CN107898812A - 一种基于脐带干细胞及活性成分的软骨损伤混合修复液 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种脐带提取物，其制备方法包括以下步骤：(1)清洗脐带，去除血液后剪碎；(2)将脐带小块冷冻干燥后，制成冻干粉；(3)将冻干粉溶解于溶剂中，利用超声提取方法进行提取；(4)收集超声提取液，离心，过滤，得到所述脐带提取物。同时，本发明还公开了含有所述脐带提取物及脐带干细胞的软骨损伤混合修复液。本发明脐带提取物有效成分丰富，包括透明质酸、胶原蛋白、白蛋白、多种氨基酸成分以及活性因子SCF和bFGF等，接近关节软骨的微环境，有利于软骨组织的修复。另外间充质干细胞可分化为软骨细胞，更有利于软骨的损伤修复。同时制备方法简单，可大规模生产和应用。

Description

一种基于脐带干细胞及活性成分的软骨损伤混合修复液
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种基于脐带干细胞及活性成分的软骨损伤混合修复液。
背景技术
关节软骨损伤是骨科较为常见的一种疾病。据统计，在行关节镜治疗的患者中，66％的患者存在关节软骨病变，11％的患者有全层软骨损伤。随着高能、高速创伤不断增多和人口老龄化加速，关节软骨损伤和退变的患者日益增多。关节软骨属于透明软骨，表面光滑，呈淡蓝色，有光泽，它是由一种特殊的叫做致密结缔组织的胶原纤维构成的基本框架，这种框架呈半环形，类似拱形球门，其底端紧紧附着在下面的骨质上，上端朝向关节面，这种结构使关节软骨紧紧与骨结合起来而不会掉下来，同时当受到压力时候，还可以有少许的变形，起到缓冲压力的作用。在这些纤维之间，散在分布着软骨细胞，软骨细胞由浅层向深层逐渐由扁平样至椭圆或圆形的细胞组成，这些软骨细胞维持关节软骨的正常代谢。关节软骨没有神经支配，也没有血管，其营养成分必须从关节液中取得，而其代谢废物也必须排至关节液中。因为关节软骨没有血管，因此关节软骨损伤后，自我修复能力很差。由于关节软骨损伤引发的疾病，目前的治疗方法几乎无法根治。
间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSCs)是一种具有高度自我更新能力和多向分化潜能的多能干细胞，在特定条件下能够向成骨细胞、神经细胞、脂肪细胞、心肌细胞、肌肉细胞、软骨细胞等分化。间充质干细胞是来源于发育早期中胚层的成体干细胞，在细胞替代治疗和组织工程血方面具有很大的应用价值。间充质干细胞可在骨髓、脐带、皮肤、肌肉、外周血等组织中分离获得，其中人脐带来源的间充质干细胞与其他来源的间充质干细胞相比，脐带的成本较低免疫原性低且来源没有伦理学争议。脐带提取物是从脐带中提取出的包括氨基酸、胶原蛋白、透明质酸在内的多种营养物质的混合物。
目前脐带提取物的制备方法繁琐，无法进行大规模生产和应用。而现有的软骨损伤修复液均存在有效成分单一，治疗效果欠佳等缺点，不能满足软骨损伤患者治疗的需要。
发明内容
基于此，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种脐带提取物，其制备方法简单、有效成分丰富，接近关节软骨的微环境。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种脐带提取物，其制备方法包括以下步骤：(1)清洗脐带，去除血液后剪碎；(2)将脐带小块冷冻干燥后，制成冻干粉；(3)将冻干粉溶解于溶剂中，利用超声提取方法进行提取；(4)收集超声提取液，离心，过滤，得到所述脐带提取物。
优选地，所述步骤(1)中脐带去除血液后剪成0.3～0.8cm3的小块；
步骤(2)中将脐带小块冷冻干燥40～56h后研磨成冻干粉；
步骤(3)中将冻干粉按1：(80～120)的料液比加入生理盐水进行溶解，然后超声提取20～45min，提取条件为：功率200～300W，超声5～10s停5～10s；
步骤(4)中离心条件为：2500g离心30min，取上清；8500g离心30min，取上清；28000rpm离心2h，取上清；所述上清经0.22μm和0.45μm双层膜过滤后，即得所述脐带提取物。
优选地，所述步骤(1)中脐带去除血液后剪成0.5cm3的小块；步骤(2)中将脐带小块冷冻干燥48h后研磨成冻干粉；步骤(3)中将冻干粉按1：100的料液比加入生理盐水进行溶解，然后超声提取30min，提取条件为：功率260W，超声8s停8s。
本发明还提供了所述的脐带提取物在制备治疗软骨损伤疾病药物中的用途。
优选地，所述脐带提取物可用于制备软骨损伤修复液。
本发明的另一目的，在于提供一种基于脐带干细胞及活性成分的软骨损伤混合修复液，其含有上述脐带提取物，有利于软骨组织的修复，同时制备方法简单，适用大规模生产。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种基于脐带干细胞及活性成分的软骨损伤混合修复液，其包含间充质干细胞和所述的脐带提取物。
优选地，所述间充质干细胞在软骨损伤混合修复液中的浓度为1×107～6×107cells/mL；优选地，所述间充质干细胞在软骨损伤混合修复液中的浓度为2×107cells/mL。
优选地，所述间充质干细胞来源于脐带。
本发明的又一目的，在于提供所述软骨损伤混合修复液的制备方法。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种基于脐带干细胞及活性成分的软骨损伤混合修复液的制备方法，包括以下步骤：
(1)脐带提取物制备：A、清洗脐带，去除血液后剪碎；B、将脐带小块冷冻干燥后，制成冻干粉；C、将冻干粉溶解于溶剂中，利用超声提取方法进行提取；D、收集超声提取液，离心，过滤，得到所述脐带提取物；
(2)间充质干细胞制备：A、取健康胎儿的脐带，剪成小段，将残留的血液挤出后沿脐动脉将脐带剪开；B、剥离血管，撕下血管周围的华尔通氏胶；C、将分离得到的华尔通氏胶剪碎，加入培养基进行培养；D、七天后将培养基和组织块倒出，更换新鲜培养基继续培养得到原代细胞；E、原代细胞至少进行3次传代培养后，即得所述间充质干细胞；
(3)按比例将间充质干细胞和脐带提取物混匀，即得所述软骨损伤混合修复液。
优选地，所述间充质干细胞在软骨损伤混合修复液中的浓度为1×107～6×107cells/mL；优选地，所述间充质干细胞在软骨损伤混合修复液中的浓度为2×107cells/mL。
优选地，所述步骤(2)的步骤A中脐带去除血液后剪成0.3～0.8cm3的小块；
步骤B中将脐带小块冷冻干燥40～56h后研磨成冻干粉；
步骤C中将冻干粉按1：(80～120)的料液比加入生理盐水进行溶解，然后超声提取20～45min，提取条件为：功率200～300W，超声5～10s停5～10s；
步骤D中离心条件为：2500g离心30min，取上清；8500g离心30min，取上清；28000rpm离心2h，取上清；所述上清经0.22μm和0.45μm双层膜过滤后，即得所述脐带提取物。
优选地，所述步骤(2)的步骤A中脐带去除血液后剪成0.5cm3的小块；步骤B中将脐带小块冷冻干燥48h后研磨成冻干粉；步骤C中将冻干粉按1：100的料液比加入生理盐水进行溶解，然后超声提取30min，提取条件为：功率260W，超声8s停8s。
本发明所述料液比是指“料”的质量与作为溶剂的“液”的体积的比，其中料(冻干粉)的质量单位为g，液(溶剂)的体积单位为mL，即料液比的单位为g/mL。
相对于现有技术，本发明的有益效果为：(1)本发明脐带提取物有效成分丰富，包括透明质酸、胶原蛋白、白蛋白、多种氨基酸成分以及活性因子SCF和bFGF等，更接近关节软骨的微环境，有利于软骨组织的修复；(2)脐带提取物中含有II型胶原蛋白，II型胶原蛋白是关节软骨特有的组成蛋白，有助于软骨组织的修复；(3)本发明软骨损伤修复液中含有脐带来源的间充质干细胞，其可分化为软骨细胞，更有利于软骨的损伤修复；(4)本发明脐带提取物和软骨损伤混合修复液制备方法简单，可大规模生产和应用。
附图说明
图1为本发明制备方法制备得到的细胞在光学显微镜下观察到的形态。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
本发明脐带提取物制备方法的一种实施例，包括以下步骤：
(1)取健康胎儿脐带，用生理盐水进行清洗，去除血液后剪成0.3cm3的小块；
(2)将脐带小块放入-40℃冰箱中预冷至收到细菌室检测报告，对所检测母血细菌病毒均为阴性的脐带小块用冷冻干燥机冷冻干燥40h，然后冻干的脐带倒入磨粉机中制成冻干粉；
(3)每g冻干粉加80mL生理盐水溶解，然后超声提取20min，提取条件为：功率200W，超声5s停5s；
(4)收集超声提取液，2500g离心30min，取上清；8500g离心30min，取上清；28000rpm离心2h，取上清；所述上清经0.22μm和0.45μm双层膜过滤后，即得所述脐带提取物。
实施例2
本发明脐带提取物制备方法的一种实施例，包括以下步骤：
(1)取健康胎儿脐带，用生理盐水进行清洗，去除血液后剪成0.8cm3的小块；
(2)将脐带小块放入-40℃冰箱中预冷至收到细菌室检测报告，对所检测母血细菌病毒均为阴性的脐带小块用冷冻干燥机冷冻干燥56h，然后冻干的脐带倒入磨粉机中制成冻干粉；
(3)每g冻干粉加120mL生理盐水溶解，然后超声提取45min，提取条件为：功率300W，超声10s停10s；
(4)收集超声提取液，2500g离心30min，取上清；8500g离心30min，取上清；28000rpm离心2h，取上清；所述上清经0.22μm和0.45μm双层膜过滤后，即得所述脐带提取物。
实施例3
本发明脐带提取物制备方法的一种实施例，包括以下步骤：
(1)取健康胎儿脐带，用生理盐水进行清洗，去除血液后剪成0.7cm3的小块；
(2)将脐带小块放入-40℃冰箱中预冷至收到细菌室检测报告，对所检测母血细菌病毒均为阴性的脐带小块用冷冻干燥机冷冻干燥45h，然后冻干的脐带倒入磨粉机中制成冻干粉；
(3)每g冻干粉加110mL生理盐水溶解，然后超声提取40min，提取条件为：功率230W，超声7s停7s；
(4)收集超声提取液，2500g离心30min，取上清；8500g离心30min，取上清；28000rpm离心2h，取上清；所述上清经0.22μm和0.45μm双层膜过滤后，即得所述脐带提取物。
实施例4
本发明脐带提取物制备方法的一种实施例，包括以下步骤：
(1)取健康胎儿脐带，用生理盐水进行清洗，去除血液后剪成0.5cm3的小块；
(2)将脐带小块放入-40℃冰箱中预冷至收到细菌室检测报告，对所检测母血细菌病毒均为阴性的脐带小块用冷冻干燥机冷冻干燥48h，然後冻干的脐带倒入磨粉机中制成冻干粉；
(3)每g冻干粉加100mL生理盐水溶解，然后超声提取30min，提取条件为：功率260W，超声8s停8s；
(4)收集超声提取液，2500g离心30min，取上清；8500g离心30min，取上清；28000rpm离心2h，取上清；所述上清经0.22μm和0.45μm双层膜过滤后，即得所述脐带提取物。
实施例5
本发明基于脐带干细胞及活性成分的软骨损伤混合修复液的一种实施例，包含间充质干细胞和实施例1所述脐带提取物，且所述间充质干细胞在的软骨损伤混合修复液中的浓度为1×107cells/mL。
所述软骨损伤混合修复液的制备方法包括以下步骤：
(1)脐带提取物制备：同实施例1；
(2)间充质干细胞制备：A、取健康胎儿的脐带10cm，放入75％酒精中浸泡1min，用生理盐水清洗去除血块和残留的酒精，然后将脐带剪成3cm的小段，将残留的血液挤出后沿脐动脉将脐带剪开，清洗内部；B、将脐带撕开，剥离血管，撕下血管周围的华尔通氏胶；C、将分离得到的华尔通氏胶剪成1mm碎块，加入Fasgrow培养基进行培养；D、培养三天后向培养瓶中添加1mL培养基，七天后将培养基和组织块倒出，更换新鲜培养基继续培养得到原代细胞；E、原代细胞传代至第4代，即得所述间充质干细胞；
(3)对间充质干细胞进行计数，并加入步骤(1)制备得到的脐带提取物中，使间充质干细胞的浓度为1×107cells/mL，即得所述软骨损伤混合修复液。
实施例6
本发明基于脐带干细胞及活性成分的软骨损伤混合修复液的一种实施例，包含间充质干细胞和实施例2所述脐带提取物，且所述间充质干细胞在的软骨损伤混合修复液中的浓度为6×107cells/mL。
所述软骨损伤混合修复液的制备方法包括以下步骤：
(1)脐带提取物制备：同实施例2；
(2)间充质干细胞制备：同实施例5；
(3)对间充质干细胞进行计数，并加入步骤(1)制备得到的脐带提取物中，使间充质干细胞的浓度为6×107cells/mL，即得所述软骨损伤混合修复液。
实施例7
本发明基于脐带干细胞及活性成分的软骨损伤混合修复液的一种实施例，包含间充质干细胞和实施例3所述脐带提取物，且所述间充质干细胞在的软骨损伤混合修复液中的浓度为4×107cells/mL。
所述软骨损伤混合修复液的制备方法包括以下步骤：
(1)脐带提取物制备：同实施例3；
(2)间充质干细胞制备：同实施例5；
(3)对间充质干细胞进行计数，并加入步骤(1)制备得到的脐带提取物中，使间充质干细胞的浓度为4×107cells/mL，即得所述软骨损伤混合修复液。
实施例8
本发明基于脐带干细胞及活性成分的软骨损伤混合修复液的一种实施例，包含间充质干细胞和实施例4所述脐带提取物，且所述间充质干细胞在的软骨损伤混合修复液中的浓度为2×107cells/mL。
所述软骨损伤混合修复液的制备方法包括以下步骤：
(1)脐带提取物制备：同实施例4；
(2)间充质干细胞制备：同实施例5；
(3)对间充质干细胞进行计数，并加入步骤(1)制备得到的脐带提取物中，使间充质干细胞的浓度为2×107cells/mL，即得所述软骨损伤混合修复液。
实施例9
本实施例对本发明制备得到的脐带提取物主要成分进行检测。
采用本领域常规检测技术对脐带提取物的以下成分进行检测：透明质酸、胶原蛋白、白蛋白、氨基酸成分以及活性因子SCF和bFGF。检测结果表明，在脐带提取物中上述成分均能检出，说明本发明提取物中至少包含上述活性成分。且利用实施例4制备方法制备得到的脐带提取物中有效成分含量最高。
实施例10
本实施例对本发明制备的细胞表型进行检测，以确认其为间充质干细胞。
1、检测方法
(1)利用流式细胞术对细胞表面以下抗原分子进行检测：CD105、CD90、CD73、CD45、CD34和HLA-DR。
(2)利用光学显微镜对细胞形态进行观察，并拍照。
2、检测结果
本发明制备方法制备得到的细胞形态如图1所示；表型检测结果如表1所示：
表1间充质干细胞表型检测结果
备注：表达率以Mean±SD表示，n＝6。
上述结果表明，本发明制备方法制备得到的细胞，其表面抗原CD105、CD90和CD73阳性表达率达到90％以上，且CD45、CD34和HLA-DR为阴性，符合间充质干细胞标准。同时，在显微镜下观察发现所述细胞符合间充质干细胞的形态特征。说明本发明制备方法制备得到的细胞为间充质干细胞。
实施例11
本实施例对实施例5～8中的软骨损伤混合修复液进行治疗效果研究。
1、实验方法
选取40名软骨损伤患者，随机分为4个实验组，各组患者间性别、年龄和疾病严重程度等临床资料不存在统计学差异，具有可比性。各组患者分别使用实施例5～8中的软骨损伤混合修复液进行治疗。
2、疗效评价标准
本发明软骨损伤混合修复液的治疗效果评价标准如表2所示：
表2效果评价标准
3、实验结果
使用2个星期后，对患者的治疗效果进行询问和记录，结果表明，实施例5～8中的软骨损伤混合修复液均具有很好的治疗效果，治疗有效率达90％以上。其中，实施例8中的软骨损伤混合修复液的治疗效果最好。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种脐带提取物，其特征在于，制备方法包括以下步骤：(1)清洗脐带，去除血液后剪碎；(2)将脐带小块冷冻干燥后，制成冻干粉；(3)将冻干粉溶解于溶剂中，利用超声提取方法进行提取；(4)收集超声提取液，离心，过滤，得到所述脐带提取物。
2.根据权利要求1所述的脐带提取物，其特征在于，所述步骤(1)中脐带去除血液后剪成0.3～0.8cm3的小块；
步骤(2)中将脐带小块冷冻干燥40～56h后研磨成冻干粉；
步骤(3)中将冻干粉按1：(80～120)的料液比加入生理盐水进行溶解，然后超声提取20～45min，提取条件为：功率200～300W，超声5～10s停5～10s；
步骤(4)中离心条件为：2500g离心30min，取上清；8500g离心30min，取上清；28000rpm离心2h，取上清；所述上清经0.22μm和0.45μm双层膜过滤后，即得所述脐带提取物。
3.根据权利要求2所述的脐带提取物，其特征在于，所述步骤(1)中脐带去除血液后剪成0.5cm3的小块；步骤(2)中将脐带小块冷冻干燥48h后研磨成冻干粉；步骤(3)中将冻干粉按1：100的料液比加入生理盐水进行溶解，然后超声提取30min，提取条件为：功率260W，超声8s停8s。
4.根据权利要求1～3任一项所述的脐带提取物在制备治疗软骨损伤疾病药物中的用途。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述脐带提取物用于制备软骨损伤修复液。
6.一种基于脐带干细胞及活性成分的软骨损伤混合修复液，其特征在于，包含间充质干细胞和权利要求1～3任一项所述的脐带提取物。
7.根据权利要求6所述的软骨损伤混合修复液，其特征在于，所述间充质干细胞在软骨损伤混合修复液中的浓度为1×107～6×107cells/mL；优选地，所述间充质干细胞在软骨损伤混合修复液中的浓度为2×107cells/mL。
8.根据权利要求6或7所述的软骨损伤混合修复液，其特征在于，所述间充质干细胞来源于脐带。
9.根据权利要求6所述的软骨损伤混合修复液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)脐带提取物制备：A、清洗脐带，去除血液后剪碎；B、将脐带小块冷冻干燥后，制成冻干粉；C、将冻干粉溶解于溶剂中，利用超声提取方法进行提取；D、收集超声提取液，离心，过滤，得到所述脐带提取物；
(2)间充质干细胞制备：A、取健康胎儿的脐带，剪成小段，将残留的血液挤出后沿脐动脉将脐带剪开；B、剥离血管，撕下血管周围的华尔通氏胶；C、将分离得到的华尔通氏胶剪碎，加入培养基进行培养；D、七天后将培养基和组织块倒出，更换新鲜培养基继续培养得到原代细胞；E、原代细胞至少进行3次传代培养后，即得所述间充质干细胞；
(3)按比例将间充质干细胞和脐带提取物混匀，即得所述软骨损伤混合修复液。
10.根据权利要求9所述的软骨损伤混合修复液的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)的步骤A中脐带去除血液后剪成0.3～0.8cm3的小块；
步骤B中将脐带小块冷冻干燥40～56h后研磨成冻干粉；
步骤C中将冻干粉按1：(80～120)的料液比加入生理盐水进行溶解，然后超声提取20～45min，提取条件为：功率200～300W，超声5～10s停5～10s；
步骤D中离心条件为：2500g离心30min，取上清；8500g离心30min，取上清；28000rpm离心2h，取上清；所述上清经0.22μm和0.45μm双层膜过滤后，即得所述脐带提取物。
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