CN106389491A - 一种组合物及其在制备改善黄褐斑的产品中的应用 - Google Patents

一种组合物及其在制备改善黄褐斑的产品中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及医药领域，尤其涉及一种组合物及其在制备改善黄褐斑的产品中的应用。本发明提供的组合物中包括当归提取物、干细胞提取物A和干细胞提取物B。实验表明，本发明提供的组合物能够将酪氨酸酶的相对活性降低至89.8％，而细胞中黑色素的相对含量也被降低至82.8％。说明本发明提供的组合物能够有效抑制酪氨酸酶活性、降低细胞黑色素含量。该效果显著优于单独给予当归提取物或单独给予干细胞提取物的对照组。另外，将本发明提供的组合物用于改善黄褐斑，有效率可达95％；缓解率可达70％。

Description

一种组合物及其在制备改善黄褐斑的产品中的应用
技术领域
本发明涉及医药领域，尤其涉及一种组合物及其在制备改善黄褐斑的产品中的应用。
背景技术
黄褐斑也称肝斑，为面部的黄褐色色素沉着。多对称蝶形分布于颊部。多见于女性，血中雌激素水平高是主要原因，其发病与妊娠、长期口服避孕药、月经紊乱有关。黄褐斑一般为黄褐或深褐色斑片，常对称分布于颧颊部，也可累及眶周、前额、上唇和鼻部，边缘一般较明显。无主观症状和全身不适。色斑深浅与季节，日晒，内分泌因素有关。精神紧张，熬夜，劳累可加重皮损。
对于黄褐斑的疗法主要分为局部治疗和全身治疗2种，全身治疗大多为给予维生素C以促进色素减退，局部治疗是更加常用的方式。局部治疗分为以下3种方式：
1、外用药物：这是最简单、最常用的治疗方法。外用酪氨酸酶抑制剂软膏，如5％氢醌霜、2％～4％曲酸霜及3％熊果苷等。涂搽后都有不同程度的疗效。该类药物为抗氧化剂，易在空气和日光中氧化，应封闭、避光保存。近年有人报道使用0.1％维A酸软膏治疗黄褐斑，外用糖皮质激素等也有一定疗效。
2、剥脱疗法：三氯醋酸溶液局部涂搽可使表皮剥脱，而除去色素斑。液氮冷冻治疗可使表皮冷冻坏死后剥离，以除去色素，磨削手术是用磨头将表皮磨去一层，而达到除去色素的目的。术后待创面愈合后搽用防晒霜等，否则日晒后易于复发。
3、面膜疗法：面膜疗法包括单纯面膜剂、面膜膏按摩法和倒模面膜法。其中倒模面膜法已广泛应用于黄褐斑的治疗。面膜倒模疗法集药物、按摩、理疗于一体，从而具有多种治疗作用。其治疗程序为：阳离子蒸气润面－面膜膏按摩－成形倒模剂倒模。面膜膏的药物成分对黄褐斑的治疗起着关键影响。目前有去色素的面膜膏、增白面膜膏和专治黄褐斑的中草药物面膜等。
4、激光或强脉冲光治疗：近来有报道应用光子嫩肤术及应用Q开关激光治疗黄褐斑部分患者有效。
然而，以上这些疗法对黄褐斑的改善效果皆非常有限，很难令人满意。因此，进一步开发用于改善黄褐斑的产品具有十分重要的意义。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种组合物及其在制备改善黄褐斑的产品中的应用，本发明提供的组合物能够抑制酪氨酸酶活性、降低细胞黑色素含量，从而有效改善黄褐斑。
本发明提供的组合物中包括当归提取物、干细胞提取物A和干细胞提取物B；
当归提取物由当归粉碎后水煎提取制得；
干细胞提取物A由干细胞的培养上清液过滤、浓缩后冻干制得；
干细胞提取物B由干细胞裂解后经过滤制得。
每100mL本发明提供的组合物中包括干细胞提取物A10mg～50mg；干细胞提取物B5mL～20mL；余量为当归提取物。
每100mL本发明提供的组合物中包括干细胞提取物A20mg～40mg；干细胞提取物B5mL～20mL；余量为当归提取物。
一些实施例中，每100mL本发明提供的组合物中包括干细胞提取物A20mg；干细胞提取物B 5mL；余量为当归提取物。
一些实施例中，每100mL本发明提供的组合物中包括干细胞提取物A40mg；干细胞提取物B 20mL；余量为当归提取物。
本发明提供的组合物中，干细胞为脐带间充质干细胞。
具体的，干细胞为人脐带间充质干细胞。
脐带间充质干细胞的获得方法为市场购得或自行制备本发明对此不做限定，其实施皆在本发明的保护范围之内。
干细胞的制备方法包括：
步骤1：脐带以含有200U/m双抗的PBS溶液冲洗3遍后，剪成2cm长小段，剥去动、静脉管和外膜后，剪碎成1-2mm2小块，均匀贴附于10cm培养皿，37℃5％CO2培养箱内倒放1-2h；培养基为X-VIVO15无血清培养基；
步骤2：加入含有10ng/mL的EGF的X-VIVO15无血清培养基，37℃5％CO2培养2～3天后半量换液，继续培养6～8天，待细胞从组织块中爬出，弃去组织块继续培养；
步骤3：待生长至80％融合，倒去培养液，PBS清洗一遍，加0.25％胰酶消化1～2min，加FBS终止消化，400g离心5min收集脐带间充质细胞。
本发明中，干细胞的培养的采用含有EGF的X-VIVO15无血清培养基；其中EGF的浓度为10ng/mL。
干细胞的培养方法为，将细胞接种至含有EGF的X-VIVO15无血清培养基37℃，5％CO2培养箱培养至80％融合后继续传代。
干细胞提取物A的制备方法包括：将干细胞培养上清液以0.45μm滤膜过滤后，滤液再经0.22μm滤膜过滤，所得滤液以切向流过滤器循环过滤3h后，经冷冻干燥制得干细胞提取物A。
干细胞培养上清液为P2或P3代的脐带间充质干细胞的培养上清液。
干细胞提取物B的制备方法包括：收集干细胞以水重悬后，反复冻融3次后，0℃～4℃超声震荡3次，每次3min；所得细胞裂解液经0.22μm滤膜过滤后制得干细胞提取物B。
本发明采用的干细胞为培养至P2或P3代的脐带间充质干细胞。
重悬至细胞密度为1×106cell/mL～5×106cell/mL。
冻融过程中，冷冻采用液氮，融化的温度为37℃。
超声的功率为300w，频率为20Hz～40Hz。
当归的水煎提取中，当归与水的质量-体积比为1g：(10mL～20mL)。
水煎提取的温度为80-100℃，时间为30-60min。
水煎提取后，以100目筛网过滤，获得当归提取物。
本发明提供的组合物在制备抑制酪氨酸酶活性、降低细胞黑色素含量的产品中的应用。
所述细胞为小鼠B16黑色素细胞。
实验表明，相对于不经处理的空白对照，本发明提供的组合物能够将酪氨酸酶的相对活性降低至89.8％，而细胞中黑色素的相对含量也被降低至82.8％。说明本发明提供的组合物能够有效抑制酪氨酸酶活性、降低细胞黑色素含量。
本发明提供的组合物在制备改善黄褐斑的产品中的应用。
实验表明，给予本发明提供的组合物能够有效改善黄褐斑，有效率可达95％；缓解率可达70％。
本发明还提供了一种改善黄褐斑的产品，包括本发明提供的组合物。
本发明提供的组合物可单独用于改善黄褐斑，也可添加其他辅料制成不同的剂型用于改善黄褐斑，本发明对此不做限定。
本发明还提供了一种改善黄褐斑的方法，该方法为给予本发明提供的组合物。
给予本发明提供的组合物的剂量为每10cm2面积涂抹1-2ml。
给予的方式为涂敷于黄褐斑区域。给药过程中，还可以辅助刮痧处理等方式。刮痧采用玉石刮痧，刮痧板的形状为鱼形或四方形。
本发明提供了一种组合物，其中包括当归提取物、干细胞提取物A和干细胞提取物B。实验表明，本发明提供的组合物能够将酪氨酸酶的相对活性降低至89.8％，而细胞中黑色素的相对含量也被降低至82.8％。说明本发明提供的组合物能够有效抑制酪氨酸酶活性、降低细胞黑色素含量。该效果显著优于单独给予当归提取物或单独给予干细胞提取物的对照组。另外，将本发明提供的组合物用于改善黄褐斑，有效率可达95％；缓解率可达70％。
具体实施方式
本发明提供了一种组合物及其在制备改善黄褐斑的产品中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1制备脐带间充质干细胞
脐带以含有200U/m双抗的PBS溶液冲洗3遍后，剪成2cm长小段，剥去动、静脉管和外膜后，剪碎成1-2mm2小块，均匀贴附于10cm培养皿，37℃5％CO2培养箱内倒放1-2h；培养基为X-VIVO15无血清培养基；
加入含有10ng/mL的EGF的X-VIVO15无血清培养基，37℃5％CO2培养2～3天后半量换液，继续培养6～8天，待细胞从组织块中爬出，弃去组织块继续培养；
待生长至80％融合，倒去培养液，PBS清洗一遍，加0.25％胰酶消化1～2min，加FBS终止消化，400g离心5min收集脐带间充质细胞。
以含有10ng/mL的EGF的X-VIVO15无血清培养基重悬脐带间充质细胞，根据计数结果接种2-3皿(接种密度为1-5×106cell/mL)。
待细胞生长至80％融合后继续传代，至P2或P3代细胞进行细胞和培养上清液的收集。
实施例2干细胞提取物A的制备
收集实施例1中制得的P2和P3代干细胞培养上清液，采用Slice200切向流过滤器浓缩，循环过滤的时间为3h，该过程中，经0.45μm滤膜过滤除去大颗粒物质，再经0.22μm滤膜过滤，除去3kDa以下小颗粒物质；浓缩液用冻干机制成冻干粉，即为干细胞提取物A。
实施例3干细胞提取物B的制备
收集实施例1中制得的P2或P3代细胞，加入纯水重悬至细胞密度为1×106cell/mL～5×106cell/mL，放入液氮速冻5min，取出后37℃解冻；
解冻后又放入液氮速冻，反复3次；
在0～4℃冰水浴中超声振荡3min(功率300W，频率20Hz～40Hz)，超声振荡3次；
合并所得混悬液，在无菌条件下经0.22μm滤膜过滤，制得干细胞提取物B。
实施例4当归提取物的制备
取当归洗净晾干，研磨成粉，水煎提取(1g当归加水10mL～20mL；100℃，提取30min)，经100目筛网过滤得到滤液，制得100ml当归提取物。
实施例5组合物的制备
混合实施例4制得的当归提取物、实施例3制得的干细胞提取物B，加入实施例2制得的干细胞提取物A，制得组合物
每100ml组合物中含有：
干细胞提取物A20mg
干细胞提取物B 5mL
其余为当归提取物。
实施例6组合物的制备
混合实施例4制得的当归提取物、实施例3制得的干细胞提取物B，加入实施例2制得的干细胞提取物A，制得组合物
每100ml组合物中含有：
干细胞提取物A40mg
干细胞提取物B 20mL
其余为当归提取物。
实施例7组合物对小鼠B16黑色素细胞的作用
黄褐斑与黑色素细胞酪氨酸酶活性和黑色素生成有直接的关系，所以对酪氨酸酶活性和黑色素生成能力的测定能直接反应制剂治疗黄褐斑的效果。对比试验流程如下：
取小鼠B16黑色素细胞，以1×105个/ml的密度接种于2个6孔板，(培养液为5％胎牛血清的1640培养基)。3块6孔板每孔分别添加：
孔1：不添加任何成分
孔2：实施例3提供的干细胞提取物B
孔3：实施例5提供的组合物5％体积浓度
孔4：实施例5提供的组合物10％体积浓度
孔5：实施例6提供的组合物5％体积浓度
孔6：实施例6提供的组合物10％体积浓度
置于37℃、5％CO2浓度培养箱中培养3天。
酪氨酸酶活力测定：
第一块6孔板培养3天后，用PBS清洗两遍，消化细胞，加入96孔板，每孔1×104个细胞(设置5个复孔)，并同时分别设置空白组(培养基)和对照组(孔1，细胞加培养基)，加入加含1％的Triton-100(MERCK公司)的PBS 100ul，冰浴超声击碎细胞，每孔添加再添加10ul的0.01mol/L的L-dopa(美国SIGMA公司)，37℃孵育1小时，于490nm处比色，测吸光度值。
以A值表示酪氨酸酶活性大小：
A＝(实验组-空白组)/(对照组-空白组)×100％
黑色素含量测定：
第二块6孔板培养3天后，用PBS清洗两遍，消化细胞，加入96孔板，每孔1×104个细胞(设置5个复孔)，并同时分别设置空白组(无细胞)和对照组(孔1细胞)，每孔加入200ul含10％二甲基亚砜(DMSO)的NaOH(1mol/L)溶液，于65℃水浴完全溶解黑色素颗粒，酶联免疫检测490nm处吸光度值，。
以B值表示酪氨酸酶活性大小：
B＝(实验组-空白组)/(对照组-空白组)×100％
检测结果如表1：
表1检测结果
组别 酪氨酸酶活性A值(％) 黑色素含量测定B值(％)
孔1 100±2.58 100±1.15
孔2 97.3±2.28 97.5±1.83
孔3 90.6±1.72 85.4±1.23
孔4 89.9±1.69 86.3±1.17
孔5 89.8±2.05 88.7±0.98
孔6 90.2±1.84 82.8±1.08
结果分析：
从酪氨酸酶活性和黑色素含量测定分析结果可知，实施例5和6提供的组合物对酪氨酸酶活性具有明显的抑制作用，该效果显著(p<0.05)优于单独给予干细胞提取物B(干细胞裂解液)，并且，本发明提供的组合物对黑色素的形成的抑制效果更佳，该效果也显著(p<0.05)优于单独使用干细胞提取物B(干细胞裂解液)。
实施例7组合物对黄褐斑的改善作用
随机选择患者100例，诊断结果为典型性黄褐色皮疹(黄褐斑)。其中男性34例，女性66例，年龄18～40岁，平均年龄25岁，病程1～8年，平均2.7年。所有病人随机分为5组进行实验。
对照组1：进行常规面部护理；
对照组2：仅以实施例4当归提取物涂敷
对照组3：以实施例3干细胞提取物B涂敷
实验组1：涂敷实施例5组合物；
实验组2：涂敷实施例6组合物；
所有病人持续治疗跟踪3年，疗效评价参照黄褐斑的临床诊断和疗效判定标准。
基本治愈：肉眼视色斑面积消退﹥90％，颜色基本消失，评分法计算和治疗后总积分下降指数﹥0.8；
显效：肉眼视色斑面积消退﹥60％，颜色明显变淡，评分法计算和治疗后总积分下降指数﹥0.5；
缓解率＝治愈数/病例数
有效率＝(显效数+治愈数)/病例数
得到结果如表2：
表2治疗效果
分组 病例数 治愈数 显效数 缓解率 有效率
对照组1 20 0 0 0 0
对照组2 20 0 2 0 10％
对照组3 20 1 8 5％ 40％
实验组1 20 12 6 60％ 90％
实验组2 20 14 5 70％ 95％
结果表明，本发明提供的组合物对黄褐斑的改善效果优于单独给予当归提取物或干细胞提取物B，该效果具有显著性。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种组合物，其特征在于，包括当归提取物、干细胞提取物A和干细胞提取物B；
所述当归提取物由当归粉碎后水煎提取制得；
所述干细胞提取物A由干细胞的培养上清液过滤、浓缩后冻干制得；
所述干细胞提取物B由干细胞裂解后经过滤制得。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，每100mL组合物中包括干细胞提取物A10mg～50mg；干细胞提取物B 5mL～20mL；余量为当归提取物。
3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述干细胞为脐带间充质干细胞。
4.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述干细胞的培养的采用含有EGF的X-VIVO15无血清培养基；其中EGF的浓度为10ng/mL。
5.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述干细胞提取物A的制备方法包括：将干细胞培养上清液以0.45μm滤膜过滤后，滤液再经0.22μm滤膜过滤，所得滤液以切向流过滤器循环过滤3h后，经冷冻干燥制得干细胞提取物A。
6.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述干细胞提取物B的制备方法包括：收集干细胞以水重悬后，反复冻融3次后，0℃～4℃超声震荡3次，每次3min；所得细胞裂解液经0.22μm滤膜过滤后制得干细胞提取物B。
7.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述当归的水煎提取中，当归与水的质量-体积比为1g：(10mL～20mL)。
8.权利要求1～7任一项所述的组合物在制备抑制酪氨酸酶活性、降低细胞黑色素含量的产品中的应用。
9.权利要求1～7任一项所述的组合物在制备改善黄褐斑的产品中的应用。
10.一种改善黄褐斑的产品，其特征在于，包括权利要求1～7任一项所述的组合物。
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