CN102696575B - 一种贴壁培养的细胞的冷冻保存方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种贴壁培养的细胞的冷冻保存方法。该方法直接在细胞培养瓶内加入冷冻液，然后将培养瓶逐步降温，最后放入超低温冰箱中保存，可保存2-3个月，待培养条件许可时解冻细胞，继续培养。本发明冷冻与解冻步骤简单、快速，省却传统冷冻方法中的细胞消化、离心等步骤，大大降低了细胞污染以及对细胞活性的损伤；冷冻时不受细胞贴壁程度的影响（20-30%即可），打破了传统冷冻对细胞数量的限制，非常适用于应对实验室中突发情况可能对细胞培养造成的毁灭性损失；不需要购买细胞冻存管，直接利用原培养瓶冷冻，解冻后细胞也不需接种到新的培养瓶，而是在原培养瓶内加入培养液继续培养，大大节省了试验费用。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物冷冻保存技术，具体是一种贴壁培养的细胞的冷冻保存方法。
背景技术
随着生物技术的快速发展，细胞培养技术已经广泛应用于生物学、医学、新药研发等各个领域，成为科研或生产中不可或缺的技术手段。实验室一般安排专人进行细胞培养工作，以期提供生长形态良好、遗传稳定的细胞用于后续试验研究。然而细胞长期体外培养会造成细胞的生长与形态等发生退变或转化，细胞失去原有的遗传特性；有时还会由于细胞污染而造成传代中断，种质细胞丢失。因此，在实际工作中通常利用冷冻方法保存细胞。
细胞在培养过程中，按照生长方式分为贴壁生长和悬浮生长两种，其中大部分细胞是贴壁生长的。贴壁培养的细胞的传统冷冻方法一般是先将贴壁的细胞消化下来，然后收集细胞消化液并离心，之后去除上清加入冷冻液，放入冻存管中逐步降温，最后放入液氮中长期保存（程金华等，2006）。这种方法用于种质细胞资源的长期保存非常成功，保存时间可长达十几、甚至二十几年，细胞解冻后依然有活力（Huang et al.,2010）。但是传统冷冻保存要求：细胞必须生长良好且存活率高（即为对数生长期），这时有80-90%细胞贴壁，数量在106以上。然而在实际工作中有时会遇到临时断电、培养箱出现问题或试验计划有变动等突发情况，这时细胞贴壁还未满80-90%，达不到传统冷冻保存所需的细胞数量；然而细胞又比较珍贵，丢弃非常可惜甚至永远丧失这一种质资源。
发明内容
为了克服传统冷冻方法存在的技术缺陷，尽最大可能保存种质细胞资源，本发明提供了一种贴壁培养的细胞的冷冻保存方法。该方法直接在细胞培养瓶内加入冷冻液，然后将培养瓶逐步降温，最后放入超低温冰箱（-80℃）中保存，待培养条件许可时解冻细胞，继续培养。
本发明的技术方案是：一种贴壁培养的细胞的冷冻保存方法，其特征是，
（1）2×冷冻液
将14-20份二甲基亚砜（DMSO）、2-6份Supercool X-1000、20-40份胎牛血清（FBS）溶解在35-45份DMEM/F12液中，之后分装到灭菌的1.5毫升离心管中，每管0.5-1.0毫升，放置4℃保存；上述份数均为体积份数；
注：本发明所用试剂除Supercool X-1000购自21st Century Medicine公司外，其余试剂均可购自Sigma、Gibco或Roche公司等。
（2）冷冻前2×冷冻液、新鲜的细胞培养液添加量
表1冷冻前2×冷冻液、新鲜的细胞培养液添加量与培养瓶型号对应表
注：本发明所用培养瓶均购自Nunc、Corning或BD Falcon公司等，可耐-80℃低温冷冻，解冻后不变形、不碎裂。
（3）解冻后细胞培养液添加量
表2解冻后细胞培养液添加量与培养瓶型号对应表
（4）细胞冷冻与解冻
将培养瓶内细胞培养液吸净，根据培养瓶型号，重新加入新鲜的细胞培养液，然后缓慢加入2×冷冻液，轻轻晃动培养瓶，让细胞培养液与2×冷冻液混匀，渗透进入贴壁细胞质内，之后将培养瓶依次平放在冰箱4℃层30-60分钟，-20℃层30-40分钟，最后放在超低温冰箱（-80℃）中保存，可保存2-3个月。
解冻时，直接将培养瓶从超低温冰箱中取出，在空气中停留3-4秒，然后快速放入37-40℃水浴锅中，轻轻晃动至冷冻液溶解，在超净台内缓慢加入细胞培养液，轻轻晃动培养瓶，让细胞培养液充分稀释冷冻液内有毒试剂DMSO，之后放入培养箱内培养。
本发明的有益效果是：（1）冷冻与解冻步骤简单、快速，省却传统冷冻方法中的细胞消化、离心等步骤（此两步操作对细胞活性损伤很大，因此需要细胞贴壁80-90%，否则会因细胞数量不够，造成解冻后细胞不易存活）。（2）冷冻时对细胞贴壁程度的要求低（20-30%即可），打破了传统冷冻对细胞数量的限制，非常适用于应对实验室中突发情况可能对细胞培养造成的毁灭性损失。（3）不需要购买细胞冻存管，直接利用原培养瓶冷冻，解冻后细胞也不需接种到新的培养瓶，而是在原培养瓶内加入培养液继续培养，大大节省了试验费用。
附图说明
图1为实施例1的细胞冷冻保存前和解冻后的细胞贴壁生长图片，其中1-A为细胞冷冻保存前的细胞贴壁生长图片，1-B为细胞解冻后培养一段时间后的细胞贴壁生长图片。
图2为实施例2的细胞冷冻保存前和解冻后的细胞贴壁生长图片，其中2-A为细胞冷冻保存前的细胞贴壁生长图片，2-B为细胞解冻后培养一段时间后的细 胞贴壁生长图片。
具体实施方式
实施例1和实施例2的细胞培养液均为添加10%（V/V）FBS的DMEM/F12液。所用试剂除Supercool X-1000购自21st Century Medicine公司外，其余试剂均可购自Sigma。所用培养瓶均购自Nunc公司，可耐-80℃低温冷冻，解冻后不变形、不碎裂。
实施例1
2011年10月27日，体外培养纯种荷斯坦奶牛乳腺细胞，18小时后30-40%细胞贴壁生长（图1-A，100×），这时接到供电公司通知大约6小时后断电，为了保存这批珍贵的种质资源，我们进行了冷冻保存处理。
1、2×冷冻液配制
将2毫升DMSO、4毫升FBS、0.4毫升Supercool X-1000溶解在3.6毫升DMEM/F12液中，之后分装到灭菌的1.5毫升离心管中，每管0.5毫升。
2、细胞冷冻保存
首先将T25培养瓶内细胞培养液吸净，重新加入0.5毫升新鲜的细胞培养液，然后缓慢加入0.5毫升2×冷冻液，轻轻晃动培养瓶1-2秒，之后将培养瓶平放在冰箱4℃层40分钟，平放在-20℃层30分钟，最后放在超低温冰箱（-80℃）中。
3、细胞解冻
2011年11月18日，即培养瓶在超低温冰箱放置约19天后，解冻细胞。解冻时，直接将培养瓶从超低温冰箱中取出，在空气中停留3-4秒，然后快速放入39℃水浴锅中，轻轻晃动至冷冻液溶解（约1分钟），之后在超净台内缓慢加入10毫升细胞培养液，轻轻晃动培养瓶1-2秒，最后将培养瓶放入培养箱内，10-12小时后10-15%的细胞重新贴壁，这时去掉旧培养液，换入新鲜培养液继续培养。 继续培养48小时后培养瓶内50-60%细胞贴壁，这时去掉旧培养液，换入新鲜培养液，再继续培养。继续培养24小时后80-90%细胞贴壁（图1-B，100×），表明细胞恢复生长，可正常传代用于后续试验。
实施例2
2011年12月8日，利用组织块法体外培养纯种安格斯牛皮下脂肪细胞，4天后20-30%细胞游离出来贴壁生长（图2-A，100×），这时二氧化碳培养箱出现报警信号，显示二氧化碳气体浓度不够，换气后问题也没有解决，我们怀疑培养箱内部有问题，需要修理。为了保存这批珍贵的种质资源，我们进行了冷冻保存处理。
1、2×冷冻液配制
将1.8毫升DMSO、3.6毫升FBS、0.6毫升Supercool X-1000溶解在4.0毫升DMEM/F12中，之后分装到灭菌的1.5毫升离心管中，每管0.5毫升。
2、细胞冷冻保存
首先将T25培养瓶内细胞培养液吸净，重新加入0.5毫升新鲜的细胞培养液，然后缓慢加入0.5毫升2×冷冻液，轻轻晃动培养瓶1-2秒，之后将培养瓶平放在冰箱4℃层30分钟，平放在-20℃层30分钟，最后放在超低温冰箱（-80℃）中。
3、细胞解冻
2012年1月30日，即培养瓶在超低温冰箱放置约51天后，解冻细胞。解冻时，直接将培养瓶从超低温冰箱中取出，在空气中停留3-4秒，然后快速放入40℃水浴锅中，轻轻晃动至冷冻液溶解（约1分钟），之后在超净台内缓慢加入10毫升细胞培养液，轻轻晃动培养瓶1-2秒，最后将培养瓶放入培养箱内，14-16小时后15-20%的细胞重新贴壁，这时去掉旧培养液，换入新鲜培养液继续培养。继续培养48小时后培养瓶内40-50%细胞贴壁，这时去掉旧培养液，换入新鲜培 养液，再继续培养。继续培养48小时后80-90%细胞贴壁（图2-B，100×），表明细胞生长正常，可传代培养用于后续试验。
参考文献
1、程金华,朱化彬,孙秀柱等.冷冻保护剂和胎牛血清对牛成纤维细胞冷冻效果的影响.繁殖与生理,2006,42(21):12-14.
2、Huang YZ,Shen JL,Gong LZ,et al.In vitro activity of human bone marrow cells after cryopreservation in liquid nitrogen for 21-25years.Zhong guo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi.2010;18(1):224-229。
Claims (2)
1.一种贴壁培养的细胞的冷冻保存方法，其特征是，将培养瓶内细胞培养液吸净，根据培养瓶型号，重新加入新鲜的细胞培养液，然后加入2×冷冻液，轻轻晃动培养瓶，让细胞培养液与2×冷冻液混匀，渗透进入贴壁细胞质内，之后将培养瓶依次平放在冰箱4℃层30-60分钟，-20℃层30-40分钟，最后放在-80℃的超低温冰箱中保存；
所述2×冷冻液为：将14-20份二甲基亚砜、2-6份Supercool X-1000、20-40份胎牛血清溶解在35-45份DMEM/F12液中，之后分装到灭菌的1.5毫升离心管中，每管0.5-1.0毫升，放置4℃保存；上述份数均为体积份数；
所述冷冻前T25型培养瓶的2×冷冻液、新鲜细胞培养液添加量均为0.5ml；T75型培养瓶的2×冷冻液、新鲜细胞培养液添加量均为1.5ml。
2.采用权利要求1所述冷冻保存方法保存的细胞的解冻方法，其特征是，解冻时，直接将培养瓶从超低温冰箱中取出，在空气中停留3-4秒，然后快速放入37-40℃水浴锅中，轻轻晃动至冷冻液溶解，在超净台内加入细胞培养液，轻轻晃动培养瓶，让细胞培养液充分稀释冷冻液内二甲基亚砜，之后放入培养箱内培养。
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