CN104487569A - 间充质干细胞的成骨分化 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种使用细胞外小泡用于诱导和/或促进成骨分化的方法及其用途。
Description
技术领域
本发明涉及一种诱导或促进细胞分化的方法，用于在诱导或促进所述分化中使用的细胞外小泡，所述小泡的用途以及一种使用所述小泡的治疗方法。
背景技术
在植入物表面处或在损伤部位处的早期骨形成的机制以及影响骨-植入物接触、稳定性和功能的维持的因素未得到完全理解。炎性细胞和干细胞与祖细胞在植入物的表面上通讯的途径的增加的知识对于理解应该如何优化下一代用于临床使用的植入物而言是重要的。伴随更多的知识，在将来，我们将有希望能够生产用于改进的骨整合的新的且更好的植入物或用于骨愈合的更好的药物。
单核细胞/巨噬细胞系统在宿主防御、伤口愈合以及生物材料表面处的免疫调控上发挥核心作用。单核细胞和间充质干细胞迅速迁移至植入的材料表面并且在细胞外基质沉积和骨形成之前被定位成彼此靠近。已经显示，来自人类单核细胞，包含例如促炎细胞因子的条件培养基促进人类间充质干细胞(hMSC)的成骨分化。单核细胞如何与MSC通讯未被完全确定，尽管已经提议它们在不存在直接的细胞间接触的情况下通讯。
细胞外小泡(EV)(包括外体)在细胞间通讯中发挥重要作用。细胞间通讯的一种提议的普遍机理涉及经由外体传递而递送RNA，很可能发生在微环境中但是潜在地还可能发生在远处。外体是内吞起源的小膜泡(40-100nm)，当多泡体与质膜融合时，其被释放进细胞外环境中。外体提供了一种细胞之间的通讯方式，其中一个细胞可以释放在微环境中或在一段距离上可以影响其他细胞的外体。外体释放自许多细胞并且其功能取决于细胞起源以及给予外体其特征性组成的产生细胞的情况。例如，起源自暴露于氧化应激的细胞的外体显示出赋予对抗受体细胞中的应激的保护性信息。
然而，对EV是否及如何影响受体细胞的分化所知甚少。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于诱导和/或促进细胞的成骨分化的方法，优选是间充质干细胞，更优选是人类间充质干细胞(hMSC)。本发明还涉及细胞外小泡用于增加骨再生及用于支持植入物的骨整合的用途。
在一个第一方面中，本发明涉及一种诱导和/或促进靶标干细胞的成骨分化的方法，该方法包括：
a.提供来自非靶标细胞的细胞培养物的条件培养基或分离自非靶标细胞的细胞外小泡；并且
b.将该培养基或这些细胞外小泡添加至这些靶标干细胞中。
在一个第二方面中，本发明涉及用于在靶标干细胞的成骨分化中使用的分离的细胞外小泡。
在一个第三方面中，本发明涉及一种培养基，该培养基包括由非靶标细胞获得的用于在靶标干细胞的成骨分化中使用的细胞外小泡。
在一个第四方面中，本发明涉及一种植入物表面，该表面包括一种暴露于细胞外小泡的涂层。
在一个第五方面中，本发明涉及一种植入物表面，该表面包括一种固定的经刺激的单核细胞、巨噬细胞或间充质干细胞的涂层，这些细胞能够产生外体。
在一个第六方面中，本发明涉及一种治疗患者的方法，该方法包括从该患者收集血液或组织样品，分离非靶标细胞，培养并刺激这些非靶标细胞，分离由这些非靶标细胞产生的外体并且将这些外体给予至该患者。
在一个第七方面中，本发明涉及分离的细胞外小泡用于治疗骨损伤、骨质疏松、骨发生或在骨固定中的用途。
在一个第八方面中，本发明涉及一种组合物，该组合物包括用于治疗骨损伤、骨空隙、骨质疏松或骨发生的分离的细胞外小泡。
在一个第九方面中，本发明涉及一种骨空隙填充物，该填充物包括分离的细胞外小泡。
附图说明
图1.从人类单核细胞细胞系HMC-1的条件培养基分离的并且经针对CD63免疫金标记的外体的透射电镜术图片。
图2.与抗-CD63乳胶珠粒轭合的从单核细胞衍生的外体的流式细胞术分析。将外体针对四次跨膜蛋白CD9、CD63和CD81(右图)以及同型匹配的对照(左图)进行免疫染色。
图3.从单核细胞外体及其供体细胞提取的蛋白质的蛋白质印迹分析。
图4.对来自单核细胞的外体的和细胞的总RNA和小RNA进行检测。电泳图谱披露了(a)单核细胞外体和细胞(b)中的总RNA以及外体(c)和细胞(d)中的小RNA的核苷酸大小分布(nt)和荧光强度(FU)。
图5.将流式细胞术分析(与用于单核细胞外体的类似)应用于从间充质干细胞中检测外体。数据显示间充质干细胞释放对于CD9、CD63和CD81呈阳性的外体。
图6.MSC外体的纳米颗粒跟踪分析。
图7.用针对CD63的免疫金标记的MSC外体的透射电镜术图片(条20nm)。
图8.电泳图谱披露了MSC和分离自MSC培养物的外体的总RNA的核苷酸大小分布(nt)和荧光强度(FU)。
图9.MSC外体向单核细胞的转移
将MSC外体分离，用一种绿色荧光染料(PKH67，西格玛(SIGMA))标记并且添加至培养物中的单核细胞里。24h后，通过(a)流式细胞仪和(b)荧光显微镜对标记的小泡的摄取进行分析。对照；PKH6染色的PBS。将DAPI用于细胞核染色。绿色细胞是对绿色外体呈阳性的单核细胞，显示它们已经摄取外体或附接至其表面的外体。
图10.MSC外体向MSC的转移与图9中的类似，将MSC外体分离，用一种绿色荧光染料(PKH67，西格玛)标记并且添加至MSC培养物中。24h后，通过(a)流式细胞仪和(b)荧光显微镜对摄取进行分析。对照；PKH6染色的PBS。将DAPI用于细胞核染色。绿色细胞是对绿色外体呈阳性的MSC，显示它们已经摄取外体或附接至其表面的外体。
图11.将释放自用LPS刺激的单核细胞/巨噬细胞的外体分离，用一种绿色荧光染料(PKH67，西格玛)标记并且添加至培养中的MSC里。将MSC在绿色外体的存在下培养大约72h，然后通过流式细胞仪(a)在荧光显微镜(b)中对细胞进行分析。将DAPI用于细胞核染色。绿色细胞是对绿色外体呈阳性的MSC，显示它们已经摄取外体或附接至其表面的外体。来自单核细胞/巨噬细胞的外体被摄取/附接至间充质干细胞。
图12.在hMSC中培养72h的Runx2和BMP-2在非条件对照培养基(对照)、在单核细胞条件培养基(CM)或在补充有外体的培养基(外体)中的基因表达。
具体实施方式
在本发明中，术语“一个靶标干细胞”或“多个靶标干细胞”意指有待被条件培养基或来自非靶标细胞的额外的细胞小泡诱导成骨分化的一个细胞或多个细胞。
术语“条件培养基”意指在已经除去培养的细胞后用于细胞培养的培养基。
通常将至细胞的信号传导认为是以可溶态呈现的和/或表面上的分子的作用，是与细胞的质膜或基质相关的。本发明涉及由细胞来源的，大约20-400nm或50-200nm，包含例如蛋白质、mRNA和微小RNA的细胞外小泡介导的细胞间通讯。这些小泡附接至、融合至靶标细胞或被靶标细胞内化并且在靶标细胞中发挥调控作用。这种通讯可以诱导和/或促进细胞(例如干细胞，尤其是人类间充质干细胞)的成骨分化。
诸位发明人已经开发了一种诱导和/或促进靶标细胞的成骨分化的方法。该方法包括提供来自非靶标细胞的细胞培养物的条件培养基或释放自非靶标细胞的分离的细胞外小泡。在一个实施例中，这些细胞外小泡是外体。这些额外的细胞小泡是通过培养非靶标细胞，任选地在非靶标细胞的刺激以释放所述小泡以及条件培养基或小泡的分离的过程中提供。可以将这些非靶标细胞培养不同时间，例如1小时或更久、或1天或更久、或2天或更久、或3天或更久。将该培养基或这些小泡添加至或接触可以是干细胞的靶标细胞。然后，这些小泡被诱导和/或促进成骨分化的靶标细胞摄取或附接其上。
这些靶标细胞可以是任何适合的细胞类型或细胞系，但是也可以是祖细胞或干细胞。这些细胞可以例如是成骨细胞、破骨细胞、肥大细胞、肌细胞、脂肪细胞或间充质干细胞(MSC)(例如人类MSC)。
据诸位发明人所知，没有描述经由细胞外体或具有类似特性的其他细胞外小泡的细胞之间的相互作用(cross-talk)的公开案，这些细胞是例如炎性细胞和靶标细胞(例如间充质干细胞)，该相互作用用于诱导和/或促进成骨分化。诸位发明人已经发现，细胞(如炎性细胞)向其他细胞(如间充质干细胞)发送信息，导致骨分化基因在受体细胞(例如干细胞)中的增加的表达。这些信息是外体和/或其他细胞外小泡。
根据本发明的靶标干细胞的成骨分化的诱导和/或促进可以通过刺激除靶标细胞以外的细胞(在此称为非靶标细胞)而进行。这些刺激的非靶标细胞可以是任何适合的细胞并且可以例如是单核细胞、巨噬细胞、红细胞、破骨细胞、肥大细胞、成肌细胞、角质形成细胞、脂肪细胞或任何其他炎性细胞或非炎性细胞以及干细胞(例如间充质干细胞)。优选地，这些非靶标细胞是单核细胞、巨噬细胞或干细胞，并且在一个优选实施例中，这些非靶标细胞是人类单核细胞、巨噬细胞或干细胞(例如hMSC)。该方法可以在体内和体外进行。
不被理论所束缚，这些靶标细胞或非靶标细胞的表型在诱导和/或促进成骨分化的成功中可以发挥一定作用。已知的是，来自具有不同表型的非靶标细胞的EV也具有不同表型和功能。此外，这些靶标细胞的表型可以影响EV是否可以结合至并且将其信息递送至靶标细胞，并且进一步影响该靶标细胞是否可以被定向在一个特定方向上。在本发明的一个实施例中，这些非靶标细胞是自体的或非自体的。在另一个实施例中，这些靶标细胞是自体的或非自体的。使用自体的益处可以是有限的免疫应答，而来自健康个体或未罹患有待治疗的疾病的个体的非自体细胞在其达到再生或愈合过程时可以是有益的。
能以多种方式刺激这些细胞，例如通过使用一种刺激剂，如脂多糖(LPS)、细胞因子、趋化因子或任何其他刺激物或其组合。刺激剂的量的范围可以是1至100ng/ml，例如1ng/ml或更多、或5ng/ml或更多、或10ng/ml或更多、或20ng/ml或更多、或100ng/ml或更少、或70ng/ml或更少、或50ng/ml或更少、或30ng/ml或更少。在一个实施例中，刺激剂的浓度范围是1至20ng/ml，在另一个实施例中，该浓度是5至50ng/ml，并且在又另一个实施例中，该浓度是5至15ng/ml。
不被理论所束缚，认为非靶标细胞(尤其是刺激的非靶标细胞)产生额外的分化刺激细胞小泡(释放自细胞的膜的小囊，例如外体)，当与靶标干细胞接触或被其摄取时，这些小泡诱导成骨分化。这些小泡(诱导和/或促进成骨分化小泡)可以分离自来自非靶标细胞中的任一个的条件培养基，这些非靶标细胞是例如单核细胞、巨噬细胞、红细胞、破骨细胞、肥大细胞、脂肪细胞以及干细胞(例如间充质干细胞)。这些小泡可以与其他生物分子(例如生长因子)混合。这些细胞外小泡的大小的范围可以是20至400nm，例如20nm或更大、或50nm或更大、或80nm或更大、或100nm或更大、或400nm或更小、或300nm或更小、或250nm或更小、或200nm或更小、或150nm或更小。图1披露了分离自条件培养基的外体。
在一个实施例中，这些分离的EV是释放自两种或更多种不同细胞类型的EV的组合。在另一个实施例中，这些分离的EV是释放自使用两种或更多种不同类型的刺激剂刺激的细胞的EV的组合。在又另一个实施例中，这些分离的EV是释放自两种或更多种不同细胞类型的EV的组合，其中使用至少一种不同类型的刺激剂对每种细胞类型进行刺激。
负责分化的细胞因子、生长因子或其他信号物质或物质的组合仍未被完全确定。这些细胞因子、生长因子和其他信号物质也可以用来刺激这些非靶向细胞，以释放例如具有一种特定表型和/或功能的细胞外小泡。其他信号物质可以例如是激素。潜在的细胞因子是IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、Il-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、IL-34、IL-35或IFN-类型，或其组合。潜在的生长因子是BMP、TGF、VEGF、TNF或FGF或其组合。趋化因子的实例将是类型CC、CXC、CX3C及XC中的任一种，例如CCL 2、CCL 3、CCL 5、CCL 7、CCL 8、CCL11、CCL 13、CCL 17、CCL 22、CCL 24、CCL 26、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5或其组合。其他信号物质可以例如是激素。
这些小泡可以进一步包括其他物质，例如其他蛋白质、生长因子(BMP、TGF、VEGF、TNF或FGF或其组合)、mRNA、miRNA或siRNA或其他调控小RNA。
在一个实施例中，使用脂多糖(LPS)、细胞因子、趋化因子、生长因子(BMP、TGF、VEGF、TNF或FGF或其组合)或任何其他刺激物或其组合刺激这些非靶向细胞，以释放包含蛋白质、生长因子(BMP、TGF、VEGF、TNF或FGF或其组合)、mRNA、miRNA或siRNA或其他调控小RNA或其组合的额外的细胞小泡。
在又另一个实施例中，使用脂多糖(LPS)、细胞因子、趋化因子、生长因子(BMP、TGF、VEGF、TNF或FGF或其组合)或任何其他刺激物或其组合刺激这些非靶向细胞，以释放包含蛋白质、生长因子(BMP、TGF、VEGF、TNF或FGF或其组合)、mRNA、miRNA或siRNA或其他调控小RNA或其组合的额外的细胞小泡。然后，将这些小泡添加至或接触靶标细胞，这些靶标细胞与脂多糖(LPS)、细胞因子、趋化因子、生长因子或任何其他刺激物或其组合处于组合形式。
诸位发明人已经证明，MSC和单核细胞两者都释放包含RNA的细胞外小泡(图1-8)，并且诸位发明人还已经证明，靶标MSC摄取释放的细胞外小泡(图9-10)。诸位发明人还已经证明，当根据本发明处理hMSC时，成骨分化被促进，如通过RUNX2和BMP-2的增加的基因表达所示例(图12)。
可以将这些细胞外小泡与一种例如PBS缓冲液或任何其他盐水缓冲液或任何其他培养基的细胞培养基(或条件培养基)混合。该培养基可以包含来自多于一种类型的非靶标细胞(例如两种、三种或四种细胞类型)的小泡。例如，该培养基可以包含来自单核细胞和hMSC，或单核细胞、hMSC和巨噬细胞的小泡的混合物。这些细胞外小泡可以在体外和体内提供给靶标细胞。
可以将来自非靶标细胞培养物的条件培养基或分离的细胞外小泡添加至需要骨再生的部位。该条件培养基或这些小泡也可以与靶标细胞一起被递送。通过将该培养基或这些小泡递送至靶标细胞定位的部位，成骨分化将得以诱导。可以通过注射或经由递送运载体的植入进行递送。与例如合成脂质体相比，细胞外小泡(例如外体)具有导致中度免疫应答或不导致免疫应答的益处。
将这些细胞外小泡以足够诱导和/或促进成骨分化的量添加至或接触靶标细胞。
此外，可以通过将这些小泡涂层或固定在表面上，例如在植入物的表面上，或作为药物递送系统的一部分来将这些小泡提供给干细胞。该植入物表面可以是一种金属表面(例如钛或氧化钛)或一种陶瓷表面(例如磷酸钙表面)。该药物递送系统可以例如是一种将缓慢释放这些小泡的水凝胶或生物降解材料。该水凝胶可以例如是透明质酸或壳聚糖或聚乙烯醇或其组合。在另一个实施例中，利用用于体内释放细胞外小泡的细胞涂覆或固定植入物表面。例如，可以用可释放增加数目的外体的经刺激的单核细胞、巨噬细胞或间充质干细胞涂覆或固定表面，以在植入物部位处诱导和/或促进成骨分化。
根据本发明的方法还可以用于治疗患者。该方法包括
-使用任何可得的适合技术从人(例如该患者本人)中收集血液或组织样品；
-分离非靶标细胞并且培养这些细胞并且任选地刺激这些非靶标细胞，以产生诱导和/或促进细胞外小泡；
-分离由这些非靶标细胞产生的所述细胞外小泡；并且
-向该患者给予这些细胞外小泡。
可以通过任何适合的技术全身地或局部地进行给予，例如通过至需要或想要成骨分化的位置的注射器。
可以将本发明用作骨外科、植入物外科、骨愈合治疗或骨或牙齿固定治疗过程中的辅助治疗。可以将这些分离的细胞外小泡固定在不同支架和植入物上，例如用于牙科应用(例如牙齿)、髋关节或膝盖的植入物或任何其他骨植入物。还可以将这些小泡固定在骨固定植入物(例如螺钉或固定板)上。此外，本发明可以用于治疗各种骨有关疾病和损伤，例如骨空隙填充材料、骨赘、颅缝早闭、骨关节炎，各种骨病、骨硬化、骨质疏松或骨发生。
实例
实例1
过程的一般描述
单核细胞的分离与培养：使用磁力分离从人类血液中分离单核细胞并且在不同生物材料上进行培养并且用或不用刺激(例如LPS)。间充质干细胞是通过梯度分离获得自人类骨髓。72h后，收获细胞并且从条件培养基中分离外体。
外体分离与检测：将使用以下的方法分离外体，该方法是基于重复的离心与过滤步骤以除去细胞碎片、凋亡小体等，随后超速离心以沉淀外体。还可以使用替代性分离方法。将使用包括电子显微术以及使用流式细胞术和蛋白质印迹法检测多种标记物的方法的组合来检测外体，这些标记物是通常发现于外体上的标记物(例如CD9、CD63、CD81、Tsg101)和应该不存在于外体中的标记物(钙联蛋白)。
外体的mRNA与微小RNA含量：将在来自暴露于不同刺激的单核细胞和MSC的外体上进行微阵列，以评估mRNA与微小RNA含量。
摄取实验：将分离的外体用一种荧光染料标记，添加至培养中的MSC里并且在不同时间点后使用荧光显微术和流式细胞术对摄取进行分析。
骨发生的评估：使用RT-PCR对组织学染色(冯·科萨法(von Kossa))和骨形成的标记物(骨钙素，runx2，I型胶原)进行评估。
材料与方法
人类单核细胞是通过磁力分离获得自血沉棕黄层(纯度90％-95％，n＝4)。将这些单核细胞用LPS(10ng/ml)处理72h并且将条件培养基(CM)进行收集。对人类脂肪来源的间充质干细胞(MSC)进行培养并且将条件培养基进行收集。将外体通过重复的离心与过滤步骤从CM中分离并且使用流式细胞术进行检测。对于流式细胞术分析，将外体与抗-CD63乳胶珠粒进行轭合并且针对四次跨膜蛋白CD9、CD63和CD81进行免疫染色。还使用透射电镜术和纳米颗粒跟踪分析将外体可视化。提取来自不同类型的小泡及其供体细胞的RNA并且使用一个生物分析仪分析大小分布图案。将hMSC在补充有单核细胞外体的培养基、CM或对照培养基中培养72h。使用实时PCR分析评估成骨分化(Runx2，BMP-2，n＝4)。通过dd-Ct方法计算靶标基因表达的相对定量。在单独的实验中，将人类单核细胞或hMSC在补充有PKH67染色的小泡的培养基中进行培养并且使用流式细胞术和显微术对摄取进行检查。
结果
流式细胞术分析揭示，LPS-刺激的单核细胞和MSC释放对于四次跨膜蛋白CD9、CD63和CD81呈阳性的外体，这些四次跨膜蛋白是通常用于外体检测的标记物，参见图2和5。
图11披露了来自单核细胞/巨噬细胞的外体被摄取/附接至间充质干细胞。与阴性对照相比，在绿色PKH67染色的外体的存在下培养的MSC在FL-1中是阳性的，表明这些外体附接至或与MSC融合或被MSC内化。此外，在补充有PKH67标记的绿色MSC外体的培养基中培养hMSC显示MSC对该绿色染料呈阳性，说明MSC经由外体与其他MSC通讯，参见图10。另外，用绿色MSC外体培养单核细胞也揭示，一部分单核细胞已经摄取或内化绿色外体，参见图9。
与对照培养基相比，在单核细胞CM或在补充有分离自CM的纯外体的培养基中培养hMSC持续72h，导致Runx2(倍数变化，分别是1.7±0.3和1.4±0.2)和BMP-2(倍数变化，分别是15.4±1.7和2.3±0.3)的显著增加的表达水平，参见图12。
这些结果证明，LPS-刺激的人类单核细胞释放增强间充质干细胞的成骨分化的因子并且这种作用的至少一部分归因于经由外体的通讯。
实例2
人类初级LPS刺激的单核细胞。培养3天后，分离外体并且提取RNA。对细胞的和外体的总RNA和小RNA进行生物分析器分析。电泳图谱示出了(图4)(a)外体和细胞(b)中的总RNA以及外体(c)和细胞(d)中的小RNA的核苷酸大小分布(nt)和荧光强度(FU)。
Claims (20)
1.一种诱导和/或促进靶标细胞的成骨分化的方法，该方法包括：
a.提供释放自非靶标细胞的诱导和/或促进成骨分化分离的细胞外小泡；并且
b.将这些细胞外小泡添加至这些靶标细胞中。
2.如权利要求1所述的方法，其中这些非靶标细胞是刺激的单核细胞、巨噬细胞或间充质干细胞或其他炎性或非炎性细胞。
3.如权利要求2所述的方法，其中用脂多糖、细胞因子、趋化因子或任何其他刺激物刺激这些非靶标细胞。
4.如权利要求2所述的方法，其中以任何其他方式刺激或修饰这些非靶标细胞，以释放诱导和/或促进间充质干细胞的成骨分化的细胞外小泡。
5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中这些细胞外小泡释放自单核细胞。
6.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中提供的这些小泡是释放自两种或更多种不同类型的细胞的小泡的组合，或释放自使用两种或更多种不同类型的刺激剂刺激的细胞的小泡的组合，或释放自两种或更多种不同细胞类型的EV的组合，其中使用至少一种不同类型的刺激剂刺激每个细胞类型。
7.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中这些细胞外小泡是外体。
8.来自非靶标细胞的分离的诱导和/或促进成骨分化细胞外小泡用于靶标细胞的成骨分化的用途。
9.根据权利要求8所述的小泡，其中这些非靶标细胞是经刺激的单核细胞、巨噬细胞或间充质干细胞或其他炎性或非炎性细胞。
10.根据权利要求9所述的小泡，其中用脂多糖、细胞因子、趋化因子或任何其他刺激物刺激这些非靶标细胞。
11.根据权利要求8至10中任一项所述的小泡，其中这些小泡是外体。
12.根据权利要求8至11中任一项所述的小泡，其中这些小泡悬浮于一种培养基中。
13.一种植入物，该植入物包括一种暴露于诱导和/或促进成骨分化细胞外小泡的涂层。
14.一种植入物，该植入物包括一种固定的经刺激的单核细胞、巨噬细胞或间充质干细胞的涂层，这些细胞能够产生诱导和/或促进成骨分化细胞外小泡。
15.根据权利要求13或14中任一项所述的植入物，其中该植入物是一种用于牙科应用、髋关节、膝盖的植入物、螺钉或固定板。
16.根据权利要求8至12中任一项用于治疗损伤、骨质疏松、骨发生或在骨固定中的用途。
17.一种组合物，该组合物包括分离的诱导和/或促进成骨分化细胞外小泡，这些细胞外小泡用于治疗骨损伤、骨空隙填充材料、骨赘、颅缝早闭、骨关节炎、各种骨病、骨质疏松或骨发生。
18.一种骨空隙填充物，该骨空隙填充物包括分离的诱导和/或促进成骨分化细胞外小泡。
19.根据权利要求18所述的骨空隙填充物，进一步包括靶向干细胞。
20.一种治疗患者的方法，该方法包括从该患者收集血液或组织样品，分离非靶标细胞，培养并刺激这些非靶标细胞，分离由这些非靶标细胞产生的细胞外小泡并且将这些细胞外小泡给予至该患者。
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