CN110592001A - 一种输卵管上皮细胞的纯化培养体系 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种输卵管上皮细胞的纯化培养体系，包括上皮细胞促贴壁试剂和完全培养基，所述上皮细胞促贴壁试剂由人类间充质干细胞促贴壁试剂与1640基础培养基以1:99的体积比混合而成；所述完全培养基包括：上皮细胞无血清培养基、Ultra GROTM–Advanced、谷胱苷肽、乳糖醛酸、左氧氟沙星。本发明选用了上皮细胞无血清培养基和人上皮细胞促贴壁试剂联合使用，进一步的限制的内皮细胞和纤维细胞的贴壁，起到了细胞纯化作用；此外，还添加了1～2％谷胱苷肽和5～15％乳糖醛酸，避免了细胞在体外培养过程中出现分化，使得人输卵管上皮细胞这类型较为成熟的细胞能够保持原有的性质，迅速分裂增殖，细胞纯度高，质量均一，数量充足。

Description

一种输卵管上皮细胞的纯化培养体系
技术领域
本发明涉及一种生物培养技术，具体是一种输卵管上皮细胞的纯化培养体系。
背景技术
胚胎早期发育过程在输卵管中进行，与输卵管微环境相互作用，并按其特定的程序逐渐发生。因此输卵管在人类生殖过程中占有重要的地位。输卵管上皮细胞的形态及功能研究已成为生殖医学领域的一个研究热点，但对妊娠早期输卵管的功能的研究尚不完全，在体外的研究又受到较大的限制，而输卵管上皮细胞体外培养是一种理想的研究模型。
目前，输卵管上皮细胞的组织来源多为输卵管伞部组织，常用方法为机械剪取和酶消化法获取上皮细胞，同时结合自然沉降差速贴壁法来初步纯化细胞，该细胞群含有多种类型的细胞：成纤维细胞、间质细胞。因此，该操作步骤仍不可避免混入部分人纤维细胞，所获得的细胞纯度低，不利于“目标”细胞的后续纯化。现有的输卵管细胞分离后，直接接种，细胞团中含有大量的红细胞，影响目标细胞的贴壁。此外，输卵管上皮细胞在体外培养P3-P5代时，细胞便出现包浆空泡及颗粒状物质增多等分化现象，随着细胞培养代次的增加，成纤维细胞的增殖优势明显，所获得的细胞群中含有大量的纤维细胞，从而导致输卵管上皮细胞培养失败。因此，需进一步的改进输卵管上皮细胞的培养体系，利于细胞纯化和大规模扩增；故需要开发出一种新型的培养体系，仅适用于输卵管上皮细胞的生长，迫在眉睫。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种输卵管上皮细胞的纯化培养体系。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种输卵管上皮细胞的纯化培养体系，包括上皮细胞促贴壁试剂和完全培养基，所述上皮细胞促贴壁试剂由人类间充质干细胞促贴壁试剂与1640基础培养基以1:99的体积比混合而成；所述完全培养基包括：上皮细胞无血清培养基、Ultra GROTM–Advanced、谷胱苷肽、乳糖醛酸、左氧氟沙星，其中上皮细胞促贴壁试剂与完全培养基的体积比为1:2。
优选地，所述Ultra GROTM–Advanced的浓度为5～10％、谷胱苷肽的浓度为1～2％、乳糖醛酸的浓度为5～15％、左氧氟沙星的浓度为1×。
本发明还提供了一种输卵管上皮细胞的纯化培养方法，包括以下步骤：
(1)取宫外孕病人的正常输卵管组织，将剪开的输卵管内膜放入含有碱性磷酸酶和胶原酶Ι的消化液进行消化；
(2)在上述消化液中加入浓度为10％的血清，离心，弃上清，再用含血清的培养液漂洗离心收集的细胞；
(3)在上述细胞中加入所述输卵管上皮细胞的纯化培养体系制成细胞悬液，调整细胞浓度并接种于培养瓶中，置于37℃、5％CO2的恒温箱中培养，每3～4天换一次培养液。
(4)采用免疫荧光检测获得的输卵管上皮细胞细的标志物胞角蛋白-17(CK-17)。
优选地，所述步骤(2)中消化液中碱性磷酸酶和胶原酶Ι的浓度分别为0.25％和0.125％。
优选地，所述步骤(2)中消化液消化的温度为37℃，消化时间为0.5小时。
优选地，所述步骤(3)中细胞浓度为1×105个/mL。
本发明的有益效果：本发明选用了上皮细胞无血清培养基和人上皮细胞促贴壁试剂联合使用，进一步的限制的内皮细胞和纤维细胞的贴壁，起到了细胞纯化作用；同时以UltraGROTM-Advanced替代胎牛血清，避免了牛源性病毒污染。此外，还添加了1～2％谷胱苷肽和5～15％乳糖醛酸，避免了细胞在体外培养过程中出现分化，使得人输卵管上皮细胞这类型较为成熟的细胞能够保持原有的性质，迅速分裂增殖，细胞纯度高，质量均一，数量充足。另外培养体系中使用添加的5～10％UltraGROTM–Advanced、1～2％谷胱苷肽和5～15％乳糖醛酸联合使用，能很好的适应上皮细胞的生长，全方位的补充营养成分，使得细胞能在体外快速分裂增殖，克服了分化程度较高的输卵管上皮细胞体外培养易于分化的缺点。
附图说明
图1为本发明体外培养输卵管上皮细胞的流程示意图。
图2为人输卵管上皮细胞示意图。
图3为人输卵管上皮细胞免疫荧光染色结果示意图。
图4为不同培养体系的人输卵管上皮细胞生长曲线。
具体实施方式
为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例及其附图对本发明做进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供一种输卵管上皮细胞的纯化培养方法，包括以下步骤：
(1)取25-40岁宫外孕病人的正常输卵管组织，无菌条件下，在培养皿中纵向剖开输卵管，曝露粘膜面，尽量洗尽血污；用锐利的弯头剪剪下粘膜(尽量避开粘膜下组织)，把剪开的输卵管展平，内膜朝上，将其放入含有0.25％碱性磷酸酶和0.125％胶原酶Ι的消化液进行消化；液面浸过内膜面，37℃温箱内分别消化0.5小时，消化过程中要吹打内膜数次使内膜充分消化。
(2)直接在上述消化液中加入浓度为10％的血清，800r/min离心10分钟，弃上清，再用含血清的培养液漂洗离心收集的细胞1次；
(3)在上述细胞中加入所述输卵管上皮细胞的纯化培养体系制成细胞悬液，经台盼蓝染色行细胞计数，调整细胞浓度为1×105个/mL并接种于一次性的培养瓶，置于37℃、5％CO2的恒温箱中培养，每3～4天换一次培养液。
(4)将上述获得的输卵管上皮细胞制成1×106个/mL的细胞悬液，分别取抗人CD34、CD31单克隆抗体5μL，加入细胞悬液500μL，室温下避光孵育20min，同时设立空白同型对照，1500r/min离心5min，弃上清，用含10％FBS的PBS洗涤2遍，用500μL PBS重悬后上机检测。
实施例1～3与对比例1、2中出培养体系的配方表
注：1×左氧氟沙星表示，左氧氟沙星的终浓度为1×。
上皮细胞无血清培养基(Epitheial Cell Culture Medium)购买于普瑞麦迪(北京)实验室技术有限公司，货号：CnT-PR；UltraGROTM-Advanced购买于微科生物科技有限公司，货号：HPCFDCRL01，Lot：69HF08。人类间充质干细胞促贴壁试剂购买于上海微科生物科技有限公司，品牌：BI，货号05-752-1F。
将上述实施例和对比例制备的输卵管上皮细胞进行检测，检测方法如下：
1、通过倒置显微镜观察，显示输卵管上皮细胞生长方式为贴壁生长，细胞形态为上皮样，多角形细胞，如图2所示。
2、通过免疫荧光检测输卵管上皮细胞角蛋白-17(CK-17)免疫荧光染色为阳性，如图3所示，经鉴定细胞纯度高于90％。
3、通过安全性检测均未检测出病毒和细菌、酵母以及真菌，结果见下表：
检测项目 HIV-1 HBV HCV 支原体 细菌 酵母 真菌
结果 阴性 阴性 阴性 阴性 阴性 阴性 阴性
4、通过检测卵管上皮细胞的生长曲线，发现采用本实施例1的培养体系获得卵管上皮细胞的生长活性最佳，结果如图4所示。从图4可知：
对比例1的细胞增值曲线平缓，在整个培养周期中，从第6天开始出现一定数量的细胞增殖；
对比例2细胞潜伏期为4天，与组别1相比，细胞增殖第2-4天时，具有显著性差异P<0.05，第4天后，细胞增殖均具有极显著性差异。
实施例1细胞潜伏期为2天，与组别1相比，细胞增殖第2-4天时，具有显著性差异P<0.05，第4天后，细胞增殖均具有极显著性差异。
对比例2和实施例1相比，实施例1的潜伏期更短，且细胞增殖更快；故实施例1优于对比例2。
综上所述：本发明的最优方案：上皮细胞无血清培养基(Epitheial Cell CultureMedium)+1～2％谷胱苷肽+5～15％乳糖醛酸+1×左氧氟沙星。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (6)

1.一种输卵管上皮细胞的纯化培养体系，其特征在于，包括上皮细胞促贴壁试剂和完全培养基，所述上皮细胞促贴壁试剂由人类间充质干细胞促贴壁试剂与1640基础培养基以1:99的体积比混合而成；所述完全培养基包括：上皮细胞无血清培养基、Ultra GROTM–Advanced、谷胱苷肽、乳糖醛酸、左氧氟沙星其中上皮细胞促贴壁试剂与完全培养基的体积比为1：2。
2.如权利要求1所述的输卵管上皮细胞的纯化培养体系，其特征在于，所述UltraGROTM–Advanced的浓度为5～10％、谷胱苷肽的浓度为1～2％、乳糖醛酸的浓度为5～15％、左氧氟沙星的浓度为1×。
3.一种输卵管上皮细胞的纯化培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取宫外孕病人的正常输卵管组织，将剪开的输卵管内膜放入含有碱性磷酸酶和胶原酶Ι的消化液进行消化；
(2)在上述消化液中加入浓度为10％的血清，离心，弃上清，再用含血清的培养液漂洗离心收集的细胞；
(3)在上述细胞中加入所述输卵管上皮细胞的纯化培养体系制成细胞悬液，调整细胞浓度并接种于培养瓶中，置于37℃、5％CO2的恒温箱中培养，每3～4天换一次培养液。
(4)采用免疫荧光检测获得的输卵管上皮细胞细的标志物胞角蛋白-17(CK-17)。
4.如权利要求3所述的输卵管上皮细胞的纯化培养方法，其特征在于，所述步骤(2)中消化液中碱性磷酸酶和胶原酶Ι的浓度分别为0.25％和0.125％。
5.如权利要求3所述的输卵管上皮细胞的纯化培养方法，其特征在于，所述步骤(2)中消化液消化的温度为37℃，消化时间为0.5小时。
6.如权利要求3所述的输卵管上皮细胞的纯化培养方法，其特征在于，所述步骤(3)中细胞浓度为1×105个/mL。
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