方案中,所述新膀胱结构由接种细胞的新膀胱模型或支架形成。在另一实施方案中,所述新膀胱支架为膀胱替代支架、膀胱扩大术支架、膀胱导管支架、或逼尿肌等价支架。
在一方面中,本发明的所述方法应用的植入新膀胱的结构从接种至少一种细胞群体的新膀胱支架形成。在一个实施方案中,所述细胞接种的聚合物模型(或模型)为膀胱替换支架、膀胱扩大支架、膀胱导管支架、或逼尿肌等价支架。在一个实施方案中,所述至少一种细胞群体大致包括肌肉细胞群体。在另一实施方案中,所述肌肉细胞群体可以是平滑肌细胞群体。接种不同密度的细胞可能是适当的,如本文所述。
在一方面中,本发明的所述方法是在植入新膀胱后,不同时间和不同持续时间进行的。在一个实施方案中,所述循环的进行在:在一段时间的每天,在一段时间的每周,或每隔一周的基础上。在另一实施方案中,所述每天循环方案的持续时间为约2周、约3周、约4周、约5周、约6周、约7周、约8周、约9周、约10周、约11周、约12周、约13周、约14周,或超过14周。循环的示例性协议见实施例18所述。
在一个实施方案中,受试者的日常循环协议可能包括所述步骤为:填充所述新膀胱约一小时,排空所述填充的新膀胱约一小时,并允许所述新膀胱排水自如,通常过夜。所述协议可以在所述受试者所述循环方案的一天之内进行。在第一天之后,这种日常序列可以连续进行数日。在一个实施方案中,在一天之后可以进行此循环协议,其中所述填充步骤持续时间增加至约两个小时,约三个小时,或约四个小时,或超过约四个小时。在另一实施方案中,在允许所述新膀胱自由排水之前,所述填充和排空步骤可重复超过每天一次。
在另一实施方案中,所述受试者植入后插入导管,并通过夹紧和松开所述受试者的导管来控制所述循环时间。
那些在本技术领域的普通技术人员将会理解,本发明仔细考虑的额外的循环方案。
循环协议的实施例如下所示。植入后的新膀胱结构(由如本文所述的新膀胱模型或支架接种细胞形成),在植入后约1个月开始每2周(14±2天的间隔)进行循环并持续进行,直到约90天。进行评估特定类型后,但在其它类型,如荧光成像评估之前,将完成循环,如所述植入新膀胱的顺应性测量。在10-25mL/min速率的所述顺应性测量完成后,通过重新用无菌生理盐水(温暖培养箱)膨胀膀胱来进行循环。所述循环将重复至少5-10次。将达到所述起始压力为0-10mmHg,并与所述起始时间一起记录。对每个循环,将会记录时间、传送的等渗溶液的体积、以及获得的所述压力,在导管周围观察的泄漏时间(也称为泄漏点)的时候,或当所述传送的体积等于刚进行的顺应性测量时,无论哪个先达到。
在一个实施方案中,本发明提供了在受试者中促进植入的新膀胱再生的方法,其中包括的步骤为(a)在所述植入的新膀胱中填充流体;(b)排空步骤(a)所述填充的新膀胱。在另一实施方案中,所述方法包括步骤(c)重复步骤(a)和(b)。在另外一个实施方案中,所述方法开始于植入后的前2周。在一个实施方案中,所述步骤(a)和(b)每天、每周、或每隔一周进行。在一些其它实施方案中,约一小时进行所述填充步骤(a),及约一小时进行所述排空步骤(b)。在又一实施方案中,直到植入约至少6周后进行步骤a)和b)。在另外一个实施方案中,植入不超过10周后进行步骤a)和b)。在另一实施方案中,植入超过约10周后进行步骤a)和b)。在其它实施方案中,所述填充包括扩大所述新膀胱。在另一实施方案中,与受试者中未发生循环的新膀胱相比,所述再生包括增加所述新膀胱的容量。在一个实施方案中,与受试者中未发生循环的新膀胱相比,所述再生包括增加所述新膀胱顺应性。在其它实施方案中,与受试者中未发生循环的新膀胱相比,所述再生包括增加在所述新膀胱中胞外模型发育。在一个实施方案中,所述增加外模型发育包括所述弹性蛋白纤维的发育。
另一方面,本发明涉及的方法用于提供哺乳动物新膀胱的稳态调控发育,使得植入的新膀胱响应于所述接受者需要。在一个实施方案中,植入的新膀胱的增长大小与接受者相称。在另一实施方案中,所述方法提供受试者新膀胱的稳态调控发育,包括步骤:(a)提供生物相容性聚合物支架;(b)在所述支架第一区域上或内部沉积第一细胞群体,所述第一细胞群体基本上为肌肉细胞群体;及(c)植入步骤(b)的所述支架到所述受试者以建立稳态调控发育。在一个实施方案中,所述稳态调控发育包括恢复器官的大小和结构。在另一实施方案中,所述稳态调控发育包括与体重相称的新膀胱容量。在一个实施方案中,在植入后约4个月,可达到新膀胱容量的所述比例。在另一实施方案中,所述方法提供的在受试者中的新膀胱的稳态调控发育的方法包括以下步骤:监测所述植入的新膀胱的稳态调控发育或发展的所述状态。所述监测可包括膀胱造影的程序以显示植入新膀胱的所述位置和形状,和/或测定尿动力学的顺应性和容量。
本发明的所述方法应用于治疗泌尿系统相关疾病的受试者。这些受试者包括任何单一的人类受试者,包括患者、符合治疗条件的,正在经历或经历了一种或多种体征、症状、或其它器官功能不足或缺乏的指标,包括缺陷,损坏的或无功能的泌尿系统。这样的受试者包括但不限于,新诊断或先前诊断的受试者和现在经历复发或旧病复发,或在器官功能不足或缺乏的风险,而不管所述病因如何。所述受试者可能已经先前治疗器官功能不足或缺乏相关的疾病,或未经治疗。受试者可能为尿流改道的候选人,包括但不限于,有膀胱癌而需要全膀胱切除术的受试者,有神经性膀胱功能障碍而影响肾功能的受试者,具有辐射损伤膀胱的受试者,和具有顽固性失禁的受试者。所述受试者可能新诊断为需要尿流改道,或先前诊断为需要尿流改道及现在遇到并发症,或有缺陷,损坏或无功能性泌尿系统的风险,而不管所述病因如何。所述受试者以前可能已经治疗过有缺陷,损坏或无功能泌尿系统的疾病,或未经治疗。
C.使用胃肠道组织构造
在一方面中,本发明考虑为需要这种治疗的受试者提供GI的器官或GI组织构造的方法。在一个实施方案中,所述GI器官或组织构造可能为层状组织管腔器官或组织构造。在另一实施方案中,所述受试者可能需要重建、扩大,或替换器官或组织。在一个实施方案中,所述方法包括提供生物相容的合成的或天然的聚合物模型的步骤,被形成以符合有需要的器官或组织构造的GI器官或GI组织构造的至少一部分。所述提供步骤可随后沉积至少一种所述受试者自体或非自体的细胞群体(其不是源自对应的GI器官或GI组织构造,所述GI器官或GI组织构造术语所述重建,扩增或替代的所述受试者)。所述沉积步骤可包括在所述聚合物模型上培养所述细胞群体。在所述模型上沉积所述细胞群体以后提供结构,其可以被植入到患者体内需要治疗的位点,以形成所需层状组织的GI器官或GI组织构造。在一个实施方案中,所述层状组织的管腔GI器官或GI组织构造为食管或部分食管或小肠或小肠的一部分。
在另一方面,本发明涉及为有需要的受试者提供GI器官或GI组织构造的方法。在一个实施方案中,所述方法包括以下步骤:a)提供生物相容性合成的或天然的聚合物模型,被成形以符合需要所述治疗的GI器官或GI组织构造的至少一部分;b)在所述聚合物模型上或内部沉积的细胞群体(不是源自GI器官或GI组织);和c)在所述受试者中植入所述合适的聚合物模型细胞结构以形成所述GI器官或组织构造。在另一方面,本发明提供了为有需要的受试者提供GI器官或GI组织构造的方法。在一个实施方案中,所述方法包括:a)提供生物相容性合成的或天然的聚合物模型,被形成以符合GI器官或GI组织构造;b)在所述聚合物模型第一区域上或内部,沉积细胞群体(不是源自GI器官或GI组织);以及c)向受试者植入合适的聚合物模型细胞结构以形成GI器官或组织构造。在另一实施方案中,本文所述方法的步骤b)的所述细胞群体包含一个或多个具有收缩功能的外周血来源的平滑肌细胞,其对平滑肌细胞标记物为阳性,或步骤b)中的所述细胞群体,包含一个或多个具有收缩功能的脂肪组织来源的平滑肌细胞,其对平滑肌细胞的标记物为阳性。在另一实施方案中,所述细胞群体生物所述收缩功能为钙依赖性的。
在另一方面中,本发明为有需要的受试者中有缺陷的GI系统提供了GI结构的方法。在一个实施方案中,为有需要的受试者提供GI结构的所述方法包括以下步骤:(a)提供生物相容性GI组织支架;(b)在所述支架的第一区域上或内部沉积第一细胞群体,所述第一细胞群体大致为肌肉细胞群体;(c)在受试者中植入步骤(b)的所述支架,以在所述受试者中形成GI组织。所述方法可进一步包括的所述支架的第一区域上或内部沉积第二细胞群体的步骤,和/或使所述第二细胞群体与步骤(b)后沉积的所述第一细胞群体接触。在另一实施方案中,所述生物相容性材料是可生物降解的。在其它实施方案中,生物相容的材料为聚乙醇酸。在又一实施方案中,所述第一细胞群体基本上为平滑肌细胞群体。在另一实施方案中,所述第二细胞群体为GI细胞群体,例如,食管细胞群体,小肠细胞群体,等。
在一个实施方案中,本发明的所述方法进一步包括用受试者的网膜、肠系膜、肌肉筋膜,和/或腹膜将所述植入的GI组织构造包裹的步骤,以允许血管形成。
在一方面中,本发明考虑本文所述的平滑肌细胞群体在GI-相关疾病的应用。本文也考虑治疗食管相关疾病的方法。所述食管包含平滑肌及在所述受试者中的食管相关疾病为由于不正确功能而具有的缺陷食管,例如,功能失调性食管肌肉。据报道,在施用时,某些细胞群体可能为所述食管提供有益效果(例如,Nakase(2008)见上文)。
另一方面,本发明提供了用于治疗GI-相关疾病的方法。所述术语“胃肠道功能疾病”、“GI疾病”、“胃肠道相关疾病”或“GI-相关疾病”是指在由食管、胃、小肠和大肠、肛门括约肌和肛门组成的胃肠道的任何缺陷。所述缺陷可能为发生在胃肠道内任何点的结构缺陷,以及可引起障碍或堵塞的原因,可导致呕吐,以及吞咽困难和排便问题。所述缺陷还可以包括沿胃肠道内的中断或间隙。那些在本技术领域的普通技术人员将会理解,各种GI疾病可能合于用本文所述的结构和方法治疗。在一个实施方案中,所述GI相关疾病的合适治疗为食管相关疾病,包括但不限于,Barrett食管、食管闭锁、长隙食管闭锁、气管食管瘘、气管食管远端瘘闭锁、气管食管近端闭锁及食管气管双瘘闭锁。在另一实施方案中,所述GI相关疾病为进行小肠切除术导致的小肠相关疾病,必要时呈现一定的适应症的患者。例如,个体发生发炎性肠道疾病、创伤、肠系膜血管疾病、肠扭转、先天性闭锁和新生儿坏死性小肠结肠炎而进行大量的切除。此切除的常见的后果为短肠综合症(SBS),这将导致正常养分和流体吸收的中断,包括钙、镁、锌、铁、维生素B12,和脂溶性维生素的缺乏,并且其特征在于,腹泻、脱水、营养吸收不良和随之而来的营养不良。
在另一实施方案中,所述GI相关的疾病具有癌症性质,包括但不限于,食管癌、胃癌、肠癌、括约肌癌,或结肠癌。
另一方面中,本发明提供了有需要的受试者肠道组织的再生、重建、扩大或替换的方法。在一个实施方案中,所述方法包括施用肠道组织构造的步骤,包括(a)支架;(b)不是自肠道组织的第一细胞群体在所述支架支架的第一表面上或内部沉积;及(c)源自肠道组织的第二细胞群体。在另外一个实施方案中,所述第一细胞群体源自脂肪。在另一实施方案中,所述第一细胞群体为平滑肌细胞(SMC)群。所述SMC群体可能对至少一种平滑肌细胞标记物为阳性。在又一实施方案中,所述第二细胞群体源自食管、小肠、大肠、胃、结肠,或肛门括约肌。在一个实施方案中,所述结构对至少一个胃肠(GI)的组织标记物为阳性。所述GI组织标记物可以为上皮细胞标记物。在另一实施方案中,所述结构包括的细胞具有协调的有节奏的收缩功能。在另外一个实施方案中,所述结构植入后,适于形成肠道组织。在又一实施方案中,所述GI组织为食管、小肠、大肠、胃、结肠,或肛门括约肌组织。
在另一实施方案中,所述方法包括在施用步骤之前,从所述受试者中获取一个或多个样品的步骤。在另外一个实施方案中,所述方法包括从所述样品中分离一种或多种细胞群体以及如本文所述的培养步骤。在又一实施方案中,所述方法包括使GI组织支架与一种或多种细胞群体接触的步骤,如本文所述,以形成GI组织构造。
在一方面中,本发明提供了本文所述结构的使用,用于有需要的受试者的GI-相关疾病治疗中所用药物的制备。在一个实施方案中,所述结构为食管组织构造,其包括接种平滑肌细胞群体和食管细胞群体的食管组织支架。在另一实施方案中,所述GI相关疾病为食管相关的疾病。在一个实施方案中,所述结构为肠道组织构造,其包括接种平滑肌细胞群体和肠细胞群体的肠组织支架。所述肠细胞群体可源自小肠。在另一实施方案中,所述GI相关的疾病为肠道相关疾病。
本发明的所述方法应用于治疗胃肠功能疾病的受试者。这些受试者包括任何单一的人类受试者,包括患者、符合治疗条件的,正在经历或经历了一种或多种体征、症状、或其它胃肠道(GI)功能不足或缺乏的指标,包括缺陷、损坏或无功能的肠道系统。这样的受试者包括但不限于,新诊断或先前诊断的受试者和现在经历复发或旧病复发,或者是GI功能不足或缺乏的风险,而不管所述病因如何。可能已经先前治疗所述受试者胃肠道功能不足或缺乏相关的疾病,或未经治疗。受试者可能为具有GI-相关疾病的候选人,包括但不限于,具有食管相关的疾病,胃相关的疾病,肠相关的疾病,或肛门括约肌相关疾病的受试者。所述受试者可能为新诊断的需要治疗这种疾病,或先前诊断的需要治疗这种疾病而现在遇到并发症,或有缺陷,损坏或非功能食管、胃、肠,肛门括约肌的风险,而不管所述病因如何。所述受试者可能已经先前治疗过缺陷,损坏或非功能性食管、胃、肠,肛门括约肌相关的疾病,或未经治疗。
D.使用呼吸组织结构
在一方面中,本发明考虑为需要这种治疗的受试者提供呼吸组织构造的方法。在一个实施方案中,所述受试者可能需要重建、再生、扩大,或替换呼吸组织,如肺、肺组织、肺泡组织和支气管组织。在一个实施方案中,所述方法包括提供生物相容性合成的或天然的聚合物模型,被形成以符合所需器官或组织构造的呼吸组织至少一部分的步骤。所述提供步骤之后,在所述模型上沉积不是源自呼吸组织的第一细胞群体。所述第一细胞群体为SMC群体。所述沉积步骤可包括在所述聚合物模型上培养所述第一细胞群体。在所述模型上沉积所述第一细胞群体以后,可在所述模型上沉积第二细胞群体,使其所述模型和/或沉积的第一细胞群体接触,以形成结构。所述第二细胞群体可以为呼吸细胞群体。所述结构可能为呼吸结构,其可被植入到患者体内的治疗位点,以形成所述所需的呼吸组织构造。在一个实施方案中,所述呼吸组织构造为肺的一部分。在一个实施方案中,所述第一和/或所述第二细胞群体为所需治疗受试者自体同源的。在另一实施方案中,所述第一和/或所述第二细胞群体为所需治疗受试者非自体同源的。
在另一方面中,本发明提供了有需要的受试者呼吸组织的再生、重建、扩大或替换的方法。在一个实施方案中,所述方法包括施用呼吸组织结构的步骤,包括(a)支架;(b)不是源自呼吸组织的第一细胞群体在所述支架支架的第一表面上或内部沉积;及(c)源自呼吸组织的第二细胞群体。本发明提供的支架适于形成呼吸组织结构,例如,接种细胞的呼吸组织支架。在一个实施方案中,所述支架包括如本文所述的细胞群体。在另一实施方案中,所述支架包括源自脂肪的SMC群体和呼吸细胞群体。在另一实施方案中,所述支架基本上由脂肪来源的SMC群体和呼吸细胞群体组成,如本文所述。在另外一个实施方案中,所述支架由源自脂肪的SMC群体和呼吸细胞群体组成,如本文所述。所述细胞群体可能为所述受试者的自体或非自体。
在另一实施方案中,所述细胞沉积在植入的结构上产生MCP-1并在植入位点释放。MCP-1可刺激天然间充质干细胞(MSC)移植到植入位点。在另外一个实施方案中,所述天然MSCs可促进和/或增强所述植入结构在所述植入位点的再生。
在一个实施方案中,所述沉积的细胞群体为如本文所述的源自脂肪组织的平滑肌细胞(SMC)群体。在另一实施方案中,所述SMC群体包括至少一个具有收缩功能及对平滑肌细胞标记物为阳性的细胞,如心肌素、α-平滑肌肌动蛋白、调宁蛋白、肌球蛋白重链、BAALC、结蛋白、肌成纤维细胞抗原、SM22,及其任意组合。在其它实施方案中,所述SMC群体包括至少一个论证为心肌素(MYOCD)表达的细胞。所述MYOCD表达可能为编码MYCOD多肽的核酸或MYOCD多肽的表达。在另一实施方案中,所述SMC的所述收缩功能为钙依赖。在另一实施方案中,所述聚合物模型中植入脂肪来源的SMC群体和呼吸细胞群体。
在所有的实施方案中,本发明的所述方法利用结构进行植入,所述结构根据已接种如本文所述细胞群体的呼吸组织支架。
在另一实施方案中,本文所述的呼吸组织的再生、重建、扩大或替换的所述方法包括步骤:a)提供生物相容性合成的或天然的聚合物模型,被形成以符合所需治疗受试者所述呼吸组织的至少一部分;b)在所述聚合物模型的第一区域上或内部沉积第一细胞群体,其细胞密度如本文所述所,所述第一细胞群体基本上为SMC群体;c)在所述聚合物模型的第二区域上或内部沉积第二细胞群体(和/或接触所述沉积的第一细胞群体),其细胞密度如本文所述;以及d)在受试者所述治疗位点植入所述合适的聚合物模型细胞结构,用于形成所述呼吸组织构造。在另外一个实施方案中,在体内形成的所述呼吸组织构造显示出自然呼吸组织的行为。在另外一个实施方案中,所述呼吸组织构造显示出协调有节奏的收缩功能。
在一方面中,本发明的方法适用于植入的呼吸组织结构,所述呼吸组织结构由接种呼吸组织支架接种第一和第二细胞群体形成。在一个实施方案中,所述第一细胞群体为脂肪来源的平滑肌细胞群体,以及所述第二细胞群体为呼吸道细胞群体。不同密度的细胞接种可以是适当的,如本文所述。
在另一实施方案中,本发明的所述平滑肌细胞群体可以施用于具有呼吸疾病的受试者,而无需使用支架,如通过移植物移入。那些在本领域的普通技术人员将理解合适的移植物移入的方法。
本发明的方法应用于治疗具有呼吸系统疾病的受试者。气道平滑肌存在于大多数脊椎动物的支气管枝中。患有呼吸系统疾病的受试者由于肺肌肉的功能不当,具有缺陷的呼吸道系统。据报道,某些细胞群体施用于肺时,可以提供有益的影响(例如,Ohnishi等,IntJChronObstructPulmonDis.2008December;3(4):509-514)。患有肺癌的个体也可从中受益。可以通过本文所述的治疗方法受益的受试者包括任何单一的人类受试者(包括符合治疗的患者),其正在经历或已经经历了一种或多种症状、病症、或其它呼吸功能不足或故障的指标,包括不足、损坏或者非功能性呼吸系统。这样的受试者包括但不限于,新诊断的或先前诊断的以及现在遇到反复或复发,或者是具有呼吸功能缺乏或故障的风险,无论所述病因如何。所述受试者可能已经被治疗呼吸功能不足的或故障的相关病症,或未经治疗。受试者可能是患有肺相关疾病的候选人,包括但不限于,受试者患有慢性阻塞性肺疾病(COPD)(即,慢性支气管炎,肺气肿)、肺癌、特发性肺纤维化(IPF)、哮喘、阻塞性和限制性气道疾病、肺发育不良(例如,早产)。所述受试者可能是新诊断的为需要治疗肺相关疾病的,或以前诊断为需要治疗肺相关疾病的而现在遇到并发症,或有不足、损坏或非功能肺的风险,无论所述病因如何。所述受试者以前可能已经治疗过不足、损坏或非功能肺的相关疾病,或未经治疗。
E.使用血管结构
所述血管支架和结构可以在需要其的受试者中治疗心血管疾病的方法中使用。在一个实施方案中,该方法包括植入血管结构的步骤。在另一个实施方案中,所述血管结构可以包括:a)生物相容性管状支架,具有第一和第二表面;以及b)源自非血管来源的第一细胞群,在所述支架第一表面上或其内部沉积。在一个实施方案中,所述第一细胞群为平滑肌细胞群。
治疗心血管疾病的所述方法,可以包括识别有需要的受试者的步骤。可从所述受试者中获得一个或多个活检或样品。在另一实施方案中,所述方法包括以下步骤:从所述样品中分离一个或多个细胞群,并在支架上培养一个或多个细胞群,以提供结构或TEBV。在另一实施方案中,所述培养包括在生物反应器中细胞接种的支架的调节。在一个实施方案中,所述调节包括在生物反应器中稳定的和/或脉动的流体。在另一实施方案中,该方法包括所述细胞接种的移植,调节TEBV到需要治疗所述心血管疾病或病症的受试者中。
那些在本领域的普通技术人员将会理解,适合于由本发明方法治疗的各种心血管疾病。在一般情况下,所述心血管疾病为可以受益于通道形成或在两个天然血管之间的吻合术的疾病,其中血液从第一天然血管直接被分流到第二天然血管。例如,所述第一天然血管可以为动脉以及所述第二天然血管可以为静脉,如在动静脉(AV)分流术的情况下。在本发明的方法和结构也可以适用于多种其它分流术,包括但不限于,Blalock-Taussig分流术,心血管分流术,左到右的分流术,从右到左的分流术,一个LaVeen腹腔静脉分流术、门腔静脉分流术、和脾肾静脉分流术。
在另一实施方案中,本发明提供本文所述的TE支架和/或TEBV的使用,用于制备在有需要的受试者的心血管疾病的治疗中有用的药物。所述支架还提供了在制备血管结构中的使用。所述血管结构用于治疗心血管疾病。
本发明的方法应用于治疗患有心血管疾病的受试者。这些受试者包括任何单一的人类受试者(包括符合治疗的患者),其正在经历或已经经历了一种或多种症状、病症、或其它心血管功能不足或故障的指标。这些受试者包括但不限于,新诊断或以前诊断的受试者,而现在遇到了反复或复发,或具有心血管功能不足或故障的风险,无论所述病因如何。所述受试者可能已经先前治疗过与心血管功能不足或故障相关的疾病,或未经治疗。
以下提供的实施例仅用于说明的目的,并且不打算以任何方式限制本发明的范围。
本说明书中引用的所有专利、专利申请、和参考文献其全部内容通过引用的方式纳入本文。