CN109153963A - 粘附状态的细胞培养物的改变方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供在形成粘附状态的细胞培养物后对其加以改变以使构成粘附状态的细胞培养物的细胞的含有比率发生变化的方法。通过提供包括将包含至少2种细胞的粘附状态的细胞培养物浸渍于低营养等渗液中的工序的方法，从而解决了上述课题。

Description

粘附状态的细胞培养物的改变方法
技术领域
本发明涉及对粘附状态的细胞培养物加以改变的方法、以及包括实施该改变的工序的制造片状细胞培养物的方法等。
背景技术
近年来，为了修复损伤的组织等，进行了移植各种细胞的尝试。例如，为了修复因心绞痛、心肌梗塞等缺血性心脏病、扩张型心肌病等而导致损伤的心肌组织，正在尝试利用胎儿心肌细胞、骨骼肌成肌细胞、间充质干细胞、心脏干细胞、ES细胞等(非专利文献1～2)。
作为上述尝试的一环，开发了利用支架(scaffold)形成的细胞结构物、将细胞形成为片状而得到的片状细胞培养物(专利文献1、非专利文献2)。
关于片状细胞培养物在治疗中的应用，已开展了下述研究：针对由烧伤等导致的皮肤损伤的培养表皮片的利用、针对角膜损伤的角膜上皮片状细胞培养物的利用、针对食道癌内窥镜切除的口腔黏膜片状细胞培养物的利用等；其中一部分已进入了临床应用阶段。
在以低分子化合物作为有效成分的医药品等常规医药品的情况下，通过有效成分的修饰、赋形剂的添加、剂型的变更等，能够改变其药效。然而，包含片状细胞培养物的医药品的情况与常规医药品不同，难以实施这样的改变。因此，在制造包含片状细胞培养物的药物组合物时，需要在形成该片状细胞培养物的阶段制备更高品质的片状细胞培养物，为此进行了许多尝试(例如专利文献2等)。另一方面，关于针对已形成为片状的细胞培养物而在形成片后进一步加以改变的技术，目前为止还未报道过。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特表2007-528755号公报
专利文献2：日本特开2010-226991号公报
非专利文献
非专利文献1：Haraguchi等人,Stem Cells Transl Med.2012年2月；1(2):136-41
非专利文献2：Sawa等人,Surg Today.2012年1月；42(2):181-4
发明内容
发明要解决的课题
本发明的目的在于提供在形成粘附状态的细胞培养物后对其加以改变以使构成粘附状态的细胞培养物的细胞的含有比率发生变化的方法。
用于解决课题的手段
在再生医疗等中使用的片状细胞培养物的情况下，目标细胞以外的细胞被认为是夹杂物，因此目标细胞的纯度越高越理想。但是，对于这样的移植用片状细胞培养物而言，为了降低排斥反应等，优选使用从受体采集组织片而制备的自身细胞来进行制造，因此常常无法完全除去目标细胞以外的细胞。另一方面，如上所述，尚不知晓在制造片状细胞培养物后改变细胞纯度的方法，因此，目前为止一直是通过使用已调节为尽可能高的纯度的自身细胞制造片状细胞培养物来提高目标细胞的纯度。
本申请的发明人在研究骨骼肌成肌细胞的片状细胞培养物的过程中，发现了下述的新见解：若将制造的骨骼肌成肌细胞的片状细胞培养物预先浸渍于Hanks平衡盐溶液(HBSS)中，则混入的成纤维细胞的含有比率减少，而作为目标细胞的骨骼肌成肌细胞的含有比率增加。基于该见解，进一步持续深入研究，结果完成了本发明。
即，本发明涉及以下记载的方案：
＜1＞对粘附状态的细胞培养物加以改变的方法，其特征在于，所述方法包括将包含至少2种细胞的粘附状态的细胞培养物浸渍于低营养等渗液中的工序，由此使构成上述粘附状态的细胞培养物的细胞种类的含有比率发生变化。
＜2＞如＜1＞所述的方法，其中，片状细胞培养物包含骨骼肌成肌细胞及成纤维细胞。
＜3＞如＜2＞所述的方法，其中，改变是使成纤维细胞的含有率降低。
＜4＞如＜1＞～＜3＞所述的方法，其中，粘附状态的细胞培养物为片状细胞培养物。
＜5＞如＜4＞所述的方法，其中，片状细胞培养物是从培养基材剥离而得到的细胞培养物。
＜6＞如＜5＞所述的方法，其中，片状细胞培养物是在剥离时发生收缩的细胞培养物。
＜7＞如＜5＞或＜6＞所述的方法，其中，片状细胞培养物在剥离后具有6cm2以上的面积。
＜8＞如＜4＞～＜7＞所述的方法，其中，片状细胞培养物是将多层的单层片状细胞培养物层叠而形成的。
＜9＞如＜1＞～＜8＞所述的方法，其中，低营养等渗液为Hanks平衡盐溶液。
＜10＞如＜1＞～＜9＞所述的方法，其中，浸渍进行24～150小时。
＜11＞如＜1＞～＜10＞所述的方法，其中，浸渍于2～8℃进行。
＜12＞片状细胞培养物的制造方法，其包括下述工序：
(a)将包含2种以上细胞的细胞群以能在不实质性增殖的情况下形成片状细胞培养物的密度接种至培养基材上，
(b)对接种的细胞群进行片化培养从而形成片状细胞培养物，以及
(c)将形成的片状细胞培养物浸渍于低营养等渗液中。
＜13＞如＜12＞所述的方法，其中，在工序(c)之前包括下述工序：
(c’)将形成的片状细胞培养物剥离。
＜14＞如＜12＞所述的方法，其中，在工序(c)之后包括下述工序：
(c’)将形成的片状细胞培养物剥离。
＜15＞如＜13＞或＜14＞所述的方法，其中，在(c)的工序中，片状细胞培养物在剥离时发生收缩。
＜16＞如＜13＞～＜15＞所述的方法，其中，所剥离的片状细胞培养物具有6cm2以上的面积。
＜17＞如＜13＞～＜16＞所述的方法，其中，在(c)之后还包括下述工序：
(c-2)将所剥离的片状细胞培养物层叠。
＜18＞片状细胞培养物的制造方法，其包括下述工序：
(a)将包含目标细胞的细胞群以能在不实质性增殖的情况下形成片状细胞培养物的密度接种至培养基材上，
(b)对接种的细胞群进行片化培养从而形成片状细胞培养物，
(c)将形成的片状细胞培养物剥离，以及
(d)将所剥离的片状细胞培养物浸渍于低营养等渗液中。
发明的效果
根据本发明，能够在制得粘附状态的细胞培养物(如形成片状等)后对该粘附状态的细胞培养物进一步加以改变从而提高品质。因此，能够进一步提高由以往的制造方法制造的片状细胞培养物等的品质，另外，即使是以往被认为品质不足的片状细胞培养物等，也能够在制备后提升至充分的品质，因此能够消除时间、材料的浪费，并且还能够减轻受体的负担。另外，改变的手段本身非常简便，能够广泛地用于各种粘附状态的细胞培养物。
附图说明
[图1]图1为示出将包含人骨骼肌成肌细胞及人成纤维细胞的片状细胞培养物在冷藏条件下浸渍于HBSS(+)中时的、每24小时骨骼肌成肌细胞的纯度变化的坐标图(graph)。图中，CD56阳性细胞是指骨骼肌成肌细胞。从开始浸渍起，纯度开始上升，在48小时左右达到约90％的纯度，之后从开始浸渍至约6天后能够保持该纯度。
[图2]图2为示出将人骨骼肌成肌细胞及人成纤维细胞的HBSS(+)悬浮液在冷藏条件下保存时的、骨骼肌成肌细胞的纯度变化的坐标图。在从开始保存起3天后，骨骼肌成肌细胞的纯度没有变化。
具体实施方式
以下，详细地说明本发明。
本说明书中，只要未另行定义，则本说明书中使用的所有技术用语及科学用语均具有与本领域技术人员通常理解的意思相同的含义。本说明书中参照的所有专利、申请、已公开的申请及其他出版物均通过参照而整体援引至本说明书中。另外，本说明书中参照的出版物和本说明书的记载产生矛盾的情况下，本说明书的记载优先。
本发明中，所谓“对粘附状态的细胞培养物加以改变”，是指使粘附状态的细胞培养物的结构、功能、特性等与处理前相比发生变化。“改变”中虽然可包括向不好的方向变化，但优选向好的方向(即，以对于片状细胞培养物的使用目的来说更合适的方式)变化。
本发明中，所谓“粘附状态的细胞培养物”，是指通过细胞与其他的细胞或基材粘附而形成的细胞培养物。细胞彼此可以直接(包括经由粘附分子等细胞要素的方式)相互连接、及/或经由中间物而相互连接。作为中间物，只要是至少能够将细胞彼此物理性(机械性)地连接的物质，则没有特别限定，例如可举出胞外基质等。中间物优选为来自细胞的物质，特别优选为来自构成细胞培养物的细胞的物质。细胞至少被物理性(机械性)地连接，也可以进一步被功能性地连接，例如化学性连接、电连接。粘附状态的细胞培养物中包括：处于与基材粘附的状态的细胞培养物；处于从基材游离且细胞彼此粘附的状态的细胞培养物；处于粘附于基材且细胞彼此粘附的状态的细胞培养物。作为粘附状态的细胞培养物，例如可举出片状细胞培养物、细胞凝集体、胚状体、球状体(spheroid)等，优选为片状细胞培养物，但并不限定于这些。在一个方式中，粘附状态的细胞培养物包括处于与基材粘附的状态的片状细胞培养物。在另一个方式中，粘附状态的细胞培养物包括处于从基材游离的状态的细胞培养物，例如为从基材剥离的片状细胞培养物、经悬浮培养的胚状体、球状体等，但并不限定于这些。
本发明中，“片状细胞培养物”是指细胞相互连接呈片状的培养物。细胞彼此可以直接(包括经由粘附分子等细胞要素的方式)相互连接、及/或经由中间物而相互连接。作为中间物，只要是至少能够将细胞彼此物理性(机械性)地连接的物质，则没有特别限定，例如可举出胞外基质等。中间物优选为来自细胞的物质，特别优选为来自构成细胞培养物的细胞的物质。细胞至少被物理性(机械性)地连接，也可以进一步被功能性地连接，例如化学性连接、电连接。片状细胞培养物可以是由1个细胞层构成的物质(单层)，也可以是由2个以上的细胞层构成的物质(层叠(多层)体，例如2层、3层、4层、5层、6层等)。
片状细胞培养物优选不包含支架(支承体)。在本技术领域中，支架有时被用于使细胞附着在其表面上及/或其内部从而维持片状细胞培养物的物理一体性，例如，已知有聚偏氟乙烯(PVDF)制的膜等，但本发明中的片状细胞培养物可以为即使没有该支架也能够维持其物理一体性的细胞培养物。另外，片状细胞培养物优选仅包含来自构成细胞培养物的细胞的物质，不包含其他物质。
构成粘附状态的细胞培养物、优选片状细胞培养物的细胞只要可形成粘附状态的细胞培养物，就没有特别限定，例如包括粘附细胞(附着性细胞)。粘附细胞包含例如具有粘附性的体细胞(例如，心肌细胞、成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞、肝细胞、胰细胞、肾细胞、肾上腺细胞、牙周膜细胞、牙龈细胞、骨膜细胞、皮肤细胞、滑膜细胞、软骨细胞等)及干细胞(例如，成肌细胞、心脏干细胞等组织干细胞、胚胎干细胞、iPS(induced pluripotentstem)细胞等多能干细胞、间充质干细胞等)等。体细胞也可以为从干细胞、尤其是iPS细胞分化而来的细胞(源于iPS细胞的粘附细胞)。作为构成粘附状态的细胞培养物的细胞的非限定例，例如可举出成肌细胞(例如，骨骼肌成肌细胞等)、间充质干细胞(例如，源于骨髓、脂肪组织、外周血、皮肤、毛根、肌肉组织、子宫内膜、胎盘、脐带血的细胞等)、心肌细胞、成纤维细胞、心脏干细胞、胚胎干细胞、iPS细胞、滑膜细胞、软骨细胞、上皮细胞(例如，口腔黏膜上皮细胞、视网膜色素上皮细胞、鼻黏膜上皮细胞等)、内皮细胞(例如，血管内皮细胞等)、肝细胞(例如，肝实质细胞等)、胰细胞(例如，胰岛细胞等)、肾细胞、肾上腺细胞、牙周膜细胞、牙龈细胞、骨膜细胞、皮肤细胞等。作为源于iPS细胞的粘附细胞的非限定例，可举出源于iPS细胞的心肌细胞、成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞、肝细胞、胰细胞、肾细胞、肾上腺细胞、牙周膜细胞、牙龈细胞、骨膜细胞、皮肤细胞、滑膜细胞、软骨细胞等。
构成粘附状态的细胞培养物、尤其是片状细胞培养物的细胞可以来自能够利用粘附状态的细胞培养物、尤其是片状细胞培养物进行治疗的任意生物。该生物不受限定，例如包括人、非人灵长类、狗、猫、猪、马、山羊、绵羊、啮齿目动物(例如，小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠等)、兔等。另外，构成粘附状态的细胞培养物、尤其是片状细胞培养物的细胞的种类数没有特别限定，通常可以仅为1种，但本发明的粘附状态的细胞培养物使用2种以上的细胞，优选为2种。形成粘附状态的细胞培养物的细胞为2种以上的情况下，最多的细胞的含有比率(纯度)在粘附状态的细胞培养物形成结束时为50％以上，优选为60％以上，更优选为70％以上，进一步优选为75％以上。
形成粘附状态的细胞培养物、尤其是片状细胞培养物的细胞可以是源于异种的细胞，也可以是源于同种的细胞。此处，关于“源于异种的细胞”，在粘附状态的细胞培养物、尤其是片状细胞培养物被用于移植的情况下，是指源于与其受体为不同种的生物的细胞。例如，受体为人时，源于猴、猪的细胞等属于源于异种的细胞。另外，“源于同种的细胞”是指源于与受体为相同种的生物的细胞。例如，受体为人时，人细胞属于源于同种的细胞。源于同种的细胞包括自源细胞(也称为自身细胞或自体细胞)即源于受体的细胞、和同种非自源细胞(也称为异体细胞)。自源细胞即使进行移植也不发生排斥反应，因此尤其在用于移植的情况下是优选的。然而，也可以利用源于异种的细胞、同种非自源细胞。利用源于异种的细胞、同种非自源细胞的情况下，为了抑制排斥反应，有时需要进行免疫抑制处理。需要说明的是，本说明书中，也有时将自源细胞以外的细胞、即源于异种的细胞和同种非自源细胞统称为非自源细胞。在本发明的一个方式中，细胞为自体细胞或异体细胞。在本发明的一个方式中，细胞为自体细胞。在本发明的另一方式中，细胞为异体细胞。
片状细胞培养物可利用已知的任意方法(例如，参见专利文献1、专利文献2、日本特开2010-081829、日本特开2011-110368等)进行制造。片状细胞培养物的制造方法典型地包括将细胞接种至培养基材上的步骤、将接种的细胞片化的步骤、将形成的片状细胞培养物从培养基材剥离的步骤，但并不限定于此。在将细胞接种至培养基材上的步骤之前，可以进行将细胞冷冻的步骤及将细胞解冻的步骤。此外，在将细胞解冻的步骤之后可以进行清洗细胞的步骤。上述各步骤可以利用适于制造片状细胞培养物的已知的任意方法进行。本发明的制造方法可以包括制造片状细胞培养物的步骤，在该情况下，制造片状细胞培养物的步骤可以包括上述片状细胞培养物的制造方法涉及的步骤中的1或2个以上作为子步骤。在某一方式中，在将细胞解冻的步骤之后、且将细胞接种至培养基材上的步骤之前不包括使细胞增殖的步骤。
“等渗”这一用语是指两种液体的渗透压等同的状态，本发明中，只要未另行说明，则是指“生理性等渗”，表示具有与细胞内液、血液等生理性液体等同的渗透压。因此，本发明中，只要未另行说明，则“等渗液”与“生理性等渗液”含义相同，是指具有与细胞内液、血液等生理性液体等同的渗透压的液体。作为等渗液，例如可举出Hanks平衡盐溶液、生理盐水、磷酸缓冲生理盐水、林格氏液、基础培养基等，但并不限定于此。
本发明中，所谓“低营养”或“低营养状态”，是指被置于该条件下的细胞群的细胞数在规定的期间内既不增殖也不死亡而得以维持的条件、即在规定的期间内细胞数实质上不变的条件。所谓“细胞数实质上不变”，是指某个时间点的细胞数A、与经过规定时间后的其他时间点的细胞数B之间没有实质性差异，具体而言，例如可举出细胞数A为细胞数B的约70％、约80％、约90％、约95％、约100％、约105％、约110％、约120％、约130％等的情况。两个时间点可以任意选择，但优选空出在通常的培养条件下进行培养的情况下可确认到细胞增殖的程度的间隔。作为该间隔，例如为3天、4天、5天、6天、7天等。
低营养状态可借助各种条件而达成，本领域技术人员的话，可根据对象细胞来制作出适当的低营养状态。作为低营养状态的要件，典型地，例如可举出：可供给细胞的生命维持所需的能量；及/或缺少细胞分裂所需的要素；等等。具体而言，例如可举出：可供给代谢所需的糖分等能量的环境；及/或无法供给细胞分裂所需的必需氨基酸的环境；等等。
在一个方式中，低营养为低糖。“低糖”是指虽然包含糖但其比例低的状态，因此低糖中不包括无糖状态。作为该方式的例子，具体而言，例如低糖为低葡萄糖，低葡萄糖并非无葡萄糖。作为低糖，典型地，例如可举出包含低于1000mg/L的糖的组成等。作为其他的低糖条件的液体，例如包括：与不含追加的糖类的一般培养液中的糖类的条件相比使所含有的糖类降低至小于1％的条件等。作为低糖状态的液体中包含的糖的量，具体而言，例如小于1000mg/L，优选小于500mg/L，更优选小于200mg/L，进一步优选小于100mg/mL。
在另一方式中，低营养为无氨基酸状态、即不包含氨基酸。作为该方式的例子，具体而言，例如不包含必需氨基酸。
本发明中，“低营养等渗液”是指等渗液中的低营养的等渗液。典型地，例如为包含规定量的碳水化合物的等渗液及/或无法供给必需氨基酸的等渗液，具体而言，例如可举出包含规定量的糖但不包含氨基酸(尤其是必需氨基酸)的等渗液、包含规定量的糖及必需氨基酸的合成抑制剂的等渗液等。低营养等渗液中可包含的碳水化合物典型地为糖，例如可举出葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖、半乳糖等，但并不限定于此，可根据对象细胞种类等进行适当选择。糖的规定含量可根据包含的糖的种类、细胞的必要维持时间(浸渍时间)的不同而不同。例如为葡萄糖的情况下，从细胞维持生命的必要量这样的观点考虑，例如可举出约100mg/L以上、约500mg/L以上、约1000mg/L以上、约1500mg/L以上、约2000mg/L以上等。另外，从等渗性的维持这样的观点考虑，例如可举出约50000mg/L以下、约40000mg/L以下、约30000mg/L以下、约25000mg/L以下、约20000mg/L以下、约15000mg/L以下、约10000mg/L以下、约5000mg/L以下、约4500mg/L以下等。因此，作为葡萄糖的含量的范围，可以为这些上限值及下限值的任意组合，但并不限定于此，例如可举出约100～500000mg/L、约500～25000mg/L、约500～4500mg/L、约1500～4500mg/L、约500～1500mg/L的范围等。本领域技术人员的话，可根据包含的糖的种类算出规定的含量。
作为低营养等渗液，例如可以为：Hanks平衡盐溶液、Earle’s平衡盐溶液、葡萄糖等渗液等作为包含规定量的糖且不包含氨基酸的组成而已知的等渗液；以及，向例如生理盐水、磷酸缓冲生理盐水、林格氏液等作为不包含碳水化合物及氨基酸的组成而已知的等渗液中添加规定量的碳水化合物而得到的等渗液。作为规定量的碳水化合物，例如为Hanks平衡盐溶液、Earle’s平衡盐溶液时，一般含有1000～4500mg/L的葡萄糖，为葡萄糖等渗液时，含有约50000mg/L的葡萄糖。在一个方式中，低营养等渗液中不包含UW液、Euro-Collins液、Hypothermosol(注册商标)等以往作为器官的冷藏保存用溶液而已知的保存液。
本发明的低营养等渗液可以包含乳酸。因此，在本发明的一个方式中，低营养等渗液不包含乳酸。另外，本发明的低营养等渗液可以包含丙酮酸。因此，在本发明的一个方式中，低营养等渗液不包含丙酮酸。另外，本发明的低营养等渗液可以包含抗坏血酸。因此，在本发明的一个方式中，低营养等渗液包含抗坏血酸。另外，本发明的低营养等渗液可以包含脂肪酸。因此，在本发明的一个方式中，低营养等渗液不包含脂肪酸。另外，本发明的低营养等渗液可以包含钙。因此，在本发明的一个方式中，低营养等渗液包含钙，包含优选约1～2mM、更优选约1.2～1.8mM的浓度的钙。另外，本发明的低营养等渗液可以包含胆固醇。因此，在本发明的一个方式中，低营养等渗液不包含胆固醇。在一个优选方式中，低营养等渗液不包含乳酸、丙酮酸、脂肪酸及胆固醇，但包含抗坏血酸，并以约1～2mM、优选约1.2～1.8mM的浓度包含钙。
本说明书中，“碳水化合物”是以单糖作为结构单元的有机化合物的统称，除单糖类、寡糖类、多糖类外，也包括糖衍生物等。本说明书中，“糖”或“糖分”这样的用语是指碳水化合物中被细胞代谢而转化为能量的物质或成分，典型地表示单糖类，但也包括可在体系中分解而被细胞代谢的物质。
本发明的一个方面涉及对粘附状态的细胞培养物加以改变的方法，所述方法包括将包含至少2种细胞的粘附状态的细胞培养物浸渍于低营养等渗液中的工序。
本申请的发明人发现，若将包含2种以上细胞的粘附状态的细胞培养物、例如包含骨骼肌成肌细胞及成纤维细胞的片状细胞培养物预先浸渍于Hanks平衡盐溶液等低营养等渗液中，则构成粘附状态的细胞培养物的各细胞种类的含有比率发生变化，由此能够对粘附状态的细胞培养物加以改变。如下述实施例所示，含有比率的变化是在悬浮液状态的细胞混合物中并不发生的现象，为粘附状态的细胞培养物中特有的现象。
利用本发明的方法使粘附状态的细胞培养物改变的原因尚不明确，作为其原因，虽不受到理论的限制，但认为是由于：通过制成粘附状态的细胞培养物，与悬浮细胞的状态相比细胞的存活性提高，并且通过预先浸渍于低营养等渗液中，为了存活而需要较多营养的细胞容易死亡，因此，就所混合的各种细胞而言，细胞的减少率各自发生变化，通过浸渍规定时间，存活细胞数的差异变得显著；等等。
本发明的方法中使用的粘附状态的细胞培养物包含至少2种细胞。作为粘附状态的细胞培养物中包含的细胞，包含作为上述构成粘附状态的细胞培养物的细胞而在本技术领域中已知的细胞中的至少一种。优选的是，片状细胞培养物中包含的所有细胞均从作为上述构成片状细胞培养物的细胞而在本技术领域中已知的细胞中选择。
本发明的粘附状态的细胞培养物、尤其是片状细胞培养物对于各种疾病、尤其是与组织异常相关的疾病的处理而言是有用的。因此，在一个方式中，粘附状态的细胞培养物用于对与组织异常相关的疾病进行处理。作为成为处理对象的组织，不受限定，例如可举出心肌、角膜、视网膜、食道、皮肤、关节、软骨、肝脏、胰脏、牙龈、肾脏、甲状腺、骨骼肌、中耳、骨髓、胃、小肠、十二指肠、大肠等消化道等。另外，作为成为处理对象的疾病，不受限定，例如可举出心脏疾病(例如，心肌损伤(心肌梗塞、心脏外伤)、心肌病等)、角膜疾病(例如，角膜上皮干细胞缺乏症、角膜损伤(热·化学腐蚀)、角膜溃疡、角膜混浊、角膜穿孔、角膜瘢痕、史-约综合征(Stevens-Johnson syndrome)、眼类天疱疮等)、视网膜疾病(例如，视网膜色素变性、年龄相关性黄斑变性等)、食道疾病(例如，食道手术(食道癌切除)后的食道的炎症·狭窄的预防等)、皮肤疾病(例如，皮肤损伤(外伤、烫伤)等)、关节疾病(例如，变形性关节炎等)、软骨疾病(例如，软骨的损伤等)、肝疾病(例如，慢性肝病等)、胰脏疾病(例如，糖尿病等)、牙科疾病(例如，牙周病等)、肾脏疾病(例如，肾功能衰竭、肾性贫血、肾性骨营养不良症等)、甲状腺疾病(例如，甲状腺功能减退症等)、肌肉疾病(例如，肌肉损伤、肌炎等)、中耳疾病(例如，中耳炎等)、骨髓疾病(例如，白血病、再生不良性贫血、免疫缺陷病等)。
粘附状态的细胞培养物适用于成为处理对象的组织，也可以将其用于修复、再生，还可以作为激素等生理活性物质的供给源而移植至成为处理对象的组织以外的部位(例如，皮下组织等)。
粘附状态的细胞培养物可用于包含细胞培养物的药物组合物的制造。该药物组合物可以包含各种追加成分，例如药学上可允许的载体、提高细胞培养物的存活性、植入性及/或功能等的成分、对于对象疾病的处理而言有用的其他有效成分等。作为该追加成分，可以使用已知的任意成分，本领域技术人员熟知这些追加成分。另外，药物组合物可以与提高粘附状态的细胞培养物的存活性、植入性及/或功能等的成分、对于对象疾病的处理而言有用的其他有效成分等并用。
在本发明的一个方式中，粘附状态的细胞培养物为用于处理心脏疾病的粘附状态的细胞培养物。作为用于处理心脏疾病的粘附状态的细胞培养物，例如可举出包含骨骼肌成肌细胞的片状细胞培养物、包含心肌细胞的片状细胞培养物、包含血管内皮细胞的片状细胞培养物、包含间充质干细胞的片状细胞培养物等，但并不限定于此。优选为包含骨骼肌成肌细胞的片状细胞培养物、包含心肌细胞的片状细胞培养物及包含血管内皮细胞的片状细胞培养物。
作为包含骨骼肌成肌细胞(目标细胞)的粘附状态的细胞培养物、尤其是片状细胞培养物中可包含的其他构成细胞，例如可举出成纤维细胞、血管内皮细胞、及/或可分化成这些细胞的细胞(例如干细胞、祖细胞)等。作为包含心肌细胞(目标细胞)的粘附状态的细胞培养物、尤其是片状细胞培养物中可包含的其他构成细胞，例如可举出血管内皮细胞、平滑肌细胞、及/或可分化成这些细胞的细胞(例如干细胞、祖细胞)等。作为包含血管内皮细胞(目标细胞)的粘附状态的细胞培养物、尤其是片状细胞培养物中可包含的其他构成细胞，例如可举出骨骼肌成肌细胞、成纤维细胞、心肌细胞及/或可分化成这些细胞的细胞(例如干细胞、祖细胞)等。作为包含间充质干细胞(目标细胞)的粘附状态的细胞培养物、尤其是片状细胞培养物中可包含的其他构成细胞，例如可举出祖细胞、脂肪细胞、巨噬细胞、血管内皮细胞等。此处，“目标细胞”是指本发明的粘附状态的细胞培养物中主要的构成细胞，特别地，在用于处理疾病的细胞培养物中，是指对疾病的处理有用的细胞。
根据本发明的方法，通过使粘附状态的细胞培养物、尤其是片状细胞培养物中其他构成细胞的数量减少，能够提高目标细胞的纯度。因此，利用本发明的方法，能够提供目标细胞的纯度高的粘附状态的细胞培养物。例如在包含骨骼肌成肌细胞和成纤维细胞的粘附状态的细胞培养物、尤其是片状细胞培养物的情况下，通过使用本发明的方法，能够使成纤维细胞的含量降低、提高骨骼肌成肌细胞的纯度。
在本发明的一个优选方式中，粘附状态的细胞培养物、尤其是片状细胞培养物包含骨骼肌成肌细胞及成纤维细胞。在另一个优选方式中，粘附状态的细胞培养物、尤其是片状细胞培养物包含骨骼肌成肌细胞、成纤维细胞及间充质干细胞。在又一优选方式中，粘附状态的细胞培养物、尤其是片状细胞培养物不包含除骨骼肌成肌细胞及成纤维细胞以及从骨骼肌成肌细胞或成纤维细胞分化而来的细胞以外的细胞。在本发明的另一个优选方式中，粘附状态的细胞培养物、尤其是片状细胞培养物包含心肌细胞及血管内皮细胞。在又一优选方式中，粘附状态的细胞培养物、尤其是片状细胞培养物不包含除心肌细胞及血管内皮细胞以及从血管内皮细胞分化而来的细胞以外的细胞。在本发明的另一个优选方式中，粘附状态的细胞培养物、尤其是片状细胞培养物包含骨骼肌成肌细胞、成纤维细胞及血管内皮细胞。在又一优选方式中，粘附状态的细胞培养物、尤其是片状细胞培养物不包含除骨骼肌成肌细胞、成纤维细胞及血管内皮细胞以及从骨骼肌成肌细胞、成纤维细胞或血管内皮细胞分化而来的细胞以外的细胞。
在本发明的另一个优选方式中，粘附状态的细胞培养物、尤其是片状细胞培养物包含间充质干细胞及该间充质干细胞的夹杂细胞。此处，“间充质干细胞的夹杂细胞”是指在获得间充质干细胞时混入的除间充质干细胞以外的细胞。间充质干细胞的夹杂细胞根据间充质干细胞的来源的不同而不同，本领域技术人员的话，可根据来源组织而容易地理解混入的夹杂细胞的种类。作为间充质干细胞的来源，已知有例如骨髓、脂肪组织、脐带、脐带血、外周血、牙髓组织、胎盘、滑膜组织、牙周韧带、真皮组织、子宫内膜、壁蜕膜(deciduavera)等，作为间充质干细胞的夹杂细胞，例如若来源于骨髓，则可举出祖细胞、脂肪细胞、巨噬细胞、血管内皮细胞等，若来源于脂肪组织，则可举出祖细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞等。
在一个方式中，本发明提供：在包含骨骼肌成肌细胞和成纤维细胞的粘附状态的细胞培养物、尤其是片状细胞培养物中，成纤维细胞的含量减少、骨骼肌成肌细胞的纯度得以提高的粘附状态的细胞培养物、尤其是片状细胞培养物。本发明提供：在包含心肌细胞和其他细胞的粘附状态的细胞培养物、尤其是片状细胞培养物中，心肌细胞以外的细胞的含量减少、心肌细胞的纯度得以提高的粘附状态的细胞培养物、尤其是片状细胞培养物。作为心肌细胞以外的细胞的非限定例，可举出多能干细胞、iPS细胞、源于iPS细胞的未分化细胞等。本发明提供：在包含心肌细胞和血管内皮细胞和其他细胞的粘附状态的细胞培养物、尤其是片状细胞培养物中，除心肌细胞及血管内皮细胞以外的细胞的纯度减少、心肌细胞和血管内皮细胞的纯度得以提高的粘附状态的细胞培养物、尤其是片状细胞培养物。作为除心肌细胞及血管内皮细胞以外的细胞的非限定例，可举出多能干细胞、iPS细胞、源于iPS细胞的未分化细胞。
在本发明的一个方式中，粘附状态的细胞培养物包含从含有iPS细胞的多能干细胞分化诱导的细胞。在该方式中，在从多能干细胞得到分化诱导细胞(例如心肌细胞等)时，未分化细胞残留，该残留未分化细胞具有肿瘤化等风险，因此有时并不理想。然而，根据本发明的方法，能够降低该残留未分化细胞的含有率。另外，通过调节浸渍时间等，能够将目标细胞(例如心肌细胞)的含有率设定在期望的范围内。
在本发明的一个优选方式中，粘附状态的细胞培养物包含从iPS细胞分化诱导而来的心肌细胞。在该方式中，作为粘附状态的细胞培养物中包含的其他细胞，例如可举出从iPS细胞分化诱导而来的内皮细胞、壁细胞等构成血管的细胞等。在一个方式中，粘附状态的细胞培养物为包含30～70％的源于iPS的心肌细胞(目标细胞)、0.1～20％的源于iPS细胞的血管内皮细胞、1～40％的源于iPS细胞的血管壁细胞的细胞培养物、优选片状细胞培养物。为该粘附状态的源于iPS细胞的心肌细胞培养物的情况下，通过浸渍于低营养等渗液中，除作为目标细胞的心肌细胞以外的细胞数减少，结果，成为心肌细胞的含有率提高的结果。
本方式的源于iPS细胞的心肌细胞培养物可包含约5.0×104个/cm2以上、优选约1.0×105个/cm2以上的心肌细胞。另外，在另一方式中，可包含约5.0×106个/cm2以下、优选约2.0×106个/cm2以下、更优选约1.0×106个/cm2以下的心肌细胞。因此，作为本发明的粘附状态的细胞培养物中可包含的心肌细胞数，可以为上述的上限值及下限值的任意组合，例如可以为5.0×104个/cm2～5.0×106个/cm2、优选1.0×105个/cm2～2.0×106个/cm2等，另外，在另一方式中，可以为1.0×105个/cm2～1.0×106个/cm2等。
在本发明的一个优选方式中，低营养等渗液为Hanks平衡盐溶液。Hanks平衡盐溶液作为以1000mg/L的浓度包含葡萄糖的等渗液，其组成在本技术领域中已知。Hanks平衡盐溶液中，有包含镁、钙等二价阳离子的HBSS(+)及不包含它们的HBSS(-)，本发明中，更优选为HBSS(+)。HBSS(+)的典型组成为氯化钙(无水)140mg/L、氯化镁(六水合物)100mg/L、硫酸镁(七水合物)100mg/L、氯化钾400mg/L、磷酸二氢钾60mg/L、碳酸氢钠350mg/L、氯化钠8000mg/L、磷酸氢钠48mg/L、葡萄糖1000mg/L。
本发明的低营养等渗液可包含不对粘附状态的细胞培养物造成不良影响程度的追加成分。作为追加成分，例如可举出自由基清除剂等，但并不限定于此。作为本发明的低营养等渗液中可使用的自由基清除剂，具体而言，例如可举出维生素C、维生素E等维生素、依达拉奉等。
浸渍粘附状态的细胞培养物时的温度可以在不对粘附状态的细胞培养物造成损伤的范围内进行适当选择。在一个方式中，于室温进行浸渍。另外，在另一方式中，在冷藏条件(例如约2℃～8℃)下进行浸渍。因此，作为浸渍时的温度条件的非限定例，可举出约2～40℃、约2～35℃、约2～30℃、约2～25℃、约2～20℃、约2～15℃、约2～10℃、约2～8℃、约2～4℃、约8～40℃、约10～40℃、约15～40℃、约20～40℃、约25～40℃、约30～40℃、约35～40℃、约8～35℃、约8～30℃、约8～25℃、约15～40℃等。浸渍时间变长的情况下，从能够降低对粘附状态的细胞培养物的损伤的观点考虑，优选冷藏条件。
粘附状态的细胞培养物的浸渍时间只要在不对粘附状态的细胞培养物造成损伤的范围内即可，没有特别限定。然而，由于浸渍的液体为低营养，因此过长时间的浸渍不优选。因此浸渍时间的上限例如可举出2天(48小时)以下、3天(72小时)以下、100小时以下、5天(120小时)以下、150小时以下、1周(168小时)以下、200小时以下等，但并不限定于此。另外，由于必须预先浸渍为了发挥由浸渍带来的对粘附状态的细胞培养物的改变效果所需的时间以上，因此浸渍时间的下限例如可举出48小时以上、24小时以上、12小时以上、10小时以上、8小时以上、6小时以上、4小时以上等，但并不限定于此。因此，作为粘附状态的细胞培养物的浸渍时间的范围，可以为上述上限值及下限值的任意组合，例如可举出4～200小时、6～200小时、8～200小时、10～200小时、12～200小时、24～200小时、48～200小时、4～168小时、6～168小时、8～168小时、10～168小时、12～168小时、24～168小时、48～168小时、4～150小时、6～150小时、8～150小时、10～150小时、12～150小时、24～150小时、48～150小时、48～144小时、4～120小时、6～120小时、8～120小时、10～120小时、12～120小时、24～120小时、48～120小时、4～100小时、6～100小时、8～100小时、10～100小时、12～100小时、24～100小时、48～100小时、4～72小时、6～72小时、8～72小时、10～72小时、12～72小时、24～72小时、4～48小时、6～48小时、8～48小时、10～48小时、12～48小时、24～48小时等，但并不限定于此。
对于粘附状态的细胞培养物向低营养等渗液中的浸渍而言，可以为上述浸渍条件的任意组合。浸渍条件可根据要浸渍的粘附状态的细胞培养物及低营养等渗液的种类而变化，本领域技术人员的话，可适当选择最适条件。例如作为将包含骨骼肌成肌细胞及成纤维细胞的片状细胞培养物浸渍于低营养等渗液时的非限定例，可举出：于约2～8℃在Hanks平衡盐溶液中约4～200小时左右；于约2～8℃在Hanks平衡盐溶液中约8～150小时左右；于约2～8℃在Hanks平衡盐溶液中约12～120小时左右；于约2～8℃在Hanks平衡盐溶液中约24～72小时左右；于约15～30℃在Hanks平衡盐溶液中约4～200小时左右；于约15～30℃在Hanks平衡盐溶液中约8～150小时左右；于约15～30℃在Hanks平衡盐溶液中约12～120小时左右；于约15～30℃在Hanks平衡盐溶液中约24～72小时左右；于约2～8℃在葡萄糖浓度为4500mg/L的低营养等渗液中约4～200小时左右；于约2～8℃在葡萄糖浓度为4500mg/L的低营养等渗液中约8～150小时左右；于约2～8℃在葡萄糖浓度为4500mg/L的低营养等渗液中约12～120小时左右；于约2～8℃在葡萄糖浓度为4500mg/L的低营养等渗液中约24～72小时左右；于约15～30℃在葡萄糖浓度为4500mg/L的低营养等渗液中约4～200小时左右；于约15～30℃在葡萄糖浓度为4500mg/L的低营养等渗液中约8～150小时左右；于约15～30℃在葡萄糖浓度为4500mg/L的低营养等渗液中约12～120小时左右；于约15～30℃在葡萄糖浓度为4500mg/L的低营养等渗液中约24～72小时左右等。由此，片状细胞培养物中的骨骼肌成肌细胞的含有率(纯度)提高，成为在通过移植片状细胞培养物来处理心脏疾病时更优选的片状细胞培养物。
在一个方式中，粘附状态的细胞培养物为片状细胞培养物。在一个方式中，该片状细胞培养物在培养基材上形成后不剥离地浸渍于低营养等渗液中。在该情况下，作为剥离时使用的介质，可以使用低营养等渗液。作为该方式的具体例，例如向形成于培养基材上的片状细胞培养物加入低营养等渗液并使其浸渍，在该状态下冷却，或者加入已冷却的低营养等渗液，剥离后在该状态下浸渍，然后回收而供于使用。
在一个方式中，在形成粘附状态的细胞培养物的中途阶段，浸渍于低营养等渗液中。该情况下，可以在形成的中途阶段从通常的培养条件变更为低营养状态，也可以在形成的开始时间点以低营养状态开始培养。另外，在低营养等渗液中浸渍一定时间后，浸渍后从低营养状态变更为通常的培养条件。通常的培养条件与低营养状态的转换例如可以通过向低营养等渗液中添加例如糖、氨基酸等缺少的成分而达成，也可以通过液体更换来达成。
在另一方式中，粘附状态的细胞培养物为片状细胞培养物，该片状细胞培养物在培养基材上形成后从培养基材剥离，剥离后被浸渍于低营养等渗液中。片状细胞培养物从培养基材剥离时发生某种程度的收缩是已知的。该收缩的程度根据构成片状细胞培养物的细胞种类、含有比率、形成条件等的不同而不同。例如在采用本申请发明的片形成培养方式来形成包含骨骼肌成肌细胞及成纤维细胞的细胞群的情况下，作为其收缩比例，例如片的直径成为约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％左右。在本发明的一个方式中，所剥离的(即已收缩的)片状细胞培养物的面积可以为约1cm2以上、约3cm2以上、优选约6cm2以上、进一步优选约10cm2以上。
在本发明的一个方式中，片状细胞培养物是将多层的单层片状细胞培养物层叠而形成的。该层叠的片状细胞培养物可以通过使所剥离的单层片状细胞培养物叠合而形成。对于片状细胞培养物而言，可以在以单层片状细胞培养物的状态浸渍于低营养等渗液中后进行叠合而制成层叠体，也可以在使单层片状细胞培养物叠合而制成层叠体后浸渍于低营养等渗液中。
本发明的一个方面提供制造片状细胞培养物的方法。
本发明的片状细胞培养物的制造方法包括以下的工序(a)～(d)：
工序(a)，将包含目标细胞的细胞群、优选为包含2种以上细胞的细胞群以能在不实质性增殖的情况下形成片状细胞培养物的密度接种至培养基材上；
工序(b)，对接种的细胞群进行培养而形成片状细胞培养物；及
工序(c)，将形成的片状细胞培养物浸渍于低营养等渗液中。
工序(a)中，在要接种的细胞群中，包含选自上述构成片状细胞培养物的细胞中的1种以上的细胞，优选由选自上述形成片状细胞培养物的细胞中的2种以上的细胞组成。形成片状细胞培养物的2种以上的细胞中，最多的细胞的含有比率(纯度)在片状细胞培养物形成结束时为50％以上，优选为60％以上，更优选为70％以上，进一步优选为75％以上。在一个方式中，本发明的制造方法包括在接种细胞前将细胞群冷冻的工序及将该冷冻细胞群解冻的工序。在上述方式中，解冻而得到的细胞群可以之后使细胞增殖、然后接种，但在一个优选方式中，在将冷冻细胞群解冻的工序与工序(a)之间不包括使细胞增殖的工序。就通过该方式制造的片状细胞培养物而言，与通过在将冷冻细胞群解冻的工序与工序(a)之间包括使细胞增殖的工序的方式制造的片状细胞培养物相比，例如细胞因子产生能力、植入能力、血管诱导能力及组织再生能力等的活性高。此处，所谓活性高，是指以作为比较对象的片状细胞培养物的活性为基准，活性高出例如5％以上、10％以上、20％以上、30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上或100％以上，但并不限定于此。在一个优选方式中，本发明的包含骨骼肌成肌细胞的片状细胞培养物包含60％～99％的骨骼肌成肌细胞。在另一个优选方式中，本发明的包含心肌细胞的片状细胞培养物包含50％～70％的心肌细胞。
在本发明的一个方式中，作为要接种的细胞群，可以使用包含从iPS细胞等多能干细胞分化诱导而来的细胞的细胞群。在该方式中，从多能干细胞得到分化诱导细胞(例如心肌细胞等)时，未分化细胞残留，该残留未分化细胞具有肿瘤化等风险，因此有时并不理想。然而，根据本发明的方法，能够降低该残留未分化细胞的含有率。另外，通过调节浸渍时间等，能够将目标细胞(例如心肌细胞)的含有率设定在期望的范围内。
在本发明的一个方式中，要接种的细胞群可以为包含选自上述构成粘附状态的细胞培养物的细胞中的1种以上的细胞、优选选自上述构成粘附状态的细胞培养物的细胞中的2种以上细胞的、粘附状态的细胞培养物或者从该粘附状态的细胞培养物制备的细胞群。即，作为要接种的细胞群，可以为球状体、胚状体本身、以及通过使这些细胞凝集体分散而得到的细胞群。在该方式中，与后述的(b)片化工序不同，可包括形成细胞间粘附的工序，所述细胞间粘附用于形成用于进行接种的球状体、胚状体。作为用于形成球状体、胚状体等粘附状态的细胞培养物的条件，可以使用本技术领域中已知的方法。作为该方法的非限定例，例如可举出Miki等人,Cell Stem Cell 16,699-711,2015年6月4日、WO2014/185358、WO2017/038562等中记载的方法等。
由本发明的制造方法制造的片状细胞培养物优选为用于心脏疾病的处理的片状细胞培养物。因此，在本发明的一个优选方式中，要接种的细胞群包含骨骼肌成肌细胞及成纤维细胞。在本发明的另一个优选方式中，要接种的细胞群包含心肌细胞及血管内皮细胞。在本发明的另一个优选方式中，要接种的细胞群包含骨骼肌成肌细胞、成纤维细胞及血管内皮细胞。
所谓“能在不实质性增殖的情况下形成片状细胞培养物的密度”是指，在用实质上不含生长因子的非增殖系培养液进行培养时，能够形成片状细胞培养物的细胞密度。该接种密度高于使用含有生长因子的培养液的方法中的密度，可以为细胞达到汇合(confluent)的密度以上。作为该密度，例如为1.0×105个/cm2以上，但并不限定于此。就接种密度的上限而言，只要不损害细胞培养物的形成、且细胞不进入分化，则没有特别限制，例如可以小于3.4×106个/cm2。在一个方式中，“能在细胞不实质性增殖的情况下形成片状细胞培养物的密度”为细胞达到汇合的密度或其以上、或者汇合密度以上。
就“能在细胞不实质性增殖的情况下形成片状细胞培养物的密度”而言，在某一方式中为1.0×105～3.4×106个/cm2，在另一个方式中为3.0×105～3.4×106个/cm2，在又一其他方式中为3.5×105～3.4×106个/cm2，在又一其他方式中为1.0×106～3.4×106个/cm2，在又一其他方式中为3.0×105～1.7×106个/cm2，在另一方式中为3.5×105～1.7×106个/cm2，在又一其他方式中为1.0×106～1.7×106个/cm2。对于上述范围而言，只要上限小于3.4×106个/cm2，则可以包含上限及下限两者或其中任一方。因此，上述密度可以为例如3.0×105个/cm2以上且小于3.4×106个/cm2(包含下限，不包含上限)、3.5×105个/cm2以上且小于3.4×106个/cm2(包含下限，不包含上限)、1.0×106个/cm2以上且小于3.4×106个/cm2(包含下限，不包含上限)、大于1.0×106个/cm2且小于3.4×106个/cm2(下限、上限均不包含)、大于1.0×106个/cm2且为1.7×106个/cm2以下(不包含下限但包含上限)。
对于培养基材而言，只要细胞能在其上形成片状细胞培养物，则没有特别限定，可使用本技术领域中通常使用的培养基材。作为该基材，例如可举出聚乙烯、聚丙烯、Teflon(注册商标)、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚甲基丙烯酸甲酯、尼龙6,6、聚乙烯醇、纤维素、硅、聚苯乙烯、玻璃、聚丙烯酰胺、聚二甲基丙烯酰胺、金属(例如，铁、不锈钢、铝、铜、黄铜)等，但并不限定于此。培养基材中，除了培养容器的一面(例如容器的底面)外，还可包含细胞培养用支架的表面等。
可以对培养基材的表面实施对片状细胞培养物的制造有利的加工，包括用于提高细胞粘附性的加工、用于使剥离容易进行的加工等。作为这样的加工，例如可举出电晕放电处理、紫外线照射处理、基于胶原凝胶、亲水性聚合物等亲水性化合物的涂覆、基于胶原、纤连蛋白、层粘连蛋白(laminin)、玻连蛋白、蛋白多糖、糖胺多糖等胞外基质、钙黏着蛋白家族、选择素家族、整合素家族等细胞粘附因子等的涂覆、基于对例如温度、光等刺激产生响应而发生物性变化的材料的涂覆等，但并不限定于此。
作为对温度、光等刺激产生响应而发生物性变化的材料，例如可以使用下述已知材料：由(甲基)丙烯酰胺化合物、N-烷基取代(甲基)丙烯酰胺衍生物(例如，N-乙基丙烯酰胺、N-正丙基丙烯酰胺、N-正丙基甲基丙烯酰胺、N-异丙基丙烯酰胺、N-异丙基甲基丙烯酰胺、N-环丙基丙烯酰胺、N-环丙基甲基丙烯酰胺、N-乙氧基乙基丙烯酰胺、N-乙氧基乙基甲基丙烯酰胺、N-四氢糠基丙烯酰胺、N-四氢糠基甲基丙烯酰胺等)、N,N-二烷基取代(甲基)丙烯酰胺衍生物(例如，N,N-二甲基(甲基)丙烯酰胺、N,N-乙基甲基丙烯酰胺、N,N-二乙基丙烯酰胺等)、具有环状基团的(甲基)丙烯酰胺衍生物(例如，1-(1-氧代-2-丙烯基)吡咯烷、1-(1-氧代-2-丙烯基)哌啶、4-(1-氧代-2-丙烯基)吗啉、1-(1-氧代-2-甲基-2-丙烯基)吡咯烷、1-(1-氧代-2-甲基-2-丙烯基)哌啶、4-(1-氧代-2-甲基-2-丙烯基)吗啉等)、或乙烯基醚衍生物(例如，甲基乙烯基醚)的均聚物或共聚物形成的温度响应性材料，具有偶氮苯基的光吸收性高分子、三苯甲烷无色氢氧化物(triphenylmethane leucohydroxide)的乙烯基衍生物与丙烯酰胺系单体的共聚物、及含有螺苯并吡喃的N-异丙基丙烯酰胺凝胶等光响应性材料等(例如，参见日本特开平2-211865、日本特开2003-33177)，但并不限定于此。通过对这些材料施加特定的刺激，可以使其物性(例如亲水性、疏水性)变化、从而能够促进附着在该材料上的细胞培养物的剥离。被覆有温度响应性材料的培养皿已有市售(例如UpCell(R)，CellSeed)，可以将其用于本发明的制造方法中。
上述培养基材可以为各种形状，可以在任意大小及形状的容器中进行，但优选为平坦的。另外，其面积没有特别限定，典型地，为约1cm2～约200cm2，优选为约2cm2～约100cm2，更优选为约3cm2～约50cm2。
工序(b)中，通过对接种的细胞群进行片化培养，从而形成片状细胞培养物。“片化培养”是指对已接种至培养基材上的细胞以形成片状细胞培养物(即，片化)的方式进行培养。典型地，片化培养通过下述方式进行：接种可在培养基材上形成片状细胞培养物的细胞，在形成片状细胞培养物的条件下，在规定的期间内进行培养，使细胞彼此相互作用，将细胞彼此连接。培养的期间只要为对于形成片状细胞培养物而言充分的期间，就没有特别限定。接种的细胞群中包含未分化细胞的情况下，规定的期间优选在细胞不进入分化的期间内。因此，在该方式中，细胞在培养期间内维持为未分化的状态。就细胞进入分化而言，可利用本领域技术人员已知的任意方法进行评价。例如，为骨骼肌成肌细胞的情况下，可以将MHC的表达、细胞的多核化作为分化的指标。
对于形成片状细胞培养物的条件而言，包含能够形成细胞与基材的粘附、细胞间粘附的任意条件，其不受限定，例如包含通常的细胞培养条件。作为该条件，例如可举出在37℃、5％CO2下的培养。因此，片化的工艺可以在常温下(例如37℃等)进行。另外，从对于形成片状细胞培养物而言充分的时间的观点考虑，培养时间根据形成片状细胞培养物的细胞(片形成细胞)的种类不同而不同。例如片形成细胞为骨骼肌成肌细胞的情况下，例如为12小时以上、16小时以上、20小时以上、24小时以上、26小时以上、28小时以上、30小时以上、32小时以上、36小时以上，但并不限定于此，从防止细胞分化的观点考虑，例如在48小时以内、44小时以内、40小时以内、36小时以内，但并不限定于此。因此，作为培养时间，可以示例这些上限及下限的任意组合，例如为12～48小时、16～48小时、20～48小时、24～48小时、26～48小时、28～48小时、30～48小时、32～48小时、36～48小时、12～44小时、16～44小时、20～44小时、24～44小时、26～44小时、28～44小时、30～44小时、32～44小时、36～44小时、12～40小时、16～40小时、20～40小时、24～40小时、26～40小时、28～40小时、30～40小时、32～40小时、36～40小时、12～36小时、16～36小时、20～36小时、24～36小时、26～36小时、28～36小时、30～36小时、32～36小时等，但并不限定于此。另外，片形成细胞为心肌细胞(包括源于iPS细胞的心肌细胞)的情况下，作为下限，例如为24小时以上、30小时以上、36小时以上，作为上限，为48小时以内、72小时以内、96小时以内、120小时以内，但并不限定于此。因此，作为培养时间，可以示例这些上限及下限的任意组合，例如可举出24～48小时、24～72小时、24～96小时、24～120小时、30～48小时、30～72小时、30～96小时、30～120小时、36～48小时、36～72小时、36～96小时、36～120小时等，但并不限定于此。本领域技术人员的话，可以根据接种的细胞种类选择最合适的条件。片化培养的非限定例记载于例如专利文献1、日本特开2010-081829、日本特开2010-226991、日本特开2011-110368、日本特开2011-172925、WO2014/185517等中。
作为片化中使用的片化介质，只要可诱导细胞的片化则没有特别限定，可以使用例如生理盐水、各种生理缓冲液(例如，PBS、HBSS等)、以各种细胞培养用的基础培养基为基底而得到的物质等。该基础培养基不受限定，例如包括DMEM、MEM、F12、DME、RPMI1640、MCDB(MCDB102、104、107、120、131、153、199等)、L15、SkBM、RITC80-7、DMEM/F12等。这些基础培养基大多已有市售，其组成也是已知的。基础培养基可以按标准的组成直接(例如，在市售的原本状态下)使用，也可以根据细胞种类、培养条件来适当变更其组成。因此，基础培养基并不限定于已知组成的培养基，包括1种或2种以上的成分被追加、除去、增量或减量而得到的培养基。片化介质可包含血清(例如，胎牛血清等牛血清、马血清、人血清等)、各种生长因子(例如，FGF、EGF、VEGF、HGF等)等添加物。
另外，如上所述，由于细胞以不实质性增殖的密度被接种，因此无需像现有方法那样等待细胞培养物生长为期望的大小，能够在短时间内得到期望的大小及形状的片状细胞培养物。片状细胞培养物的大小、形状可以通过下述方式任意调节：调节培养基材的细胞附着面的大小·形状；或在培养容器的细胞粘附面设置期望的大小·形状的模框、并在其内部培养细胞；等等。
在本发明的一个方式中，
工序(c)中，将所剥离的片状细胞培养物浸渍于低营养等渗液中。因此，片状细胞培养物在已收缩的状态下浸渍于低营养等渗液中。该浸渍工序的详细情况如上述片状细胞培养物的改变方法中记载的那样。
本发明方法的一个方式中，还包括工序(c’)将形成的片状细胞培养物剥离。工序(c’)可以在工序(c)之前进行，也可以在工序(c)之后进行。工序(c’)中，作为剥离用介质，可以使用通常的培养基，也可以使用低营养等渗液。使用低营养等渗液作为剥离介质的情况下，可以在工序(c)中浸渍于低营养等渗液中后直接实施工序(c’)，也可以在工序(c’)中剥离后使其直接浸渍于剥离用介质中而作为工序(c)。另外，片状细胞培养物的浸渍、之后的保存也可以在常温或冷藏条件下进行，优选在冷藏条件下进行。
对于剥离而言，只要能够在保持片状细胞培养物的结构的状态下从培养基材剥离，则没有特别限定，可以使用本技术领域中已知的方法。具体而言，例如，可以通过利用蛋白质分解酶(例如胰蛋白酶等)的酶处理、吹吸等机械性处理、使用了支承体的物理性剥离等来进行。另外，使用由对温度、光等刺激产生响应而发生物性变化的材料被覆培养基材的表面而得到的培养基材时，通过施加特定的刺激，也可以非酶性地脱离。例如使用由低温下粘接性降低的温度响应性材料被覆表面而得到的培养基材时，可以加入剥离用的介质(可以与上述片化介质相同)并进行冷却、或者加入已冷却的剥离用介质，从而使粘接性降低，进行剥离。另外，即使在为了将形成的片状细胞培养物剥离而加入已冷却的介质的情况下，剥离工序本身仍可以于常温(例如，37℃附近的温度)进行，也可以在冷藏条件下进行。
片状细胞培养物从培养基材剥离时发生某种程度的收缩是已知的。该收缩的程度根据构成片状细胞培养物的细胞种类、含有比率、形成条件等的不同而不同。例如在采用本申请发明的片形成培养方式来形成包含骨骼肌成肌细胞及成纤维细胞的细胞群的情况下，作为其收缩比例，例如片的直径成为约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％左右。在本发明的一个方式中，所剥离的(即已收缩的)片状细胞培养物的面积可以为约1cm2以上、约3cm2以上、优选约6cm2以上、进一步优选约10cm2以上。使所剥离的片状细胞培养物收缩时，可以于常温(例如，37℃附近的温度)使其收缩，也可以在冷藏条件下使其收缩。
另外，剥离工序(c)之后，可以任选地增加清洗工序。该清洗工序也可以于常温(例如，37℃附近的温度)进行，也可以在冷藏条件下进行。
该剥离工序的详细情况如上述片状细胞培养物的改变方法中所记载的那样。
本发明方法的一个方式中，在工序(c’)之后，还包括工序(c”)将所剥离的片状细胞培养物层叠。对于工序(c”)而言，只要在工序(c’)之后即可，可以在工序(c)之前也可以在工序(c)之后。即，可以在浸渍于低营养等渗液中后进行剥离及层叠；也可以在剥离后浸渍于低营养等渗液中，之后进行层叠；还可以在进行剥离及层叠后将成为层叠体的片状细胞培养物浸渍于低营养等渗液中。
本发明中，只要能够将温度等浸渍条件控制地合适，就能够将片状细胞培养物以浸渍于低营养等渗液中的状态进行输送。另外，利用本发明的方法加以改变的片状细胞培养物可以在从低营养等渗液取出后立即用于移植中。因此，在本发明的一个方式中，可以制造片状细胞培养物并浸渍于低营养等渗液中，在该状态下进行输送及保存，然后取出使用。
如上所述，本发明的片状细胞培养物可以用于药物组合物的制造。因此，本发明中也包括使用本发明的片状细胞培养物对上述各种疾病进行处理的方法。
本发明的处理方法包括下述步骤：将有效量的片状细胞培养物或包含其的药物组合物施予至需要其的对象。关于成为处理方法的对象的组织、疾病，如上文中针对片状细胞培养物记载过的那样。另外，在该处理方法中，可以将提高片状细胞培养物的存活性、植入性及/或功能等的成分、对于对象疾病的处理而言有用的其他有效成分等与细胞培养物并用。
本说明书中记载的各种特征可以进行各种各样的组合，由这样的组合得到的方案(也包括本说明书中未具体记载的组合)均在本发明的范围内。另外，本领域技术人员理解可进行不超出本发明主旨的各种大量改变，包含所述改变的等同方案也包括在本发明的范围内。因此，本说明书中记载的方式仅仅是示例，应当理解的是这些并非出于限制本发明的范围的意图而记载。以下，通过实施例具体地说明本发明，但本发明并不限定于这些实施例。
实施例
例1.片状细胞培养物的改变试验
(1)片状细胞培养物的制备
使用利用常规方法从人骨骼肌制备的骨骼肌成肌细胞(包含成纤维细胞)，制备片状细胞培养物。以成为3.7×106个/孔的方式，将在含有20％人血清的DMEM/F12培养基(Thermo Fisher Scientific Inc.)中悬浮的人骨骼肌成肌细胞与人成纤维细胞的细胞混合物接种于温度响应性培养皿(UpCell(R)12孔多孔培养板，CellSeed)中，于37℃、5％CO2下进行12～26小时片化培养。片化培养后，除去培养基，加入700μL的已冷却的HBSS(+)(Thermo Fisher Scientific Inc.)，静置10分钟，之后轻轻地吹吸而使片状细胞培养物完全剥离。
在将片状细胞培养物完全剥离后，除去HBSS(+)，加入新的常温HBSS(+)进行漂洗。将该清洗工序进行4次。在除去HBSS(+)后，加入1.55mL新的HBSS(+)，在2～8℃的条件下静置。
(2)骨骼肌成肌细胞含有率的评价
针对(1)中在冷藏条件下静置的片状细胞培养物，每24小时测定骨骼肌成肌细胞含有率(以下称为“纯度”)。用胰蛋白酶这样的蛋白分解酶使形成的片状细胞培养物解离后，进行离心处理，弃去上清液。向其中加入含0.5％BSA的PBS液对细胞进行漂洗，然后添加经含0.5％BSA的PBS液稀释10倍的抗人CD56抗体(Becton Dickinson)，并进行混合。作为对照，准备下述物质，其是添加经含0.5％BSA的PBS液稀释10倍的阴性对照用抗体(BectonDickinson)并进行混合而得到的。混合各抗体后，立即在冷暗处反应约1小时，加入含0.5％BSA的PBS液对细胞进行漂洗，然后，加入含0.5％BSA的PBS液并供于分析。分析是使用流式细胞仪(Becton Dickinson)，对混合有各抗体的细胞中包含的抗体阳性细胞的比例进行测量。在进行测量时，以阴性对照的阳性率进行校正，分析了5,000～10,000个细胞数。分析后，根据混合有各抗体的细胞的阳性细胞率的比例之差求出纯度。
将结果示于图1。由图1可知，在冷藏条件下浸渍于HBSS(+)中时，CD56阳性细胞(即骨骼肌成肌细胞)的纯度上升，在约48小时达到90％左右，保持该比例而以维持约90％的纯度的状态保存至144小时后。然而，216小时后纯度急剧降低。认为这是由于骨骼肌成肌细胞无法存活、开始死亡。
例2.细胞悬浮液中的改变试验
针对处于未片化状态的人骨骼肌成肌细胞与人成纤维细胞的混合物，加入1.55mLHBSS(+)，在2～8℃的冷藏条件下静置。在试验开始时和72小时后，与上述例1(2)同样地测定骨骼肌成肌细胞的纯度。
将结果示于图2。在未片化的情况下，未能确认到骨骼肌成肌细胞的纯度变化。

Claims (18)

1.对粘附状态的细胞培养物加以改变的方法，其特征在于，所述方法包括将包含至少2种细胞的粘附状态的细胞培养物浸渍于低营养等渗液中的工序，由此使构成所述粘附状态的细胞培养物的细胞种类的含有比率发生变化。
2.如权利要求1所述的方法，其中，粘附状态的细胞培养物包含骨骼肌成肌细胞及成纤维细胞。
3.如权利要求2所述的方法，其中，改变是使成纤维细胞的含有率降低。
4.如权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，粘附状态的细胞培养物为片状细胞培养物。
5.如权利要求4所述的方法，其中，片状细胞培养物是从培养基材剥离而得到的细胞培养物。
6.如权利要求5所述的方法，其中，片状细胞培养物是在剥离时发生收缩的细胞培养物。
7.如权利要求5或6所述的方法，其中，片状细胞培养物在剥离后具有6cm2以上的面积。
8.如权利要求4～7中任一项所述的方法，其中，片状细胞培养物是将多层的单层片状细胞培养物层叠而形成的。
9.如权利要求1～8中任一项所述的方法，其中，低营养等渗液为Hanks平衡盐溶液。
10.如权利要求1～9中任一项所述的方法，其中，浸渍进行24～150小时。
11.如权利要求1～10中任一项所述的方法，其中，浸渍于2～8℃进行。
12.片状细胞培养物的制造方法，其包括下述工序：
(a)将包含2种以上细胞的细胞群以能在不实质性增殖的情况下形成片状细胞培养物的密度接种至培养基材上，
(b)对接种的细胞群进行片化培养从而形成片状细胞培养物，以及
(c)将形成的片状细胞培养物浸渍于低营养等渗液中。
13.如权利要求12所述的方法，其中，在工序(c)之前包括下述工序：
(c’)将形成的片状细胞培养物剥离。
14.如权利要求12所述的方法，其中，在工序(c)之后包括下述工序：
(c’)将形成的片状细胞培养物剥离。
15.如权利要求13或14所述的方法，其中，在(c’)的工序中，片状细胞培养物在剥离时发生收缩。
16.如权利要求13～15中任一项所述的方法，其中，所剥离的片状细胞培养物具有6cm2以上的面积。
17.如权利要求13～16中任一项所述的方法，其中，在(c’)之后还包括下述工序：
(c”)将所剥离的片状细胞培养物层叠。
18.片状细胞培养物的制造方法，其包括下述工序：
(a)将包含目标细胞的细胞群以能在不实质性增殖的情况下形成片状细胞培养物的密度接种至培养基材上，
(b)对接种的细胞群进行片化培养从而形成片状细胞培养物，
(c)将形成的片状细胞培养物剥离，以及
(d)将所剥离的片状细胞培养物浸渍于低营养等渗液中。
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