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Abstract

本发明公开了角蛋白1在异位妊娠中的应用和产品，属于生物技术和临床医学检测技术领域。在本发明中，以角蛋白1作为检测指标，并应用于制备检测异位妊娠的产品中；产品包括用于检测角蛋白1浓度的试剂；本产品具有灵敏度高、特异性高、准确度高、精确度高、操作简单及能批量快速检测等特点。

Description

角蛋白1在异位妊娠中的应用和产品
技术领域
本发明涉及角蛋白1在异位妊娠中的应用和产品，尤其涉及以角蛋白1为检测指标并在异位妊娠中的应用和产品，属于生物技术和临床医学检测技术领域。
背景技术
异位妊娠，俗称“宫外孕”，是指受精卵种植并发育在子宫体腔以外的器官或组织，例如：输卵管、卵巢、腹腔、子宫颈、子宫角、阔韧带或剖宫产瘢痕部位等，其中，输卵管妊娠最为常见，约占95%。
异位妊娠是妇产科常见的急腹症，发病率为2-3%，是早期妊娠孕妇死亡的主要原因，其中，异位妊娠的典型临床表现为停经、腹痛和阴道流血。目前，临床上主要的辅助检查手段包括血HCG测定和超声检查，但由于血HCG浓度随孕周变化而不断变化，因此无法成为独立预测指标；而超声检查虽然有助于明确异位妊娠的部位和大小，但却无法发现早期肿块较小的异位妊娠。
CN109971847A中公开了Calponin-h2作为诊断异位妊娠的标记物的应用，其中，揭示了CNN2可以作为异位妊娠早期诊断的特异性血清标记物，提高异位妊娠的早期诊断率。
发明内容
发明人在长期的研究中发现，正常怀孕女性子宫腔内角蛋白1浓度显著低于异位妊娠女性子宫腔内角蛋白1浓度，因此，基于这一研究结果，角蛋白1可作为异位妊娠的诊断指标并应用于的检测产品中。
本发明针对现有技术的不足，而提出了角蛋白1在异位妊娠中的应用和产品。在本技术方案中，以角蛋白1为检测指标，通过定量的检测角蛋白1浓度，从而准确的判断异位妊娠，完成异位妊娠确诊和治疗的前期工作。
为了实现上述技术目的，提出如下的技术方案：
本发明首次将角蛋白1作为检测指标，特定的应用于异位妊娠检测的产品中，通过定量检测受试者的角蛋白1浓度，而作为异位妊娠检测的依据。
进一步的，所述检测是针对受试者的生物样本进行，生物样本选自血清或血浆或全血。
进一步的，所述生物样本来自怀孕4周以上的女性。
进一步的，所述用于检测角蛋白1指标的试剂是用于在蛋白水平上检测角蛋白1的试剂。
进一步的，所述产品以检测生物样本中的角蛋白1浓度为检测指示，当生物样本中的角蛋白1浓度高于或等于28.76pg/mL时，判定生物样本呈阳性，即为异位妊娠；当生物样本中的角蛋白1浓度低于28.76pg/mL时，判定生物样本呈阴性，即为宫内正常早孕。
针对该研究结果，本发明另提出角蛋白1在异位妊娠中应用的产品，所述产品包括用于检测角蛋白1浓度的试剂。
进一步的，所述试剂在蛋白水平上检测角蛋白1浓度的方法包括免疫层析法、免疫荧光分析法、ELISA、生物芯片法及电化学发光法。
进一步的，所述产品包括检测试剂盒，检测试剂盒包括：
（1）包被有鼠抗人角蛋白1单克隆抗体的酶标板；
（2）标记有生物素的兔抗人角蛋白1多克隆抗体检测液；
（3）角蛋白1标准品；
（4）亲和素-辣根过氧化物酶；
（5）显色底物3',3',5,5'-四甲基联苯胺；
（6）标准品稀释液、洗涤缓冲液及终止液。
采用本技术方案，带来的有益技术效果为：
1）在本发明中，基于检测角蛋白1作为检测指标，应用于异位妊娠检测的产品中，实现灵敏度高、特异性高、准确度高、精确度高、操作简单、能批量快速检测等目的；
2）本发明通过研究首次发现，正常怀孕女性子宫腔内角蛋白1浓度显著低于异位妊娠女性子宫腔内角蛋白1浓度，因此，基于这一研究结果，首次将角蛋白1为异位妊娠的检测指标，并应用于检测产品中。目前，尚未发现以血液样本中的角蛋白1作为异位妊娠检测指标的报道，也未发现以血液样本中的角蛋白1为检测指标的检测产品（比如：试剂盒）及其制备方法的相关报道；
3）本发明将检测角蛋白1浓度的试剂用于制备检测异位妊娠的产品，如检测试剂盒等，操作方法简单，以血液为检测样品，可实现快速、批量的检测，角蛋白1可通过现有免疫层析法进行定性粗筛选后，再利用免疫荧光分析法、ELISA、生物芯片法或电化学发光法等方法进行定量浓度的测定，具有高灵敏度、高特异性、高准确度以及高精确度的特点；
4）在本发明中，检测指标角蛋白1在怀孕4周即可出现差异性改变，能够早期为异位妊娠检测提供理论依据；
5）在本发明中，设置检测试剂盒的KRT1浓度检测限为28.76pg/mL，具有高灵敏度（84.38%）和高特异性（80%），进而提高检测产品的可利用性。
附图说明
图1为本发明的实施例4中A450值- KRT1浓度标准曲线。
具体实施方式
下面通过对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例基于“正常怀孕女性子宫腔内角蛋白1浓度显著低于异位妊娠女性子宫腔内角蛋白1浓度”这一研究结果，将角蛋白1作为检测指标，特定的应用于异位妊娠检测的产品中，通过定量检测受试者的角蛋白1浓度，而作为异位妊娠检测的依据。
其中，所涉及检测是针对受试者的生物样本进行，生物样本选自全血；
其中，所涉及生物样本来自怀孕4周以上的女性；
其中，所涉及用于检测角蛋白1指标的试剂是用于在蛋白水平上检测角蛋白1的试剂；
以检测生物样本中的角蛋白1浓度为检测指示，当生物样本中的角蛋白1浓度高于或等于28.76pg/mL时，判定生物样本呈阳性，即为异位妊娠；当生物样本中的角蛋白1浓度低于28.76pg/mL时，判定生物样本呈阴性，即为宫内正常早孕。
实施例2
本实施例基于“正常怀孕女性子宫腔内角蛋白1浓度显著低于异位妊娠女性子宫腔内角蛋白1浓度”这一研究结果，另提出角蛋白1在异位妊娠中应用的产品，该产品包括用于检测角蛋白1浓度的试剂。
其中，试剂在蛋白水平上检测角蛋白1浓度的方法包括免疫层析法、免疫荧光分析法、ELISA、生物芯片法及电化学发光法。
实施例3
本实施例基于实施例1-2，提供一种以角蛋白1为指标的检测试剂盒，具体包括：
（1）包被有鼠抗人角蛋白1单克隆抗体的酶标板；
（2）标记有生物素的兔抗人角蛋白1多克隆抗体检测液；
（3）角蛋白1标准品；
（4）亲和素-辣根过氧化物酶；
（5）显色底物3',3',5,5'-四甲基联苯胺；
（6）标准品稀释液、洗涤缓冲液及终止液。
实施例4
本实施例基于实施例3，以来自四川大学华西第二医院急诊和门诊的七十二个样本为例，对本技术方案做进一步说明，具体包括如下步骤：
一、前处理
标准品（KRT1蛋白标准品，）准备：用标准品稀释液（0.1M PBS，pH7.3-7.4）将KRT1蛋白标准品（购自Abcam公司，ab114282；或，Abbexa公司，abx067601）分别稀释成浓度为10 ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL、1.25ng/mL、0.63ng/mL、0.31ng/mL和0.16ng/mL的标准品稀释液，并依次编号为1-7，即共七个标准品样本；
待测样本准备：以怀孕女性为实验对象，根据现有诊断方法将实验对象分为宫内正常早孕组和异位妊娠组，收集两组怀孕女性的血清样本作为待测样本，共计七十二个，其中，编号1-40待测样本为宫内正常早孕组，编号41-72待测样本为异位妊娠组，血清样本采用现有常规技术提取；
空白对照：仅加入标准品稀释液，作为空白对照。
二、样本检测
A．将检测试剂盒中所有试剂及待测样本取出，缓慢平衡至室温（18-25℃）；
B．分别取100 μL经前处理后的标准品、空白对照和待测样本，分别加入至包被有鼠抗人KRT1单克隆抗体（购自Abcam公司，ab270243；或Abbexa公司，abx173241）的96孔板上的相应加样孔中，各标准品、空白对照和待测样本均设复孔对照；用封板膜封闭96孔板，将96孔板置于37℃孵育1.5小时；
C．孵育结束后，吸尽各加样孔中液体，分别向加样孔中加入100 μL标记有生物素的兔抗人KRT1多克隆抗体（购自Abcam公司ab93652；或，Abbexa公司，abx113333）检测液，用封板膜封闭96孔板，将96孔板置于37℃孵育1.0小时；
D．孵育结束后，吸尽各加样孔中液体，并将该96孔板置于自动洗板机中清洗，其中，自动洗板机上设置如下清洗程序：300 μL/孔洗涤缓冲液（洗涤缓冲液为浓度0.02 mol/L的磷酸盐缓冲液，或者为浓度为0.02 mol/L的Tris缓冲液）清洗三次，每次清洗时，洗涤缓冲液需在各加样孔中浸泡1-2分钟；清洗完毕后，将96孔板的加样孔孔口朝下，置于吸水纸上，除去各加样孔中残留的洗涤缓冲液；
E．向经步骤D处理后的96孔板上的各加样孔中，加入100 μL亲和素-辣根过氧化物酶，用封板膜封闭96孔板，将96孔板置于37℃孵育30分钟；
F．孵育结束后，吸尽各加样孔中的液体，按步骤D中方法清洗该96孔板，清洗五次；
G．向经步骤F处理后的96孔板上的各加样孔中，加入90 μL显色底物3',3',5,5'-四甲基联苯胺至，37℃孵育15分钟；
H．孵育结束后，向96孔板上的各加样孔中分别加入50 μL终止液（终止液为由2 mol/L硫酸与0.1 mol/L亚硫酸钠配制的水溶液）。
I．将经步骤H处理后的96孔板置于酶标仪中，设置波长为450nm，检测各孔内物质的吸光度值（A450值），检测结果见表1-3（其中，A450值为复孔的平均值），空白对照的A450值为0.0804。
Figure 114788DEST_PATH_IMAGE001
Figure DEST_PATH_IMAGE002
Figure 156562DEST_PATH_IMAGE003
根据KRT1蛋白标准品浓度及编号1-7标准品对应的A450值，制作A450值- KRT1浓度标准曲线（如图1所示），得到计算公式：y=1.0385x+0.6428。公式中，x为待测样品的A450值，y为待测样品中KRT1的浓度，x和y呈显著线性关系（R2=0.9993）。
根据各待测样本的A450值，用公式y=1.0385x+0.6428计算KRT1的浓度，待测样本中A450值低于空白对照，KRT1浓度计为0 pg/mL，计算结果见表4-5。
Figure DEST_PATH_IMAGE004
Figure DEST_PATH_IMAGE006
计算表4中编号1-40待测样本的KRT1平均浓度为66.51±175.73 pg/mL，计算表5中编号41-72待测样本的KRT1平均浓度为1112.02±1551.15 pg/mL，两者相比，差异性具有统计学意义（p<0.05）。以上结果表明：宫内正常早孕组中的KRT1平均浓度显著低于异位妊娠组中的KRT1平均浓度。
结合GraphPad Prism 5 Project分析，得出检测试剂盒的KRT1浓度检测限为28.76pg/mL，即待测样本中 KRT1浓度高于或等于28.76pg/mL判定为阳性，即为异位妊娠；KRT1浓度低于28.76pg/mL判定为阴性，即为宫内正常早孕。

Claims (8)

1.角蛋白1在异位妊娠中的应用，其特征在于，包括以角蛋白1作为检测指标在制备检测异位妊娠的产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的角蛋白1在异位妊娠中的应用，其特征在于，所述检测是针对受试者的生物样本进行，生物样本选自血清或血浆或全血。
3.根据权利要求2所述的角蛋白1在异位妊娠中的应用，其特征在于，所述生物样本来自怀孕4周以上的女性。
4.根据权利要求1所述的角蛋白1在异位妊娠中的应用，其特征在于，所述用于检测角蛋白1指标的试剂是用于在蛋白水平上检测角蛋白1的试剂。
5.根据权利要求1-4中任意一项所述的角蛋白1在异位妊娠中的应用，其特征在于，所述产品以检测生物样本中的角蛋白1浓度为检测指示，当生物样本中的角蛋白1浓度高于或等于28.76pg/mL时，判定生物样本呈阳性；当生物样本中的角蛋白1浓度低于28.76pg/mL时，判定生物样本呈阴性。
6.角蛋白1在异位妊娠中应用的产品，其特征在于，包括用于检测角蛋白1浓度的试剂。
7.根据权利要求6所述的角蛋白1在异位妊娠中应用的产品，其特征在于，所述试剂在蛋白水平上检测角蛋白1浓度的方法包括免疫层析法、免疫荧光分析法、ELISA、生物芯片法及电化学发光法。
8.根据权利要求6所述的角蛋白1在异位妊娠中应用的产品，其特征在于，所述产品包括检测试剂盒，检测试剂盒包括：
（1）包被有鼠抗人角蛋白1单克隆抗体的酶标板；
（2）标记有生物素的兔抗人角蛋白1多克隆抗体检测液；
（3）角蛋白1标准品；
（4）亲和素-辣根过氧化物酶；
（5）显色底物3',3',5,5'-四甲基联苯胺；
（6）标准品稀释液、洗涤缓冲液及终止液。
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