CN116942912A - 诱导组织再生的细胞外基质支架及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种诱导组织再生的细胞外基质支架及其制备方法和应用，涉及生物材料技术领域，本发明利用细胞与微球共培养产生细胞外基质，制得可诱导组织再生的细胞外基质支架；体外组织工程化得到低免疫原性、且具有生物活性的支架材料；能够实现组织的原位再生。

Description

诱导组织再生的细胞外基质支架及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物材料技术领域，尤其是涉及一种诱导组织再生的细胞外基质支架及其制备方法和应用。
背景技术
意外或疾病造成的组织缺损(如颅骨缺损、长骨缺损、皮肤缺损、肌肉缺损等)是常见临床病症，严重影响着病人的身心健康和生活质量。由于人体组织的自我修复能力有限，组织缺损修复成为临床难题之一。组织工程技术为解决这一难题提供了新思路，其基本原理为：将分离的正常组织细胞在体外培养、扩增，种植到可生物降解支架材料上，形成细胞-支架复合物，然后将其植入到组织缺损部位，细胞继续增殖并分泌细胞外基质，形成形态和功能与自身组织相一致的再生组织，从而实现组织缺损的修复。支架材料，种子细胞和生物活性因子是其三要素，其中支架材料不仅为细胞粘附、增殖、分化及分泌细胞外基质提供物理支撑，还应为细胞提供适宜的微环境，促进细胞的增殖、定向分化，促进相应细胞外基质的分泌。因此，支架材料的结构及性能对组织的再生过程及组织缺损修复效果起到至关重要的作用。大量研究表明支架材料是组织工程策略赖以实现的关键。
近年来，随着组织工程学的迅速发展，探索制备具有生物活性的组织工程支架已成为研究热点。目前组织工程支架材料主要分为天然材料(如明胶、海藻酸盐、透明质酸等)、合成材料(如聚己内酯、聚乳酸、聚乙醇酸等)和无机材料(如羟基磷灰石、磷酸钙陶瓷、金属、金属氧化物)三类。然而这些材料都难以真实地模拟人体组织细胞外基质。近几年，通过对天然组织进行脱细胞处理来获得组织工程支架受到广泛研究。然而，天然组织脱细胞支架存在诸多问题，例如自体组织来源有限，异体组织存在免疫排异等。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种诱导组织再生的细胞外基质支架，以至少解决现有技术中存在的技术问题之一。
本发明的目的之二在于提供上述诱导组织再生的细胞外基质支架的制备方法。
本发明的目的之三在于提供上述诱导组织再生的细胞外基质支架在制备促进组织活性修复的产品中的应用。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
本发明提供了一种诱导组织再生的细胞外基质支架，包括微球及复合于所述微球的细胞外基质。
进一步的，所述微球的直径为1～500μm。
进一步的，所述微球包括蛋白基微球、聚酯基微球、聚乙烯基微球、聚苯乙烯基微球、无机材料基微球或天然微球形状的物质中的至少一种；
可选地，所述蛋白基微球包括明胶微球、胶原微球或纤维蛋白微球；
可选地，所述聚酯基微球包括聚乳酸微球、聚碳酸酯微球或聚己内酯微球；
可选地，所述无机材料基微球包括二氧化硅微球、碳酸钙或磷酸钙；
可选地，所述天然微球形状的物质包括酵母细胞。
进一步的，所述细胞外基质来源于软骨细胞、干细胞、成纤维细胞、上皮细胞、基质细胞或成骨细胞中的至少一种。
本发明还提供了上述的诱导组织再生的细胞外基质支架的制备方法，包括如下步骤：
(1)将微球与细胞进行体外或体内共培养，得到三维的微球-细胞复合体；
(2)对所述微球-细胞复合体进行脱细胞处理，得到所述诱导组织再生的细胞外基质支架。
进一步的，步骤(1)中，共培养的时间为大于3天；
优选地，所述微球为细胞粘附性微球。
进一步的，步骤(2)中，所述脱细胞处理包括：依次用细胞裂解液、磷酸盐缓冲液、核酸酶溶液处理微球-细胞复合体，清洗后得到所述诱导组织再生的细胞外基质支架。
进一步的，所述细胞裂解液处理包括(1)将所述微球-细胞复合体置于EDTA-Tris溶液或十二烷基硫酸钠溶液中震荡处理，以及(2)将(1)处理后的复合体置于Triton-100溶液中震荡处理；
优选地，所述磷酸盐缓冲液处理包括置于磷酸盐缓冲液中浸泡；
优选地，所述核酸酶包括DNA酶和RNA酶，所述核酸酶处理包括置于核酸酶溶液中浸泡；
优选地，所述清洗包括使用无菌去离子水冲洗。
进一步的，包括如下步骤：
(a)将微球-细胞复合体放入EDTA-Tris溶液或十二烷基硫酸钠溶液，震荡48小时，期间每隔12小时换液1次；
(b)然后用1％的Triton-100溶液继续处理，震荡48小时，期间每隔12小时换液1次；
(c)用磷酸盐缓冲液浸泡48小时，期间每隔12小时换液一次；
(d)用核酸酶溶液，37℃处理24小时；
(e)用无菌去离子水冲洗48小时，每隔12小时换液一次，然后弃掉去离子水，放入-80℃冰箱内保存备用。
此外，本发明还提供了上述的诱导组织再生的细胞外基质支架在制备促进组织修复的产品中的应用；
优选地，所述组织包括骨、软骨、皮肤、肌肉、韧带或肌腱。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的诱导组织再生的细胞外基质支架，利用自体细胞产生的细胞外基质与微球复合，体外组织工程化得到无免疫原性、且具有生物活性(如：促进细胞粘附、增殖及分化)的支架材料；能够实现组织的原位再生。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1提供的诱导组织再生的细胞外基质支架的显微照片及降解曲线，其中A为光学显微照片，B为电子显微照片，C为体外降解曲线；
图2为本发明实施例1提供的诱导组织再生的细胞外基质支架和明胶水凝胶支架与软骨细胞共培养的显微照片(Micrograph)和相机照片(Photograph)；
图3为本发明实施例1提供的明胶微球-软骨细胞复合体的活/死细胞染色结果图；
图4为本发明实施例1提供的明胶微球-软骨细胞复合体和水凝胶-软骨细胞复合体的骨桥蛋白(OPN)和骨钙素(OCN)的免疫荧光染色结果图；
图5A为本发明实施例1提供的明胶微球-软骨细胞复合体脱细胞处理得到的诱导组织再生的细胞外基质支架(即，活性支架)；
图5B为本发明实施例1提供的大鼠颅骨全层缺损模型的构建和活性支架植入照片；
图6为本发明实施例1提供的大鼠颅骨缺损部位的电子计算机断层扫描(CT)照片；
图7为本发明实施例2提供的脱细胞支架植入股骨缺损60天取出后的照片；
图8A为本发明实施例4提供的小鼠皮肤缺损模型构建和脱细胞支架植入皮肤缺损30天后的照片；
图8B为本发明实施例4提供的小鼠皮肤缺损模部位组织的苏木精-伊红(HE)染色，箭头指示新生毛囊。
具体实施方式
除非本文另有定义，连同本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应当清晰，然而，在任何潜在不明确性的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外来定义。在本申请中，除非另有说明，“或”的使用意味着“和/或”。此外，术语“包括”及其他形式的使用是非限制性的。
一般地，连同本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交使用的命名法和其技术是本领域众所周知和通常使用的那些。除非另有说明，本发明的方法和技术一般根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来进行，所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨论。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书、如本领域通常实现的或如本文所述来进行。连同本文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的命名法、以及其实验室程序和技术是本领域众所周知和通常使用的那些。
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
根据本发明的第一个方面，提供了一种诱导组织再生的细胞外基质支架，包括微球及复合于所述微球的细胞外基质。
本发明提供的诱导组织再生的细胞外基质支架，利用自体细胞产生的细胞外基质与微球复合，体外组织工程化得到无免疫原性、且具有生物活性(如：促进细胞粘附、增殖及分化)的支架材料；能够实现组织的原位再生。
在一些优选的实施方式中，所述微球的直径为1～500μm，例如可以为，但不限于1μm、10μm、50μm、100μm、200μm、300μm、400μm或500μm。
典型的聚合物微球可以为蛋白基微球，例如明胶微球、胶原微球或纤维蛋白微球；也可以为聚酯基微球，例如聚乳酸微球、聚碳酸酯微球或聚己内酯微球；还可以为聚乙烯基微球、聚苯乙烯基微球、无机材料基微球或天然微球形状的物质等，其中无机材料基微球例如为二氧化硅微球、碳酸钙、磷酸钙，天然微球形状的物质例如为酵母细胞等。在本发明提供的诱导组织再生的细胞外基质支架中，可以单独使用上述各种微球，也可以选择上述微球中的两种、三种、四种或更多种共同使用作为微球。
需要说明的是，对于不利于细胞粘附的微球本发明还进行了表面涂层修饰，以促进细胞粘附，例如可以为，但不限于明胶涂层、RGD多肽涂层、胶原涂层等促细胞粘附材料涂层。其中，不利于细胞粘附的微球包括聚酯基微球、聚乙烯基微球、聚苯乙烯基微球、无机材料基微球或天然微球形状的物质等。
在一些优选的实施方式中，所述细胞外基质来源于软骨细胞、干细胞、成纤维细胞或成骨细胞中的至少一种，例如可以单独来源于软骨细胞、成纤维细胞、上皮细胞、基质细胞或成骨细胞，也可以共同来源于上述细胞中的两种、三种、四种或更多种。
根据本发明的第二个方面，提供了上述的诱导组织再生的细胞外基质支架的制备方法，包括如下步骤：
(1)将微球与细胞进行体外共或体内培养，得到三维的微球-细胞复合体；
(2)对所述微球-细胞复合体进行脱细胞处理，得到所述诱导组织再生的细胞外基质支架。
本发明提供的诱导组织再生的细胞外基质支架的制备方法工艺简单，操作方便，适于产业化应用。
在一些优选的实施方式中，共培养的时间为大于3天，例如可以为，但不限于3天，7天，14天，21天，28天等。
在一些优选的实施方式中，所述微球为细胞粘附性微球，细胞粘附性微球更利于得到三维的微球-细胞复合体，当选用的微球本身不具备细胞粘附性或细胞粘附性较差时，可对其应用促细胞粘附材料进行表面涂层修饰。
在一些优选的实施方式中，脱细胞处理包括：依次用细胞裂解液、磷酸盐缓冲液、核酸酶溶液处理微球-细胞复合体，清洗后得到所述诱导组织再生的细胞外基质支架。
细胞裂解液处理：
包括两步，(1)将所述微球-细胞复合体置于EDTA-Tris溶液或十二烷基硫酸钠溶液中震荡处理，以及(2)将(1)处理后的复合体置于Triton-100溶液中震荡处理；两步处理使得细胞脱离率更好，脱细胞效果更好。
具体包括如下步骤：(a)将微球-细胞复合体放入EDTA-Tris溶液或十二烷基硫酸钠溶液，震荡48小时，期间每隔12小时换液1次；(b)然后用1％的Triton-100溶液继续处理，震荡48小时，期间每隔12小时换液1次。
磷酸盐缓冲液(PBS)处理：
包括置于磷酸盐缓冲液中浸泡；去除残留的细胞裂解液。
具体包括如下步骤：(c)用磷酸盐缓冲液浸泡48小时，期间每隔12小时换液一次。
核酸酶处理：
包括置于核酸酶溶液中浸泡；其中，所述核酸酶包括DNA酶和RNA酶，分别10U/ml。
具体包括如下步骤：(d)用核酸酶溶液，37℃处理24小时。
清洗处理：
包括使用无菌去离子水冲洗。
具体包括如下步骤：(e)用无菌去离子水冲洗48小时，每隔12小时换液一次，然后弃掉去离子水，放入-80℃冰箱内保存备用。
此外，本发明的第三个方面还提供了上述的诱导组织再生的细胞外基质支架在制备促进组织修复的产品中的应用；
优选地，所述组织包括但不限于骨、软骨、皮肤、肌肉、韧带或肌腱等。
下面通过实施例对本发明作进一步说明。如无特别说明，实施例中的材料为根据现有方法制备而得，或直接从市场上购得。
实施例1
本实施例提供了一种诱导组织再生的细胞外基质支架，包括明胶微球及复合于所述明胶微球表面的软骨细胞来源的细胞外基质。
该诱导组织再生的细胞外基质支架通过如下方法制备得到：
(1)将明胶微球与软骨细胞进行体外共培养，培养14天后，得到三维的微球-细胞复合体(如图2所示，明胶微球与细胞共培养3天后，形成一个整体)；
其中，利用油包水(W/O)乳液法制备明胶微球，其粒径主要集中在100-200μm(如图1中的A、B所示)，明胶微球具有酶降解性能(如图1中的C所示)；明胶微球在蛋白酶溶液中2天内可以完全降解，表明其具有良好的生物可降解性。
酶降解性能的检测方法为：将1g明胶微球分散于5ml的蛋白酶溶液(200μg/mL)，定期离心后称量剩余明胶微球重量，计算微球的剩余量。
共培养的条件为：将每1g明胶微球加入到含有5×106个软骨细胞的1ml细胞培养基中，用移液器吹打均匀，得到微球/细胞共悬液，100μl/孔共悬液加入到24孔板的每个孔中；
(2)将微球-细胞复合体放入0.2％EDTA-0.7％Tris(pH 8.0)的EDTA-Tris溶液，震荡48小时，期间每隔12小时换液1次；
(3)然后用1％的Triton-100溶液继续处理，震荡48小时，期间每隔12小时换液1次；
(4)用磷酸盐缓冲液浸泡48小时，期间每隔12小时换液一次；
(5)用DNA酶溶液(10U/ml)和RNA酶溶液(10U/ml)，37℃处理24小时；
(6)用无菌去离子水冲洗48小时，每隔12小时换液一次，然后弃掉去离子水，放入-80℃冰箱内保存备用。
实施例2
本实施例提供了一种诱导组织再生的细胞外基质支架，与实施例1的不同之处在于，使用聚乳酸微球替换明胶微球。
实施例3
本实施例提供了一种诱导组织再生的细胞外基质支架，与实施例1的不同之处在于，使用碳酸钙微球替换明胶微球。
实施例4
本实施例提供了一种诱导组织再生的细胞外基质支架，与实施例1的不同之处在于，使用成纤维细胞替换软骨细胞。
实施例5
本实施例提供了一种诱导骨缺损修复的细胞外基质支架，与实施例1的不同之处在于，使用成骨细胞来源的细胞外基质替换软骨细胞来源。
实施例6
本实施例提供了一种诱导骨缺损修复的细胞外基质支架，与实施例1的不同之处在于，使用聚乳酸微球和碳酸钙微球的混合物替换明胶微球，其中聚乳酸微球和碳酸钙微球的质量比为1:1。
实施例7
本实施例提供了一种诱导骨缺损修复的细胞外基质支架，与实施例1的不同之处在于，共培养的时间为28天。
对比例1
本对比例提供了一种细胞外基质支架，与实施例1的不同之处在于，软骨细胞三维包覆于明胶水凝胶支架。
该细胞外基质支架通过如下方法制备得到：
(1)将包覆软骨细胞的明胶水凝胶(水凝胶-软骨细胞复合体)进行体外培养，培养14天(如图二所示)；
(2)将水凝胶-软骨细胞复合体放入0.2％EDTA-0.7％Tris(pH 8.0)溶液，震荡48小时，期间每隔12小时换液1次；
(3)然后用1％的Triton-100溶液继续处理，震荡48小时，期间每隔12小时换液1次；
(4)用磷酸盐缓冲液浸泡48小时，期间每隔12小时换液一次；
(5)用DNA酶溶液(10U/ml)和RNA酶溶液(10U/ml)，37℃处理24小时；
(6)用无菌去离子水冲洗48小时，每隔12小时换液一次，然后弃掉去离子水，放入-80℃冰箱内保存备用。
对比例2
本对比例提供了一种细胞外基质支架，与实施例1的不同之处在于，软骨细胞种植于明胶多孔海绵支架。
该细胞外基质支架通过如下方法制备得到：
(1)将软骨细胞种植于明胶多孔海绵(多孔海绵-软骨细胞复合体)进行体外培养，培养14天；
(2)将多孔海绵-软骨细胞复合体放入0.2％EDTA-0.7％Tris(pH 8.0)溶液，震荡48小时，期间每隔12小时换液1次；
(3)然后用1％的Triton-100溶液继续处理，震荡48小时，期间每隔12小时换液1次；
(4)用磷酸盐缓冲液浸泡48小时，期间每隔12小时换液一次；
(5)用DNA酶溶液(10U/ml)和RNA酶溶液(10U/ml)，37℃处理24小时；
(6)用无菌去离子水冲洗48小时，每隔12小时换液一次，然后弃掉去离子水，放入-80℃冰箱内保存备用。
对比例3
本对比例提供了一种细胞外基质支架，与对比例1的不同之处在于，软骨细胞种植于聚乳酸多孔支架。
该细胞外基质支架通过如下方法制备得到：
(1)将软骨细胞种植于聚乳酸多孔支架(聚乳酸多孔支架-软骨细胞复合体)进行体外培养，培养14天；
(2)将聚乳酸多孔支架-软骨细胞复合体放入0.2％EDTA-0.7％Tris(pH8.0)溶液，震荡48小时，期间每隔12小时换液1次；
(3)然后用1％的Triton-100溶液继续处理，震荡48小时，期间每隔12小时换液1次；
(4)用磷酸盐缓冲液浸泡48小时，期间每隔12小时换液一次；
(5)用DNA酶溶液(10U/ml)和RNA酶溶液(10U/ml)，37℃处理24小时；
(6)用无菌去离子水冲洗48小时，每隔12小时换液一次，然后弃掉去离子水，放入-80℃冰箱内保存备用。
对比例4
本对比例提供了一种细胞外基质支架，与对比例1的不同之处在于，成纤维细胞三维包覆于明胶水凝胶支架。
实验例
本实验例以实施例1-7和对比例1和/或对比例2为例，进行了该诱导组织再生的细胞外基质支架的表征及应用验证：
(1)活/死细胞染色：在培养过程中，利用活/死细胞染色试剂(Calcein-AM/PI)盒对明胶微球-细胞复合体进行染色，观察细胞存活，如图3所示，随着培养时间的延长，明胶微球与软骨细胞共培养过程中，软骨细胞逐渐将明胶微球“粘合”成为一个整体，活细胞的比例越来越高，而且培养14天后表现出极高的细胞存活率，表明微球材料有利于细胞的存活，为促进细胞外基质的分泌奠定了基础。
(2)骨基质的免疫荧光染色：明胶微球-细胞复合体进行多聚甲醛固定并切片，然后进行骨桥蛋白(osteopontin,OPN)和骨钙素(osteocalcin,OCN)的免疫荧光染色，如图4所示，OPN和OCN均匀分布于整个微球-细胞复合体，说明此复合体中的软骨细胞已向成骨细胞表型分化，而且分泌的骨基质能够均匀分布于整个复合体。而对比例1在软骨细胞-水凝胶复合体内OPN和OCN主要分布于水凝胶支架的边缘部位，说明水凝胶支架内部的软骨细胞难以向成骨细胞分化，而且软骨细胞-水凝胶复合体内骨基质的分泌量较低且不均匀。与水凝胶支架相比，明胶微球支架能够明显促进软骨细胞向成骨细胞分化并分泌骨桥蛋白和骨钙素，有利于生物活性细胞外基质支架的构建。
(3)颅骨缺损模型的建立和修复：将明胶微球-细胞复合体进行脱细胞处理，得到诱导组织再生的细胞外基质支架，即活性支架(图5A和图5B)，随后将其植入大鼠颅骨缺损处，考察其骨缺损修复能力。同时，将对比例1提供的软骨细胞-水凝胶复合体及对比例2提供的多孔海绵-软骨细胞复合体进行脱细胞处理并植入大鼠颅骨缺损处。
CT检测骨缺损修复：将上述微球-细胞复合体，软骨细胞-水凝胶复合体及多孔海绵-软骨细胞复合体，进行脱细胞处理得到的脱细胞支架植入颅骨缺损90天后分别利用电子计算机断层扫描(CT)检测骨形成，如图6所示，微球-细胞复合体脱细胞处理得到的诱导组织再生的细胞外基质支架(活性支架)明显促进颅骨缺损修复，而对比例1的基于软骨细胞-水凝胶复合体和对比例2的多孔海绵-软骨细胞复合体的脱细胞支架材料分别植入90天无法实现大鼠颅骨缺损的修复。
(4)股骨缺损模型的建立和修复：按照实施例2制备了聚乳酸微球-细胞复合体(活性支架组)并进行脱细胞处理，得到诱导组织再生的细胞外基质支架，将其植入大鼠股骨缺陷考察其骨缺损修复能力。同时，将对比例3提供的聚乳酸多孔支架-软骨细胞复合体(多孔支架组)进行脱细胞处理并植入大鼠股骨缺损处。如图7所示，聚乳酸微球-细胞复合体脱细胞处理得到的细胞外基质支架明显促进股骨缺损修复。
(5)皮肤缺损模型的建立和修复：按照实施例4制备了基于明胶微球-成纤维细胞复合体和明胶水凝胶-成纤维细胞复合体(活性支架组)，进行脱细胞处理后分别植入小鼠缺损模型，30天后分别利用苏木精-伊红(HE)染色检测皮肤修复效果。如图8A和8B所示，与对比例4提供的明胶水凝胶-成纤维细胞复合体相比(水凝胶组)，微球-细胞复合体脱细胞处理得到的细胞外基质支架更加促进皮肤缺损修复。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种诱导组织再生的细胞外基质支架，其特征在于，包括微球及复合于所述微球的细胞外基质。
2.据权利要求1所述的诱导组织再生的细胞外基质支架，其特征在于，所述微球的直径为1～500μm。
3.根据权利要求2所述的诱导组织再生的细胞外基质支架，其特征在于，所述微球包括蛋白基微球、聚酯基微球、聚乙烯基微球、聚苯乙烯基微球、无机材料基微球或天然微球形状的物质中的至少一种；
可选地，所述蛋白基微球包括明胶微球、胶原微球或纤维蛋白微球；
可选地，所述聚酯基微球包括聚乳酸微球、聚碳酸酯微球或聚己内酯微球；
可选地，所述无机材料基微球包括二氧化硅微球、碳酸钙或磷酸钙；
可选地，所述天然微球形状的物质包括酵母细胞。
4.根据权利要求1所述的诱导组织再生的细胞外基质支架，其特征在于，所述细胞外基质来源于软骨细胞、干细胞、成纤维细胞、上皮细胞、基质细胞、成骨细胞或基因修饰细胞中的至少一种。
5.权利要求1-4任一项所述的诱导组织再生的细胞外基质支架的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将微球与细胞进行体外或体内共培养，得到三维的微球-细胞复合体；
(2)对所述微球-细胞复合体进行脱细胞处理，得到所述诱导组织再生的细胞外基质支架。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，共培养的时间大于3天；
优选地，所述微球为细胞粘附性微球。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述脱细胞处理包括：依次用细胞裂解液、磷酸盐缓冲液、核酸酶溶液处理微球-细胞复合体，清洗后得到所述诱导组织再生的细胞外基质支架。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述细胞裂解液处理包括(1)将所述微球-细胞复合体置于EDTA-Tris溶液或十二烷基硫酸钠溶液中震荡处理，以及(2)将(1)处理后的复合体置于Triton-100溶液中震荡处理；
优选地，所述磷酸盐缓冲液处理包括置于磷酸盐缓冲液中浸泡；
优选地，所述核酸酶包括DNA酶和RNA酶，所述核酸酶处理包括置于核酸酶溶液中浸泡；
优选地，所述清洗包括使用无菌去离子水冲洗。
9.根据权利要求5-8任一项所述的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(a)将微球-细胞复合体放入EDTA-Tris溶液或十二烷基硫酸钠溶液，震荡48小时，期间每隔12小时换液1次；
(b)然后用1％的Triton-100溶液继续处理，震荡48小时，期间每隔12小时换液1次；
(c)用磷酸盐缓冲液浸泡48小时，期间每隔12小时换液一次；
(d)用核酸酶溶液，37℃处理24小时；
(e)用无菌去离子水冲洗48小时，每隔12小时换液一次，然后弃掉去离子水，放入-80℃冰箱内保存备用。
10.权利要求1-4任一项所述的诱导组织再生的细胞外基质支架在制备促进组织修复的产品中的应用；
优选地，所述组织包括骨、软骨、皮肤、肌肉、韧带或肌腱。
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