CN114423441A

CN114423441A - 用于提高cd56阳性细胞的比率的方法

Info

Publication number: CN114423441A
Application number: CN202080062751.XA
Authority: CN
Inventors: 结城璃咲
Original assignee: Terumo Corp
Current assignee: Terumo Corp
Priority date: 2019-09-30
Filing date: 2020-09-30
Publication date: 2022-04-29
Anticipated expiration: 2040-09-30
Also published as: CN114423441B; EP4026587A1; JPWO2021065989A1; US20220175846A1; WO2021065989A1; EP4026587A4

Abstract

本发明以提供使采集到的骨骼肌组织中的CD56阳性细胞的比率提高的方法为课题。上述课题是通过以下方法来解决的，所述方法包括将采集到的骨骼肌组织浸渍在保存液中的步骤，提高骨骼肌组织中的CD56阳性细胞的比率。

Description

用于提高CD56阳性细胞的比率的方法

技术领域

本发明涉及用于提高骨骼肌组织中的CD56阳性细胞的比率的方法、CD56阳性细胞的比率高的细胞群的制备方法、利用上述方法而得的移植片的制备方法、以及通过该制备方法制备而得的移植片等。

背景技术

尽管近年来对心脏病的治疗取得革命性的发展，但仍未建立针对严重心力衰竭的治疗体系。作为治疗严重心力衰竭的解决对策而开展新的再生医学被认为是不可或缺的。在严重心肌梗塞等中，心肌细胞陷入功能衰竭，进而发展出纤维细胞的增殖、间质的纤维化发展，呈现出心力衰竭。伴随心力衰竭的发展，心肌细胞遭受损害并陷入凋亡，但由于心肌细胞几乎不发生细胞分裂，因此心肌细胞数量减少而心功能的降低进一步加剧。细胞移植法对于上述严重心力衰竭患者的心功能恢复是有用的，已经启动了基于骨骼肌成肌细胞的临床应用。

近年来，作为其中一例，提供了包含骨骼肌成肌细胞的、能向心脏移植的三维构建的细胞培养物，及其制备方法(专利文献1)。用于上述细胞移植的骨骼肌成肌细胞通常是从移植的对象的骨骼肌组织中分离被称为骨骼肌成肌细胞、肌卫星细胞的CD56阳性细胞而获得的，作为使CD56阳性细胞的比例提高的策略，已知有以下方法，例如，将骨骼肌组织在蛋白质分解酶溶液中浸渍规定的时间进行酶处理，将处理得到的酶处理液弃置后，再在蛋白质分解酶溶液中浸渍规定的时间进行酶处理，回收包含于得到的酶处理液中的细胞的方法(专利文献2)，作为仅培养肌细胞的培养液，使用含有血清和基础培养基、而实质上不含葡萄糖的培养基是已知的，其中，上述血清浓度为全培养液中10～40体积％、上述基础培养基为全培养液中50～90体积％(专利文献3)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：特表2007-528755号公报

专利文献2：特开2011-110368号公报

专利文献3：特开2018-000194号公报

发明内容

发明要解决的课题

骨骼肌成肌细胞、肌卫星细胞等CD56阳性细胞存在于构成骨骼肌的肌纤维的深部、即基底膜和原生质膜之间，因此为了从被采集到的骨骼肌组织中分离CD56阳性细胞，需要将骨骼肌组织整体进行破坏，结果导致经分离得到的细胞群中必然也大量地含有构成骨骼肌组织地成纤维细胞等非CD56阳性细胞。为了制备更高品质的移植片，需要简单且稳定地提高CD56阳性细胞的比率的方法。

用于解决课题的手段

本申请的发明人为解决上述问题进行了深入研究，结果发现，将采集到的骨骼肌组织浸渍在保存液中并将其维持后，骨骼肌组织中的CD56阳性细胞的比率发生飞跃性提高，进而推进研究，从而完成了本发明。

即，本发明涉及以下内容。

[1]使骨骼肌组织中的CD56阳性细胞的比率提高的方法，所述方法包括将采集到的骨骼肌组织浸渍在保存液中的步骤。

[2]如[1]所述的方法，其中，在浸渍的步骤中，至采集到的骨骼肌组织中的非CD56阳性细胞的比率减少至20％以下为止进行浸渍。

[3]如[1]或[2]所述的方法，其中，在浸渍的步骤中，至骨骼肌组织的溶胀度成为1.2以上为止在保存液中进行浸渍。

[4]如[1]～[3]中任一者所述的方法，其中，在浸渍的步骤中，在保存液中浸渍12小时以上。

[5]制备CD56阳性细胞数的比率高的细胞群的方法，所述方法包括[1]～[4]中任一者所述的方法。

[6]如[5]所述的方法，其进一步包括从骨骼肌组织中分离细胞群的步骤。

[7]CD56阳性细胞的比率高的细胞群，其是通过[5]或[6]所述的方法而得到的。

[8]移植片的制备方法，其使用了[7]所述的细胞群。

[9]移植片，其是通过[8]所述的方法得到的。

[10]对象的心脏疾病的治疗方法，其包括向有需要的对象施予治疗有效量的[7]所述的细胞群或[9]所述的移植片的工序。

发明效果

本发明可以使采集到的组织中的CD56阳性细胞的比率提高，从而可以简单且稳定地提供高品质的细胞群和移植片等。

附图说明

[图1]图1是示出肌卫星细胞(A)存在于构成骨骼肌的肌纤维的基底膜(B)与原生质膜(C)之间的示意图。

具体实施方式

除非本说明书中另外定义，本说明书中使用的所有技术术语和科学术语均具有与本领域技术人员的通常理解相同的意味。本说明书中引用的所有专利、专利申请、已公开的专利申请及其他出版物，其全文均通过引用而援引到本说明书中。以下，基于本发明的优选的实施方式，对本发明进行说明。

<提高组织中的CD56阳性细胞的比率的方法>

包括使骨骼肌组织中的CD56阳性细胞的比率提高的方法，所述方法包括将采集到的骨骼肌组织浸渍在保存液中的步骤。

本公开文本中的“CD56阳性细胞”是指以细胞表面标志物CD56为特征的细胞。CD56阳性细胞可以是体细胞，也可以是未分化的干细胞(例如成肌细胞、多能性干细胞(心脏干细胞等组织干细胞等)、间充质干细胞等)等，但包含于骨骼肌组织中的CD56阳性细胞通常是骨骼肌成肌细胞和肌卫星细胞等骨骼肌前体细胞。

本公开文本中的“CD56阳性细胞的比率”指相对于构成以下组织或细胞群的全部细胞数的CD56阳性细胞数的比例，所述组织或细胞群包含CD56阳性细胞和CD56阳性细胞以外的细胞(也称为非CD56阳性细胞)。

从骨骼肌组织分离而得的细胞群主要由例如骨骼肌成肌细胞和肌卫星细胞等骨骼肌前体细胞以及成纤维细胞构成。在此情况下，骨骼肌前体细胞为CD56阳性细胞，“CD56阳性细胞的比率的增加”是使骨骼肌前体细胞的比率增加。因此，在本发明的一个实施方式中，CD56阳性细胞为骨骼肌成肌细胞及/或肌卫星细胞，非CD56阳性细胞为成纤维细胞。

作为测定CD56阳性细胞的比率的方法，可举出例如用抗CD56抗体进行标记，将抗体所结合的阳性细胞数除以计数而得的总细胞数。CD56阳性细胞的计数可以通过用特异性抗体染色过的标本的显微镜观察、显微镜图像的图像分析、用特异性抗体染色过的细胞群的流式细胞术分析等来进行。

若CD56阳性细胞为例如骨骼肌成肌细胞，则除CD56以外没有限制，可以通过例如Pax7、GATA4、MyoD、α7整合素、肌球蛋白重链IIa、肌球蛋白重链IIb、肌球蛋白重链IId(IIx)、Myf5、肌细胞生成素(myogenin)等标志物来识别。若CD56阳性细胞为肌卫星细胞，则除CD56以外没有限制，可以通过例如Pax7、α7整合素、CD34、CXCR4、CD29等标志物来识别。

本发明中使用的骨骼肌组织(以下也称为组织)可源于任何生物。上述生物没有限制，包括例如人、非人类灵长类、啮齿类(小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠等)、犬、猫、猪、马、牛、山羊、绵羊等。对于本发明中使用的组织可以是从生物体而言，例如从受体采集到的组织。因此，本发明的使CD56阳性细胞的比率提高的方法可以包括以下步骤：进行浸渍前，从生物体等采集骨骼肌组织的步骤及/或清洗所采集到的骨骼肌组织的步骤。

用于本发明的保存液只要是组织中的CD56阳性细胞能存活的保存液即可，没有特殊限定，可举出生理盐水、各种生理缓冲液(例如PBS、HBSS等)、以各种细胞培养用的基础培养基为基础的细胞培养液、组织保存液或内脏保存液等。上述基础培养基没有限制，包括例如DMEM、MEM、F12、DME、RPMI1640、MCDB(MCDB102、104、107、120、131、153、199等)、L15、SkBM、RITC80-7、DMEM/F12等。大部分上述细胞培养液、组织保存液和内脏保存液是市售的，其组成也是已知的。可以直接使用标准的组成(例如，直接呈市售的状态)，也可以根据细胞种类、细胞条件，适当改变例如糖类、氨基酸类、维生素类、电解质等的组成。但不限于这些，可举出向HBSS中添加葡萄糖而得的组织保存液、AQIXR RS-I(AQIX LTD，产品编号:RSIKIT4)、TelioKeep(Bioverde，产品编号:TPO-A1)等作为已知的组织保存液。作为内脏保存液不限于此，可举出例如Euro-Collins液、UW液、HTK液、Celsior液、ETKyoto液、IGL-1液、EP-TU液等。除普通血清(例如胎牛血清(FBS)等牛血清、马血清、人血清等)、各种生长因子(例如FGF、EGF、VEGF、HGF等)以外，可含有Nrf2活化剂、抗生素等任何添加物。优选是基于HBSS的组织保存液或AQIXR RS-I。

本申请的发明人发现，通过将采集到的骨骼肌组织浸渍在保存液中，能够使骨骼肌组织中的CD56阳性细胞的比率提高。骨骼肌组织中的CD56阳性细胞的比率的增加是由于浸渍造成骨骼肌组织中的非CD56阳性细胞减少所致。因此，在本发明的一个实施方式中，浸渍的步骤可以是通过浸渍使非CD56阳性细胞减少的步骤。

一般而言，在将采集到的骨骼肌组织浸渍在组织保存液中的情况下，组织中的全部细胞数随时间而减少。然而，在骨骼肌组织中，骨骼肌成肌细胞、肌卫星细胞等CD56阳性细胞分布于构成骨骼肌组织的肌纤维的深部，即被基底膜与原生质膜包夹的特殊环境中。因此，即使维持骨骼肌组织的浸渍，也易于维持上述环境的渗透压、营养状态、支架结构等对于CD56阳性细胞存活而言必要的条件，由此可认为，随着成纤维细胞等非CD56减少，CD56阳性细胞被相对地维持。如此，CD56阳性细胞只要存在于骨骼肌组织中，就相对于非CD56阳性细胞而言具有存活优势，因此，本领域技术人员可以理解，浸渍所造成的非CD56阳性细胞的减少有助于CD56阳性细胞的比率的增加。

因此，在本发明的保存液中进行浸渍的步骤是在从骨骼肌组织中分离细胞群的步骤之前进行的，一般是对未经酶处理的骨骼肌组织进行，但只要维持骨骼肌组织的组织结构，则也可以在例如破碎及/或切碎的步骤之后进行。

在本发明的保存液中进行浸渍的步骤是使骨骼肌组织中的非CD56阳性细胞减少的步骤，而不同于单纯的清洗、保存。相反，本发明的浸渍可以作为组织的清洗来进行，也可以作为保存来进行，只要能够使非CD56阳性细胞减少即可。

在本发明中，骨骼肌组织中的CD56阳性细胞数不必在浸渍中必须得以维持，本领域技术人员可以理解，只要CD56阳性细胞的减少率低于非CD56阳性细胞的减少率，就有助于CD56阳性细胞的比率的增加。

本发明的浸渍可以在单一的保存液中进行，也可以在复数的保存液中进行。本发明的浸渍优选进行至组织中的非CD56阳性细胞的减少停止为止。

在本发明的一个实施方式中，浸渍可以进行至骨骼肌组织中的非CD56阳性细胞率减少到例如20％以下、19％以下、18％以下、17％以下、16％以下、15％以下、14％以下、13％以下、12％以下、10％以下、9％以下、8％以下、7％以下、6％以下、5％以下、4％以下、3％以下、2％以下、1％以下、0％，优选15％以下，更优选10％以下，进一步优选5％以下。

因此，在本发明的一个实施方式中，浸渍没有限制，可以进行至骨骼肌组织中的CD56阳性细胞率成为例如80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、100％，优选85％以上，更优选90％以上，进一步优选95％以上。

在本发明的其他方式中，浸渍没有限制，只要使骨骼肌组织中的非CD56阳性细胞率较之浸渍前的组织减少例如10％以上、20％以上、30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、95％以上即可。

在本发明的其他方式中，对于浸渍而言，使骨骼肌组织中的CD56阳性细胞率较之浸渍前增加1％以上、2％以上、3％以上、4％以上、5％以上、6％以上、7％以上、8％以上、9％以上、10％以上、11％以上、12％以上、13％以上、14％以上、15％以上、16％以上、17％以上、18％以上、19％以上、20％以上即可。

骨骼肌组织中的CD56阳性细胞率可以通过用特异性抗体对骨骼肌组织中的CD56阳性细胞进行染色而得的标本的显微镜观察、显微镜图像的图像分析来进行，也可以通过已知方法分离细胞群之后用特异性抗体染色而得的细胞群的流式细胞术分析等来进行。

本公开文本中，骨骼肌组织的“溶胀”是指骨骼肌组织的重量由于本发明的浸渍而增加。将骨骼肌组织浸渍在保存液中时，骨骼肌组织中所含的保存液的量经时地增加，由此浸渍后的组织重量增加。在本发明中，“溶胀度”是将浸渍前的组织重量除以浸渍后的组织重量而得的值。

在本发明的一个实施方式中，浸渍可以进行至骨骼肌组织的溶胀度成为例如1.05以上、1.1以上、1.2以上、1.3以上、1.4以上、1.5以上、1.6以上、1.7以上、1.8以上、1.9以上、2.0以上，优选可为1.2以上，更优选可为1.5以上。

在本发明的一个实施方式中，浸渍时间没有特殊限制，只要CD56阳性细胞能够存活即可，作为下限值，例如为1小时以上、2小时以上、4小时以上、5小时以上、6小时以上、8小时以上、10小时以上、12小时以上，从使非CD56阳性细胞发生充分减少的观点考虑，优选为12小时以上、24小时以上、48小时以上、49小时以上、60小时以上、72小时以上、84小时以上、96小时以上、180小时以上、240小时、350小时以上，也可以是750小时、1500小时以上、3000小时以上。

在本发明的一个实施方式中，作为浸渍时间的下限值，是2500小时以下、1500小时以下、750小时以下、672小时以下、350小时以下、336小时以下、240小时以下、180小时以下、170小时以下等，可以任意地选择上述上限值和下限值。

在本发明的一个实施方式中，作为浸渍时间的上限和下限的组合，可以从以下时间中进行选择。可以是例如5小时～672小时、5小时～336小时、6小时～336小时、12小时～336小时、12小时～170小时、49小时～170小时。

浸渍温度只要能维持CD56阳性细胞的存活即可，没有特殊限制，可以是1～40℃、2～20℃、3～15℃、2～10℃、2～8℃、4～6℃，优选1～15℃，进一步优选2～8℃。浸渍的步骤可以是恒定温度，也可以是变化的。浸渍可以使用已知的容器，静置进行，也可以使容器振荡或旋转来进行。

<制备CD56阳性细胞数的比率高的细胞群的方法>

本发明的其他方面为包括上述使CD56阳性细胞数的比率提高的方法的细胞群的制备方法。本发明的制备方法包括通过已知的方法从通过本发明的方法使CD56阳性细胞的比率提高了的骨骼肌组织中分离细胞群的步骤。

分离的步骤只要可以分离细胞群即可，没有特殊限制，可以包括例如破碎及/或切碎骨骼肌组织的步骤及/或供于酶处理的步骤等。破碎及/或切碎的步骤及/或供于酶处理的步骤可以使用已知的任何方法来进行。本发明的细胞群制备方法可以还包括将经分离的细胞群进行培养的步骤、将经培养的细胞进行传代的步骤。

细胞的培养和传代可以使用已知的任何方法进行。本发明的细胞群制备方法还可进一步包括向经回收的细胞中导入基因的基因导入步骤。导入的基因只要对治疗疾病的治疗而言有用即可，没有特殊限制，可以是例如HGF等细胞因子。基因的导入可以使用磷酸钙法、脂质转染法、超声波导入法、电穿孔法、基因枪法、利用腺病毒载体、逆转录病毒载体等病毒载体的方法、显微注射法等已知的任何方法进行。

<细胞群>

随后，对本发明的细胞群进行说明。

本发明的细胞群可通过本发明的细胞群制备方法获得，CD56阳性细胞率高。细胞群中的CD56阳性细胞率的高低为例如80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、100％，优选85％以上，更优选90％以上，进一步优选95％以上。

本发明的细胞群以高比率含有CD56阳性细胞，因此作为用于心脏疾病治疗等中的骨骼肌成肌细胞及/或肌卫星细胞等骨骼肌前体细胞的供给源是非常有用的。本发明的细胞群优选是无菌的。此外，本发明的细胞群可附着于培养容器，也可悬浮于任何液体中，也可以是被冷冻保存的状态。

<移植片的制造方法>

本发明的另一方面涉及使用通过本发明的方法得到的CD56阳性细胞比率高的细胞群而得的移植片的制造方法。

在本发明中，“移植片”意指用于向生物体内移植的结构物，尤其意指包含细胞作为构成成分的移植用结构物。在优选的一个实施方式中，移植片是不含细胞和源自细胞的物质以外的结构物(例如支架(scaffold)等)的移植用结构物。作为本公开文本中的移植片，并非限定于此，而可以举出例如片状细胞培养物、球体(spheroid)、细胞团块等，优选为片状细胞培养物或球体，更优选为片状细胞培养物。

本公开文本中，“片状细胞培养物”指细胞相互连结成为片状而得的物质。本公开文本中，“球体”指细胞相互连结成为近似球状而得的物质。细胞彼此可以直接(包括介由粘附分子等细胞要素的情况)及/或介由媒介物质而相互连结。作为媒介物质，只要是能够将细胞彼此至少物理性(机械性)地进行连结的物质即可，没有特殊限制，可举出例如细胞外基质等。媒介物质优选来自于细胞的物质，尤其是来自于构成片状细胞培养物的细胞的物质。细胞至少被物理性(机械性)连结，此外，还可以被功能性连接，例如化学性连结、电连结。片状细胞培养物可以由1个细胞层构成(单层)，也可以由2个以上的细胞层构成(层叠体(多层)，例如2层、3层、4层、5层、6层等)。此外，片状细胞培养物可以具有三维结构，所述三维结构具有的厚度超过单个细胞的厚度，而细胞不示出明确的层结构。例如，在片状细胞培养物的垂直剖面中，细胞并未在水平方向上均匀地排列，而可以以不均匀地(例如马赛克状)进行配置的状态存在。

本公开文本的移植片，尤其是片状细胞培养物，优选不含支架(支承体)。支架在本领域中被用于使细胞附着于其表面上及/或其内部，并维持片状细胞培养物等移植片的物理完整性，例如已知偏二氟乙烯(PVDF)制的膜等，但本公开文本的移植片即使没有上述支架也可以维持其物理完整性。此外，本公开文本的移植片优选仅由构成移植片的、源自细胞的物质组成，不含除此以外的物质。

培养基材只要是细胞可形成于其上的细胞培养物即可，没有特殊限制，包括例如各种材质及/或形状的容器、容器中的固态或半固态的表面等。容器优选为不使培养液等液体透过的的结构·材料。作为上述材料，没有特殊限制，可举出例如聚乙烯、聚丙烯、特氟龙(注册商标)、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚甲基丙烯酸甲酯、尼龙6,6、聚乙烯醇、纤维素、硅、聚苯乙烯、玻璃、聚丙烯酰胺、聚二甲基丙烯酰胺、金属(例如铁、不锈钢、铝、铜、黄铜)等。此外，容器优选具有至少1个平坦的面。作为上述容器的例子，没有特殊限制，可举出例如以下培养容器，所述容器具备以能够形成细胞培养物的培养基材构成的底面，和液体不透过性的侧面。作为上述培养容器的特定例子，不受限制，可举出细胞培养皿、细胞培养瓶等。容器的底面可以是透明的，也可以是不透明的。容器的底面若是透明的，则可以从容器背面进行细胞的观察、计数等。此外，容器可以在其内部具有固态或半固态的表面。作为固态的表面，可举出如上所述的各种材料的平板、容器等，作为半固态的表面，可举出凝胶、软质的聚合物基质等。培养基材可以使用上述材料制作，也可以利用市售的材料。

作为优选的培养基材，没有特殊限制，可举出例如具有适于片状细胞培养物形成的粘附性的表面的基材、具有适于球体形成的低粘附性的表面的基材及/或具有均匀的孔状结构的基材等。具体而言，在形成片状细胞培养物的情况下，可举出例如将电晕放电处理而得的聚苯乙烯、明胶凝胶、亲水性聚合物等亲水性化合物包被于该表面而得的基材，进而可举出将明胶、纤连蛋白、层粘连蛋白、玻连蛋白、蛋白聚糖、糖胺聚糖等细胞外基质、钙粘蛋白家族、选择素家族、整合素家族等细胞粘附因子等包被于表面而得的基材等。此外，上述基材是市售的(例如Corning(R)TC-Treated Culture Dish、Corning等)。此外，在形成球体的情况下，可举出将非细胞粘附性化合物包被于表面而得的基材及/或于表面具有均匀的凹凸结构的基材等，所述非细胞粘附性化合物例如为软琼脂、将聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PIPAAm)用聚乙二醇(PEG)交联而得的温度响应性凝胶(市售名称：MebiolGel)、聚甲基丙烯酸羟乙酯(polyHEMA)、2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱(MPC)聚合物等水凝胶等。上述基材也有市售的(例如EZSPHERE(R)等)。培养基材的整体或部分可以是透明的，也可以是不透明的。

培养基材可以用响应刺激(例如温度、光)而物性发生变化的材料覆盖表面。作为上述材料不受限制，例如可以使用如下已知的材料：包含(甲基)丙烯酰胺化合物、N-烷基取代的(甲基)丙烯酰胺衍生物(例如N-乙基丙烯酰胺、N-正丙基丙烯酰胺、N-正丙基甲基丙烯酰胺、N-异丙基丙烯酰胺、N-异丙基甲基丙烯酰胺、N-环丙基丙烯酰胺、N-环丙基甲基丙烯酰胺、N-乙氧基乙基丙烯酰胺、N-乙氧基乙基甲基丙烯酰胺、N-四氢糠基丙烯酰胺、N-四氢糠基甲基丙烯酰胺等)、N,N-二烷基取代的(甲基)丙烯酰胺衍生物(例如N,N-二甲基(甲基)丙烯酰胺、N,N-乙基甲基丙烯酰胺、N,N-二乙基丙烯酰胺等)、具有环状基团的(甲基)丙烯酰胺衍生物(例如1-(1-氧代-2-丙烯基)-吡咯烷、1-(1-氧代-2-丙烯基)-哌啶、4-(1-氧代-2-丙烯基)-吗啉、1-(1-氧代-2-甲基-2-丙烯基)-吡咯烷、1-(1-氧代-2-甲基-2-丙烯基)-哌啶、4-(1-氧代-2-甲基-2-丙烯基)-吗啉等)、或乙烯醚衍生物(例如甲基乙烯基醚)的同聚物或共聚物的温度响应性材料、具有偶氮苯基的吸光性高分子、三苯甲烷无色氢氧化物(triphenylmethane leucohydroxide)的乙烯基衍生物与丙烯酰胺系单体的共聚物、以及含有螺苯并吡喃的N-异丙基丙烯酰胺凝胶等光响应性材料等(参见例如日本特开平2-211865、日本特开2003-33177)。通过向这些材料施加规定的刺激，可以使其物性(例如亲水性、疏水性)变化，从而促进附着于同一材料上的细胞培养物的剥离。被覆有温度响应性材料的培养皿已有市售(例如CellSeed Inc.的UpCell(R))，可以将其用于本公开文本的制备方法中。

培养基材可以是各种形状。此外，其面积没有特殊限制，可以是例如约1cm²～约200cm²、约2cm²～约100cm²、约3cm²～约50cm²等。例如，作为培养基材可举出直径10cm的圆形培养皿。在此情况下，面积为56.7cm²。培养表面可以是平坦的，也可以具有凹凸结构。在具有凹凸结构的情况下，优选是均匀的凹凸结构。

培养基材可以用血清涂覆(覆盖或包被)。通过使用以血清涂覆而得的培养基材，可以形成更高密度的片状细胞培养物。“以血清涂覆”意指在培养基材的表面附着血清成分的状态。上述状态没有限制，例如，可以通过用血清处理培养基材来获得。基于血清的处理包括使血清接触培养基材，以及根据需要而孵育规定的时间。

作为血清，可以使用异种血清及/或同种血清。当将移植片、尤其是将片状细胞培养物用于移植时，异种血清意指源自与其受体不同种的生物的血清。例如，受体为人的情况下，源自牛、马的血清相当于异种血清，例如胎牛血清(FBS、FCS)、小牛血清(CS)、马血清(HS)等。此外，“同种血清”意指源自与受体同种的生物的血清。例如，受体为人的情况下，人血清相当于同种血清。同种血清包括自身血清(也称为自体血清)，即，源自受体的血清，以及源自受体以外的同种个体的同种异体血清。需要说明的是，本说明书中，自身血清以外的血清，即，异种血清和同种异体血清有时也统称为非自身血清。

用于涂覆培养基材的血清可以是市售的，或者可以从所期望的生物采集到的血液中通过常规方法制备而成。具体而言，可举出例如将采集到的血液于室温放置约20分钟～约60分钟左右而使其凝固，将其以约1000×g～约1200×g左右离心分离，采集上清液的方法，等等。

在培养基材上进行孵育时，血清可使用原液，也可经稀释再使用。稀释可以用任何介质进行，例如可以不受限制地用水、生理盐水、各种缓冲液(例如PBS、HBSS等)、各种液体培养基(例如DMEM、MEM、F12、DMEM/F12、DME、RPMI1640、MCDB(MCDB102、104、107、120、131、153、199等)、L15、SkBM、RITC80-7等)等。稀释浓度没有特殊限制，只要血清成分能附着于培养基材上即可，例如为约0.5％～约100％(v/v)，优选约1％～约60％(v/v)，更优选约5％～约40％(v/v)。

孵育时间也没有特殊限制，只要血清成分能附着于培养基材上即可，例如为约1小时～约72小时，优选约2小时～约48小时，更优选约2小时～约24小时，进一步优选约2小时～约12小时。孵育温度也没有特殊限制，只要血清成分能够附着于培养基材上即可，例如为约0℃～约60℃，优选约4℃～约45℃，更优选室温～约40℃。

可以在孵育后将血清弃置。作为血清的弃置方法，可使用基于移液器等的吸移、倾析(Decantation)等惯用的液体弃置方法。本公开文本的优选方式中，在血清弃置后，可用无血清清洗液清洗培养基材。作为无血清清洗液，只要是不含血清，且不对附着于培养基材上的血清成分产生不良影响的液体介质即可，没有特殊限制，例如可以不受限制地用水、生理盐水、各种缓冲液(例如PBS、HBSS等)、各种液体培养基(例如DMEM、MEM、F12、DMEM/F12、DME、RPMI1640、MCDB(MCDB102、104、107、120、131、153、199等)、L15、SkBM、RITC80-7等)等进行。作为清洗方法，可使用惯用的培养基材清洗方法，例如可以不受限制地向培养基材上施加无血清清洗液并搅拌规定时间(例如约5秒钟～约60秒钟)后，进行弃置的方法等。

本公开文本中，可以用生长因子涂覆培养基材。此处，“生长因子”意指较之没有因子的情况而言能促进细胞的增殖的任何物质，包括例如上皮细胞生长因子(EGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)等。基于生长因子的培养基材的涂覆方法、弃置方法和清洗方法，除了孵育时的稀释浓度为例如约0.0001μg/mL～约1μg/mL，优选约0.0005μg/mL～约0.05μg/mL，更优选约0.001μg/mL～约0.01μg/mL以外，基本上与血清相同。

本公开文本中，可以用甾体药物涂覆培养基材。此处，“甾体药物”是指具有甾核的化合物中，可能会对生物体造成肾上腺皮质功能障碍、库欣综合征等不良影响的化合物。作为上述化合物，不受限制，包括例如皮质醇、泼尼松龙、曲安西龙(triamcinolone)、地塞米松、倍他米松等。对于基于甾体药物的培养基材的涂覆方法、弃置方法和清洗方法而言，除了孵育时的稀释浓度以外，基本上与血清相同，关于所述浓度，对于地塞米松而言，例如为约0.1μg/mL～约100μg/mL，优选约0.4μg/mL～约40μg/mL，更优选约1μg/mL～约10μg/mL。

培养基材可以用血清、生长因子和甾体药物中的任一者进行涂覆，也可以用它们的任意组合进行涂覆，即，血清和生长因子、血清和甾体药物、血清和生长因子和甾体药物、或生长因子和甾体药物的组合。用多种成分进行涂覆时，可以将这些成分混合并同时进行涂覆，也可以通过分开的步骤进行涂覆。

向培养基材接种细胞群可以用已知的任何方法和条件进行。向培养基材接种细胞群可以通过，例如将细胞群悬浮于培养液中而得的细胞悬浮液注入培养基材(培养容器)来进行。细胞悬浮液的注入可以使用滴管、移液器等适于细胞悬浮液的注入操作的器具。

本发明的制备方法中使用的培养液只要能够维持细胞的存活即可，没有特殊限制，一般可利用氨基酸、维生素类、电解质作为主要成分。在本发明的一个实施方式中，培养液是以细胞培养用的基础培养基为基础的培养液。所述基础培养基不受限制，包括例如DMEM、MEM、F12、DMEM/F12、DME、RPMI1640、MCDB(MCDB102、104、107、120、131、153、199等)、L15、SkBM、RITC80-7等。这些基础培养基多数已有市售，其组成也是已知的。然而，当用于本发明的制备方法时，可以根据细胞种、培养条件适当变更其组成。

被接种的细胞密度没有特殊限制，只要是能形成片状细胞培养物的密度即可，在优选的方式中，细胞群以达到汇合的密度或其以上的密度进行接种。

本公开文本中，“达到汇合的密度”是指以下程度的密度，即接种细胞时，预期被接种的细胞无空隙地覆盖培养容器的粘附表面一整面的程度。例如是以下密度：接种时，预期细胞进行相互接触的程度的密度、发生接触抑制的密度、或者由接触抑制实质性地停止细胞的增殖的密度。

细胞群的接种密度的非限制性例子包括约7.1×10⁵个/cm²～约3.0×10⁶个/cm²、约7.3×10⁵个/cm²～约2.8×10⁶个/cm²、约7.5×10⁵个/cm²～约2.5×10⁶个/cm²、约7.5×10⁵个/cm²～约3.0×10⁶个/cm²、约7.8×10⁵个/cm²～约2.3×10⁶个/cm²、约8.0×10⁵个/cm²～约2.0×10⁶个/cm²、约8.5×10⁵个/cm²～约1.8×10⁶个/cm²、约9.0×10⁵个/cm²～约1.6×10⁶个/cm²等的密度。需要说明的是，除非另有记载，上述密度为细胞群中含有的全部细胞的密度。

在又一其他方式中，可以在实质上不含生长因子的细胞培养液中，以能包含在细胞群中的至少1种移植片形成细胞实质上不发生增殖的密度进行接种。在上述方式中，细胞群中可含有的其他细胞在经受增殖抑制的同时也可以是能增殖的密度。可用于本公开文本的方法中的培养基材如上所述。在一个优选的方式中，培养基材可以被血清覆盖。在另一优选的方式中，培养基材可以被温度响应性材料覆盖。在更优选的一个方式中，培养基材可以被温度响应性材料和血清覆盖。

接种的细胞群中包含至少1种CD56阳性细胞，也可以包含2种以上的CD56阳性细胞，也可以包含CD56阳性细胞以外的细胞。在本公开文本的一个方式中，细胞群中包含的至少1种CD56阳性细胞优选为骨骼肌成肌细胞，更优选为骨骼肌成肌细胞和肌卫星细胞。在所述方式中，细胞群还可含有成纤维细胞。即，可举出例如含有成肌细胞和成纤维细胞作为移植片形成细胞的移植片。在本公开文本的另一方式中，细胞群中含有的至少1种片形成细胞为间充质干细胞。在所述方式中，细胞还可含有血管内皮细胞。

比率的高低如上所述。本发明的移植片可以是通过本发明的片状细胞培养物制备方法制备而得的。本发明的片状细胞培养物优选为无菌的培养物。本发明的移植片由于以高比率含有CD56阳性细胞，治疗效果等高于未使用本发明的方法而得的片状细胞培养物。

<试剂盒>

本发明的其他方面涉及用于制备片状细胞培养物的试剂盒，所述试剂盒包括使骨骼肌组织中的CD56阳性细胞的比率提高的方法、CD56阳性细胞的比率高的细胞群的制备方法、移植片的制备方法中的部分或全部要素。

本发明的试剂盒不受限制，可包括保存液、以及构成移植片的细胞(含有CD56阳性细胞的细胞群)、培养液、培养皿、器具类(例如移液器、滴管、镊子等)、关于片状细胞培养物的制备方法的指示(例如使用说明书，记录有关于制备方法、本发明的冷冻保存细胞的回收方法的信息的介质，例如软盘、CD、DVD、蓝光光盘、存储卡、USB存储器等)等。

<处理疾病的方法>

本公开文本的其他方面涉及处理上述对象中的疾病的方法，所述方法包括将通过本公开文本的方法得到的细胞群或移植片的有效量向有需要的对象适用。本公开文本中，术语“处理”包括以疾病的治愈、暂时性缓解或预防等为目的的、医学上容许的所有种类的预防性及/或治疗性的介入。例如，“处理”的术语包括与组织异常相关的疾病的发展的延迟或停止、病变的回缩或消失、该疾病发病的预防或复发的防止等，包括各种目的的医学上容许的介入。

在本公开文本的处理方法中，可以将使移植片的存活性、植入性及/或功能等提高的成分、对于对象疾病的处理有用的其他有效成分等与本公开文本的移植片联用。

本公开文本的处理方法可包括本公开文本的细胞群和移植片。本公开文本的处理方法还可包括，在使骨骼肌组织中的CD56阳性细胞的比率提高之前，从对象中采集骨骼肌组织的步骤。

在一个方式中，采集细胞或成为细胞供给源的组织的对象与接受细胞群或移植片等的施予的对象是同一个体。

在其他方式中，采集细胞或成为细胞供给源的组织的对象与接受细胞群或移植片等的施予的对象是同种的其他个体。在其他方式中，采集成为细胞群或移植片等的供给源的组织的对象与接受片细胞群或移植片等的施予的对象是不同种的个体。

本公开文本中，有效量是如下的量，例如，能够抑制疾病的发病、复发、减轻症状、或者延迟或停止发展的量(例如片状细胞培养物的尺寸、重量、片数等)，优选是预防该疾病的发病和复发、或治愈该疾病的量。此外，优选不产生超过施予所带来的利益的不良影响的量。上述量可以通过例如小鼠、大鼠、犬或猪等实验动物、疾病模型动物中的试验等适当地确定，这样的试验方法是本领域技术人员普遍已知的。此外，成为处理对象的组织病变的大小可成为用于确定有效量的重要指标。

作为施予方法，可举出例如静脉施予、肌肉内施予、骨内施予、髓腔内施予、对组织直接适用等。施予频率一般为每次处理中施予1次，在没有得到所需效果时，也可以施予多次。对组织适用时，可以通过缝合线、钉(staple)等锁定手段将本发明的细胞培养物、组合物、或片状细胞培养物等固定于对象的组织中。

以上针对优选的实施方式对本发明进行了说明，但本发明不限于上述内容。本发明中，各构成均可用能发挥相同功能的任何构成进行取代，或者也可以添付任何构成。

实施例

比较例1：使用刚采集的骨骼肌组织而得的细胞群的CD56阳性细胞率

[比较例1]

[预备清洗工序]

从猪下肢每次采集约2g骨骼肌组织，浸渍于组织保存液((以下也称为骨骼肌冲洗液)(HBSS(Hanks'Balanced Salt Solution，Life Technologies Corporation))中、葡萄糖注射液(Terumo公司)1.6mg/mL、庆大霉素(富士制药工业公司)0.1mg/mL、两性霉素(Fungizon)(Life Technologies Corporation)2.5μg/mL)，清洗后立即供于后述的分离工序。

[分离工序]

<切碎工序>

将预备清洗工序中清洗过的骨骼肌组织置于直径10cm的培养皿(Terumo公司)中。然后，将清洗过的骨骼肌于室温在10mL酶消化液(含有胶原酶的溶液)中切碎。从中取出白色组织(结缔组织)。

<酶处理工序>

按骨骼肌组织处理物的重量，分别添加酶消化液，于37℃进行酶反应。反应结束后，将酶消化物在锥形管(称为锥形管1)中搅拌，然后静置，将细胞滤网(BD Falcon^TM CellStrainer，40μm，日本BD公司)设置于新的锥形管(称为锥形管2)中，将回收的上清液过滤并回收。将细胞滤网用初代增殖用培养基冲洗，回收于锥形管中。将回收的滤液离心处理，弃置上清液。向沉淀的细胞中添加初代增殖用培养基作为细胞悬浮液。

<培养工序>

将细胞悬浮液移入培养瓶(底面积175cm²)中，在37℃、5％(V/V)CO₂条件下培养。培养后，回收细胞，对细胞数进行计数。

[CD56阳性率的计数]

使细胞悬浮液的一部分与CD56抗体反应，使用流式细胞仪，测定CD56阳性细胞率。CD56阳性细胞率是指，通过上述分离工序得到的细胞群中的CD56阳性细胞的比率。表1中示出结果。

[表1]

试样编号	947	948
			CD56阳性细胞率	80.30％	79.30％

实施例1：浸渍时间带来的CD56阳性细胞率的变化

从与比较例不同的猪下肢采集到的骨骼肌中每次采集约2g组织。除了将比较例1的预备清洗工序中的浸渍时间设为17小时、68小时和161小时(浸渍温度2～8℃)以外，以与比较例1相同的顺序进行细胞的分离。

将分离而得的细胞与比较例1同样地测定CD56阳性细胞率。此外，使用血细胞计数器(hemocytometer)对回收细胞数和存活力进行计数。将计数而得的回收细胞数、存活力、CD56阳性细胞率的均值示于表2。

[表2]

通过维持将骨骼肌组织浸渍于组织保存液中的状态，可见CD56阳性细胞率飞跃性地上升。此外，任一者均示出高的存活力和回收细胞数，因而暗示出通过浸渍使非CD56阳性细胞死亡，而使CD56阳性细胞维持于高比例。

实施例2：浸渍时间造成的CD56阳性细胞率的变化

从与实施例1不同的猪下肢采集到的骨骼肌中每次采集约3～4g组织。除了将比较例1的预备清洗工序中的浸渍时间设为15小时、66小时和140小时(浸渍温度2～8℃)以外，以与比较例1相同的顺序进行细胞的分离，测定使用血细胞计数器而得的回收活细胞数、存活力的计数和CD56阳性细胞率。回收细胞数、存活力和CD56阳性细胞率的均值示于表3。

[表3]

不论个体差或骨骼肌组织的处理量，均可见通过浸渍骨骼肌组织，CD56阳性细胞率飞跃性地上升。

实施例3：浸渍液的组成造成的CD56阳性细胞率的变化

从与实施例1同一个体的猪下肢采集到的骨骼肌中每次采集约2.0g组织。除了使用AQIXR RS-I(货号：RSIKIT4)替代实施例1中的预备清洗工序中使用的组织运输液以外，以与实施例1相同的顺序进行细胞的分离，测定基于血细胞计数器的回收细胞数、存活力的计数和CD56阳性细胞率。计数而得的回收细胞数、存活力和CD56阳性细胞率的均值示于表4。

[表4]

可见，即使用不同组成的浸渍液浸渍骨骼肌组织的情况下，CD56阳性细胞率仍飞跃性地上升。

从6个人的下肢采集到约4～6g骨骼肌组织。从2头猪的下肢采集到约8～9g骨骼肌组织。浸渍15～22小时。采集时和浸渍后(切碎时)的骨骼肌组织的重量示于表5。

[表5]

由表5可见，通过浸渍，组织重量比采集时增加了1.2倍以上。

Claims

1.使骨骼肌组织中的CD56阳性细胞的比率提高的方法，所述方法包括将采集到的骨骼肌组织浸渍在保存液中的步骤。

2.如权利要求1所述的方法，其中，在浸渍的步骤中，至采集到的骨骼肌组织中的非CD56阳性细胞的比率减少至20％以下为止进行浸渍。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中，在浸渍的步骤中，至骨骼肌组织的溶胀度成为1.2以上为止在保存液中进行浸渍。

4.如权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，在浸渍的步骤中，在保存液中浸渍12小时以上。

5.制备CD56阳性细胞数的比率高的细胞群的方法，所述方法包括权利要求1～4中任一项所述的方法。

6.如权利要求5所述的方法，其进一步包括从骨骼肌组织中分离细胞群的步骤。

7.CD56阳性细胞的比率高的细胞群，其是通过权利要求5或6所述的方法得到的。

8.移植片的制备方法，其使用了权利要求7所述的细胞群。

9.移植片，其是通过权利要求8所述的方法得到的。

10.对象的心脏疾病的治疗方法，其包括向有需要的所述对象施予治疗有效量的权利要求7所述的细胞群或权利要求9所述的移植片的工序。