CN111518747A - 一种从胎盘中分离提取羊膜干细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种从胎盘中分离提取羊膜干细胞的方法，本发明通过对医院废弃胎盘进行简单的清洗和杀菌后用来提取羊膜干细胞，做到资源的充分利用。本发明首先通过对羊膜的清洗、切块、培养、消化相应的步骤从羊膜中获得少量的羊膜干细胞，然后再将获得的羊膜干细胞继续培养、消化、离心获得大量的羊膜干细胞。该制备方法简便、易操作，并且本发明在从羊膜中提取羊膜干细胞时，通过将羊膜剪成2‑3mm3的肉糜状，促使更多的羊膜干细胞裸露出来，从而增加羊膜干细胞与培养基的接触面积，促使羊膜干细胞的体外扩增，提高了从羊膜中提取的羊膜干细胞的量。
Description
技术领域
本发明涉及一种新型的细胞分离纯化方法，具体地，涉及一种从胎盘中分离提取羊膜干细胞的方法。
背景技术
羊膜干细胞具有神经生物学功能，与神经干细胞具有同源性。神经干细胞(NSC)研究虽起步较晚，但却是当前研究的热点。由于成体神经组织内NSC数量少，分散分布，取材困难，无免疫原性NSC细胞系建立困难以及异体移植存在的免役排斥问题等原因，使NSC在神经系统疾病治疗中的应用受到一定的限制。随着对羊膜上皮细胞具有神经干细胞特性的研究逐步深入，羊膜干细胞为治疗神经系统退行性疾病和外伤性神经损伤将会带来新的契机。
在胚胎发育中来源于外胚层。在机体正常的组织损伤修复过程中，羊膜干细胞是一种重要的参与组织再生的细胞库。相比神经干细胞，羊膜干细胞易于分离扩增，体外倍增能力旺盛，即使扩增1亿倍仍能保持其多向分化能力。因此，羊膜干细胞是一种实用的组织修复种子细胞。
但是，神经干细胞的获取目前存在提取率低、分离方法复杂、来源稀少等问题，导致羊膜干细胞的成产成本加大。
发明内容
为了克服现有技术中存在的问题，本发明提供一种操作简单、安全性高、成本较低且扩增倍数高的一种从胎盘中分离提取羊膜干细胞的方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种从胎盘中分离提取羊膜干细胞的方法，具体包括以下步骤：
步骤S1：将经过前处理得到的碎块状的羊膜置于加入有培养基的塑料培养皿中并将其剪成2-3mm3的肉糜状，再将肉糜状羊膜平铺在塑料培养皿上，然后将塑料培养皿置于5％CO2培养箱培养；
步骤S2：在第7天时，将步骤S1塑料培养皿中的培养上清和羊膜块移除，然后再用生理盐水对塑料培养皿中剩下的细胞进行漂洗，获得少量干净的细胞；
步骤S3：往步骤S2对细胞进行漂洗后的塑料培养皿中加入胰酶替代物溶液并均匀覆盖在细胞面上，然后再将塑料培养皿置于培养箱或室温中进行消化；
步骤S4：对步骤S3消化中的细胞进行观察，待细胞变圆并开始脱落时，通过拍打塑料培养皿使细胞从塑料培养皿脱落，然后再往塑料培养皿中加入培养基终止消化，获得细胞悬液；
步骤S5：将步骤S4获得的细胞悬液均分到多个添加有培养基的培养瓶中并摇匀细胞，然后将培养瓶置于5％CO2培养箱中培养，直至细胞长至汇合度大于80％；
步骤S6：在第13天时，将所有培养瓶中的细胞上清移除培养瓶并将其收集，然后再用生理盐水对培养瓶中的细胞进行漂洗，获得大量干净的细胞；
步骤S7：往步骤S6中对细胞漂洗后的培养瓶中加入胰酶替代物溶液并使其均匀覆盖在细胞的表面，然后将培养瓶放置在培养箱中或室温中进行消化；
步骤S8：对步骤S7消化中的细胞进行观察，直至细胞变圆并开始脱落，拍打培养瓶使细胞从培养瓶上脱落，然后再往培养瓶中加入培养基或步骤S6收集的细胞上清来终止消化，获得细胞悬液；
步骤S9：将步骤S8获得的细胞悬液进行离心，去掉细胞上清获得羊膜干细胞。
优选地，所述步骤S1中碎块状的羊膜的前处理具体包括以下步骤：
步骤B1：取出胎盘并置于无菌培养平板中，并用含青链霉素的无菌蒸馏水将胎盘表面的血污进行冲洗，再用生理盐水对胎盘进行再次漂洗，然后从漂洗后的胎盘剪下一段羊膜并将其转移至新的无菌塑料培养皿中继续用生理盐水对羊膜表面血污进行清洗；
步骤B2：将步骤B1清洗后的羊膜进一步剪成0.5-1cm2的小片并用生理盐水进行清洗，再将清洗后的小片羊膜转移至新的无菌塑料培养皿中继续用生理盐水漂洗直到无血污，然后再将漂洗后的小片羊膜剪碎呈碎块状。
优选地，所述步骤S1、步骤S5中的5％CO2培养箱中的温度均为37℃，所述步骤S5在细胞培养过程中需要每3天将培养瓶中的全部液体换成新的培养基。
优选地，所述生理盐水为0.9％的生理盐水，所述培养基为DMEM/F12或α-MEM，所述步骤B1中的含青链霉素的无菌蒸馏水的青链霉素的浓度为100单位/mL。
优选地，所述步骤S3将塑料培养皿置于培养箱中进行消化时，消化温度为37℃；所述步骤S7将培养瓶置于培养箱中进行消化时，消化温度为37℃；所述步骤S3、步骤S7的消化时间均为30s～90s。
优选地，所述步骤S8中装有细胞悬液的培养瓶用步骤S6收集的细胞上清进行细胞回收，并将清洗后获得的细胞上清与细胞悬液一起进行离心。
优选地，所述步骤S9中的离心环境的温度为2～8℃。
优选地，所述步骤S9获得的羊膜干细胞还可进行保存，其保存具体包括以下步骤：
步骤C1：往将步骤S9获得的羊膜干细胞中加入新鲜的DMEM/F12培养基使细胞重新分散；
步骤C2：将步骤C1分散在DMEM/F12培养基中的细胞进行细胞浓度调整并加入冻存保护液，获得细胞悬浮液；
步骤C3：将步骤C2获得的细胞悬浮液先静置，然后再转移至液氮中进行保存。
优选地，所述步骤C2中的冷冻保存液为：30％-55％DMSO+25％-5％右旋糖酐+培养基，所述步骤C2中细胞浓度为500-1000万每支。
优选地，所述步骤C3中细胞悬浮液静置的时间为11～13h。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明说采用的羊膜干细胞提取方法具有简便、易操作，并且采用该方法更快的得到纯净的羊膜干细胞。
(2)本发明中用于羊膜干细胞提取的羊膜来源于医院废弃的胎盘，实现了废物利用，并且该废弃胎盘经简单生理盐水和含青链霉素的无菌蒸馏水清洗后就可直接使用，其处理步骤简单快捷，可降低羊膜干细胞的生产成本。
(3)本发明是一种高效的羊膜干细胞体外扩增的方法，通过将羊膜剪成肉糜状，促使更多的羊膜干细胞裸露出来，从而增加羊膜干细胞与培养基的接触面积，促使羊膜干细胞的体外扩增。并此外，本发明还对细胞消化时间和细胞的离心温度进行了限定，保证了细胞的活性。
(4)本发明避免了现有技术中羊膜干细胞在培养之前需要用非人源性蛋白(酶解液)对组织块进行消化来获得羊膜干细胞，如此，现有技术中羊膜干细胞的提取方法，不仅延长了羊膜干细胞的获得时间，增加羊膜干细胞的成本；同时引入的非人源性蛋白增加了获得的羊膜干细胞的毒性，不利于后期临床试验。而本发明利用羊膜干细胞具有塑料贴壁性，将清洗处理后的羊膜直接平铺在塑料培养皿中，通过将塑料培养皿置于37℃、5％CO2培养箱中培养使羊膜干细胞从羊膜组织块游离出来，将获得的羊膜干细胞再培养后经离心获得羊膜干细胞；因此，减少了利用非人源性蛋白对组织块的消化获得羊膜干细胞的步骤，缩短了获得羊膜干细胞的时间，同时，由于没有非人源性蛋白的引入，使得羊膜干细胞的分离更加简单(本发明中的羊膜干细胞悬液直接离心后就可获得羊膜干细胞)，也有利于获得更加纯净的羊膜干细胞，降低了干细胞的外源性毒性，有利于后续羊膜干细胞的临床试验研究。
(5)在研究中发现羊膜干细胞具有神经生物学功能，与神经干细胞具有同源性，而神经干细胞(neural stem cell，NSC)由于成体神经组织内NSC数量少、分散分布、取材困难、无免疫原性NSC细胞系建立困难以及异体移植存在的免役排斥问题等原因，使NSC在神经系统疾病治疗中的应用受到一定的限制。随着对羊膜上皮细胞具有神经干细胞特性的深入研究，羊膜干细胞为治疗神经系统退行性疾病和外伤性神经损伤将会带来新的契机，将进一步扩大市场对羊膜干细胞的需求，而采用本方法制备的羊膜干细胞由于没有外源毒性、纯度高、成本低的特性，使得其具有广阔的市场前景。
附图说明
图1-9为从9个不同胎盘分别获得的羊膜干细胞图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案进一步清楚、完整地描述，其中，本发明实施例所用原材料均为市售，以下实施例中细胞培养中的培养基均采用DMEM/F12。
实施例1
一种从胎盘中分离提取羊膜干细胞的方法，具体包括以下步骤：
步骤1：用无菌镊子取出胎盘并置于无菌培养平板中，并用含青链霉素的无菌蒸馏水将胎盘表面的血污进行冲洗，再用0.9％的生理盐水对胎盘再次进行漂洗，然后从漂洗后的胎盘剪下一段羊膜并将其转移至新的无菌塑料培养皿中并继续用生理盐水对羊膜表面血污进行清洗，其中，含青链霉素的无菌蒸馏水中青链霉素的浓度为100单位/mL。
步骤2：将步骤1清洗后的羊膜进一步剪成0.5-1cm2的小片并用生理盐水进行清洗，再将清洗后的小片羊膜转移至新的无菌塑料培养皿中继续用生理盐水漂洗直到无血污，然后再将漂洗后的小片羊膜剪碎呈碎块状。
步骤3：将步骤2获得的碎块状的羊膜置于装有DMEM/F12的塑料培养皿中并将其剪成2-3mm3的肉糜状，将肉糜状羊膜均匀平铺在塑料培养皿上，然后将塑料培养皿置于37℃的5％CO2培养箱培养。
步骤4：在第7天时，将步骤3中的塑料培养皿中的培养上清和羊膜块移除，然后再用生理盐水对塑料培养皿中剩下的细胞进行漂洗，将生理盐水移除后，塑料培养皿中只剩漂洗后的细胞，此时的细胞的数量很少。
步骤5：往步骤4只剩漂洗后的细胞的塑料培养皿中加入1mL的胰酶替代物溶液并均匀覆盖在细胞面上，然后再将塑料培养皿置于37℃的培养箱中进行消化，消化时间为60s。
步骤6：对步骤5消化中的细胞进行观察，待细胞变圆并开始脱落时，通过拍打塑料培养皿使细胞从塑料培养皿脱落，然后再往塑料培养皿中加入DMEM/F12终止消化，获得细胞悬液。
步骤7：将步骤6获得的细胞悬液均分到多个添加有DMEM/F12的培养瓶中并摇匀细胞，然后将培养瓶置于37℃的5％CO2培养箱中培养，直至细胞长至汇合度大于80％，本实例中细胞摇匀时采用的是“十字法”或“8字法”将细胞摇匀。
步骤8：在第13天时，将步骤7中的所有培养瓶中的细胞上清移除培养瓶并将其收集，然后再用生理盐水对培养瓶中的细胞进行漂洗，将生理盐水移除，培养瓶中只剩漂洗后的细胞，此时的细胞的数量很多。
步骤9：往步骤8中只剩漂洗后细胞的培养瓶中加入1mL胰酶替代物溶液并使其均匀覆盖在细胞的表面，然后将培养瓶放置在37℃的培养箱中进行消化60s。
步骤10：对步骤9消化中的细胞进行观察，直至细胞变圆并开始脱落，拍打培养瓶使细胞从培养瓶上脱落，然后再往培养瓶中加入DMEM/F12终止消化，获得细胞悬液。
步骤11：将步骤10获得的细胞悬液进行离心，去掉细胞上清获得羊膜干细胞，在离心之前需要将离心机预冷到4℃。
步骤12：往将步骤11获得的羊膜干细胞中加入新鲜的DMEM/F12培养基使细胞重新分散。
步骤13：将步骤12分散在DMEM/F12培养基中的细胞进行细胞浓度调整到500-1000万每支，然后再加入冻存保护液(30％-55％DMSO+25％-5％右旋糖酐+DMEM/F12，获得细胞悬浮液。
步骤14：将步骤13获得的细胞悬浮液先静置12小时后，然后再转移至液氮中进行保存。
实施例2
按照实施例1的方法从胎盘中分离提取羊膜干细胞，不同的是，所诉步骤5和步骤9中的消化时间均为30s，所诉步骤11中的离心机预冷到2℃。
实施例3
按照实施例1的方法从胎盘中分离提取羊膜干细胞，不同的是，所诉步骤5和步骤9中的消化时间均为90s，所诉步骤11中的离心机预冷到8℃。
根据上述所述实施例1关于一种从胎盘中分离提取羊膜干细胞的方法，在相同的条件下，本发明随机选取9个25-30岁产妇的足月的胎盘来分离提取羊膜干细胞，并将获得的羊膜干细胞用奥林巴斯CX41+DP20数码摄像头进行羊膜干细胞数据采集，采集得的羊膜干细胞数据如图1-9所示。
从图1-9可以看出，从9个不同胎盘上分离提取的羊膜干细胞全部为典型的干细胞的形状，符合干细胞的检验标准。
综上所述，本发明解决现有技术中的技术缺陷。本发明将医院废弃胎盘进行简单的清洗和抗菌处理后直接用来提取羊膜干细胞，并且羊膜干细胞的培养过程中没有外源的毒性的加入，一方面简化了羊膜干细胞的分离提取步骤，另一方面也降低羊膜干细胞的生产成本，同时还利于做后续的临床研究。
以上所述仅是本发明的部分实施方法，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种从胎盘中分离提取羊膜干细胞的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
步骤S1：将经过前处理得到的碎块状的羊膜置于加入有培养基的塑料培养皿中并将其剪成2-3mm3的肉糜状，再将肉糜状羊膜平铺在塑料培养皿上，然后将塑料培养皿置于5％CO2培养箱培养；
步骤S2：在第7天时，将步骤S1塑料培养皿中的培养上清和羊膜块移除，然后再用生理盐水对塑料培养皿中剩下的细胞进行漂洗，获得少量干净的细胞；
步骤S3：往步骤S2对细胞进行漂洗后的塑料培养皿中加入胰酶替代物溶液并均匀覆盖在细胞面上，然后再将塑料培养皿置于培养箱或室温中进行消化；
步骤S4：对步骤S3消化中的细胞进行观察，待细胞变圆并开始脱落时，通过拍打塑料培养皿使细胞从塑料培养皿脱落，然后再往塑料培养皿中加入培养基终止消化，获得细胞悬液；
步骤S5：将步骤S4获得的细胞悬液均分到多个添加有培养基的培养瓶中并摇匀细胞，然后将培养瓶置于5％CO2培养箱中培养，直至细胞长至汇合度大于80％；
步骤S6：在第13天时，将所有培养瓶中的细胞上清移除培养瓶并将其收集，然后再用生理盐水对培养瓶中的细胞进行漂洗，获得大量干净的细胞；
步骤S7：往步骤S6中对细胞漂洗后的培养瓶中加入胰酶替代物溶液并使其均匀覆盖在细胞的表面，然后将培养瓶放置在培养箱中或室温中进行消化；
步骤S8：对步骤S7消化中的细胞进行观察，直至细胞变圆并开始脱落，拍打培养瓶使细胞从培养瓶上脱落，然后再往培养瓶中加入培养基或步骤S6收集的细胞上清来终止消化，获得细胞悬液；
步骤S9：将步骤S8获得的细胞悬液进行离心，去掉细胞上清获得羊膜干细胞。
2.根据权利要求1所述的一种从胎盘中分离提取羊膜干细胞的方法，其特征在于，所述步骤S1中碎块状的羊膜的前处理具体包括以下步骤：
步骤B1：取出胎盘并置于无菌培养平板中，并用含青链霉素的无菌蒸馏水将胎盘表面的血污进行冲洗，再用生理盐水对胎盘进行再次漂洗，然后从漂洗后的胎盘剪下一段羊膜并将其转移至新的无菌塑料培养皿中继续用生理盐水对羊膜表面血污进行清洗；
步骤B2：将步骤B1清洗后的羊膜进一步剪成0.5-1cm2的小片并用生理盐水进行清洗，再将清洗后的小片羊膜转移至新的无菌塑料培养皿中继续用生理盐水漂洗直到无血污，然后再将漂洗后的小片羊膜剪碎呈碎块状。
3.根据权利要求1所述的一种从胎盘中分离提取羊膜干细胞的方法，其特征在于，所述步骤S1、步骤S5中的5％CO2培养箱中的温度均为37℃，所述步骤S5在细胞培养过程中需要每3天将培养瓶中的全部液体换成新的培养基。
4.根据权利要求2所述的一种从胎盘中分离提取羊膜干细胞的方法，其特征在于，所述生理盐水为0.9％的生理盐水，所述培养基为DMEM/F12或α-MEM，所述步骤B1中的含青链霉素的无菌蒸馏水的青链霉素的浓度为100单位/mL。
5.根据权利要求1所述的一种从胎盘中分离提取羊膜干细胞的方法，其特征在于，所述步骤S3将塑料培养皿置于培养箱中进行消化时，消化温度为37℃；所述步骤S7将培养瓶置于培养箱中进行消化时，消化温度为37℃；所述步骤S3、步骤S7的消化时间均为30s～90s。
6.根据权利要求4所述的一种从胎盘中分离提取羊膜干细胞的方法，其特征在于，所述步骤S8中装有细胞悬液的培养瓶用步骤S6收集的细胞上清进行细胞回收，并将清洗后获得的细胞上清与细胞悬液一起进行离心。
7.根据权利要求6所述的一种从胎盘中分离提取羊膜干细胞的方法，其特征在于，所述步骤S9中的离心环境的温度为2～8℃。
8.根据权利要求7所述的一种从胎盘中分离提取羊膜干细胞的方法，其特征在于，所述步骤S9获得的羊膜干细胞还可进行保存，其保存具体包括以下步骤：
步骤C1：往将步骤S9获得的羊膜干细胞中加入新鲜的DMEM/F12培养基使细胞重新分散；
步骤C2：将步骤C1分散在DMEM/F12培养基中的细胞进行细胞浓度调整并加入冻存保护液，获得细胞悬浮液；
步骤C3：将步骤C2获得的细胞悬浮液先静置，然后再转移至液氮中进行保存。
9.根据权利要求8所述的一种从胎盘中分离提取羊膜干细胞的方法，其特征在于，所述步骤C2中的冷冻保存液为：30％-55％DMSO+25％-5％右旋糖酐+培养基，所述步骤C2中细胞浓度为500-1000万每支。
10.根据权利要求8所述的一种从胎盘中分离提取羊膜干细胞的方法，其特征在于，所述步骤C3中细胞悬浮液静置的时间为11～13h。
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