CN116515745A - 一种用于女性卵巢早衰生殖修复的干细胞制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及干细胞制备技术领域，尤其涉及一种用于女性卵巢早衰生殖修复的干细胞制备方法。本发明以人体脂肪组织和人体经血为原料，分别制备得到自体脂肪间充质干细胞和子宫内膜间充质干细胞。接着分别进行原代分离培养和传代培养，获得多代培养的自体脂肪间充质干细胞液和自体子宫内膜间充质干细胞液；然后离心处理，得到自体脂肪间充质干细胞上清液；再将自体脂肪间充质干细胞上清液和自体子宫内膜间充质干细胞液合并，进行共培养。通过共培养，以自体脂肪间充质干细胞上清液作为培养基组分，促进子宫内膜间充质干细胞增殖，提高了子宫内膜间充质干细胞的数量，分泌出的营养因子可以延缓衰老，恢复女性卵巢早衰患者的月经，改善更年期症状。
Description
技术领域
本发明涉及干细胞制备技术领域，尤其涉及一种用于女性卵巢早衰生殖修复的干细胞制备方法。
背景技术
人体的衰老与干细胞相对数量不足或活性不足有关。女性的衰老与卵巢衰老密切相关。随着年龄的增长，卵巢逐渐衰老，这种趋势导致卵巢结构受损，功能衰退，导致一系列卵巢相关疾病和症状的发生。干细胞具有再生修复衰老或受损的卵巢结构，恢复卵巢的生殖和内分泌功能，从而起到永葆青春，健康长寿的作用。
近年来，日本科学家Hida在女性经血中发现了具有多向分化潜能的干细胞，该干细胞可用于修复受损的心肌组织。2008年，美国科学家Patel等发现，从健康女性经血中可分离出来间充质干细胞，这些细胞具有多向分化能力。且该干细胞的制备对人体损伤小，不具有伦理道德和法律问题。因此更多人想将其应用与女性卵巢早衰生殖修复中。但人体经血立体后，存在活性降低的问题，导致子宫内膜间充质干细胞增殖困难。
发明内容
针对背景技术中存在的问题，提出一种用于女性卵巢早衰生殖修复的干细胞制备方法。通过共培养，以自体脂肪间充质干细胞上清液作为培养基组分，促进子宫内膜间充质干细胞增殖，保证子宫内膜间充质干细胞的活力，提高了子宫内膜间充质干细胞的数量，分泌出的营养因子可以延缓衰老，恢复女性卵巢早衰患者的月经，改善更年期症。
本发明提出一种用于女性卵巢早衰生殖修复的干细胞制备方法，首先以人体脂肪组织和人体经血为原料，分别制备得到自体脂肪间充质干细胞和子宫内膜间充质干细胞；接着对自体脂肪间充质干细胞和自体子宫内膜间充质干细胞分别进行原代分离培养和传代培养，获得多代培养的自体脂肪间充质干细胞液和自体子宫内膜间充质干细胞液；然后将多代培养的自体脂肪间充质干细胞液进行离心处理，得到自体脂肪间充质干细胞上清液；再将自体脂肪间充质干细胞上清液和自体子宫内膜间充质干细胞液合并，进行共培养，促进自体子宫内膜间充质干细胞增殖。
优选的，自体脂肪间充质干细胞的制备步骤如下：取自体脂肪组织，剪碎，得到脂肪颗粒；将脂肪颗粒用生理盐水重悬、离心，得到白色沉淀；对白色沉淀进行培养，得到脂肪干细胞。
优选的，自体脂肪间充质干细胞的制备步骤如下：在无菌状态下抽取脂肪组织，PBS漂洗后充分剪碎至糊状，加入Ⅰ型胶原酶，置于摇床中37℃下震荡30分钟进行消化；终止消化后离心，去上清液及未消化的脂肪，少量培养基重悬细胞沉淀，0.16mol/L氯化氨溶解剩余红细胞，将收集的细胞悬液经200目铜网过滤，离心后得到单个核细胞；经过计数后进行传代培养，即可得到脂肪干细胞。
优选的，子宫内膜间充质干细胞的制备步骤如下：体外收集经血，并制备经血采集液；经血混合液经过过滤、离心处理，得到单个核细胞；对单个核细胞进行培养，得到子宫内膜干细胞。
优选的，将采集管中的经血混合液充分混匀后用100μm的细胞滤网进行过滤，以去除大部分粘液及凝块，然后用PBS漂洗，加入胰蛋白酶，置于摇床中37℃下震荡30分钟进行消化；采用密度梯度离心法，收集单个核细胞。
优选的，经血和经血采集液的体积比为1:1-5；每100ml的经血采集液包括0.1-0.3％的青霉素、0.1-0.3％的链霉素、0.1-0.3％的头抱氨苄、450单位肝素、0.5-1.0mM的丝氨酸蛋白酶抑制剂AEBSF、低于0.8mM的半胱氨酸蛋白酶抑制剂E-64、0.3-0.75mM金属蛋白酶抑制剂EDTA和余量的生理盐水。
优选的，进行自体脂肪间充质干细胞和自体子宫内膜间充质干细胞共培养时每2天更换干细胞培养液，4-6天传代一次。
优选的，共培养方法为：吸去原有培养液，将自体脂肪间充质干细胞上清液和自体子宫内膜间充质干细胞液1:1混合，转移至STO细胞饲养层上培养。
优选的，共培养时还需要加入20％的血清替代品、2mmol/L谷氨酞胺、0.1mmol/Lβ-巯基乙醇、100mg/mL链霉素、1％的非必需氨基酸、2.5μmol/L BIO、5-10ng/ml碱性成纤维生长因子和1％的ITS。
与现有技术相比，本发明具有如下有益的技术效果：
本发明首先以人体脂肪组织和人体经血为原料，分别制备得到自体脂肪间充质干细胞和子宫内膜间充质干细胞。接着对自体脂肪间充质干细胞和自体子宫内膜间充质干细胞分别进行原代分离培养和传代培养，获得多代培养的自体脂肪间充质干细胞液和自体子宫内膜间充质干细胞液；然后将多代培养的自体脂肪间充质干细胞液进行离心处理，得到自体脂肪间充质干细胞上清液；再将自体脂肪间充质干细胞上清液和自体子宫内膜间充质干细胞液合并，进行共培养，促进自体子宫内膜间充质干细胞增殖。上述干细胞源于自体，因此有效避免了免疫排斥问题，在临床上具有优先应用优势。采用共培养的方式，以自体脂肪间充质干细胞上清液作为培养基组分，促进子宫内膜间充质干细胞增殖，大大提高了子宫内膜间充质干细胞的数量，分泌出的营养因子可以延缓衰老，恢复女性卵巢早衰患者的月经，改善更年期症状。且制备过程操作方法简单，成本低。
附图说明
图1为本发明一种实施例的方法流程图。
具体实施方式
实施例一
如图1所示，本发明提出的一种用于女性卵巢早衰生殖修复的干细胞制备方法，步骤如下：
S1、首先以人体脂肪组织和人体经血为原料，分别制备得到自体脂肪间充质干细胞和子宫内膜间充质干细胞；
S2、接着对自体脂肪间充质干细胞和自体子宫内膜间充质干细胞分别进行原代分离培养和传代培养，获得多代培养的自体脂肪间充质干细胞液和自体子宫内膜间充质干细胞液；
S3、然后将多代培养的自体脂肪间充质干细胞液进行离心处理，得到自体脂肪间充质干细胞上清液；
S4、再将自体脂肪间充质干细胞上清液和自体子宫内膜间充质干细胞液合并，进行共培养，促进自体子宫内膜间充质干细胞增殖。
实施例二
如图1所示，本发明提出的一种用于女性卵巢早衰生殖修复的干细胞制备方法，步骤如下：
S1、首先以人体脂肪组织和人体经血为原料，分别制备得到自体脂肪间充质干细胞和子宫内膜间充质干细胞；
S2、接着对自体脂肪间充质干细胞和自体子宫内膜间充质干细胞分别进行原代分离培养和传代培养，获得多代培养的自体脂肪间充质干细胞液和自体子宫内膜间充质干细胞液；
S3、然后将多代培养的自体脂肪间充质干细胞液进行离心处理，得到自体脂肪间充质干细胞上清液；
S4、再将自体脂肪间充质干细胞上清液和自体子宫内膜间充质干细胞液合并，进行共培养，促进自体子宫内膜间充质干细胞增殖。
进一步的，自体脂肪间充质干细胞的制备步骤如下：取自体脂肪组织，剪碎，得到脂肪颗粒；将脂肪颗粒用生理盐水重悬、离心，得到白色沉淀；对白色沉淀进行培养，得到脂肪干细胞。
需要进一步说明是，子宫内膜间充质干细胞的制备步骤如下：体外收集经血，并制备经血采集液；经血混合液经过过滤、离心处理，得到单个核细胞；对单个核细胞进行培养，得到子宫内膜干细胞。
需要进一步说明是，进行自体脂肪间充质干细胞和自体子宫内膜间充质干细胞共培养时每2天更换干细胞培养液，4-6天传代一次。
实施例三
如图1所示，本发明提出的一种用于女性卵巢早衰生殖修复的干细胞制备方法，步骤如下：
S1、首先以人体脂肪组织和人体经血为原料，分别制备得到自体脂肪间充质干细胞和子宫内膜间充质干细胞；
S2、接着对自体脂肪间充质干细胞和自体子宫内膜间充质干细胞分别进行原代分离培养和传代培养，获得多代培养的自体脂肪间充质干细胞液和自体子宫内膜间充质干细胞液；
S3、然后将多代培养的自体脂肪间充质干细胞液进行离心处理，得到自体脂肪间充质干细胞上清液；
S4、再将自体脂肪间充质干细胞上清液和自体子宫内膜间充质干细胞液合并，进行共培养，促进自体子宫内膜间充质干细胞增殖。
需要进一步说明是，自体脂肪间充质干细胞的制备步骤如下：在无菌状态下抽取脂肪组织，PBS漂洗后充分剪碎至糊状，加入Ⅰ型胶原酶，置于摇床中37℃下震荡30分钟进行消化；终止消化后离心，去上清液及未消化的脂肪，少量培养基重悬细胞沉淀，0.16mol/L氯化氨溶解剩余红细胞，将收集的细胞悬液经200目铜网过滤，离心后得到单个核细胞；经过计数后进行传代培养，即可得到脂肪干细胞。
需要进一步说明是，将采集管中的经血混合液充分混匀后用100μm的细胞滤网进行过滤，以去除大部分粘液及凝块，然后用PBS漂洗，加入胰蛋白酶，置于摇床中37℃下震荡30分钟进行消化；采用密度梯度离心法，收集单个核细胞。
需要进一步说明是，经血和经血采集液的体积比为1:1-5；每100ml的经血采集液包括0.1-0.3％的青霉素、0.1-0.3％的链霉素、0.1-0.3％的头抱氨苄、450单位肝素、0.5-1.0mM的丝氨酸蛋白酶抑制剂AEBSF、低于0.8mM的半胱氨酸蛋白酶抑制剂E-64、0.3-0.75mM金属蛋白酶抑制剂EDTA和余量的生理盐水。
需要进一步说明是，进行自体脂肪间充质干细胞和自体子宫内膜间充质干细胞共培养时每2天更换干细胞培养液，4-6天传代一次。
需要进一步说明是，共培养方法为：吸去原有培养液，将自体脂肪间充质干细胞上清液和自体子宫内膜间充质干细胞液1:1混合，转移至STO细胞饲养层上培养。
实施例四
如图1所示，本发明提出的一种用于女性卵巢早衰生殖修复的干细胞制备方法，步骤如下：
S1、首先以人体脂肪组织和人体经血为原料，分别制备得到自体脂肪间充质干细胞和子宫内膜间充质干细胞；
S2、接着对自体脂肪间充质干细胞和自体子宫内膜间充质干细胞分别进行原代分离培养和传代培养，获得多代培养的自体脂肪间充质干细胞液和自体子宫内膜间充质干细胞液；
S3、然后将多代培养的自体脂肪间充质干细胞液进行离心处理，得到自体脂肪间充质干细胞上清液；
S4、再将自体脂肪间充质干细胞上清液和自体子宫内膜间充质干细胞液合并，进行共培养，促进自体子宫内膜间充质干细胞增殖。
需要进一步说明是，自体脂肪间充质干细胞的制备步骤如下：在无菌状态下抽取脂肪组织，PBS漂洗后充分剪碎至糊状，加入Ⅰ型胶原酶，置于摇床中37℃下震荡30分钟进行消化；终止消化后离心，去上清液及未消化的脂肪，少量培养基重悬细胞沉淀，0.16mol/L氯化氨溶解剩余红细胞，将收集的细胞悬液经200目铜网过滤，离心后得到单个核细胞；经过计数后进行传代培养，即可得到脂肪干细胞。
需要进一步说明是，将采集管中的经血混合液充分混匀后用100μm的细胞滤网进行过滤，以去除大部分粘液及凝块，然后用PBS漂洗，加入胰蛋白酶，置于摇床中37℃下震荡30分钟进行消化；采用密度梯度离心法，收集单个核细胞。
需要进一步说明是，经血和经血采集液的体积比为1:1-5；每100ml的经血采集液包括0.1-0.3％的青霉素、0.1-0.3％的链霉素、0.1-0.3％的头抱氨苄、450单位肝素、0.5-1.0mM的丝氨酸蛋白酶抑制剂AEBSF、低于0.8mM的半胱氨酸蛋白酶抑制剂E-64、0.3-0.75mM金属蛋白酶抑制剂EDTA和余量的生理盐水。
需要进一步说明是，进行自体脂肪间充质干细胞和自体子宫内膜间充质干细胞共培养时每2天更换干细胞培养液，4-6天传代一次。
需要进一步说明是，共培养方法为：吸去原有培养液，将自体脂肪间充质干细胞上清液和自体子宫内膜间充质干细胞液1:1混合，转移至STO细胞饲养层上培养。
需要进一步说明是，STO细胞饲养层制备方法如下：STO细胞融合成单层,弃培养液，加入含10μg/ml丝裂霉素C溶液(覆盖细胞单层即可)，37℃、5％C02、100％湿度培养箱内放置2-3h。弃丝裂霉素处理液，用PBS充分洗涤3-5次，除去残余丝裂霉素C。消化液消化制成3×105个/ml浓度的细胞悬液，种植到预先用0.1％明胶处理过的培养瓶或培养皿内(0.1％明胶覆盖培养瓶或培养皿表面,室温放置2h以上,用前吸弃多余的明胶,直接使用或稍干燥后使用)。37℃、5％C02、100％湿度培养箱培养,细胞很快贴壁并铺展为单层。细胞如果过稀可补加丝裂霉素处理过的细胞,这样制成的饲养单层可使用6-1Od,用前更换ES细胞培养浓。STO细胞单层用丝裂霉素处理及PBS充分洗涤后,也可以不消化直接使用。
需要进一步说明是，共培养时还需要加入20％的血清替代品、2mmol/L谷氨酞胺、0.1mmol/Lβ-巯基乙醇、100mg/mL链霉素、1％的非必需氨基酸、2.5μmol/LBIO、5-10ng/ml碱性成纤维生长因子和1％的ITS。
本发明首先以人体脂肪组织和人体经血为原料，分别制备得到自体脂肪间充质干细胞和子宫内膜间充质干细胞。接着对自体脂肪间充质干细胞和自体子宫内膜间充质干细胞分别进行原代分离培养和传代培养，获得多代培养的自体脂肪间充质干细胞液和自体子宫内膜间充质干细胞液；然后将多代培养的自体脂肪间充质干细胞液进行离心处理，得到自体脂肪间充质干细胞上清液；再将自体脂肪间充质干细胞上清液和自体子宫内膜间充质干细胞液合并，进行共培养，促进自体子宫内膜间充质干细胞增殖。上述干细胞源于自体，因此有效避免了免疫排斥问题，在临床上具有优先应用优势。采用共培养的方式，以自体脂肪间充质干细胞上清液作为培养基组分，促进子宫内膜间充质干细胞增殖，大大提高了子宫内膜间充质干细胞的数量，分泌出的营养因子可以延缓衰老，恢复女性卵巢早衰患者的月经，改善更年期症状。且制备过程操作方法简单，成本低。
上面结合附图对本发明的实施方式作了详细说明，但是本发明并不限于此，在所属技术领域的技术人员所具备的知识范围内，在不脱离本发明宗旨的前提下还可以作出各种变化。
Claims (9)
1.一种用于女性卵巢早衰生殖修复的干细胞制备方法，其特征在于，
首先以人体脂肪组织和人体经血为原料，分别制备得到自体脂肪间充质干细胞和子宫内膜间充质干细胞；
接着对自体脂肪间充质干细胞和自体子宫内膜间充质干细胞分别进行原代分离培养和传代培养，获得多代培养的自体脂肪间充质干细胞液和自体子宫内膜间充质干细胞液；
然后将多代培养的自体脂肪间充质干细胞液进行离心处理，得到自体脂肪间充质干细胞上清液；
再将自体脂肪间充质干细胞上清液和自体子宫内膜间充质干细胞液合并，进行共培养，促进自体子宫内膜间充质干细胞增殖。
2.根据权利要求1所述的一种用于女性卵巢早衰生殖修复的干细胞制备方法，其特征在于，自体脂肪间充质干细胞的制备步骤如下：取自体脂肪组织，剪碎，得到脂肪颗粒；将脂肪颗粒用生理盐水重悬、离心，得到白色沉淀；对白色沉淀进行培养，得到脂肪干细胞。
3.根据权利要求2所述的一种用于女性卵巢早衰生殖修复的干细胞制备方法，其特征在于，自体脂肪间充质干细胞的制备步骤如下：在无菌状态下抽取脂肪组织，PBS漂洗后充分剪碎至糊状，加入Ⅰ型胶原酶，置于摇床中37℃下震荡30分钟进行消化；终止消化后离心，去上清液及未消化的脂肪，少量培养基重悬细胞沉淀，0.16mol/L氯化氨溶解剩余红细胞，将收集的细胞悬液经200目铜网过滤，离心后得到单个核细胞；经过计数后进行传代培养，即可得到脂肪干细胞。
4.根据权利要求1所述的一种用于女性卵巢早衰生殖修复的干细胞制备方法，其特征在于，子宫内膜间充质干细胞的制备步骤如下：体外收集经血，并制备经血采集液；经血混合液经过过滤、离心处理，得到单个核细胞；对单个核细胞进行培养，得到子宫内膜干细胞。
5.根据权利要求4所述的一种用于女性卵巢早衰生殖修复的干细胞制备方法，其特征在于，将采集管中的经血混合液充分混匀后用100μm的细胞滤网进行过滤，以去除大部分粘液及凝块，然后用PBS漂洗，加入胰蛋白酶，置于摇床中37℃下震荡30分钟进行消化；采用密度梯度离心法，收集单个核细胞。
6.根据权利要求5所述的一种用于女性卵巢早衰生殖修复的干细胞制备方法，其特征在于，经血和经血采集液的体积比为1:1-5；每100ml的经血采集液包括0.1-0.3％的青霉素、0.1-0.3％的链霉素、0.1-0.3％的头抱氨苄、450单位肝素、0.5-1.0mM的丝氨酸蛋白酶抑制剂AEBSF、低于0.8mM的半胱氨酸蛋白酶抑制剂E-64、0.3-0.75mM金属蛋白酶抑制剂EDTA和余量的生理盐水。
7.根据权利要求1所述的一种用于女性卵巢早衰生殖修复的干细胞制备方法，其特征在于，进行自体脂肪间充质干细胞和自体子宫内膜间充质干细胞共培养时每2天更换干细胞培养液，4-6天传代一次。
8.根据权利要求8所述的一种用于女性卵巢早衰生殖修复的干细胞制备方法，其特征在于，共培养方法为：吸去原有培养液，将自体脂肪间充质干细胞上清液和自体子宫内膜间充质干细胞液1:1混合，转移至STO细胞饲养层上培养。
9.根据权利要求8所述的一种用于女性卵巢早衰生殖修复的干细胞制备方法，其特征在于，共培养时还需要加入20％的血清替代品、2mmol/L谷氨酞胺、0.1mmol/Lβ-巯基乙醇、100mg/mL链霉素、1％的非必需氨基酸、2.5μmol/L BIO、5-10ng/ml碱性成纤维生长因子和1％的ITS。
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