CN113973498A - 源自间充质干细胞的外泌体生产方法及利用其制备的培养液 - Google Patents
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Abstract
本申请提供源自间充质干细胞的外泌体生产方法及利用其生产的细胞培养液,其特征在于,包括:从间充质干细胞获取细胞样品并传代培养的步骤;在包含蛋白合成抑制酶的基质培养基中培养已培养的细胞后获取细胞培养液的步骤;以及从上述细胞培养液分离外泌体的步骤。本申请的外泌体生产方法具有可分离高纯度和高浓度的外泌体的优点。
Description
技术领域
本申请要求于2020年5月25日在韩国知识产权局提交且申请号为第10-2020-0062365号的韩国专利申请的优先权,其全部内容通过引用包括在本申请中。
本申请涉及源自间充质干细胞的外泌体生产方法。
背景技术
目前,已发现人类的骨髓中存在多种祖细胞(progenitor),将其中具有多能性的祖细胞称为间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSC)。已知间充质干细胞不仅存在于骨髓中,还存在于脂肪、肝脏、肌肉等身体大部分的器官中。
间充质干细胞具有自我更新能力,可分化为成骨细胞(osteoblasts)、软骨细胞(chondrocytes)、肌细胞(myocytes)、骨髓基质细胞(marrow stromal cells)、腱韧带成纤维细胞(tendonligamentfibroblasts)、脂肪细胞(adipocytes)等,并且,其为高增殖性的贴壁细胞,已知具有抗炎及免疫调节能力。尤其,显示出如T细胞和B细胞的增殖及分化抑制以及如树突细胞(dendritic cell)、自然杀伤(natural killer,NK)细胞及巨噬细胞(macrophage)的免疫细胞的功能抑制等免疫抑制效果。
就这种间充质干细胞而言,与间充质干细胞本身的分化功能相比,间充质干细胞所分泌的各种因子(旁分泌(paracrine)/分泌因子(secretory factors)),例如趋化因子(chemokine)、细胞因子(cytokine)、生长因子(growth factors)等代替干细胞的效果而备受瞩目。并且,已知间充质干细胞不仅分泌这种因子,还分泌胞外囊泡(extracellularvesicle,EV),已知胞外囊泡通过细胞之间的信号传导而在细胞的命运、功能、分化等多方面产生影响。
在各种因子中,外泌体(Exosome)为由脂质-双层组成的囊泡(vesicle),是细胞向细胞外分泌的物质的组成成分。已知外泌体起到输送(转运)作为细胞内的生物分子的蛋白质、生物活性脂质及核糖核酸(RNA)(微小核糖核酸(miRNA)),以执行介导细胞-细胞之间的通讯(cell-cell communication)及细胞免疫的功能性作用。这种外泌体正被研究作为阿尔茨海默病等神经系统疾病的生物标志物,并且,由于其具有足以穿透分离脑脊液和血液的血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)的高的选择渗透性,因此还用于研发如特定药物的纳米载体(nanocarrier)的药物递送系统。
另外,已知从间充质干细胞分泌的外泌体参与细胞-细胞之间的通讯并显示出干细胞所具有的再生医学治疗功效,近来,正在积极研究不使用间充质干细胞本身,而是利用间充质干细胞分泌的外泌体的各种疾病的治疗效果。
但是,在外泌体分离方法中最常用的超速离心(Ultracetrifugation)具有可一次性分离大量的外泌体的优点,但具有如下的问题,即需要昂贵的设备,分离时间长,且由于强的离心可使外泌体发生物理损伤,尤其,存在分离的外泌体的纯度降低等问题。在用于改善这种问题的方法中,具有利用与磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine,PS)特异性结合的物质来提高所分离的外泌体的纯度的磷脂酰丝氨酸亲和方法(PS affinity method),其中,上述磷脂酰丝氨酸为存在于外泌体的膜(membrane)的蛋白质。虽然,与超速离心方法相比,磷脂酰丝氨酸亲和方法可分离高纯度的外泌体,但具有收率低的缺点。并且,现有技术中,报告了利用色谱法(chromatography)的外泌体获取方法,但存在与悬浮在细胞培养液或血液中的外泌体具有相似的大小、密度的脂蛋白(lipoprotein)一同被洗脱的问题。
因此,需要研发可从间充质干细胞以高浓度获取不含杂质且高纯度的外泌体的分离方法。
发明内容
发明要解决的问题
本申请一实施例的生产方法为了解决如上所述的现有问题而提出,用于从间充质干细胞分离不含杂质、高纯度、高浓度的外泌体。
本申请提供一种源自间充质干细胞的外泌体生产方法。
本申请提供一种培养液,其包含利用上述生产方法制备的源自间充质干细胞的外泌体。
本申请提供一种药学组合物,其包含利用上述生产方法生产的外泌体作为有效成分。
本申请提供一种化妆品组合物,其包含利用上述生产方法生产的外泌体作为有效成分。
用于解决问题的手段
为了解决如上所述的问题,在本申请的一实施例中,提供一种源自间充质干细胞的外泌体生产方法,其特征在于,包括:从间充质干细胞获取细胞样品的步骤;在低糖DMEM(low-glucose Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)培养基中对上述细胞样品进行传代培养的步骤;在包含蛋白合成抑制酶的基质培养基中培养已培养的上述细胞后获取细胞培养液的步骤;以及从上述细胞培养液中分离外泌体的步骤。
在本申请的一实施例中,在获取上述干细胞培养液的步骤中,上述基质培养基还可包含肿瘤坏死因子α(TNFα)。
在本申请的一实施例中,可包含5ng/mL~500ng/mL的浓度的上述肿瘤坏死因子α。
在本申请的一实施例中,上述蛋白合成抑制酶可以为选自由环己酰亚胺(Cycloheximide)、茴香霉素(Anisomycin)、金精三羧酸(Aurintricarboxylic acid)、白喉毒素(Diphtheria toxin)、伊短菌素(Edeine)、梭链孢酸(Fusidic acid)、密旋霉素(Pactamycin)、嘌呤霉素(Puromycin)、蓖麻毒蛋白(Ricin)、氟化钠(Sodium fluoride)、司帕霉素(Sparsomycin)、四环素(Tetracycline)及木霉(Trichoderma)组成的组中的一种或两种以上。
在本申请的一实施例中,在上述基质培养基中,肿瘤坏死因子α与蛋白合成抑制酶的比例可以为1∶10至1∶2000。
在本申请的一实施例中,上述肿瘤坏死因子α及蛋白合成抑制酶的处理时间可以为30小时至100小时。
在本申请的一实施例中,在上述细胞培养液中,外泌体的数量、源自外泌体的蛋白质和源自外泌体的核糖核酸中的一种以上的含量可增加。
在本申请的一实施例中,每1ml的上述细胞培养液可分离1.1×1011个以上的外泌体。
在本申请的一实施例中,在对上述细胞样品进行传代培养的步骤中,上述培养基可包含选自由表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)、生长分化因子11(GDF11)、角质细胞生长因子(KGF)、肝细胞生长因子(HGF)、血小板源性生长因子(PDGF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、胰岛素样生长因子(IGF)及转化生长因子-b(TGF-b)组成的组中的一种以上。
在本申请的一实施例中,在对上述细胞样品进行传代培养的步骤中,可传代培养4代至10代。
在本申请的一实施例中,上述外泌体的标志物可以为选自由分化簇63(CD63)、分化簇9(CD9)、分化簇81(CD81)、鞘氨醇-1-磷酸受体1(S1PR1)及鞘氨醇-1-磷酸受体3(S1PR3)组成的组中的一种以上。
在本申请的一实施例中,在获取上述样品的步骤中,上述间充质干细胞可从脂肪组织或胎盘组织中获取。
在本申请的一实施例中,上述干细胞可以为胚胎干细胞、成体干细胞或诱导多能干细胞(Induced pluripotent stem cell,IPS)。
在本申请的一实施例中,提供一种培养液,其包含利用上述方法生产的源自间充质干细胞的外泌体。
在本申请的一实施例中,提供一种药学组合物,其包含利用上述方法生产的源自间充质干细胞的外泌体作为有效成分。
在本申请的一实施例中,提供一种化妆品组合物,其包含利用上述方法生产的源自间充质干细胞的外泌体作为有效成分。
发明的效果
本申请一实施例的源自间充质干细胞的外泌体生产方法具有能够以更高的收率获取高纯度的外泌体的优点。
本申请一实施例的源自间充质干细胞的外泌体生产方法具有通过在基质培养基处理肿瘤坏死因子α和/或蛋白合成抑制酶来大量分离外泌体的优点。
本申请一实施例的包含源自间充质干细胞的外泌体的培养液具有分化能力和增殖能力可实现增强的优点。
本申请具有利用本申请一实施例的培养液提供药学组合物或化妆品组合物的优点,上述药学组合物具有如下的优点,即由于外泌体的无细胞特性,可降低药物副作用的发生概率。
附图说明
图1为示出根据肿瘤坏死因子α与环己酰亚胺比例的干细胞外泌体生产量的变化的图表。
图2为示出处理肿瘤坏死因子α及环己酰亚胺的间充质干细胞中的根据时间的外泌体生产量变化的图表。
图3为示出通过纳米粒子追踪分析(NTA,Nanoparticle-Tracking Analysis)测定本申请的实施例及比较例的外泌体的浓度的图表。
图4为示出通过布拉德福蛋白质定量法(Bradford assay)测定本申请的实施例及比较例的外泌体的蛋白质浓度的图表。
图5为示出对于本申请的实施例及比较例的通过纳米粒子追踪分析测定实施例14((a)部分)、实施例15((b)部分)及比较例1((c)部分)的外泌体的大小和根据外泌体大小的粒子分布直方图的图表。
图6为示出对于本申请的实施例及比较例的通过纳米粒子追踪分析测定比较例2((d)部分)、比较例3((e)部分)及比较例4((f)部分)的外泌体的大小和根据外泌体大小的粒子分布直方图的图表。
图7为示出对于本申请的实施例及比较例的通过纳米粒子追踪分析测定比较例5((g)部分)、比较例6((h)部分)及比较例7((i)部分)的外泌体的大小和根据外泌体大小的粒子分布直方图的图表。
图8示出本申请的实施例及比较例的外泌体的蛋白质印迹(Western blot)。
图9为本申请的外泌体的透射电子显微镜(Transmission microscopy,TEM)照片。
图10示出通过Exoview技术(Exoview technique)分析本申请的外泌体的图表。
具体实施方式
以下,将更加详细地说明本申请。
以下的特定功能说明仅为了说明本申请概念的实施例而例示,根据本申请概念的实施例能够以多种实施方式实施,不应解释为限定于在本说明书中说明的实施例。
根据本申请概念的实施例可实施各种变更并可具有各种实施方式,因此,在本说明书中将详细说明特定实施例。但是,这并不旨在将根据本申请概念的实施例限定于特定公开实施方式,而是应理解为,包含在本申请的思想及技术范围的所有变更、等同方案或替代方案。
在本说明书中使用的术语仅用于说明特定实施例,并不旨在限定本申请。除非在文脉上明确表示不同,否则单数的表达包括复数的表达。
除非另行定义,包括技术术语或科学术语在内的在此使用的所有术语的含义与本申请所属技术领域的普通技术人员通常所理解的含义相同。如通常使用的词典中所定义的术语应解释为具有与相关技术的文脉所具有的含义相同的含义,除非在本说明书中明确定义,不应解释为理想或过于形式的含义。
在本申请的一实施例中,提供一种源自间充质干细胞的外泌体生产方法,其特征在于,包括:从间充质干细胞获取细胞样品的步骤;在低糖DMEM培养基中传代培养上述细胞样品的步骤;在包含蛋白合成抑制酶的基质培养基中培养已培养的上述细胞后获取细胞培养液的步骤;以及从上述细胞培养液中分离外泌体的步骤。
在从间充质干细胞获取细胞样品的步骤中,就上述样品而言,对以使其通过膜而制备的滤液进行离心来获取细胞。此时,膜可使用50μm至200μm的尼龙,但并无特殊限制。
本申请中的术语“离心”为利用离心器的分离法,以轴为中心旋转物质来施加离心力。本申请中的离心可以为选自由差速离心(Differential centrifugation)、密度梯度离心(Density gradient centrifugation)及气体离心(Gas centrifugation)组成的组中的一种。
本申请中的术语“干细胞”是指具有自我复制能力且具有分化为两个以上的新的细胞的能力的细胞,可分类为全能干细胞(totipotent stem cells)、多能干细胞(pluripotent stem cells)、多潜能干细胞(multipotent stem cells)。为了被识别为上述干细胞,必须在未分化状态下不断复制,且必须可在特定培养条件下分化为特定细胞。记述的上述干细胞由于具有分化能力和自我复制能力,最近作为细胞治疗剂组合物候选而受到关注,并正在进行与此相关的许多研究。由此,具有可提取包含干细胞的遗传信息、蛋白质、生长因子的外泌体的优点。
上述干细胞可以为骨髓干细胞、脐带血干细胞或源自脂肪的干细胞,可以为人源干细胞或源自动物的干细胞或者源自植物的干细胞,例如,可以为源自人脂肪的干细胞,但并不限定于此。
本申请中的术语“外泌体”为从多种细胞分泌的膜结构的囊泡,通过与其他细胞及组织结合来起到递送膜组分、蛋白质、核糖核酸(RNA)等各种作用。
在本申请中,“DMEM培养基”是指达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco’sModified Eagle’s Medium),是最常用的用于培养动物细胞的培养基。当培养细胞时,使用低糖(low glucose)DMEM培养基,但并不限定于此,还可使用高糖(high glucose)DMEM培养基,并且,可以使细胞(cell)在高糖培养基生长至80%至100%为止后,在低糖培养基中培养。如上述方法,当混合高糖DMEM和低糖DMEM来在培养基中培养时,具有可快速获取细胞的优点。上述低糖DMEM中的葡萄糖浓度可以为800mg/L至1200mg/L,同时,可向低糖DMEM培养基添加胎牛血清来培养,但并不局限于此。
在本申请中,术语“培养液”是指利用间充质干细胞培养液培养间充质干细胞的细胞培养上清液。间充质干细胞培养液包含在间充质干细胞的培养过程中从细胞分泌的各种生理活性物质。
上述膜可以为50μm至200μm,但没有特别限制。对上述样品通过膜后的滤液以100×g至500×g的条件离心5分钟至30分钟,由此可获取细胞团块(Pellet)。并且,上述膜只要是半透膜就可使用,具体为尼龙膜过滤器(Nylon membrane filter),但并不局限于此。
对上述细胞团块进行传代培养的步骤可包括抗生素。抗生素可以为青霉素(penicillin)和/或链霉素(Streptomycin),但并不局限于此。可在100mm至150mm的细胞培养皿(Petridish)稀释为1×105细胞/1ml培养基的浓度,可在30℃至40℃的温度,具体为37℃的温度,以及在3%至10%,具体为在5%的CO2培养箱中培养。并且,可不使用培养皿来培养细胞,而可以是在简单形态的瓶中培养,由于可长期保持细胞稳定,由此具有可大量生产细胞培养液的优点。
在培养基中对上述细胞团块样品进行传代培养的步骤中,可培养4代至10代。当增殖为4代以下时,具有细胞未扩增而表达程度低的问题,当增殖为10代以上时,具有细胞过表达的问题。
在上述传代培养的步骤中,上述DMEM培养基可包含选自由生长分化因子(Growthand differentiation factor 11,GDF11)、表皮生长因子(Epidermal growth factor,EFG)、血管内皮细胞生长因子(Vascular endothelium growth factor,VEGF)、角质细胞生长因子(Keratinocyte growth factor,KGF)、肝细胞生长因子(Hepatocyte growthfactor,HGF)、转化生长因子(Transforming growth factor-beta,TGF-b)、成纤维细胞生长因子(Fibroblast growth factor 2,FGF-2)、胰岛素样生长因子(Insulin growthfactor)及血小板源性生长因子(Platelet-derived growth factor,PDGF)组成的组中的一种或两种以上。
优选地,在上述传代培养的步骤中,每70小时~75小时更换一次培养基来进行培养,直到融合度(confluency)为80%至100%为止。具体优选地,每72小时更换一次培养基来进行培养,若在70小时以内更换培养基,则具有无法获取高纯度的团块的问题,若超出75小时的时间更换一次培养基,则具有无法获取高浓度的团块的问题。本申请的用于提取源自间充质干细胞的高纯度外泌体的传代培养步骤具有可在扩增间充质干细胞的同时增强外泌体的分化能力和增殖能力的优点。
上述“培养液”是指利用间充质干细胞培养液培养间充质干细胞的细胞培养上清液。间充质干细胞培养液包含在间充质干细胞的培养过程中从细胞分泌的各种生理活性物质。
上述基质培养基可以为无血清基质培养基或血清基质培养基。上述基质培养基使用低糖DMEM培养基,但并不限定于此,也可使用高糖DMEM培养基,或者包括两者来使用。
在本申请的一实施例中,包含在上述基质培养基的蛋白合成抑制酶可以为选自由环己酰亚胺、茴香霉素、金精三羧酸、白喉毒素、伊短菌素、梭链孢酸、密旋霉素、嘌呤霉素、蓖麻毒蛋白、氟化钠、司帕霉素、四环素、木霉组成的组中的一种,但并不限定于此,只要是可实现相同机制的蛋白生物合成抑制酶就可代替。具体地,上述蛋白合成抑制酶优选为环己酰亚胺。
在本申请一实施例的获取细胞培养液的步骤中,基质培养基还可包含肿瘤坏死因子α。可包含5ng/mL~500ng/mL的浓度的上述肿瘤坏死因子α。
在本申请的一实施例中,上述基质培养基中的肿瘤坏死因子α∶蛋白合成抑制酶的比例可以为1∶1~1∶2000。上述肿瘤坏死因子α∶蛋白合成抑制酶的添加比例可以为1∶1~1∶2000,具体可为1∶10~1∶1000,更具体可为1∶20~1∶500,更加具体可为1∶50至1∶200。当蛋白合成抑制酶的添加比例小于肿瘤坏死因子α时,存在所提取的外泌体的大小和量不多的问题,当肿瘤坏死因子α∶蛋白合成抑制酶的添加比例超出1∶2000时,蛋白合成抑制酶的比例过高,因此具有抑制细胞团块的扩增的问题。具体地,若同时包含肿瘤坏死因子α和蛋白合成抑制酶,则与仅添加肿瘤坏死因子α或仅添加蛋白合成抑制酶时相比,从干细胞提取的外泌体的大小、数量、源自外泌体的蛋白质或源自外泌体的核糖核酸的含量增加,由此具有可提取高浓度且高纯度的外泌体的优点。
在本申请的一实施例中,上述肿瘤坏死因子α和/或蛋白合成抑制酶的处理时间可以为培养30小时~100小时。
当上述肿瘤坏死因子α和/或蛋白合成抑制酶的处理时间小于30小时时,具有无法充分实现干细胞团块培养的问题,而当超出100小时时,由于过长的培养时间,存在细胞过表达的问题。
在本申请的一实施例中,分离上述外泌体的步骤可包括:将收集的干细胞培养液以200×g~400×g的条件离心5分钟~20分钟来获取第一上清液的步骤;将上述上清液以1800×g~2300×g的条件离心5分钟~30分钟来获取第二上清液的步骤;将上述第二上清液以90000×g~110000×g的条件离心或超速离心50分钟~100分钟来去除上清液,并获取外泌体团块的步骤;以及将获取的上述外泌体团块悬浮于磷酸盐缓冲液并分离外泌体粒子的步骤。当分离外泌体粒子时,可进行超声波处理。
若获得上述外泌体团块后未将其悬浮在磷酸盐缓冲液(PBS)并进行超声波处理时,由于硬硬的结块的团块,具有无法提取高纯度的外泌体的问题。因此,从获取的外泌体团块仅分离外泌体粒子,则具有可提取高纯度的外泌体粒子的优点。
在本申请的一实施例中,在从上述间充质干细胞获取细胞样品的步骤中,可将上述样品制成小切片,添加胶原酶来处理20分钟~40分钟。之后,可添加DMEM来使酶反应非活性化,此时,选择性地,还可包含10%的胎牛血清(10%Fetal bovine serum,FBS)。并且,以200×g~400×g的条件离心3分钟~20分钟后,去除上清液并提取细胞团块粒子,可将团块粒子悬浮在胎牛血清及DMEM来获取细胞样品。
在获取上述细胞样品的步骤中,还可包括重悬获取的细胞样品后接种(Seeding)重悬的细胞的步骤。若还包括上述接种步骤,则具有可在悬浮的胎牛血清缓冲液内防止细胞团块相互结块的现象的优点。
在本申请的一实施例中,在获取上述样品的步骤中,上述间充质干细胞可从脂肪组织或胎盘组织中提取。
可从上述脂肪组织提取的源自脂肪组织的干细胞是指源自人的脂肪细胞的干细胞(human adipose-derived stem cells)。由此,具有可分离出包含脂肪细胞的遗传信息、蛋白质、生长因子的外泌体的优点。
在本申请的一实施例中,上述干细胞可以为胚胎干细胞、成体干细胞或诱导多能干细胞。
在本申请的一实施例中,上述细胞培养液可增加外泌体的数量、源自外泌体的蛋白质和源自外泌体的核糖核酸(RNA)中的一种以上的含量。
在本申请的一实施例中,每1ml的上述细胞培养液可分离1.1×1010个以上的外泌体。更具体地,每1ml的细胞培养液可分离1.1×1011个以上且1.2×1012个以下的外泌体。
当利用DNase I对通过本申请一实施例的方法分离的外泌体进行处理时,具有纯度增加10%以上的优点。
本申请的一实施例提供一种培养液,其包含利用上述方法制备的源自间充质干细胞的高纯度外泌体。
在本申请的一实施例中,上述培养液可增加外泌体的数量、源自外泌体的蛋白质和源自外泌体的核糖核酸中的一种的含量。
并且,具有如下的优点,即为了分析上述外泌体的状态,可利用荧光物质标记,通过测定标记有荧光物质的外泌体的荧光信号值来分析外泌体的状态,从而可标示出提取值。
本申请中的术语“荧光物质”是指通过物理条件变化、化学处理而产生光的物质。例如,上述荧光物质可以为如绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)、黄色荧光蛋白(Yellow fluorescent protein,YFP)、红色荧光蛋白(Red fluorescent protein,RFP)的荧光蛋白(fluorescent protein)或发光蛋白(photoprotein)或荧光素酶(luciferase)。
并且,在上述荧光物质标记的外泌体中,荧光物质单独位于外泌体的内部,或者可包括膜蛋白和荧光物质结合的融合蛋白。在上述融合蛋白中,荧光物质可直接与膜蛋白结合,或者可通过连接子(linker)与膜蛋白结合,由此具有可准确地掌握外泌体的量和信号值的优点。
本申请的一实施例提供药学组合物,其包含利用上述方法制备的源自间充质干细胞的外泌体作为有效成分。
在本申请的药学组合物中,可使用通常公知并使用的辅助剂及额外的适合载体或稀释剂。本申请的药学组合物能够以固体制剂、溶液制剂、乳剂、分散剂、胶粒、脂质体等的形态使用。其中,在此获得的组合物与适合应用于肠内或非口服的有机载体或无机载体或赋形剂一同包含本申请的药学组合物(作为活性成分)。例如,活性成分可与药学上可接受的载体(对于片剂、丸剂、胶囊剂、栓剂、溶液剂、乳剂、悬浮剂及适合使用的任意其他形态而言通常是无毒性的)一同混合。可使用的载体包括固体、半固体或液体的葡萄糖、乳糖、阿拉伯胶、明胶、甘露醇、淀粉糊、三硅酸镁盐、滑石、玉米淀粉、胶体二氧化硅、马铃薯淀粉、尿素、链长度为中间程度的三酸甘油脂、葡聚糖及适合用于制备制剂的其他载体。并且,可使用辅助剂、稳定剂、增稠剂、着色剂及香料。
上述药学组合物分别可根据常规方法剂型化为散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、悬浮液、乳液、糖浆、气雾剂等的口服剂型、外用剂、栓剂或无菌注射溶液的形态来使用。详细地,当制剂化时,可通过使用通常使用的填充剂、增量剂、结合剂、湿润剂、崩解剂、表面活性剂等的稀释剂或赋形剂来配制。用于口服给药的固体制剂包括片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂等,这种固体制剂可通过向上述本发明的药学组合物混合一种以上的赋形剂,例如淀粉、碳酸钙(calcium carbonate)、蔗糖(sucrose)、乳糖(lactose)、明胶等来配制。并且,除简单的赋形剂之外,还可使用如硬脂酸镁、滑石的润滑剂。用于口服的液体制剂包括悬浮剂、内服液剂、乳剂、糖浆剂等,除如水、液体石蜡等的通常使用的简单的稀释剂之外,还可包括各种赋形剂,例如湿润剂、甜味剂、芳香剂、保存剂等。用于非经胃肠道给药的制剂包括无菌水溶液、非水溶剂、悬浮剂、乳剂、冷冻干燥制剂及栓剂。作为非水溶剂、悬浮剂,可使用丙二醇(propylene glycol)、聚乙二醇、如橄榄油的植物油、如油酸乙酯的可注射的酯等。作为栓剂的基剂,可使用半合成脂肪酸酯(witepsol)、聚乙二醇(Macrogol)、吐温(tween)61、可可脂、月桂酸甘油酯、甘油明胶等。
本申请的药学组合物的给药途径包括但不限于口腔、静脉内、肌内、动脉内、骨髓内、鞘内、心脏内、透皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、肠道、局部、舌下或直肠。优选为口服或非口服给药。本申请中使用的术语“非口服”包括皮下、皮内、静脉内、肌内、关节内、滑膜囊内、胸骨内、鞘内、病灶内及颅骨内注射或输注技术。本申请的药学组合物还能够以用于直肠给药的栓剂的形式给药。
本申请的药学组合物可通过任意装置给药以使活性物质递送至靶细胞。优选的给药方式及制剂为注射剂。注射剂可利用生理盐水、林格尔氏液、汉克氏(Hank)液或无菌水溶液等的水性溶剂、橄榄油等的植物油、油酸乙酯等的高级脂肪酸酯及乙醇、苯甲醇、丙二醇、聚乙二醇或甘油等的非水溶剂等来配制,为了黏膜渗透,可使用适合于所要通过的屏障的本领域公知的非侵入型制剂,还可包括如抗坏血酸、亚硫酸氢钠、丁基羟基茴香醚(BHA)、生育酚、乙二胺四乙酸(EDTA)等的用于防止变质的稳定剂、乳化剂、用于调节pH值的缓冲剂、苯基硝酸汞、硫柳汞、苯扎氯铵、苯酚、甲酚、苯甲醇等的用于抑制微生物生长的保鲜剂等的药学载体。
本申请的药学组合物可根据包括所使用的特定有效成分的活性、年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、给药时间、给药途径、排泄率、配合药物以及所要预防或治疗的特定疾病的严重程度的各种因素而以多种方式发生改变,并且,上述药学组合物的剂量根据患者的状态、体重、疾病的程度、药物形态、给药途径及给药期间而不同,但可由普通技术人员适当选择,能够以一天0.0001mg/kg至50mg/kg或者0.001mg/kg至50mg/kg的量进行给药。可一天给药一次,或也可一天给药数次。上述剂量并不在任何方面限定本发明的范围。
本申请的一实施例提供一种化妆品组合物,其包含利用上述方法制备的源自间充质干细胞的外泌体作为有效成分。
本申请的上述化妆品组合物可以为选自由润肤乳液、柔肤剂、爽肤水、收敛剂、乳液、牛奶乳液、保湿乳夜、营养乳液、按摩霜、营养霜、保湿霜、护手霜、粉底、精华、营养精华、面膜、香皂、洁面泡沫、洁面乳、洁面霜、身体乳、沐浴露、洁面剂、护理液、美容液、美容面膜、软膏剂、凝胶剂、擦剂、液剂、贴剂及喷雾剂组成的组中的一种剂型,但并不限定于特定剂型,可具有常规的化妆品组合物的剂型。
上述各个剂型的添加剂也并不受限,可添加化妆品领域通常使用的添加剂。作为上述化妆品领域的通常的添加剂可例举选自由抗生素、结合剂、崩解剂、稀释剂、润滑剂、稳定剂、保存剂、香料、油分、水、表面活性剂、保湿剂、低级醇、增稠剂、螯合剂、色素及防腐剂组成的组中的一种以上。
以下,通过实施例及比较例详细说明本发明。下述实施例及比较例仅用于例示本发明,本发明的内容并不限定于下述实施例。
1.分离及培养源自人脂肪的间充质干细胞
脂肪组织可通过吸脂术获取,但并不限定于此。通过下述方法从通过吸脂获取的脂肪组织分离源自人脂肪的间充质干细胞。
利用磷酸盐缓冲液(Phosphate buffered saline,PBS)洗涤摘取的脂肪组织。将洗涤的脂肪组织制成小切片后,添加0.1%的Ⅱ型胶原酶(type Ⅱ collagenase)。在37℃的温度下处理30分钟后,添加10%的胎牛血清和低糖DMEM(10%FBS low-glucose DMEM)来使酶反应非活性化,以300×g的条件离心10分钟,离心2次。去除上清液(supernatant),将剩余的团块悬浮在10%的胎牛血清低糖DMEM后,使其通过100μm的尼龙膜(nylonmembrane),将通过膜的滤液以300×g的条件离心10分钟来收集团块。
并且,使细胞团块悬浮于添加有青霉素及链霉素的包含10%的胎牛血清的低糖DMEM(完全培养基(complete media))后,在150mm的细胞培养皿(petridish)以1×105细胞/1ml培养基的浓度稀释,并在37℃、5%的CO2培养箱中培养。
每72小时将培养基更换为新的完全培养基,在细胞的浓度超出80%的时间点,利用胰蛋白酶(Trypsin)-乙二胺四乙酸(EDTA)分离细胞后,在新的150mm的细胞培养皿以1×105细胞/1ml培养基的浓度实施传代培养。
2.扩增间充质干细胞
为了从培养的上述干细胞分离外泌体,当对4代~10代的间充质干细胞进行传代培养时,在添加有5ng/ml的表皮生长因子的完全培养基培养至融合度为80%至100%,且以每72小时更换培养基的方式进行培养,由此增强分化能力和增殖能力。
3.根据添加至基质培养基的肿瘤坏死因子a(TNFa)与环己酰亚胺(cycloheximide)比例的干细胞外泌体生产量的变化
利用磷酸盐缓冲液将在100mm的培养皿中培养的融合度为100%的间充质干细胞(5×106细胞)洗涤3次,将基质培养基更换为低糖DMEM。通过纳米粒子追踪分析测定由间充质干细胞分离的外泌体的浓度,其中,上述间充质干细胞是在上述基质培养基中以50ng/ml的浓度处理肿瘤坏死因子α的同时增加环己酰亚胺的浓度来一同处理过的间充质干细胞。
相对于固定浓度50ng/ml的上述肿瘤坏死因子α,以如下的环己酰亚胺的浓度进行处理,即作为1∶1比例的50ng/ml的环己酰亚胺、作为1∶5比例的250ng/ml的环己酰亚胺、作为1∶20比例的1000ng/ml的环己酰亚胺、作为1∶100比例的5000ng/ml的环己酰亚胺、作为1∶500比例的25000ng/ml的环己酰亚胺、作为1∶1000比例的50000ng/ml的环己酰亚胺、作为1∶2000比例的100000ng/ml的环己酰亚胺。培养48小时后,收集干细胞培养液并通过如下方式纯分离外泌体。收集间充质干细胞培养液后,以300×g的条件离心10分钟,分离上清液,将分离的上清液以2000×g的条件离心20分钟后,分离上清液。将分离的上清液再次以100000×g的条件超速离心70分钟后,将去除上清液的团块(pellet)(外泌体)悬浮在磷酸盐缓冲液,进行超声波处理(sonication)来分离外泌体粒子,并通过纳米粒子追踪分析(NTA)测定分离的外泌体的浓度。在表1示出通过上述纳米粒子追踪分析测定的结果。
参见下述表1,可确认可从每1ml的细胞培养液分离1.58×109±3.2×109至1.26×1011±2.8×109的粒子。
表1
4.根据添加于基质培养基的肿瘤坏死因子a和环己酰亚胺处理时间的干细胞外泌体的分离
从在实施例3的基质培养基中处理肿瘤坏死因子α(50ng/ml)和环己酰亚胺(5000ng/ml),并在指定的时间内通过37℃、5%的CO2的培养箱培养的培养液中分离干细胞外泌体,通过纳米粒子追踪分析(NTA)测定外泌体的浓度,并示于表2。参见下述表2,当以30小时至100小时处理肿瘤坏死因子α(50ng/ml)和环己酰亚胺(5000ng/ml)时,可确认从每1ml的细胞培养液分离1.1×1011以上的外泌体。
表2
5.根据基质培养基的添加剂种类的干细胞外泌体的分离
利用磷酸盐缓冲液将在150mm的培养皿中培养的融合度为100%(1.5×107细胞)的间充质干细胞洗涤3次。在更换为低糖DMEM的间充质干细胞中联合添加肿瘤坏死因子α(50ng/ml)和环己酰亚胺(5ug/ml)(实施例14)、添加环己酰亚胺(5ug/ml)(实施例15)、添加肿瘤坏死因子α(50ng/ml)(比较例1)、添加1uM的星形孢菌素(Staurosporine)(比较例2)、添加2uM的星形孢菌素(比较例3)、添加毒胡萝卜素(Thapsigargin)(5uM)(比较例4)、氨基酸缺乏培养基(汉克氏平衡盐溶液(Hank’s balanced salt solution,HBSS))(比较例5)、葡萄糖缺乏培养基[Gluc(-):Glucose-depleted media](比较例6)、基质培养基(添加有10%的磷酸盐缓冲液的低糖DMEM(10%PBS low-glucose-DMEM))(比较例7)培养48小时。之后,根据通过上述的分离方法从培养液分离外泌体。
在分离的外泌体中,通过纳米粒子追踪分析定量粒子数和粒子大小,通过布拉德福蛋白质定量法定量蛋白质。并且,利用蛋白质印迹测定外泌体标志物。在图3及图4示出分离的外泌体的粒子数,并将其示于下述表3。在图5至图7及表4示出外泌体的蛋白质量和粒子大小。并且,在图8示出了外泌体标志物CD63(分化簇63)、鞘氨醇-1-磷酸受体1(S1PR1,Sphingosine-1-phosphate receptor1)以及鞘氨醇-1-磷酸受体3(S1PR3,Sphingosine-1-phosphate receptor 3)的表达。
实施例14的肿瘤坏死因子α(50ng/ml)和环己酰亚胺(5ug/ml)的处理条件,从间充质干细胞诱导出了众数值(mode value)141.6±58.4nm大小的粒子,其结果在表4和图5的(a)部分示出。参照图9,外泌体粒子被双层脂质膜包围,通过透射电子显微镜确认了作为外泌体的标志物的CD63的表达。参照图10,在利用Exoview的外泌体的表面标志物表达测试中,源自间充质干细胞的外泌体显示出分化簇63(Cluster of Differentiation 63,CD63)、分化簇9(Cluster of Differentiation 9,CD9)及分化簇81(Cluster ofDifferentiation 81,CD81)的外泌体标志物。
表3
表4
以上,详细记述了本申请的特定部分,对于本领域的普通技术人员而言这些具体记述仅为优选的实例,因此本申请的范围并不局限于此,这是显而易见的。因此,本申请的实质范围通过所附的权利要去范围及其等同技术方案来定义。
Claims (15)
1.一种源自间充质干细胞的外泌体生产方法,其特征在于,包括:
从间充质干细胞获取细胞样品的步骤;
在低糖DMEM培养基中对上述细胞样品进行传代培养的步骤;
在包含蛋白合成抑制酶的基质培养基中培养传代培养的上述细胞后获取细胞培养液的步骤;以及
从上述细胞培养液中分离外泌体的步骤。
2.根据权利要求1所述的源自间充质干细胞的外泌体生产方法,其特征在于,
在获取上述细胞培养液的步骤中,上述基质培养基还包含肿瘤坏死因子α。
3.根据权利要求1所述的源自间充质干细胞的外泌体生产方法,其特征在于,
上述蛋白合成抑制酶为选自由环己酰亚胺、茴香霉素、金精三羧酸、白喉毒素、伊短菌素、梭链孢酸、密旋霉素、嘌呤霉素、蓖麻毒蛋白、氟化钠、司帕霉素、四环素及木霉组成的组中的一种以上。
4.根据权利要求2所述的源自间充质干细胞的外泌体生产方法,其特征在于,
在上述基质培养基中,肿瘤坏死因子α与蛋白合成抑制酶的比例为1∶10至1∶2000。
5.根据权利要求4所述的源自间充质干细胞的外泌体生产方法,其特征在于,
包含5ng/mL~500ng/mL的浓度的上述肿瘤坏死因子α。
6.根据权利要求2所述的源自间充质干细胞的外泌体生产方法,其特征在于,
上述肿瘤坏死因子α及蛋白合成抑制酶的处理时间为30小时至100小时。
7.根据权利要求2所述的源自间充质干细胞的外泌体生产方法,其特征在于,
在上述细胞培养液中,外泌体的数量、源自外泌体的蛋白质和源自外泌体的核糖核酸中的一种以上的含量增加。
8.根据权利要求1所述的源自间充质干细胞的外泌体生产方法,其特征在于,
每1ml的上述细胞培养液分离1.1×1011个以上的外泌体。
9.根据权利要求1所述的源自间充质干细胞的外泌体生产方法,其特征在于,
在对上述细胞样品进行传代培养的步骤中,上述培养基包含选自由表皮生长因子、成纤维细胞生长因子-2、生长分化因子11、角质细胞生长因子、肝细胞生长因子、血小板源性生长因子、血管内皮细胞生长因子、胰岛素样生长因子及转化生长因子-b组成的组中的一种以上,且传代培养4代至10代。
10.根据权利要求1所述的源自间充质干细胞的外泌体生产方法,其特征在于,
上述外泌体的标志物为选自由分化簇63、分化簇9、分化簇81、鞘氨醇-1-磷酸受体1及鞘氨醇-1-磷酸受体3组成的组中的一种以上。
11.根据权利要求1所述的源自间充质干细胞的外泌体生产方法,其特征在于,
在获取上述样品的步骤中,上述间充质干细胞从脂肪组织或胎盘组织中获取。
12.根据权利要求11所述的源自间充质干细胞的外泌体生产方法,其特征在于,
上述干细胞为胚胎干细胞、成体干细胞或诱导多能干细胞。
13.一种培养液,其特征在于,包含通过权利要求1至12中任一项所述的方法生产的源自间充质干细胞的外泌体。
14.一种药学组合物,其特征在于,包含通过权利要求1至12中任一项所述的方法生产的源自间充质干细胞的外泌体作为有效成分。
15.一种化妆品组合物,其特征在于,包含通过权利要求1至12中任一项所述的方法生产的源自间充质干细胞的外泌体作为有效成分。
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