CN108503684A - 分离蛋白的方法及设备 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种分离蛋白的方法及设备，包括：将组织块进行玻璃化冷冻，得到玻璃化冷冻后产物；对所述玻璃化冷冻产物进行冻干脱水，获得冻干产物；对所述冻干产物进行脱脂处理，以获得脱脂类冻干本底组分；将所述脱脂冻干本底组分进行分子粉体制备，以得到脱脂冻干本底组分分子粉体；将所述脱脂冻干本底组分分子粉体通过气体离心法进行蛋白分离，以分离得到若干蛋白组分。本发明无需加入难以祛除的生理毒性物质，同时工序简单，生产效率高，成本低。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程领域，尤其涉及一种分离蛋白的方法及设备。
背景技术
细胞与细胞间质，是再生医疗技术依赖的两类基础材料。比较而言，细胞的制备方法更受关注，而细胞间质的大规模分离纯化技术与装备的开发比较弱势。细胞间质主要是蛋白成分，包括各种类型的胶原蛋白。
生物工程来源的人胶原蛋白相似物和直接人体组织来源的人源胶原蛋白，都需要经过分离纯化工序以获得临床可用的成品。目前的蛋白纯化工艺总体上是低温液态分离，从组织糜产物中以沉淀、亲和层析等方法分离目标分子。该工艺方法工序繁杂，生产效率低，需要加入难以祛除的生理毒性物质，如蛋白酶抑制剂，直接导致蛋白产品的价格高昂，无法普及应用。
发明内容
本发明实施例的目的是提供一种分离蛋白的方法及设备，本发明安全无污染，同时工序简单，生产效率高，成本低。
为实现上述目的，本发明实施例提供了一种分离蛋白的方法，包括：
将组织块进行玻璃化冷冻，得到玻璃化冷冻后产物；
对所述玻璃化冷冻产物进行真空冻干脱水，获得冻干产物；其中，所述真空冻干脱水的起点温度为所述玻璃化冷冻的温度；
对所述冻干产物进行脱脂处理，以获得脱脂类冻干本底组分；
将所述脱脂冻干本底组分进行分子粉体制备，以得到脱脂冻干本底组分分子粉体；
将所述脱脂冻干本底组分分子粉体通过气体离心法进行蛋白分离，以分离得到若干蛋白组分。
进一步的，所述将所述脱脂冻干本底组分分子粉体通过气体离心法进行蛋白分离，以分离得到若干蛋白组分后还包括：
对每一所述蛋白组分进行电场分离，从而得到纯化后的蛋白组分。
进一步的，所述组织块的获取的方法包括：将组织或组织集合物进行切割，得到若干预定规格尺寸的组织块。
进一步的，所述将组织块进行玻璃化冷冻包括：将所述组织块混入冷冻保护剂后置入液氮中进行玻璃化冷冻。
进一步的，所述对所述冻干产物进行脱脂处理，以获得脱脂类冻干本底组分包括：
对所述冻干产物通过超临界二氧化碳萃取法萃取所述糖类组分和脂类组分，以得到脱脂类冻干本底组分。
进一步的，所述将所述脱脂冻干本底组分分子粉体通过气体离心法进行蛋白分离包括：将所述脱脂冻干本底组分分子粉体放入高速涡轮气体梯度离心机以实现通过气体离心法进行蛋白分离。
相应的，本发明实施例还提供的一种分离蛋白的设备，包括：
玻璃化冷冻装置，用于将组织块进行玻璃化冷冻，得到玻璃化冷冻后产物；
冻干脱水装置，用于对所述玻璃化冷冻产物进行冻干脱水，获得冻干产物；其中，所述冻干脱水的起点温度为所述玻璃化冷冻的温度；
脱脂装置，用于对所述冻干产物进行脱脂处理，以获得脱脂类冻干本底组分；
分子粉体制备装置，用于将所述脱脂冻干本底组分进行分子粉体制备，以得到脱脂冻干本底组分分子粉体；
蛋白分离装置，用于将所述脱脂冻干本底组分分子粉体通过气体离心法进行蛋白分离，以分离得到若干蛋白组分。
进一步的，还包括：
电离纯化装置，对每一所述蛋白组分进行电场分离，从而得到纯化后的蛋白组分；
组织块切割装置，用于将组织或组织集合物进行切割，得到若干预定规格尺寸的组织块。
进一步的，所述脱脂装置为超临界二氧化碳萃取装置，所述超临界二氧化碳萃取装置用于对所述冻干产物通过超临界二氧化碳萃取法萃取所述糖类组分和脂类组分，以得到脱脂类冻干本底组分。
进一步的，所述蛋白分离装置为高速涡轮气体梯度离心机，所述高速涡轮气体梯度离心机用于将所述脱脂冻干本底组分分子粉体通过气体离心法进行蛋白分离，以分离得到若干蛋白组分。
与现有技术相比，本发明实施例公开的一种蛋白分离的方法及设备，主要实现细胞间质的大规模工业化分离纯化，通过对组织块依次进行玻璃化冷冻、真空冻干脱水、脱脂脱糖处理、分子粉体制备和电离纯化，通过固态低温机械方法，实现了从复杂生物组织内分离出若干不同类型的纯化后的活性蛋白组分，解决了现有技术中加入难以祛除的生理毒性物质以及效率过低的问题，获得了工序简单、生产效率高、成本低的有益效果，有利于工业化大规模生产。
附图说明
图1是本发明实施例1提供的一种分离蛋白的方法的主要步骤的流程示意图；
图2是本发明实施例1提供的一种分离蛋白的方法的整体流程图；
图3是本发明实施例1提供的一种分离蛋白的方法中一种梯度级联高速涡轮气体离心机的结构示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
相应的，本发明实施例1还提供的一种分离蛋白的方法，参见图1，图1为主要步骤的流程示意图，本实施例包括下述主要步骤：
S1、将组织块进行玻璃化冷冻，得到玻璃化冷冻后产物；
S2、对所述玻璃化冷冻产物进行冻干脱水，获得冻干产物；其中，所述真空冻干脱水的起点温度为所述玻璃化冷冻的温度；
S3、对所述冻干产物进行脱脂处理，以获得脱脂类冻干本底组分；
S4、将所述脱脂冻干本底组分进行分子粉体制备，以得到脱脂冻干本底组分分子粉体；
S5、将所述脱脂冻干本底组分分子粉体通过气体离心法进行蛋白分离，以分离得到若干蛋白组分。
参见图2，图2为本实施例的整体步骤的流程示意图，进一步的，本实施例在步骤S5分离得到若干蛋白组分后还包括对蛋白组分纯化工序：
S6、对每一所述蛋白组分进行电场分离，从而得到纯化后的蛋白组分。
其中，电场分离是纯化工序，可以分离相似分子量和涡旋运动特征的不同电荷的分子组分从而纯化所得产物。利用蛋白分子电荷属性以及在电场中的偏转特性分离不同电荷属性的分子，所采用的电场分离设备可以是洁净环境下分离的加电金属板，板间隙为电场空间，作为偏转分离腔。
进一步的，在步骤S1前还包括获取组织块的处理步骤，具体的获取方法为：
S0、将组织或组织分类分离集合物进行切割，得到若干预定规格尺寸的组织块。优选的，所述的组织或组织分类分离集合物为清洁新鲜的。所述的组织或组织分类分离集合物优选为胎盘组织或胎盘分类分离。
以人胎盘为例说明组织分类分离集合物，比如处理胎盘时，可能会单独分离胎盘的血管组织，获得血管组织的集合物；可能单独分离脐带血管，获得脐带血管的组织集合物，可能单独分离脐带华通胶，获得华通胶组织集合物；可能单独收集胎盘血液，获得胎盘血液组织集合物，等等。
进一步的，步骤S1中所述将组织块进行玻璃化冷冻具体包括：将所述组织块混入冷冻保护剂后置入液氮中进行快速玻璃化冷冻后，在液氮温度区粉碎。
对应的，步骤S2中所述冻干脱水的起点温度为液氮温度。具体的冻干脱水的方法可以为传统的真空冻干方法，也可以为任何现有生产所可以实现的细胞冻干技术。
进一步的，步骤S3中除了进行脱脂处理，还进行脱糖处理，则对所述冻干产物进行脱脂处理，以获得脱脂类冻干本底组分包括：
对所述冻干产物通过超临界二氧化碳萃取法萃取的糖类组分和脂类组分，以得到脱脂类冻干本底组分。如图2所示的萃取得到的萃取组分一、萃取组分二、…表示萃取出来的糖类组分和脂类组分
脱脂处理的目的从冻干产物中分离各类脂类组分与脱脂类冻干本底组分，以获得脱脂类冻干本底组分；另外，在脱脂处理的同时还进行脱糖处理。因为脂类和糖类可能会对之后的工序例如涡轮离心分离工序造成干扰，比如高速涡轮离心分离中，需要使用高速微喷管，比如拉瓦尔喷管，糖类和脂类可能会造成喷管堵塞。其中，高速涡轮离心分离将在下述步骤S5的说明中提及。
具体的，冻干产物置入超临界二氧化碳萃取装置，糖类以及糖脂、糖蛋白成分都可以在超临界二氧化碳萃取工艺中被分类萃取，具体通过调整萃取参数，则可以获得相对应的产物；萃取出的组分包括糖类，脂类，脂蛋白和糖蛋白等可萃取组分，而经过超临界二氧化碳萃取后脱除可萃取组分后的不可萃取组分，则为所需要得到的脱脂类冻干本底组分。
进一步的，步骤S4中分子粉体制备的方法使用超临界氮气制备粉体的方法，可以采用分子粉体制备装置，将组织冻干产物在超临界氮气腔体中，使用喷管喷出到低压低温分子粉体制备腔体，获得分子粉体。分子粉体制备装置有商品化规模生产，是成熟的工业产品。
进一步的，步骤S5中将所述脱脂冻干本底组分分子粉体通过气体离心法进行蛋白分离具体包括：将所述脱脂冻干本底组分分子粉体放入梯度离心机以实现通过气体离心法进行蛋白分离，得到不同种类的蛋白组分(蛋白组分一、蛋白组分二、……)。优选的，为所述梯度离心机可以为梯度级联高速涡轮气体离心机；参见图3，图3为一种梯度级联高速涡轮气体离心机的结构示意图。
本实施例的方法适用于分离生物组织内的活性蛋白组分，优选适用获取胎盘或胎盘分类分离集合物内的胶原蛋白。当然，本实施例还适用于类人源蛋白产品，使用生物工程方法生产的类人源蛋白的分离纯化，可以用同样的工艺设备完成分离纯化，对类人源蛋白产品冷冻后冻干，冻干产物制备低温分子粉体后高速涡旋分离。从而完成分离蛋白步骤。当然，如果类人源蛋白产品已经脱糖脱脂，那么此时步骤S3所进行的脱脂脱糖处理可以省略。
本实施例分离的目标物主要是细胞间质，关注的是细胞间质的大规模工业化分离纯化。如果需要获得细胞内蛋白成分，可以使用反复冻融的方法。在分子粉体制备工序中，可以得到包含细胞内蛋白的组分，超临界萃取和涡旋分离工艺过程中，也能得到细胞内蛋白组分。
现有的主流的蛋白分离纯化工艺是低温液体环境下的分离，分离起点为组织糜，由于组织细胞天然含有活性蛋白酶类物质，在低温液体环境下，蛋白酶类物质也具有酶解活性，常用的层析分离耗时较长，低温状态下也不能忽略蛋白酶类的干扰，因而该工艺下的组织糜蛋白分离需要添加抑制剂。蛋白酶抑制剂有强烈的致畸、致瘤、代谢毒性等等毒性作用。如果需要提取分离并纯化同一份组织标本的全部类型蛋白成分，现有工艺很难完成。
比如，sigma公司人胎盘来源1型胶原报价每毫克200人民币以上，是等质量黄金价格的几百倍，申请人经过研究认为导致1型胶原的高价问题应该是工艺结果，因为胎盘是废弃物，并不存在胎盘资源缺乏的问题，不能用资源短缺来解释高价问题。
本实施例所提供的方法是固态方法的分子级纯化，使用机械方法分离纯化，可以实现标准化工业化大规模生产，理论上，可以获得同一份组织标本的全部分类的蛋白纯品。
本实施例对组织块依次进行玻璃化冷冻、真空冻干脱水、脱脂脱糖处理、分子粉体制备和电离纯化，通过固态低温机械方法，实现了从复杂生物组织内分离出若干不同类型的纯化后的活性蛋白组分，无需加入难以祛除的生理毒性物质，如蛋白酶抑制剂，同时工序简单，生产效率高，成本低，有利于工业化大规模生产。
相应的，本发明实施例2还提供的一种分离蛋白的设备，包括：
玻璃化冷冻装置11，用于将组织块进行玻璃化冷冻，得到玻璃化冷冻后产物；
冻干脱水装置12，用于对所述玻璃化冷冻产物进行真空冻干脱水，获得冻干产物；其中，所述真空冻干脱水的起点温度为所述玻璃化冷冻的温度；
脱脂装置13，用于对所述冻干产物进行脱脂处理，以获得脱脂类冻干本底组分；
分子粉体制备装置14，用于将所述脱脂冻干本底组分进行分子粉体制备，以得到脱脂冻干本底组分分子粉体；
蛋白分离装置15，用于将所述脱脂冻干本底组分分子粉体通过气体离心法进行蛋白分离，以分离得到若干蛋白组分。
进一步的，还包括：
电离纯化装置16，对每一所述蛋白组分进行电场分离，从而得到纯化后的蛋白组分；其中，电场分离是纯化工序，可以分离相似分子量和涡旋运动特征的不同电荷的分子组分从而纯化所得产物。利用蛋白分子电荷属性以及在电场中的偏转特性分离不同电荷属性的分子，所采用的电场分离设备可以是洁净环境下分离的加电金属板，板间隙为电场空间，作为偏转分离腔。
组织块切割装置10，用于将组织或组织集合物进行切割，得到若干预定规格尺寸的组织块。优选的，所述的组织或组织分类分离集合物为清洁新鲜的。所述的组织或组织分类分离集合物优选为胎盘组织或胎盘分类分离。
以人胎盘为例说明组织分类分离集合物，比如处理胎盘时，可能会单独分离胎盘的血管组织，获得血管组织的集合物；可能单独分离脐带血管，获得脐带血管的组织集合物，可能单独分离脐带华通胶，获得华通胶组织集合物；可能单独收集胎盘血液，获得胎盘血液组织集合物，等等。
进一步的，玻璃化冷冻装置11将组织块进行玻璃化冷冻具体包括：将所述组织块混入冷冻保护剂后置入液氮中进行快速玻璃化冷冻后，在液氮温度区粉碎。
冻干脱水装置12中的所述冻干脱水的起点温度为液氮温度。具体的冻干脱水装置12可以为传统的真空冻干脱水装置，也可以为任何现有生产所可以实现的冻干脱水装置。
进一步的，所述脱脂装置13为超临界二氧化碳萃取装置，所述超临界二氧化碳萃取装置13除了用于进行脱脂处理，还进行脱糖处理，具体的对所述冻干产物进行脱脂处理，以获得脱脂类冻干本底组分包括：对所述冻干产物通过超临界二氧化碳萃取法萃取所述糖类组分和脂类组分，以得到脱脂类冻干本底组分。
脱脂脱糖处理的目的从冻干产物中分离各类脂类组分与脱脂类冻干本底组分，以获得脱脂类冻干本底组分；另外，在脱脂处理的同时还进行脱糖处理。因为脂类和糖类可能会对之后的工序例如涡轮离心分离工序造成干扰，比如高速涡轮离心分离中，需要使用高速微喷管，比如拉瓦尔喷管，糖类和脂类可能会造成喷管堵塞。
具体的，冻干产物置入超临界二氧化碳萃取装置，糖类以及糖脂、糖蛋白成分都可以在超临界二氧化碳萃取工艺中被分类萃取，具体通过调整萃取参数，则可以获得相对应的产物；萃取出的组分包括糖类，脂类，脂蛋白和糖蛋白等可萃取组分，而经过超临界二氧化碳萃取后脱除可萃取组分后的不可萃取组分，则为所需要得到的脱脂类冻干本底组分。
优选的，分子粉体制备装置14为超临界氮气制备粉体装置，将组织冻干产物在超临界氮气腔体中，使用喷管喷出到低压低温分子粉体制备腔体，获得分子粉体。分子粉体制备装置有商品化规模生产，是成熟的工业产品。
进一步的，所述蛋白分离装置15为高速涡轮气体梯度离心机，所述高速涡轮气体梯度离心机用于将所述脱脂冻干本底组分分子粉体通过气体离心法进行蛋白分离，以分离得到若干蛋白组分(蛋白组分一、蛋白组分二、……)。优选的，为所述梯度离心机可以为梯度级联高速涡轮气体离心机；参见图3，图3为一种梯度级联高速涡轮气体离心机的结构示意图。
本实施例分离的目标物主要是细胞间质，关注的是细胞间质的大规模工业化分离纯化。如果需要获得细胞内蛋白成分，可以使用反复冻融的方法。在分子粉体制备工序中，可以得到包含细胞内蛋白的组分，超临界萃取和涡旋分离工艺过程中，也能得到细胞内蛋白组分。
具体实施时，本实施例所提供的设备实现对组织块依次进行玻璃化冷冻、真空冻干脱水、脱脂脱糖处理、分子粉体制备和电离纯化，通过固态低温机械方法，实现了从复杂生物组织内分离出若干不同类型的纯化后的活性蛋白组分，无需加入难以祛除的生理毒性物质，如蛋白酶抑制剂，同时工序简单，生产效率高，成本低，有利于工业化大规模生产。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种分离蛋白的方法，其特征在于，包括：
将组织块进行玻璃化冷冻，得到玻璃化冷冻后产物；
对所述玻璃化冷冻产物进行冻干脱水，获得冻干产物；其中，所述冻干脱水的起点温度为所述玻璃化冷冻的温度；
对所述冻干产物进行脱脂处理，以获得脱脂类冻干本底组分；
将所述脱脂冻干本底组分进行分子粉体制备，以得到脱脂冻干本底组分分子粉体；
将所述脱脂冻干本底组分分子粉体通过气体离心法进行蛋白分离，以分离得到若干蛋白组分。
2.如权利要求1所述的一种分离蛋白的方法，其特征在于，所述将所述脱脂冻干本底组分分子粉体通过气体离心法进行蛋白分离，以分离得到若干蛋白组分后还包括：
对每一所述蛋白组分进行电场分离，从而得到纯化后的蛋白组分。
3.如权利要求1所述的一种分离蛋白的方法，其特征在于，所述组织块的获取的方法包括：将组织或组织集合物进行切割，得到若干预定规格尺寸的组织块。
4.如权利要求1所述的一种分离蛋白的方法，其特征在于，所述将组织块进行玻璃化冷冻包括：将所述组织块混入冷冻保护剂后置入液氮中进行玻璃化冷冻。
5.如权利要求1所述的一种分离蛋白的方法，其特征在于，所述对所述冻干产物进行脱脂处理时还包括的对所述冻干产物进行脱糖处理；
所述对所述冻干产物进行脱脂处理，以获得脱脂类冻干本底组分包括：
对所述冻干产物通过超临界二氧化碳萃取法萃取所述糖类组分和脂类组分，以得到脱脂类冻干本底组分。
6.如权利要求1所述的一种分离蛋白的方法，其特征在于，所述将所述脱脂冻干本底组分分子粉体通过气体离心法进行蛋白分离包括：将所述脱脂冻干本底组分分子粉体放入高速涡轮气体梯度离心机以实现通过气体离心法进行蛋白分离。
7.一种分离蛋白的设备，其特征在于，包括：
玻璃化冷冻装置，用于将组织块进行玻璃化冷冻，得到玻璃化冷冻后产物；
冻干脱水装置，用于对所述玻璃化冷冻产物进行冻干脱水，获得冻干产物；其中，所述冻干脱水的起点温度为所述玻璃化冷冻的温度；
脱脂装置，用于对所述冻干产物进行脱脂处理，以获得脱脂类冻干本底组分；
分子粉体制备装置，用于将所述脱脂冻干本底组分进行分子粉体制备，以得到脱脂冻干本底组分分子粉体；
蛋白分离装置，用于将所述脱脂冻干本底组分分子粉体通过气体离心法进行蛋白分离，以分离得到若干蛋白组分。
8.如权利要求7所述的一种分离蛋白的设备，其特征在于，还包括：
电离纯化装置，对每一所述蛋白组分进行电场分离，从而得到纯化后的蛋白组分；
组织块切割装置，用于将组织或组织集合物进行切割，得到若干预定规格尺寸的组织块。
9.如权利要求7所述的一种分离蛋白的设备，其特征在于，所述脱脂装置为超临界二氧化碳萃取装置，所述超临界二氧化碳萃取装置用于对所述冻干产物通过超临界二氧化碳萃取法萃取所述糖类组分和脂类组分，以得到脱脂类冻干本底组分。
10.如权利要求7所述的一种分离蛋白的设备，其特征在于，所述蛋白分离装置为高速涡轮气体梯度离心机，所述高速涡轮气体梯度离心机用于将所述脱脂冻干本底组分分子粉体通过气体离心法进行蛋白分离，以分离得到若干蛋白组分。
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