KR101787468B1 - 신규한 라이실 티알엔에이 합성효소 단편 및 이를 포함하는 마이크로베지클 - Google Patents

신규한 라이실 티알엔에이 합성효소 단편 및 이를 포함하는 마이크로베지클 Download PDF

Info

Publication number
KR101787468B1
KR101787468B1 KR1020150074892A KR20150074892A KR101787468B1 KR 101787468 B1 KR101787468 B1 KR 101787468B1 KR 1020150074892 A KR1020150074892 A KR 1020150074892A KR 20150074892 A KR20150074892 A KR 20150074892A KR 101787468 B1 KR101787468 B1 KR 101787468B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
krs
cancer
fragment
leu
glu
Prior art date
Application number
KR1020150074892A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20150137028A (ko
Inventor
김성훈
박민철
김상범
Original Assignee
재단법인 의약바이오컨버젼스연구단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 재단법인 의약바이오컨버젼스연구단 filed Critical 재단법인 의약바이오컨버젼스연구단
Publication of KR20150137028A publication Critical patent/KR20150137028A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101787468B1 publication Critical patent/KR101787468B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/93—Ligases (6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/25—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving enzymes not classifiable in groups C12Q1/26 - C12Q1/66
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y601/00—Ligases forming carbon-oxygen bonds (6.1)
    • C12Y601/01—Ligases forming aminoacyl-tRNA and related compounds (6.1.1)
    • C12Y601/01006—Lysine-tRNA ligase (6.1.1.6)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5011—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing antineoplastic activity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/9015—Ligases (6)

Abstract

본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하며 암세포로부터 분비되는 라이실 티알엔에이 합성효소(KRS) 단편, 상기 KRS 단편을 포함하는 마이크로베지클 및 이들을 이용하여 암 진단에 필요한 정보를 제공하고 암 전이 억제제를 스크리닝하는 방법에 관한 것으로, 본 발명은 암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위한 진단 키드 개발 또는 암 전이 억제제 개발에 유용하게 이용될 수 있어 산업상 이용가능성이 크다.

Description

신규한 라이실 티알엔에이 합성효소 단편 및 이를 포함하는 마이크로베지클{Novel lysyl tRNA synthetase fragment and microvesicle comprising the same}
본 발명은 신규한 라이실 티알엔에이 합성효소 단편 및 이를 포함하는 마이크로베지클에 관한 것으로, 보다 상세하게는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하며 암세포로부터 분비되는 라이실 티알엔에이 합성효소(KRS) 단편, 상기 KRS 단편을 포함하는 마이크로베지클 및 이들을 이용하여 암 진단에 필요한 정보를 제공하고 암 전이 억제제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
암(또는 종양)은 비정상적이고 비제어성이며 무질서한 세포증식의 산물이다. 특히, 파괴적인 성장성, 침투성 및 전이성이 있다면 악성으로 분류된다. 침투성이란 주위 조직을 침투 또는 파괴하는 성질로서, 일반적으로 조직의 경계를 이루는 기저층을 파괴시켜 종양이 국부적으로 전파되는 것을 의미하며, 종종 체내의 순환계로도 유입된다. 전이란 일반적으로 림프관(lymphotic) 또는 혈관에 의해 원발 위치와는 다른 곳으로 종양 세포가 퍼지는 것을 의미한다. 전이는 또한 장액성 체강 또는 다른 공간을 통해 직접 신장하여 종양 세포를 이동시키는 것을 의미하기도 한다. 이러한 암을 치료하기 위해서는, 먼저 치료 이전의 단계에서 높은 정확도와 특이도를 가진 암의 진단 방법의 개발이 무엇보다 중요하며, 나아가 암(및 이의 전이)에 대한 예후를 예측하여 맞춤형 진단 및 치료가 요구되고 있다.
한편, 사이토킨은 많은 세포에서 분비되는데, 그 중에서도 특히 면역세포에서 분비된다. 또한 사이토킨은 세포의 증식, 분화, 이동, 세포자살 등을 조절하는 세포 간 신호를 전달한다. 사이토킨들은 세포 내에서는 기능이 없기 때문에, 효과가 있기 위해서는 분비가 돼야만 한다. 대부분의 사이토킨들은 소포체로 향하는 시그널 펩티드 서열을 아미노 말단에 포함하고 있다. COP II 복합체가 사이토킨들을 소포체에서 골지체로 운반하면, 사이토킨들은 세포 외로 분비된다. 즉, 세포 내에 존재하는 전형적인(classical) 사이토킨들, 예를 들어 TNF-alpha, TGF-beta, IL1-beta는 세포 내의 기능이 없고, 시그널 펩티드 서열을 가지고선 ER-golgi를 거쳐서 세포 외부로 분비 되어서 기능을 한다.
비 전형적인(non-classical) 사이토킨들은 세포 내에서도 기능을 하기 때문에, 아미노 말단에 시그널 펩티드 서열을 갖고 있지 않다. 이런 이유로, 비 전형적인 사이토킨들은 비 보편적인 분비 경로를 통해 분비되는데, 비 보편적인 분비 경로로는 분비 매개 운반체, 외포작용(microvesicle shedding), 엑소좀 방출, 분비성 라이소좀 등이 있다. 상기 비 전형적 분비경로들 중에서 엑소좀은 세포 내 단백질, mRNA, micro RNA 등의 세포 내 분자들을 운반한다. 엑소좀은 직경 30-100 nm인 막 유래 마이크로베지클이다. 엑소좀은 다포성소체(MVBs) 내부에서 기원하여, 세포막에서 유래한 엔도좀과 혼합되어 세포 외로 방출된다. 여러 세포들 중 암세포와 면역 세포들은 세포 간 상호작용을 매개하기 위해 엑소좀을 방출한다.
KRS는 단백질 합성을 위하여 동족의(cognate) 아미노산 및 tRNA를 접합시키는 aminoacyl-t-RNA synthetases(ARSs)에 속한다. 이들 원시 효소들은 촉매적 활성 외에도 다면적(pleiotropic) 특징을 갖는다(Park, S. G., Ewalt, K. L. ＆ Kim, S. Functional expansion of aminoacyl-tRNA synthetases and their interacting factors: new perspectives on housekeepers. Trends Biochem. Sci . 30 , 569-574 (2005)). 이에 반해, KRS를 포함한 몇몇 포유류의 ARS는 구성 단백질의 다양한 기능을 조절하기 위하여, 분자 저장소(molecular reservoir)로서 작용하는(Ray, P. S., Arif, A. ＆ Fox, P. Macromolecular complexes as depots for releasable regulatory proteins. Trends Biochem. Sci. 32, 158-164 (2007)) 거대분자 복합체를 형성한다(Lee, S. W., Cho, B. H.,Park, S. G. ＆ Kim, S. Aminoacyl-tRNA synthetase complexes: beyond translation. J. Cell. Sci. 117, 3725-3734 (2004); Han, J. M., Kim, J. Y. ＆ Kim, S. Molecular network and functional implications of macromolecular tRNA synthetase complex. Biochem. Biophys. Res. Commun. 303, 985-993 (2003)).
KRS 단백질은 cancer cell에서 secretion되어서 macrophage를 통한 TNF-alpha secretion과 macrophage migration을 증가시켜서 염증반응을 일으킨다고 알려져 있다. KRS는 serum starvation시에 secretion이 일어나고 TNF-alpha를 동시에 처리 했을 때 secretion이 증가되는 것으로 알려져 있다. 이러한 KRS가 어떻게 secretion이 되는 가에 대해선 아직 알려진 바가 없다.
[비특허문헌 1] K. Choe, Y. Hwang, H. Seo, and P. Kim, "In vivo high spatiotemporal resolution visualization of circulating T lymphocytes in high endothelial venules of lymph nodes.," J.Biomed.Opt.,vol.18,no.3,p.036005,Mar.2013. [비특허문헌 2] N. Faust, F. Varas, L. M. Kelly, S. Heck, and T. Graf, "Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages," vol. 96, no. 2, pp. 719726, 2000.
이에 본 발명자들은 KRS의 분비기작에 관하여 연구하던 중, 세포 외 분비를 위하여 KRS가 caspase-8에 의해 필수적으로 절단되고 상기 절단에 의해 생성된 KRS단편이 엑소좀을 통해 세포 외로 분비된다는 신규한 사실을 규명하여, 상기 KRS 단편과 이를 포함하는 마이크로베지클(특히 엑소좀)의 암 진단 및 암 전이 억제제 스크리닝 용도를 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하며, 암세포로부터 분비되는 라이실 티알엔에이 합성효소 단편을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 라이실 티알엔에이 합성효소 단편을 포함하는 암세포에서 분비되는 마이크로베지클을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 (a) 암이 의심되는 개체로부터 채취한 생물학적 시료에서 마이크로베지클을 분리하는 단계; (b) 상기 (a) 단계의 마이크로베지클을 파쇄하여 서열번호 1의 라이실 티알엔에이 합성효소 단편 수준 또는 상기 단편을 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 단편 수준 또는 상기 단편을 암호화하는 유전자의 발현 수준을 정상 대조군 시료의 상기 단편 수준 또는 상기 단편을 암호화하는 유전자의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는 암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 (A) 라이실 티알엔에이 합성효소(KRS) 또는 이의 C-터미널 영역을 포함하는 KRS 단편, 신테닌(syntenin) 및 시험제제를 접촉시키는 단계; (B) 상기 KRS 또는 이의 단편과 신테닌의 결합수준의 변화를 측정하는 단계; 및 (C) 상기 KRS 또는 이의 단편과 신테닌의 결합수준을 변화시킨 시험제제를 암세포에 접촉시켜, 상기 암세포로부터 서열번호 1의 라이실 티알엔에이 합성효소 단편을 포함하는 마이크로베지클이 분비되는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는 암 전이 억제제 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적의 달성하기 위해, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하며, 암세포로부터 분비되는 라이실 티알엔에이 합성효소 단편을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 상기 라이실 티알엔에이 합성효소 단편을 포함하는 암세포에서 분비되는 마이크로베지클을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 (a) 암이 의심되는 개체로부터 채취한 생물학적 시료에서 마이크로베지클을 분리하는 단계; (b) 상기 (a) 단계의 마이크로베지클을 파쇄하여 서열번호 1의 라이실 티알엔에이 합성효소 단편 수준 또는 상기 단편을 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 단편 수준 또는 상기 단편을 암호화하는 유전자의 발현 수준을 정상 대조군 시료의 상기 단편 수준 또는 상기 단편을 암호화하는 유전자의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는 암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 (A) 라이실 티알엔에이 합성효소(KRS) 또는 이의 C-터미널 영역을 포함하는 KRS 단편, 신테닌(syntenin) 및 시험제제를 접촉시키는 단계; (B) 상기 KRS 또는 이의 단편과 신테닌의 결합수준의 변화를 측정하는 단계; 및 (C) 상기 KRS 또는 이의 단편과 신테닌의 결합수준을 변화시킨 시험제제를 암세포에 접촉시켜, 상기 암세포로부터 서열번호 1의 라이실 티알엔에이 합성효소 단편을 포함하는 마이크로베지클이 분비되는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는 암 전이 억제제 스크리닝 방법을 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
정의
다른 정의가 없는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 당업자들에 의해 통상적으로 이해되는 동일한 의미를 가진다. 다음의 참고문헌은 본 발명의 명세서에 사용된 여러 용어들의 일반적인 정의를 갖는 기술(skill)의 하나를 제공한다. Singleton et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY(2d ed. 1994); THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY(Walker ed., 1988); 및 Hale ＆ Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY. 또한 다음의 정의는 본 발명의 실시를 위해 독자(reader)에게 도움을 주기 위해 제공된다.
본 명세서에서 용어 "단백질"은 "폴리펩티드(polypeptide)" 또는 “펩티드(peptide)"와 호환성 있게 사용되며, 예컨대, 자연상태의 단백질에서 일반적으로 발견되는 바와 같이 아미노산 잔기의 중합체를 말한다.
본 발명에서 "핵산" 또는 "폴리뉴클레오티드" 는 단일-또는 이중-가닥의 형태로 된 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드를 말한다. 다른 제한이 없는 한, 자연적으로 생성되는 뉴클레오티드와 비슷한 방법으로 핵산에 혼성화되는 자연적 뉴클레오티드의 공지된 아날로그도 포함된다.
본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하며, 암세포로부터 분비되는 라이실 티알엔에이 합성효소 단편(KRS 단편)을 제공한다.
본 발명에서 "KRS"는 당업계에 라이실 티알엔에이 합성효소로 알려져 있는 전장(全長) 폴리펩티드를 말한다. 상기 KRS는 당업계에 라이실 티알엔에이 합성효소로 알려진 것이라면 그 구체적 아미노산 서열이 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어 서열번호 2(Genbank Accession No. NP_005539.1), 서열번호 3(Genbank Accession No. NP_001123561.1) 등을 포함한다. 본 발명에서 KRS는 바람직하게 서열번호 2(Genbank Accession No. NP_005539.1)로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드를 의미하는 것 일 수 있다.
본 발명에서 용어“KRS 단편”은 상기 KRS 폴리펩타이드 전장 서열에 대한 일부 단편을 의미하는 것으로서, 본 발명의 KRS 단편은 바람직하게 공지의 인간 KRS(Genbank Accession No. NP_005539.1)의 N-말단으로부터 1 내지 12번째 아미노산이 결실된 형태의, 서열번호 1로 표시되는 단편을 의미한다. 본 발명자는 암세포로부터 기존에 KRS 단백질로 알려진 폴리펩타이드의 전장 서열이 분비되는 것이 아니라, KRS가 세포 내에서 가공되어 일부 영역이 절단된 KRS 단편(서열번호 1) 형태로 분비되고 이때 엑소좀 등의 마이크로베지클을 그 분비 수단으로 이용하며, 이러한 과정은 암 전이의 미세환경 조성에 관여하는 상기 KRS 유래 성분이 활성을 나타내는데 있어서 필수 불가결하다는 사실을 밝혔으며, 이는 본 발명에서 최초로 공개하는 것이다. 이는 본 발명의 명세서 실시예에 잘 나타나 있다.
본 발명은 바람직하게, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지며 암세포로부터 분비되는 라이실 티알엔에이 합성효소 단편을 제공하며, 상기 본 발명의 KRS 단편은 이의 기능적 동등물을 포함하는 의미 일 수 있다.
상기 기능적 동등물이란 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상의 서열 상동성(즉, 동일성)을 갖는 폴리펩티드를 말한다. 예를 들면, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 것으로, 서열번호 1로 표시되는 폴리펩티드와 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 폴리펩티드를 말한다. 상기 기능적 동등물은 서열번호 1의 아미노산 서열 중 일부가 부가, 치환 또는 결실의 결과 생성될 것 일 수 있다. 상기에서 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환이다. 천연에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 다음과 같다 지방족 아미노산(Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산(Ile, Leu, Val), 방향족 아미노산(Phe, Tyr, Trp), 산성 아미노산(Asp, Glu), 염기성 아미노산(His, Lys, Arg, Gln, Asn) 및 황함유 아미노산(Cys, Met). 또한 상기 기능적 동등물에는 본 발명의 KRS 단편 폴리펩티드의 아미노산 서열상에서 아미노산의 일부가 결실된 변형체도 포함된다. 상기 아미노산의 결실 또는 치환은 바람직하게는 본 발명의 폴리펩티드의 생리활성에 직접적으로 관련되지 않은 영역에 위치해 있다. 또한 아미노산의 결실은 바람직하게는 KRS 단편 폴리펩티드의 생리활성에 직접 관여하지 않는 부분에 위치한다. 아울러 상기 KRS 단편 폴리펩티드의 아미노산 서열의 양 말단 또는 서열 내에 몇몇의 아미노산이 부가된 변형체도 포함된다. 또한 본 발명의 기능적 동등물의 범위에는 본 발명에 따른 폴리펩티드의 기본 골격 및 이의 생리 활성을 유지하면서 폴리펩티드의 일부 화학 구조가 변형된 폴리펩티드 유도체도 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드의 안정성, 저장성, 휘발성 또는 용해도 등을 변경시키기 위한 구조변경이 이에 포함된다.
본 명세서에서 서열 상동성 및 동질성은 KRS 단편의 아미노산 서열(서열번호 1)과 후보 서열을 정렬하고 갭(gaps)을 도입한 후 KRS 단편의 아미노산 서열에 대한 후보 서열의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 필요한 경우, 최대 백분율 서열 동질성을 수득하기 위하여 서열 동질성의 부분으로서 보존적 치환은 고려하지 않는다. 또한, KRS 단편의 아미노산 서열의 N-말단, C-말단 또는 내부 신장, 결손 또는 삽입은 서열 동질성 또는 상동성에 영향을 주는 서열로서 해석되지 않는다. 또한, 상기 서열 동질성은 두 개의 폴리펩티드의 아미노산 서열의 유사한 부분을 비교하기 위해 사용되는 일반적인 표준 방법에 의해 결정할 수 있다. BLAST 또는 FASTA와 같은 컴퓨터 프로그램은 두 개의 폴리펩티드를 각각의 아미노산이 최적으로 매칭되도록 정렬한다(하나 또는 두 서열의 전장서열을 따라 또는 하나 또는 두 서열의 예측된 부분을 따라). 상기 프로그램은 디펄트 오프닝 페널티(default opening penalty) 및 디펄트 갭 페널티(default gap penalty)를 제공하며 컴퓨터 프로그램과 함께 연계되어 사용될 수 있는 PAM250(표준 스코링 매트릭스 Dayhoff et al., in Atlas of Protein Sequence and Structure, vol 5, supp 3, 1978)와 같은 스코링 매트릭스를 제공한다. 예를 들어, 백분율 동질성은 다음과 같이 계산할 수 있다. 일치하는 서열(identical matches)의 총 수에 100을 곱한 다음 대응되는 스팬(matched span) 내의 보다 긴 서열의 길이와 두 서열을 정렬하기 위해 보다 긴 서열 내로 도입된 갭(gaps)의 수의 합으로 나눈다.
본 발명에 따른 KRS 단편은 천연에서 추출하거나 유전공학적 방법에 의해 작제될 수 있다. 예를 들면, 통상적인 방법에 따라 상기 KRS 단편 또는 이의 기능적 동등물을 암호화하는 핵산(예를들어, 서열번호 5의 폴리뉴클레오타이드 서열)을 작제한다. 상기 핵산은 적절한 프라이머를 사용하여 PCR 증폭함으로써 작제할 수 있다. 다른 방법으로 당업계에 공지된 표준 방법에 의해, 예컨대, 자동 DNA 합성기(Biosearch 또는 Applied Biosystems 사에서 판매하는 것)을 사용하여 DNA 서열을 합성할 수도 있다. 작제된 핵산은 이에 작동가능하게 연결되어(operatively linked) 핵산의 발현을 조절하는 하나 이상의 발현 조절 서열(expression control sequence)(예: 프로모터, 인핸서 등)을 포함하는 벡터에 삽입시키고, 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주세포를 형질전환 시킨다. 생성된 형질전환체를 상기 핵산이 발현되기에 적절한 배지 및 조건 하에서 배양하여, 배양물로부터 상기 핵산에 의해 발현된, 실질적으로 순수한 폴리펩티드를 회수한다. 상기 회수는 당업계에 공지된 방법(예컨대, 크로마토그래피)을 이용하여 수행할 수 있다. 상기에서 "실질적으로 순수한 폴리펩티드(substantially pure polypeptide)"라 함은 본 발명에 따른 폴리펩티드가 숙주세포로부터 유래된 어떠한 다른 단백질도 실질적으로 포함하지 않는 것을 의미한다. 본 발명의 폴리펩티드 합성을 위한 유전공학적 방법은 다음의 문헌을 참고할 수 있다: Maniatis et al., Molecular Cloning; A laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, 1982; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y., Second(1998) and Third(2000) Editions Gene Expression Technology, Method in Enzymology, Genetics and Molecular Biology, Method in Enzymology, Guthrie & Fink(eds.), Academic Press, San Diego, Calif, 1991; 및 Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:12073-12080, 1990.
또한, 본 발명의 폴리펩티드는 당업계에 공지된 화학적 합성(Creighton, Proteins; Structures and Molecular Principles, W. H. Freeman and Co., NY, 1983)에 의해 쉽게 제조될 수 있다. 대표적인 방법으로서 이들로 한정되는 것은 아니지만 액체 또는 고체상 합성, 단편 응축, F-MOC 또는 T-BOC 화학법이 포함된다(Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, Williams et al., Eds., CRC Press, Boca Raton Florida, 1997; A Practical Approach, Athert on ＆ Sheppard, Eds., IRL Press, Oxford, England, 1989).
본 발명은 상기 라이실 티알엔에이 합성효소 단편을 포함하는 암세포에서 분비되는 마이크로베지클을 제공한다.
본 발명에서 용어‘마이크로베지클’은 세포막 성분으로 이루어진 지질 이중층에 의해 내부와 외부가 구분되며 세포의 세포막 지질과 단백질, 핵산 및 기타 세포 성분 등을 가지고 있고 원래 세포보다 크기가 작은 소낭입자를 의미한다.
본 발명에서 서열번호 1의 KRS 단편이 이의 세포외 분비 수단으로서 이용하는 마이크로베지클은 엑소좀, 엑소좀 형태의 마이크로베지클(exosome-like microvesicle, 엑소좀 유사 마이크로베지클), epididimosomes, argosomes, promininosomes, prostasomes, dexosomes, texosomes, archeosomes 및 oncosomes로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 마이크로베지클일 수 있다. 바람직하게 본 발명에서 마이크로베지클은 엑소좀 또는 엑소좀 형태의 마이크로베지클(exosome-like microvesicle) 일 수 있으며, 가장 바람직하게는 엑소좀인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 상기 마이크로베지클은 바람직하게 10nm 내지 1000nm의 직경을 가지는 것일 수 있고, 더욱 바람직하게는 10nm 내지 200nm의 직경을 가지는 것 일 수 있고, 가장 바람직하게는 50nm 내지 150nm의 직경을 가지는 것일 수 있다.
본 발명의 KRS 단편 및 이를 포함하는 마이크로베지클은 암세포로부터 분비되는 것이 특징으로, 상기 암은 유방암, 대장암, 폐암, 소세포폐암, 위암, 간암, 혈액암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문부근암, 결장암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암, 질암, 음문암종, 호지킨병, 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장암, 수뇨관 암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, CNS종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간신경교종 및 뇌하수체 선종으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 마이크로베지클은 in vivo 상에서 생체 내 암세포로부터 자연적으로 분비되나, 본 발명의 마이크로베지클을 다량으로 수득하기 위하여 하기와 같은 단계를 포함하는 제조방법을 통해 in vitro 상에서도 분비를 유도할 수 있다; (1) 암세포에 기아(starvation) 스트레스를 처리하는 단계; 및 (2) 상기 단계의 세포에서 분비된 마이크로베지클을 수집하는 단계.
상기 (1) 단계에서는 암세포에 기아(starvation) 스트레스를 부여하여, 세포 내에서 서열번호 1의 KRS 단편을 생성 촉진하고 이들의 분비 기작을 활성화한다.
세포에 기아 스트레스를 부여하는 방법은 당업계에 공지되어있으며, 예를 들어 혈청을 제거한 배지(serum free-media)에서 암 세포를 배양하는 것 일 수 있다. 본 발명의 마이크로베지클을 분비할 수 있는 암 종류에 대해서는 전술한 바와 같다.
또한 상기 (1) 단계에서는 상기 기아 스트레스와 더불어 TNF-alpha 를 처리하는 공정이 추가적으로 수행될 수 있다.
상기 (2) 단계는 상기 (1)단계의 세포로부터 생성되어 세포 외로 분비된 마이크로베지클만을 분리 수득하는 단계이다. 상기 (1) 단계에서 세포에 기아(starvation) 스트레스를 주며 배양된 세포 배양배지를 회수하여, 본 발명의 KRS 단편이 포함되어있는 것으로 추정되는 특정 크기 또는/및 밀도의 구조물(입자) 분획을 회수한다.
혼합물로부터 목적하는 크기 또는/및 밀도의 입자만을 분리 수득하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를들어 밀도 구배, 원심분리(ex. 초원심분리, 밀도기울기원심법 등), 여과(ex. 특정 직경의 filter를 사용하는 방법 등), 투석, 및 자유 유동 전기 이동법 등이 포함된다. 상기 여러 가지 방법들을 하나 이상, 수회 반복 수행하여 목적하는 입자크기의 수득물을 얻을 수 있다.
한가지 실시 양태에서, 상기 (2) 단계에서는 전술한 방법을 통하여 10nm 내지 1000nm의 직경을 가지는 마이크로베지클들을 수득하는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 10nm 내지 200nm의 직경을 가지는 마이크로베지클들을 수득할 수 있으며, 가장 바람직하게는 50nm 내지 150nm의 직경을 가지는 마이크로 베지클들을 수득하는 것이 바람직하다.
또 한가지 실시 양태에서, 상기 (2) 단계에서는 전술한 방법을 통하여 1.09 g/ml 내지 1.19g/ml의 밀도를 가지는 마이크로베지클들을 수득하는 것이 바람직할 수 있다. 가장 바람직하게는 1.09 g/ml 내지 1.18g/ml의 밀도를 가지는 마이크로베지클들을 수득하는 것이 바람직할 수 있다.
본 발명의 서열번호 1로 표시되는 KRS 단편은 마이크로베지클(특히, 엑소좀)의 형태로 암세포에서 특이적으로 세포 외로 분비되므로 생체에서 암의 진단 마커 용도로서 이용될 수 있다. 뿐만 아니라 암 세포로부터의 자연적 작제물인 본 발명의 마이크로베지클은 서열번호 1의 KRS 단편을 세포 밖으로 분비하는 운반체로서, 암의 미세환경과 관련하여 주변 대식세포 및 호중구(대식세포/호중구)의 소집 및 암전이와 관련된 사이토카인의 분비를 촉진하여 암 조직 주변에 암 전이 환경을 조성한다. 따라서 본 발명의 마이크로베지클은 암 진단 또는 암 전이의 진단을 위한 바이오마커로서 기능할 수 있다. 따라서 본 발명은 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 KRS 단편 또는 상기 KRS 단편을 포함하는 마이크로베지클을 포함하는 암 진단 또는 암의 전이 진단 마커 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어“진단”은 질병 발생의 예측 및 질병 발생위험도를 결정하거나 도출시키는데 사용되는 모든 유형의 분석을 포함한다.
본 발명에서 용어“암 진단 마커”란 암 조직 및 세포에서 발현되고 이의 발현 여부를 확인함으로써 암의 발병을 확인할 수 있는 물질, 바람직하게는 정상조직과 암 조직에서 유의한 차이를 보이는 단백질 또는 mRNA 등과 같은 유기 생체 분자를 의미한다. 또한 본 발명에서 용어“암의 전이 진단 마커”란 전이(metastasis)의 징후를 보이는 암 세포에서 발현되고 이의 발현 여부를 확인함으로서 암의 전이 가능성 여부를 확인할 수 있는 물질, 바람직하게는 정상조직과 암 조직에서 유의한 차이를 보이는 단백질 또는 mRNA 등과 같은 유기 생체 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 암 진단 마커 또는 암전이 진단 마커는 다양한 암 조직 및 세포에서만 특이적으로 발현되는 서열번호 1로 표시되는 KRS 단편 또는 이를 포함하는 마이크로베지클이며, 서열번호 1로 표시되는 KRS 단편 또는 이를 포함하는 마이크로베지클이 세포 외로 분비되었는지 여부를 확인함으로써 암을 진단할 수 있다.
기존에 암을 진단하는 일반적인 방법은 초기 전이 상태에서 암이 발생된 것으로 추정되는 조직의 일정부분을 떼어내어 조사하는 생검(biopsy)인데, 정확한 생검부위를 결정하는 것은 쉽지 않은 단점이 있다. 뿐만 아니라 조직 샘플링 시의 침습정도에 따라 개체에 추가적인 손상 및 2차적 병증을 야기(즉, 합병증)할 수 있다는 위험성이 있다. 즉, 생물학적 마커에 대하여 대다수는 세포 내부에서 발현상태를 유지하고 있으며, 이는 종종 해당 환부 조직의 채취를 위한 침습을 필요로 하고, 상기 조직의 침습적 샘플링은 개체에 추가적인 병리상태를 야기 및 심화시킬 위험성이 존재한다.
그러나 본 발명의 마커는 암세포로부터 특수한 과정을 거쳐 가공 및 분비되므로, 본 발명의 상기 마커를 대상으로하여 암 및 이의 전이 가능성 여부 진단에 이용하는 경우에는, 기존처럼 암의 환부로부터 직접적으로 조직을 채취하지 않고도, 이보다 덜 침습적인 방법인 액체 생검(liquid biopsy) 등의 방법으로도 암(또는 이의 전이 가능성) 여부를 진단 할 수 있다는 장점이 있다. 상기 액체 생검은 종양 환자의 생체 고형조직 대신 체액을 이용한 검사이다. 액체 생검은 기존 생체조직검사에 비해 시료 채취가 간단하며, 환자의 고통 및 감염 위험성 등이 적은 것으로 알려져 있다.
또한, 본 발명은 상기 본 발명의 마커(서열번호 1로 표시되는 KRS 단편 또는 이를 포함하는 마이크로베지클)의 존재 여부와, 그 양, 패턴 또는 양자 모두를 검출하는 물질(시약)을 포함하는 암 진단용 조성물을 제공한다. 상기 마커의 존재 여부와, 그 양, 패턴 또는 양자 모두를 검출하는 물질은 본 발명의 마커에 특이적인 항체 일 수 있다.
본 발명의 한 실시 양태에서, 서열번호 1로 표시되는 KRS 단편을 마커로 이용하는 경우, 이의 존재 여부와, 그 양, 패턴 또는 양자 모두를 검출하는 것은 단백질 수준에서의 검출 또는 상기 마커를 코딩하는 유전자 수준에서의 검출을 모두 포함하는 의미일 수 있으나, 본원에서는 바람직하게 단백질 수준에서의 검출을 의미한다. 이때 단백질 수준에서 검출할 수 있는 시약은 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 기질, 앱타머, 수용체, 리간드 또는 보조인자, 또는 질량분광분석기 검출용 시약 등을 포함하며, 이에 제한되지 않는다.
상기 검출에 사용되는 물질(시약)은, 본 발명의 서열번호 1로 표시되는 KRS 단편 또는 이를 포함하는 마이크로베지클을 전술한 바와 같은 방법으로 제조하여 이에 대한 분석을 기반으로 제작 및 선별될 수 있다.
또한 본 발명은 암 진단용 키트로서, 본 발명에 따른 마커를 검출하기 위한 시약과 이의 분석을 위한 장치 또는 알고리즘이 내장된 컴퓨터를 포함하는 암 진단용 키트를 제공한다.
한가지 실시 양태에서, 상기 본 발명의 마커를 이용하여 암(또는 암 전이 가능성 여부) 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법은 하기의 단계를 포함하여 수행되는 것 일 수 있다;
(a) 암이 의심되는 개체로부터 채취된 생물학적 시료에서 마이크로베지클을 분리하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계의 마이크로베지클을 파쇄하여 서열번호 1의 라이실 티알엔에이 합성효소 단편 수준 또는 상기 단편을 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(c) 상기 단편 수준 또는 상기 단편을 암호화하는 유전자의 발현 수준을 정상 대조구 시료의 상기 단편 수준 또는 상기 단편을 암호화하는 유전자의 발현 수준과 비교하는 단계.
이하 각 단계별로 설명한다.
(a) 단계에서는 암이 의심되는 개체로부터 채취된 생물학적 시료에서 마이크로베지클을 분리한다.
본 발명에서 용어‘개체(subject)’란 암 진단 대상이 되는 동물을 의미하는 것으로, 바람직하게는 포유동물, 특히 인간을 포함하는 동물일 수 있다. 상기 개체는 치료가 필요한 환자(patient)일 수 있다.
상기 생물학적 시료는 암이 의심되는 개체로부터 분리 수득되는 것으로서, 본 발명에서 세포로부터 분비된 마이크로베지클을 수득할 수 있는 시료라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어 암종의 조직, 세포, 전혈(혈액), 혈장, 혈청, 침, 안구액, 뇌척수액, 땀, 뇨, 젖, 복수액, 활액, 복막액, 림프액 등일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 가장 바람직하게 상기 생물학적 시료는 뇨, 혈액, 혈청 또는 림프액 일 수 있다. 시료는 검출에 사용하기 전에 전처리 할 수 있다. 예를 들어, 여과, 증류, 추출, 농축, 방해 성분의 불활성화, 시약의 첨가 등을 포함할 수 있다.
상기 (a) 단계에서는 시료로부터 목적하는 마이크로베지클을 분리하며, 이때 혼합물로부터 목적하는 크기 또는/및 밀도의 입자만을 분리 수득하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를들어 밀도 구배(ex. 피콜(Ficoll), 글리세롤(Glycerol), 수크로즈(Sucrose), 옵티프렙(OptiPrep™) 등에 의한 밀도 구배), 원심분리(ex. 초원심분리, 밀도기울기원심법 등), 여과(ex. 겔 여과(gel filtration) 또는 한외여과(ultrafiltration) 등 특정 직경의 filter를 사용하는 방법 등), 투석, 및 자유 유동 전기 이동법 등이 포함된다. 상기 여러 가지 방법들을 하나 이상, 수회 반복 수행하여 목적하는 입자크기의 수득물을 얻을 수 있다.
한가지 실시 양태에서, 상기 (a) 단계에서는 전술한 방법을 통하여 10nm 내지 1000nm의 직경을 가지는 마이크로베지클들을 수득하는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 10nm 내지 200nm의 직경을 가지는 마이크로베지클들을 수득할 수 있으며, 가장 바람직하게는 가장 바람직하게는 50nm 내지 150nm의 직경을 가지는 마이크로 베지클들을 수득하는 것이 바람직하다.
또 한가지 실시 양태에서, 상기 (a) 단계에서는 전술한 방법을 통하여 1.09 g/ml 내지 1.19g/ml의 밀도를 가지는 마이크로베지클들을 수득하는 것이 바람직할 수 있다. 가장 바람직하게는 1.09g/ml 내지 1.18 g/ml의 밀도를 가지는 마이크로베지클들을 수득하는 것이 바람직할 수 있다.
(b) 단계에서는 상기 (a)단계에서 분리수득한 마이크로베지클을 파쇄하고, 서열번호 1의 KRS 단편 수준(level) 또는 상기 단편을 암호화하는 유전자의 발현수준을 측정하며, (c) 단계에서는 상기 단편 수준 또는 상기 단편을 암호화하는 유전자의 발현 수준을 정상 대조구 시료의 상기 단편 수준 또는 상기 단편을 암호화하는 유전자의 발현 수준과 비교한다.
상기에서 암세포가 KRS(단편)를 세포 외로 분비할 시에, 마이크로베지클(특히, 엑소좀)을 이용한다는 것을 설명한 바 있다. 따라서 개체로부터 수득된 생물학적 시료로부터 분리한 마이크로베지클에서 서열번호 1의 KRS 단편이 높은 수준으로 검출된다면(특히, 정상 대조구 시료와 대비하여), 상기 개체는 암의 발병 및 진행상태를 경험하고 있을 가능성이 매우 높다.
상기 서열번호 1의 KRS 단편 수준의 검출은 당업계에 공지된 다양한 면역분석 방법을 통해 실시될 수 있다. 예를 들어, 상기 KRS 단편 수준의 검출 및 이의 양적 변화는 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경쟁 분석, 그리고 샌드위치 분석등을 사용할 수 있고, 이외에도 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역염색, 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 웨스턴 블랏, 단백질 칩(protein chip) 등이 사용될수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한 상기 KRS 단편을 암호화하는 유전자의 발현 수준은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 실시될 수 있다. 예를 들어, mRNA 발현수준은 RT-PCR(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블롯팅(Peter B. Kaufma et al., Molecular 및 Cellular Methods in Biology 및 Medicine, 102-108, CRC press), cDNA 마이크로어레이를 이용한 혼성화 반응(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)) 또는 인 시투(in situ) 혼성화 반응(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), DNA 칩 등을 이용하여 실시할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
한편, 본 발명은
(A) 라이실 티알엔에이 합성효소(KRS) 또는 이의 C-터미널 영역을 포함하는 KRS 단편, 신테닌(syntenin) 및 시험제제를 접촉시키는 단계;
(B) 상기 KRS 또는 이의 단편과 신테닌의 결합수준의 변화를 측정하는 단계; 및
(C) 상기 KRS 또는 이의 단편과 신테닌의 결합수준을 변화시킨 시험제제를 암세포에 접촉시켜, 상기 암세포로부터 서열번호 1의 라이실 티알엔에이 합성효소 단편을 포함하는 마이크로베지클이 분비되는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는 암 전이 억제제 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명자는 본 발명의 마이크로베지클(특히 KRS exosome)이 암 세포로부터 분비되어 주변 조직에 암 전이(metastasis)환경을 조성하며, 상기 마이크로베지클의 분비에 신테닌이 중요하게 작용한다는 사실을 규명하였다. 구체적으로, KRS가 세포 내에서 N-terminal이 잘리는 과정을 통해 신테닌-1(syntenin-1)과의 결합이 증가되고 이렇게 신테닌과 결합이 증가하는 것은 KRS exosome 분비에 중요함을 규명하였으며, 상기 분비된 KRS exosome이 macrophage 및 neutrophil의 소집(recruitment)에 작용하고 cancer metastasis를 촉진하는 사이토카인들의 분비를 증가시켜 암 전이에 중요한 역할을 한다. 따라서, 본 발명은 KRS 단편과 이를 포함하는 마이크로베지클의 전술한 분비 특성에 기반하여 상기 (A) 내지 (C)단계를 포함하는 암 전이 억제제 스크리닝 방법을 제공하며, 이하 단계별로 설명한다.
상기 (A) 단계에서는 (ⅰ) 라이실 티알엔에이 합성효소(KRS) 또는 이의 C-터미널 영역을 포함하는 KRS 단편과 (ⅱ) 신테닌 및 (ⅲ) 시험제제를 접촉시키는 단계이다.
상기 KRS 는 당업계에 라이실 티알엔에이 합성 효소로 알려진 것이라면 그 아미노산 서열이 특별히 제한되지 않으며, 예를들어 서열번호 2(Genbank Accession No. NP_005539.1), 서열번호 3(Genbank Accession No. NP_001123561.1) 등이 당업계에 알려져있다. 상기 (A) 단계에서 KRS는 이의 기능적 동등물도 포함하는 의미이다.
상기 (A) 단계에서 사용되는 KRS 단편은 KRS 폴리펩타이드 전장 서열에 대한 조각(단편) 중에서도 KRS의 C-터미널 영역을 포함하는 단편인 것을 특징으로 한다. 상기 KRS의 C-터미널 영역은 바람직하게 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열(VGTSV)로 이루어지는 것 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
바람직하게 상기 (A) 단계에서 사용가능한 KRS 단편(KRS C-터미널 영역을 포함)은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 것 일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 또한 상기 (A) 단계에서의 KRS 단편은 이의 기능적 동등물도 포함하는 의미이다.
상기 신테닌(syntenin)은 바람직하게 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 신테닌-1(syntenin-1) 폴리펩티드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 "제제(agent)" 또는 "시험 제제(test agent)"라 함은 임의의 물질(substance), 분자(molecule), 원소(element), 화합물(compound), 실재물(entity) 또는 이들의 조합을 포함한다. 예컨대, 이에 제한되지는 않으나, 단백질, 폴리펩티드, 소 유기 물질(small organic molecule), 다당류(polysaccharide), 폴리뉴클레오티드 등을 포함한다. 또한 자연 산물(natural product), 합성 화합물 또는 화학 화합물 또는 2개 이상의 물질의 조합일 수도 있다. 다르게 지정되지 않는 한, 제제, 물질 및 화합물은 호환성 있게(interchangeably) 사용할 수 있다.
보다 구체적으로 본 발명의 스크리닝 방법으로 스크리닝 될 수 있는 시험 제제는, 폴리펩티드, 베타-턴 미메틱(beta-turn mimetics), 다당류, 인지질, 호르몬, 프로스타글란딘, 스테로이드, 방향족 화합물, 헤테로사이클릭 화합물, 벤조디아제핀(benzodiazepines), 올리고머릭 N-치환 글리신(oligomeric N-substituted glycines), 올리고카르바메이트(oligocarbamates), 당류(saccharides), 지방산, 퓨린, 피리미딘 또는 이들의 유도체, 구조적 아날로그 또는 조합을 포함한다. 어떤 시험 제제는 합성 물질일 수 있으며, 다른 시험 제제는 천연물질일 수 있다. 상기 시험 제제는 합성 또는 자연 화합물의 라이브러리를 포함하는 광범위하고 다양한 출처로부터 얻어질 수 있다. 조합(combinatorial) 라이브러리는 스텝-바이-스텝 방식으로 합성될 수 있는 여러 종류의 화합물로 생산 될 수 있다. 다수의 조합 라이브러리의 화합물들은 ESL(encoded synthetic libraries) 방법(WO 95/12608, WO93/06121, WO 94/08051, WO 95/395503 및 WO 95/30642)에 의해 제조될 수 있다. 펩티드 라이브러리는 파지 디스플레이 방법(WO91/18980)에 의해 제조될 수 있다. 박테리아, 곰팡이, 식물 및 동물 추출물 형태의 자연 화합물의 라이브러리는 상업적인 출처로부터 얻거나 또는 필드(field)에서 수집될 수 있다. 공지된 약리학적(pharmacological) 제제가 구조적 아날로그를 제조하기 위하여 아실화, 알킬화, 에스테르화 반응(esterification), 아미드화 반응(amidification)과 같은 지시되거나(direct) 무작위한 화학적 수식에 적용될 수 있다.
상기 시험 제제는 자연적으로 생성되는 단백질 또는 그의 단편일 수 있다. 이런 시험 제제는 자연 출처(natural source), 예컨대, 세포 또는 조직 용해물로부터 수득될 수 있다. 폴리펩티드 제제의 라이브러리는 예컨대, 통상적인 방법에 의해 생성되거나 상업적으로 입수할 수 있는 cDNA 라이브러리로부터 수득될 수 있다.상기 시험 제제는 펩티드, 예컨대, 약 5-30개, 바람직하게는 약 5-20개, 보다 바람직하게는 약 7-15개의 아미노산을 가지는 펩티드일 수 있다. 상기 펩티드는 자연적으로 생성되는 단백질, 랜덤 펩티드 또는 "바이어스(biased)" 랜덤 펩티드의 절단물일 수 있다.
또한 상기 시험 제제는 "핵산"일 수 있다. 핵산 시험 제제는 자연적으로 생성되는 핵산, 랜덤 핵산, 또는 "바이어스(biased)" 랜덤 핵산일 수 있다. 예컨대, 원핵 또는 진핵 게놈의 절단물을 위에서 기재한 바와 유사하게 사용될 수 있다.
또한 상기 시험 제제는 소분자(예: 약 1,000 이하의 분자량을 갖는 분자)일 수 있다. 소분자의 조절 제제를 스크리닝하기 위한 방법에는 바람직하게는 고속 분석 어세이(high throughput assay)가 적용될 수 있다. 많은 어세이가 상기 스크리닝에 유용하다(Shultz, Bioorg. Med. Chem. Lett., 8:2409-2414, 1998; Weller, Mol.Drivers., 3:61-70, 1997; Fernandes, Curr. Opin. Chem. Biol., 2:597-603, 1998; and Sittampalam, Curr.Opin. Chem. Biol., 1:384-91, 1997).
본 발명의 방법에 스크리닝되는 시험 제제의 라이브러리는 신테닌과 KRS 또는 이의 단편이나 아날로그에 대한 구조 연구를 근거로 제조될 수 있다. 이런 구조 연구는 신테닌 또는 KRS(또는 KRS 단편)에 결합할 가능성이 있는 시험 제제의 규명을 가능하게 한다. 신테닌 또는 KRS(또는 KRS 단편)의 3차원적 구조는 여러 방법, 예컨대, 결정학 구조 및 분자적 모델링(crystal structure and molecular modeling)으로 연구될 수 있다. X-선 결정학(X-ray crystallography)을 이용하는 단백질 구조 연구 방법이 문헌에 잘 알려져 있다: Physical Bio-Chemistry, Van Holde, K. E.(Prentice-Hall, New Jersey 1971), pp.221-239, and Physical Chemistry with Applications to the Life Sciences, D. Eisengerg ＆ D.Crothers(Benjamin Cummings, Menlo Park 1979). 신테닌 또는 KRS의 구조에 대한 컴퓨터 모델링은 스크리닝하기 위해 시험 제제의 디자인을 위한 다른 수단을 제공한다. 분자적 모델링 방법은 문헌에 개시되어 있다: U.S. Pat. No. 612,894 and U.S. Pat. No. 5,583,973. 또한 단백질 구조는 중성자 회절(neutron diffraction) 및 NMR(nuclear magnetic resonance)에 의해 결정될 수 있다: Physical Chemistry, 4th Ed. Moore, W. J.(Prentice-Hall, New Jersey 1972) and NMR of Proteins and Nucleic Acids, K. Wuthrich(Wiley-Interscience, New York 1986).
본 명세서에서 용어 "접촉(contacting)"은 이의 일반적인 의미이며, 2개 이상의 제제(예: 2개의 폴리펩티드)를 결합(combine)시키거나, 제제와 세포(예; 단백질과 세포)를 결합시키는 것을 말한다. 접촉은 시험관 내(in vitro)에서 일어날 수 있다. 예컨대, 시험관(test tube) 또는 다른 컨테이너(container)에서 2개 이상의 제제를 결합시키거나 시험 제제와 세포 또는 세포 용해물과 시험 제제를 결합시키는 것이다. 또한 접촉은 세포 또는 인시투(in situ)에서 일어날 수도 있다. 예컨대, 2개의 폴리펩티드를 암호화하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 세포 내에서 공동발현(coexpresion)시킴으로써 세포 또는 세포 용해물에서 2개의 폴리펩티드를 접촉시키는 것이다.
상기 (B) 단계에서는 상기 (A) 단계에서 시험제제와 함께 접촉시킨 상기 KRS 또는 이의 단편과 신테닌의 결합수준의 변화를 측정하며, 측정 결과로부터 상기 KRS 또는 이의 단편과 신테닌의 결합수준이 변화된 시험제제를 선별한다.
상기 용어‘결합’은 KRS 전체 또는 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 이의 단편과 신테닌 단백질의 직접적 또는 간접적 결합일 수 있다. 상기 간접적 결합은 두 단백질간의 결합이 다른 매개인자를 통하여, 또는 매개인자와 함께 복합체(complex)를 이루는 것을 의미한다.
본 발명에서 상기 KRS 또는 이의 단편과 신테닌의 결합 수준의 변화는 바람직하게 결합 수준(level)의 감소일 수 있다.
상기 결합수준의 감소는 상기 KRS 또는 이의 단편과 신테닌의 결합을 제거, 방지, 또는 억제하는 것을 의미한다. 구체적으로, 상기 결합수준의 감소는 시험제제가 상기 KRS 또는 이의 단편과 신테닌을 제거, 생성 방지 또는 생성 억제하여 KRS 또는 이의 단편과 신테닌의 발현된 수준을 변화시키거나, 또는 시험제제가 KRS 또는 이의 단편과 신테닌에 경쟁적 또는 비경쟁적으로 결합하여 둘 간의 상호작용(결합) 수준을 변화시키는 방법, 또는 이미 세포내에 생성된 KRS 또는 이의 단편-신테닌 단백질 복합체에 대하여 시험제제에 의해 상기 복합체의 KRS 또는 이의 단편과 신테닌 사이의 상호작용(결합)을 제거하는 방법 등에 의하여 이루어질 수 있다. 상기 경쟁적으로 결합하는 것은 KRS 또는 이의 단편과 신테닌이 서로 상호작용(결합)하는 부위에 시험제제가 결합하여 KRS 또는 이의 단편과 신테닌의 상호작용을 제거, 방지, 또는 억제하는 것을 의미하며, 본 발명에서 신테닌은 KRS 또는 이의 단편의 C-터미널 영역에서 상호작용하는 것이 특징이다. 비경쟁적으로 결합하는 것은 KRS 또는 이의 단편과 신테닌이 서로 상호작용(결합)하는 부위 외의 부위에 시험제제가 결합하여 KRS 또는 이의 단편과 신테닌의 상호작용을 제거, 방지 또는 억제하는 것을 말한다. 즉, 본원 발명은 부작용을 일으키지 않는 범위 내에서, KRS 또는 이의 단편과 신테닌의 발현 및 본연의 기능들을 억제함과 동시에 (혹은 비의존적으로) KRS 또는 이의 단편과 신테닌의 세포내 상호작용(결합)수준을 억제 또는 감소시키는 시험제제를 스크리닝하는 것이다.
바람직하게 본 발명의 결합수준의 감소는 바람직하게 시험제제가 KRS 또는 이의 단편과 신테닌에 경쟁적 또는 비경쟁적으로 결합하여 둘 간의 상호작용(결합) 수준을 변화시키는 방법, 또는 이미 세포내에 생성된 KRS 또는 이의 단편-신테닌 단백질 복합체에 대하여 시험제제에 의해 상기 복합체의 KRS 또는 이의 단편과 신테닌 사이의 상호작용(결합)을 제거되는 방법으로 이루어질 수 있다.
상기 시험제제들은 반드시 KRS 또는 이의 단편과 신테닌의 발현 및 본연의 기능들을 기능적으로 억제할 필요는 없으며, KRS 또는 이의 단편과 신테닌의 상호작용(결합)을 억제하는 정도면 충분하다.
상기 본 발명의 스크리닝 방법은 표지된 시험관 내 단백질-단백질 결합 어세이(시험관 내 풀-다운 어세이), EMSA,단백질 결합을 위한 면역어세이, 기능적 어세이(인산화 어세이 등), 효모-2 하이브리드 어세이, 비면역침전 어세이, 면역 침전 웨스턴 블럿 어세이, 면역-공동-위치화 어세이 등 당업계에 공지된 다양한 방법으로 수행될 수 있으며, 상기한 바에 의해 제한되지 않는다.
예컨대, 박테리아 리프레서 LexA 또는 효모 GAL4의 DNA-결합 도메인 및 효모 GAL4 단백질의 트랜스엑티베이션(transactivaton) 도메인에 각각 융합된, KRS 또는 이의 단편과 신테닌, 또는 이들 단백질의 일부 또는 상동체(homologues)를 발현하는 효모를 이용하여 효모-2 하이브리드 어세이를 수행할 수 있다(KIM, M. J. et al., Nat. Gent., 34:330-336, 2003). KRS 또는 이의 단편과 신테닌의 상호작용은 LexA 단백질 또는 GAL4의 DNA-결합 도메인에 결합된 조절 서열을 가지고 있는 프로모터의 통제 하에서 리포터 유전자의 발현을 유도하는 트랜스엑티베이터를 재구성하게 한다.
상기 리포터 유전자로는 위에서 기재한 바와 같이 당업계에 공지된 임의의 검출가능한 폴리펩티드를 암호화하는 유전자(예: CAT(chloramphenicol acetyltransferase), 루시퍼라제, 베타-갈락토시다제, 베타-글루코시타제, 알칼린 포스파타제 및 GFP(green fluorescent protein) 등 를 사용할 수 있다. 만약 KRS 또는 이의 단편과 신테닌, 또는 이들 단백질의 일부 또는 상동체의 결합이 시험 제제에 의해 저해되거나 약화되는 경우, 상기 리포터 유전자는 발현되지 않거나 정상 조건에 비해 덜 발현된다.
또한 리포터 유전자로는 효모의 성장을 가능하게 하는 단백질(즉, 상기 리포터 유전자가 발현되지 않을 때 효모의 성장이 억제된다)을 암호화하는 것으로 선택될 수 있다. 예를 들면, 아미노산 또는 질소 염기를 위한 생합성 과정에 관계있는 효소를 암호화하는 영양요구성(auxotropic) 유전자(예: ADE3, HIS3 등의 효모 유전자 또는 다른 종 유래의 동등 유전자)일 수 있다. 이 시스템에서 발현된 KRS 또는 이의 단편과 신테닌, 또는 이들 단백질의 일부 또는 상동체의 결합은 시험 제제에 의해 저해되는 경우, 리포터 유전자는 발현되지 않는다. 따라서, 상기 조건 하에서 효모의 성장은 정지되거나 느려진다. 이러한 리포터 유전자의 발현에 의한 효과는 육안이나 장치(예: 현미경)를 통하여 관찰될 수 있다.
상기 (C) 단계에서는 상기 (B)단계에서 선별된 제제(즉, 상기 KRS 또는 이의 단편과 신테닌의 결합수준이 변화된 시험제제)를 암세포에 접촉시키고, 상기 암세포로부터 서열번호 1의 KRS 단편이 포함된 마이크로베지클이 분비되는지 여부를 확인하고, 상기 마이크로베지클이 분비가 감소(억제)된 시험제제를 선별하는 단계이다.
상기 (C) 단계에서는 서열번호 1의 KRS 단편이 포함된 마이크로베지클이 분비되는지 여부를 확인하기 위하여, 서열번호 1로 표시되는 KRS 단편 또는 이를 포함하는 마이크로베지클의 존재 여부와, 그 양, 패턴 또는 양자 모두를 검출하는 물질(시약)들을 사용할 수 있다. 상기 시약에 대해서는 전술한 바와 같으며, 상기 시약을 사용하여 해당 표적 물질을 검출하는 방법에 대해서는 당업계에 잘 알려져있다.
구체적으로 상기 (C) 단계는, 상기 (b) 단계에서 선별된 시험제제를 암세포에 처리하여 일정 시간 배양한 후, 세포 배양이 끝난 배양배지를 회수하고 이로부터 마이크로베지클을 분리하여, 상기 마이크로베지클에 서열번호 1의 KRS 단편 수준을 측정하는 방식으로 수행될 수 있다. 시료로부터 목적하는 마이크로베지클을 분리하고 상기 마이크로베지클로부터 서열번호 1의 KRS 단편 수준을 검출하는 방법에 대해서는 전술한 바를 참조로 할 수 있다.
본 발명의 암 전이 억제제 스크리닝 방법은 상기 (A) 내지 (C) 단계 후에, 추가적으로 하기의 (D) 단계를 수행할 수 있다;
(D) 상기 (C) 단계에서 서열번호 1의 KRS 단편이 포함된 마이크로베지클의 분비를 억제 하는 것으로 확인된 시험제제를 암을 가지고 있는 동물에 투여하여 암 전이의 예방 또는 치료 효과(즉, 암 전이 억제 효과)를 나타내는지 검사하는 단계.
상기 (D) 단계에서 동물은 인간이 아닌 동물(non-human animal)을 의미하는 것으로서, 바람직하게 비인간 포유동물 일 수 있다.
본 발명에서 제공하는 라이실 티알엔에이 합성효소(KRS) 단편 및 상기 KRS 단편을 포함하는 마이크로베지클은 암 세포가 세포 외로 분비하는 특이적인 마커로서 암 진단에 필요한 정보를 제공하므로, 이를 이용하여 용이하게 암을 진단할 수 있다. 뿐만 아니라 본 발명은 상기 KRS 단편 및 이를 포함하는 마이크로베지클의 암세포로부터의 분비 특성에 기반한 암 전이 억제제 스크리닝 방법을 제공하며, 이는 암 전이 현상을 특이적으로 억제하는 물질의 개발에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1a는 KRS가 세포 외로 분비될 시에 N-termial이 절단됨을 western blot 방법을 이용하여 확인한 결과이다. Myc-KRS 또는 KRS-myc을 발현하도록 HCT116 세포를 형질전환하고 24시간 후에, 상기 형질전환체를 TNF-α(10 ng/ml)가 첨가되었거나 첨가되지 않은 무혈청배지(serum starvation media)에서 12시간동안 배양하였다. 분비된 단백질을들 TCA에 의하여 침전시키고 항-myc 항체를 이용한 western blot으로 조사하였다(WCL:whole cell lysate).
도 1b는 strep-KRS-myc 플라스미드를 이용하여 KRS가 세포 외로 분비될 시에 N-termial이 절단됨을 확인한 결과이다. strep-KRS-myc 플라스미드를 HCT116 세포에 형질전환 시킨후 24시간 후에, 이렇게 생성된 형질전환체를 TNF-α(10 ng/ml)가 첨가되었거나 첨가되지 않은 무혈청배지(serum starvation media)에서 12시간동안 배양하였다. 분비된 단백질을들 TCA에 의하여 침전시키고 항-STREP 항체 및 항-myc 항체를 이용한 western blot으로 조사하였다(WCL:whole cell lysate ).
도 1c는 KRS 단백질에서 12-13a.a 사이가 절단됨을 확인한 결과이다. Myc-KRS wild type 및 myc-▲N12(13-597a.a mutant)를 HCT116 세포에 형질전환시키고 24시간 후에, 이렇게 생성된 형질전환체를 TNF-α (10 ng/ml)가 첨가되었거나 첨가되지 않은 무혈청배지(serum starvation media)에서 12시간동안 배양하였다. 분비된 단백질을 TCA에 의하여 침전시키고 항-myc 항체를 이용한 western blot으로 조사하였다(WCL:whole cell lysate ).
도 1d는 serum starvation 조건, 또는 serum starvation + TNF-alpha 처리 조건에 대하여 시간별로 KRS가 절단되는 양을 확인한 결과이다. GFP-KRS를 과발현시킨 후 24시간 후에 HCT116세포를 TNF-α(10 ng/ml)가 첨가되었거나 첨가되지 않은 무혈청배지(serum starvation media)에서 0분, 30분 60분 동안 배양하였고, 그 후 whole cell lysate에서 GFP-KRS 및 GFP 단백질(truncated GFP, GFP-KRS 결합체 중에서 KRS N-말단에서 절단이 일어나므로)을 항-GFP 항체를 이용한 western blot으로 검출한 결과를 나타낸다.
도 1e는 serum starvation 처리 시간 시간에 따른 KRS의 절단을 luciferase assay로 확인한 결과이다. 구체적으로 N-renilla-KRS-C-renilla vector를 이용하여, 기아(serun stravation) 조건에 의하여 KRS가 절단되는지를 확인하였다. N-renilla-KRS-C-renilla 벡터와 firefly luciferase 벡터를 HCT116 cell에 형질전환시킨 후 24시간 후에, 각 시간별(0시간, 3시간, 6시간)로 무혈청 배지(serum starvation media)에서 배양하였다. 그 후 각 샘플에서의 renilla/firefly luciferase activity를 측정하였다.
도 2a는 BioEdit를 이용하여 KRS 다중정렬(Multiple-alignment)한 결과를 나타낸다. 본 도면에 Caspase-cleavage consensus 및 eukaryote-specific expansion domain 이 표시되었다.
도 2b는 Pan-caspase inhibitor의 처리에 의한 KRS secretion 여부를 western blot으로 확인한 결과이다. Pan-caspase inhibitor인 Z-VAD-FMK를, starved HCT116 cell에 14uM 처리하고 12시간동안 배양한 후, KRS 분비를 항-KRS항체를 이용한 western blot방법으로 조사한 결과를 나타낸다(WCL:whole cell lysate).
도 2c는 Pan-caspase inhibitor의 처리에 의한 KRS 절단 여부를 western blot으로 확인한 결과이다. KRS의 세포내 절단이 Pan-caspase inhibitor에 의하여 억제된다는 것을 보여주는 결과로, GFP-KRS를 과발현시킨 세포를 14uM pan-caspase inhibitor(Z-VAD-FMK)가 포함된 무-혈청(serum free starvation) 배지에서 1시간동안 배양한 후, KRS의 절단을 항-GFP 항체를 이용한 western blot으로 검출한 결과를 나타낸다.
도 2d는 caspase에 의해서 인식되는 KRS sequence의 부분적인 mutation (D12A)을 통한 KRS의 secretion 여부를 western blot으로 확인한 결과이다. 즉, KRS-myc wild type (WT) 또는 D12A mutant (KRS WT의 12번째 Asp를 Ala로 치환한 변이체) 를 사용하여 KRS 분비가 caspase 의존적으로 이루어지는지 테스트한 결과로서, c-terminal에 myc이 tagging된 KRS WT 또는 D12A mutant가 발현되도록 HCT116 세포를 형질전환시킨 후 24시간 후에, 무혈청 기아 배지에서 12시간 배양한 후, KRS의 분비를 항-myc항체를 이용한 western blot방법으로 조사한 결과를 나타낸다(WCL:whole cell lysate).
도 2e는 caspase에 의해서 인식되는 KRS sequence의 부분적인 mutation (D12A)을 통한 KRS의 절단 여부를 western blot으로 확인한 결과이다. GFP-KRS WT 또는 이의 D12A mutant를 과발현하도록 HCT116 세포를 형질전환시킨 후 24시간 후에, 상기 형질전환체들을 무혈청 기아 배지에서 1시간 동안 배양하고, GFP-KRS 및 cleaved GFP를 항-GFP 항체를 이용한 western blot으로 검출한 결과를 나타낸다.
도 2f는 caspase-3, -6, -8, -9를 억제하는 inhibitor의 처리에 의한 KRS secretion 여부를 western blot으로 확인한 결과이다. caspase-3, -6, -8, -9를 억제하는 각각의 inhibitor인 Z-VAD-DQMD (3), Z-VAD-VEID (6), Z-VAD-IETD (8) 및 Z-VAD-LEHD (9)가 처리된 무혈청 기아 배지에서 HCT116세포를 12시간 배양한 후, KRS가 세포 외로 분비되는지 여부를 항-KRS항체를 이용한 western blot방법으로 조사한 결과를 나타낸다(WCL:whole cell lysate).
도 2g는 caspase-3, -6, -8, -9 siRNA 처리에 의한 KRS secretion 여부를 western blot으로 확인한 결과이다. caspase-3, -6, -8, -9 각각에 특이적인 siRNA 또는 non-specific siRNA control로 형질전환 시킨 후 48시간 후에 HCT116 cell을 무혈청 기아 배지에서 12시간 배양한 후, KRS 분비 여부를 항-KRS항체를 이용한 western blot방법으로 조사한 결과를 나타낸다(WCL:whole cell lysate).
도 2h는 serum starvation 조건에서 Caspase-3, -6, -8, -9의 발현량을 western blot으로 확인한 결과이다. HCT116 cell을 각 시간별로 무혈청 기아 배지 에서 배양한 후, 단백질 용해물로부터 각 caspase의 발현 수준을 조사하였다.
도 2i는 caspase-8의 과발현 조건에서 KRS가 절단되는 양을 western blot으로 조사하여, caspase-8의 증가가 KRS의 N-terminal 절단을 증가시킴을 확인한 결과를 나타낸다. HCT116 세포에 Caspase-8 및 GFP-KRS를 과발현시킨 후 24시간 후에 1시간동안 무혈청 배지에서 배양한 후, 세포 내(intracellular space) KRS의 절단을 항-GFP 항체를 이용한 western blot으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 3a는 KRS의 C-terminal에서 PDZ binding motif 의 다중정렬(Multiple alignment) 결과를 나타낸다.
도 3b는 starvation 조건 또는/및 TNF-alpha 처리시에 KRS와 syntenin-1의 결합을 면역침전 및 western blot으로 조사한 결과로서, KRS와 syntenin-1 사이의 상호작용은 기아조건에 의하여 유도됨을 확인하였다. HCT116세포를 무혈청 기아조건 또는 TNF-alpha가 포함된 무혈청 기아 배지에서 1시간동안 배양한 후, syntenin-1에 대하여 면역침전(IP)시고, 항-KRS항체를 이용하여 웨스턴 블롯을 수행하여 KRS와 syntenin-1 사이의 상호작용을 조사하였다.
도 3c는 caspase-8 inhibitor 처리시에 KRS와 syntenin-1의 binding을 western blot으로 조사한 결과로서 KRS-syntenin-1의 상호작용은 caspase-8 inhibitor 처리에 의하여 감소됨을 확인하였다. 세포들을 caspase-8 inhibitor (Z-VAD-IETD)가 처리되거나 처리되지 않은 무혈청 배지에서 배양한 후, syntenin-1에 대하여 면역침전(IP)시고, 항-KRS항체를 이용하여 웨스턴 블롯을 수행하여 KRS와 syntenin-1 사이의 상호작용을 조사하였다.
도 3d는 D12A mutant 를 이용하여 KRS와 syntenin-1 사이의 상호작용을 조사한 결과를 나타낸다. C-terminus myc가 tag된 KRS WT 및 D12A mutant를 세포에 형질전환하여 과발현 시키고 24시간 후에, 무혈청 배지에서 1시간 배양한 후, 항-myc 항체를 사용하여 침전시킨 후, KRS와 결합한 syntenin-1 을 western blot으로 조사하였다(mock:empty vector를 세포에 도입한 대조군).
도 3e는 KRS와 syntenin-1의 상호작용(결합)을 BiFC(Bimolecular fluorescence complementation) assay로 확인한 결과이다. KRS WT-VN173 또는 D12A mutnat-VN173과 syntenin-1-VC15를 세포에 형질전환하여 과발현 시키고 24시간 후에, 상기 형질전환체를 무혈청 기아 배지에서 4시간 배양한 후 형광현미경으로 검출하였다. 이때 실험군 중 하나에는 Caspase-8 inhibitor를 처리하였다. flag-KRS 는 항-flag-항체에 의하여 검출되었다.
도 3f는 syntenin-1 특이적 siRNA 처리에 의한 KRS secretion 여부를 western blot으로 조사한 결과로서, KRS 분비는 syntenin-1 의존적임을 확인하였다. HCT116 cell에 Syntenin-1 특이적 siRNA를 처리하여 Syntenin-1의 발현을 억제한 후 48시간 후에, 상기 세포를 무혈청 배지에서 12시간동안 배양하였고, 그 후 분비된 KRS를 TCA로 침전시킨 후 항-KRS항체를 사용한 웨스턴 블롯으로 검출하였다(con: siRNA control 처리, syn: syntenin-1 특이적 siRNA 처리, WCL: whole cell lysate).
도 3g는 KRS의 c-terminal을 잘라 버린 deletion mutant(▲c5(1-592a.a)) 와 syntenin-1의 결합을 western blot으로 확인한 결과이다. KRS WT 및 c-terminal deletion mutant(▲c5(1-592a.a))를 사용하여 syntenin-1과의 상호작용 및 KRS 분비를 조사하였다. HCT116 세포를 KRS WT-myc 또는 deletion mutant(▲c5(1-592a.a))-myc으로 형질전환 시키고, 24시간 후에 세포 용해물을 항-syntenin-1 항체를 사용하여 면역침전(IP)시킨 후, 상기 침전물에서 syntenin-1과 결합된 KRS를 항-myc 항체를 이용한 웨스턴 블랏으로 조사하였다(WCL: whole cell lysate).
도 3h는 KRS deletion mutant(▲c5(1-592a.a))의 KRS 분비에 대한 영향을 western blot으로 확인한 결과이다. HCT116 세포를 KRS WT 및 deletion mutant(▲c5(1-592a.a))로 형질전환 시키고 24시간 후에 무혈청 배지에서 12시간 배양한다. 배양배지로 분비된 단백질을 TCA로 침전시킨 후 항-myc항체를 사용하여 분비된 KRS의 양을 웨스턴 블롯으로 검출하였다.
도 4a는 KRS가 secretion된 media로부터 분리된 마이크로베지클들의 전자현미경 이미지를 나타낸다. HCT116 cell들은 무혈청 배지에서 12시간동안 배양되었고, 100,000g에서 원심분리하여 세포 외로 분비된 마이크로베지클들을 분리한 후, 전자현미경을 이용하여 이미지를 확인하였다.
도 4b는 KRS가 secretion 된 media로부터 분리된 마이크로베지클들의 평균 size를 나타낸다. HCT116 세포를 무혈청 배지에서 12시간동안 배양한 후, 배양배지로부터 분리된 마이크로베지클들을 100,000g 원심분리법을 이용하여 분리하였다. 분리된 마이크로베지클들의 size를 Dynamic light scattering를 이용하여 측정하였다.
도 4c는 KRS가 검출된 마이크로베지클들의 density를 opti-prep gradient assay로 확인한 결과이다. HCT116 세포를 무혈청 배지에서 12시간 동안 배양한 후, 배양 배지로부터 분리된 마이크로베지클들을 opti-prep gradient에 loading 하여 총 9개의 분획을 수득하였고, 이들을 항-KRS 항체 및 항-Syntenin-1항체를 이용한 웨스턴 블랏 방법으로 분석하였다.
도 4d는 si-syntenin 처리 후 KRS exosome secretion을 western blot으로 조사하여, KRS exosome의 분비가 syntenin-1에 의존적임을 확인한 결과이다. HCT116 세포에 Syntenin-1 특이적인 siRNA를 처리하여 이의 발현을 억제시키고 48시간 후에, 상기 세포를 무혈청 배지에서 12시간동안 배양하였다. 100,000g에서 원심분리하여 분비된 엑소좀들을 정제하고, 웨스턴 블롯으로 단백질을 조사하였다(si-Con: 유전자 발현에 영향을 미치지 않는 siRNA control 처리, si-syn: syntenin-1 특이적 siRNA 처리, WCL: whole cell lysate)
도 4e는 KRS deletion mutant(▲c5(1-592a.a))의 KRS exosome secretion에 대한 영향을 western blot으로 확인한 결과이다. KRS WT-myc 또는 deletion mutant(▲c5(1-592a.a))-myc을 이용하여 syntenin-1과의 상호작용과 KRS exosome 분비에 대한 영향을 확인하였다. HCT116 cell에 KRS WT-myc 또는 deletion mutant(▲c5(1-592a.a))-myc 를 형질전환시키고 24시간 후에, 상기 형질전환체들을 무혈청 배지에서 12시간동안 배양하였다. 정제된 엑소좀들을 웨스턴블롯으로 분석하였다(WCL: whole cell lysate)
도 4f는 D12A mutation의 KRS exosome secretion에 대한 영향을 western blot으로 확인한 결과이다. KRS 절단(truncation)과 KRS exosome 분비와의 상호 관계를 알아보기 위하여 D12A mutant를 이용하였다. C-terminus myc tagging KRS WT 또는 이의 D12A mutant를 HCT116 세포에 형질전환하여 과발현시키고, 24시간 후에 상기 형질전환체들을 무-혈청 배지에서 12시간동안 배양한 후, 100,000g에서 원심분리하여 exosome을 분리수득한 뒤 이의 단백질을 웨스턴블롯으로 확인하였다(WCL: whole cell lysate)
도 5a는 대식세포에 KRS WT, truncated KRS(▲N12(13-597a.a)) 또는 KRS exosome의 처리에 따른 TNF-alpha 분비를 TNF-alpha ELISA 방법으로 조사한 결과를 나타낸다. RAW 264.7 세포들은 100nM의 KRS WT, truncated KRS(▲N12(13-597a.a))단백질 및 KRS exosome(0.05, 0.5, 5ug)과 함께 배양되었으며, 분비된 TNF-alpha 를 분석하였다.
도 5b는 대식세포에 KRS WT, truncated KRS(▲N12(13-597a.a)) 또는 KRS exosome의 처리에 따른 세포 이동(cell migration)을 확인한 결과로서, KRS exosome 처리에 따른 세포 이동을 wound-healing assay 방법으로 조사하였다. RAW 264.7 세포 단층을 한번 긁은 후 100nM KRS 단백질(WT, ▲N12 각각) 또는 KRS exosome(0.05, 0.5, 5ug)을 농도별로 처리하였다. 12시간 후에, 현미경으로 상기 세포들의 이동 상황을 관찰하였다.
도 6a는 si-con 또는 si-KRS 처리된 HCT116 세포로부터 엑소좀을 정제하여 샘플을 제작하고 면역블랏팅을 수행한 결과를 나타낸다.
도 6b는 RAW 264.7 세포를 100nM ▲N12 KRS 단백질과 함께 배양하거나 Si-con 또는 Si-KRS 처리된 HCT116 세포로부터 정제한 엑소좀(5ug/ml)들과 함께 배양하였을때, TNF-alpha ELISA방법으로 TNF-alpha 의 분비를 분석한 결과를 나타낸다.
도 6c는 RAW 264.7 세포를 100nM ▲N12 KRS 단백질과 함께 배양하거나 Si-con 또는 Si-KRS 처리된 HCT116 세포로부터 정제한 엑소좀(5ug/ml)들과 함께 배양하였을때, transwell migration assay방법으로 cell migration effect를 분석한 결과를 나타낸다(왼쪽은 현미경 관찰결과 이미지를 나타내며, 오른쪽은 이동 세포의 비율을 정량화 하여 나타내었다).
도 6d는 KRS WT-myc 또는 D12A mutant-myc 각각을 과발현시킨 B16F10 세포들을 이용하여 수득한 생체 내 이미지(intravital image, 왼쪽) 및 상기 이미지에서의 초록형광 강도를 정량화하여 나타낸 결과(오른쪽)이다. 상기 B16F10 세포를 마우스 귀에 주입한 후, 0min, 30min, 60min, 90min에서 시간별로 이미지를 수득한 결과를 보여준다(빨강: 세포, 초록: 대식세포 및 호중구).
도 6e는 100nM KRS 단백질(WT, ▲N12 각각) 또는 KRS exosome(5ug/ml)처리된 대식세포에서 분비된 각 사이토카인들의 수준(level)을 luminex screening assays (bead-based multiplex kits)를 이용하여 평가한 결과를 나타낸다(Cont: 비처리 대조군, Exo: KRS exosome 처리군).
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실험방법>
1. 세포 배양 및 재료
HCT116 세포들은 10% FBS(fetal bovine serum), 50μg/mL의 페니실린 및 스트렙토마이신이 보충된 RPMI 배지(25mM HEPES 및 L-Glutamine과 함께, Hyclone)를 이용하여 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양되었다. RAW264.7 세포들은 10% FBS(fetal bovine serum), 50μg/mL 페니실린 및 스트렙토마이신이 보충된 High glucose DMEM 배지(2.5g porecine trypsin, 4.00mM L-glutamate, 400mg/L Glutamaine 및 Sodium pyruvate와 함께, Hyclone)를 이용하여 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양되었다. 인간 TNF-alpha(Sigma, USA)는 무혈청조건(serum-free condition) 하에서 10ng/ml의 농도로 처리되었다. syntenin-1에 대한 si-RNA는 santacuz로부터 수득하였다(sc-42164). KRS에 대한 si-RNA는 invitrogen으로부터 수득하였다; KRS si-RNA sequence (Cat. No /Lot No. 10620318-277773 C07, C08 : KARS shss105656 : GGGAAGACCCAUACCCACACAAGUU, AACUUGUGUGGGUAUGGGUCUUCCC). caspase -3, -6, -8, -9 각각에 특이적인 si-RNA는 Sigma-aldrich로부터 수득하였다. Stealth universal RNAi(Santa cruz)는 비-특이적 대조군으로서 사용되었고, Lipofectamine™ 2000 Transfection reagent (Invitrogen, Cat. No. 18324-012)를 제조사의 프로토콜에 따라 사용하여 형질전환(트렌스펙션)하였다. caspase-3 inhibitor(Cat No. 219002), caspase-6 inhibitor(Cat No. 218757), caspase-8 inhibitor(Cat No. 368055), caspase-9 inhibitor(Cat No. 218776)는 calbiochem으로부터 수득되었다. 그리고 상기 caspase inhibitor들은 무혈청조건(serum-free condition) 하에서 14uM의 농도로 처리되었다.
2. 웨스턴 블롯 및 면역침전
150mM NaCl, 10mM NaF, 12mM beta-glycerophophate, 1mM EDTA, 1% NP-40, 10% glyerol 및 protease inhibitor를 포함하는 50mM Tris-HCl(pH 7.4)buffer를 세포에 가하여 용해하였다. 30분 후에, 상층액을 SDS sample buffer에 용해시키고, SDS-PAGE로 분리하였다. 내생 KRS(endogenous KRS)의 면역블랏팅을 수행하기 위하여 항-KRS 항체를 사용하였다. Hsp90, syntenin-1, GFP, myc, caspase-3, -6, -8, -9, syntenin-1에 대한 항체들은 santa cruz 사로부터 구입하였으며, alix에 대한 항체는 cell signaling으로부터 구입하였다. 항-KRS 항체는 서열번호 2로 표시되는 KRS(Genbank Accession No. NP_005539.1)단백질을 뉴질랜드 흰토끼에 주입하여 면역반응을 일으킨 후, 이에 대한 항체를 수득하는 통상적인 과정으로 제작하였다.
면역침전을 위하여, 세포들은 150mM NaCl, 0.5% NP-40, 2mM EDTA, 5% glycerol 및 protease inhibitor(Calbiochem, San diego, CA, USA)를 함유하는 50mM HEPES (pH7.4) buffer로 4℃에서 용해되었다. 단백질 추출물은 각각의 단백질 특이적 항체와 4℃에서 교반하며 배양되었다. 그리고 protein G agarose를 첨가하였다. protein G agarose를 첨가하고 4시간 후에, 원심분리하여 침전 샘플을 수득하였다. 차가운 용해 버퍼(lysis buffer)를 사용하여, 침전 샘플들을 5분동안 3회 세척하였다. 상기 침전물들은 SDS-PAGE에 의하여 분리되었다.
3. KRS 분비 검사
HCT116 세포들을 10% FBS(Hyclone)가 함유된 RPMI 배지에서 배양하였으며, 60mm dish에 대하여 60% confluency가 될 때까지 배양하였다. 상기 세포들은 2회 PBS 세척된 후 serum-free RPMI배지에서 배양하며 10ng/ml TNF-α가 12시간동안 처리되었다. 세포배양액의 상층액을 조심스럽게 회수한 후 500g에서 10분동안 원심분리하였고, 이렇게 생성된 상층액을 다시 10,000g에서 30분동안 원심분리하여 membrane organelle을 제거하였다. 그리고 나서 상층액에 12% TCA가 첨가된 후 4℃ 12시간동안 배양되어 침전처리되었다. 침전 처리 후, 상층액은 18,000g에서 15분동안 원심분리되었고, 이때 상층부는 폐기하고 남은 펠렛을 100mM HEPES ph8.0으로 중화한 후 5 x sample buffer를 가하여 SDS-PAGE로 분리하였다. 상기 SDS-PAGE로 분리한 산물은 항-KRS 항체로 웨스턴 블롯팅하였다.
4. Human Full length KRS 및 Truncated KRS Protein(▲N12 KRS)의 준비
서열번호 2의 Human KRS를 코딩하는 cDNA를 EcoRI 및 XhoI의 제한효소를 이용하여 pET-28a(Novagen)에 서브클론(subclone)하였고, 그 후 Escherichia coli BL21 (DE3)에 도입하여 과발현시켰다. 그리고나서 nickel affinity (Invitrogen) 및 Mono Q ion-exchange chromatography를 제조사의 프로토콜에 따라 사용하여 his-tagged KRS를 정제하였다. LPS(lipopolysaccharide)를 제거하기위하여, KRS가 함유된 용액을 pyrogen-free buffer에 투석하였다. 여전히 잔재하는 LPS를 제거하기 위해서, 상기 KRS 용액을 20% glycerol이 포함된 PBS에 다시 한번 투석하였고, Posidyne membrane (Pall Gelman Laboratory)을 통해 여과하였다.
5. 면역형광염색(Immunofluorescent staining)
HCT116세포에 KRS-VN173 plasmid 및 syntenin-1-VC155 plasmid를 모두 형질도입한 후, 기아 조건(starvation condition, serum-free condition)에서 4시간동안 배양하였다. 상기 HCT116세포들을 9mm coverslip 위에 위치시킨 후 4% paraformaldehyde 이용하여 고정시키고, 차가운 PBS로 짧게 세척하였다. 5% BSA blocking buffer 로 1시간동안 배양한 후, 10분동안 DAPI 염색을 수행하였다. 다시 차가운 PBS로 5분씩 6번 세척한 후, slide glass에 마운팅 시킨다(mounting). 그 후 표본을 공초점 레이저 주사 현미경 (confocal Laser Scanning Microscopy A1, nikon)으로 관찰하였다.
6. 마이크로베지클 분리
HCT116 cell을 각각의 처리 조건(특히, serum-starvation condidion)에서 특정 시간 배양한 후, 그 배지를 분리하여 연속적인 원심분리를 한다. 500g(10분), 10,000g(30분), 100,000g(90분) 총 3번을 하여 마이크로베지클 펠렛을 형성한다. 마이크로베지클 단백질의 양은 Bradford assay 를 이용했다.
7.opti-prep gradient 원심분리
마이크로베지클의 밀도를 측정하기 위해, 100,000 g로 펠렛화된 마이크로베지클을 연속적인 opti-prep gradient 구배에 깔아준 후, 150,000g에서 15시간 동안 원심분리해준다. 9개의 분획들을 수득하여, 굴절률로 밀도를 측정한 후, SDS-PAGE sample buffer로 재현탁(resuspend)하여 특이 항체들을 이용하여 면역 블롯팅을 하였다.
8.전자현미경 관찰
음성 염색을 위해 분리된 마이크로베지클들을 PBS로 5배 희석했다. 그 후, 5㎕를 글로방전(Glow-discharged/Harrick Plasma, U.S)된 탄소 코팅 격자에 3분 동안 공기 중에서 넣은 후, 1% uranyl acetate로 격자 음성 염색을 실시한다(Jung, H. S., et.al., Mol.Biol.Cell: 19; 3234-3242, 2008 참조). 상기 방법을 모든 시료에 적용한다. 면역-전자현미경을 위해서 마이크로베지클을 polyclonal anti-KRS 항체와 6시간 이하로 섞어준 후, 6nm 금색 입자(JIRE, U.K.)를 입힌 토끼 2차 항체와 결합시킨다. 그 후, 얼음위에 12시간 동안 놓아둔 후, 위에 설명한대로 음성염색을 시킨다. 격자는 120 kV로 작동하는 Technai G2 Spirit Twin TEM(FEI, USA)으로 실험한다. 이미지는 4K x 4K Ultrascan 895 CCD (Gatan, U.S)로 기록했다.
9.동적광산란법(Dynamic light scattering)
분비된 마이크로베지클들을 수득하여 PBS로 재현탁(resuspend)시켜준 후, 입자 크기를 광산란분광광도계 ELS-Z(Otsuka Electronics, Japan)를 이용하여 측정했다. 측정은 20℃에서 5분동안 동적평형을 이룬 후 automatic mode에서 이뤄졌다. 데이터는 multiple narrow mode에서 제조업체의 소프트웨어를 이용하여 진행됐다.
10. BiFC-Renilla Luciferase assay
루시퍼라아제(luciferase) 활성을 측정하기 위하여 Renilla Luciferase Reporter Assay System(Promega, Madison, WI)을 이용하였다. 또한 firefly luciferase vector를 대조군으로 이용하였다. 루시퍼라아제 활성은 FLUOstar OPTIMA(BMG LABTECH)를 이용하여 계산되었다. BiFC-renilla luciferase KRS plasmid 및 firefly luciferase plasimd가 도입된 후, 세포들은 기아조건(serum free media)에서 배양되었다. 배지를 제거한 후, 세포들은 PBS를 이용하여 세척되었다. Lysis buffer(Promega, Madison, WI) 80ul/well 를 각 well에 첨가한 후, 상온에서 15분동안 부드럽게 흔들어주었다. 세포 용해물(cell lysate)들은 회수되어 luciferase assay에 사용되었다. 먼저, 20ul의 세포 용해물을 2 white opaque 96-well plate (Falcon, 353296)에 옮겼다. 그리고 Firefly 및 Renilla luciferin은 모든 각각의 2 white opaque 96-well plate에 옮겨졌다. 각 well에 injector dispensing assay reagent가 투여된 후에, 각각의 luminescence reading을 위하여, 2초간의 사전측정 지연 기간(2-second pre-measurement delay) 및 그 후에 10초의 측정시간(10-second measurement period)이 부여되었다. Luciferase assays는 세포의 수 및 형질전환 효율성을 정규화하기위하여 Renilla/Firefly의 비율에 기반하여 분석되었다.
11. wound healing assay
RAW264.7 세포들을 coverslip위에 분주하여 95%이상 포화되도록 배양하였다. 그 후 RAW 264.7 monolayer에 스크래치(scratch)를 내어서 상처를 제작한 후, 여기에 100nM KRS proteins (WT, ▲N12) 또는 KRS exosome(0.05, 0.5, 5ug)을 농도별로 처리하고 12시간동안 배양하였다. 그 후 현미경으로 세포들의 morphology를 관찰하였다.
12. TNF-alpha 분비 ELISA assay
RAW264.7 세포(2 X 104)를 10% FBS 및 1% 항생제가 포함된 DMEM를 함유하는 24well plate에서 12시간동안 배양하였고, 2시간동안 serum-free media에서 세포 절식(starvation, 기아)시켰다. KRS 단백질(WT, ▲N12 각각) 100nM 및 KRS exosomes (0.05, 0.5, 5ug) 각각을 첨가하여 6시간동안 처리하였고, 그 후 3,000 g에서 5분동안 원심분리하여 세포 배지를 회수하였다. TNF-alpha ELISA kit (Pharmingen, BD Science)를 제조사의 프로토콜에 따라 사용하여, 세포로부터 분비된 TNF-alpha를 검출하였다.
13. Transwell migration assay
Costar 사로부터 transwell cell culture chamber 24-well plate(6.5mm insert with 5.0uM polycarbonate membrane)를 구입하여 사용하였다. 5uM insert들은 0.5mg/mL의 gelatin(Sigma) 10uL 으로 코팅되었고, UV 하에서 하룻밤동안 건조되었다. RAW264.7 세포들은 Serum-Free DMEM에 현탁된 후 1X105 cell의 정도로 상기 insert에 첨가되었으며, 그리고 각각의 well에 BSA (100nM), KRS(▲N12)(100nM), si-control 또는 si-KRS 처리된 세포로부터 정제한 엑소좀(5ug/ml)을 처리하여 5% CO2incubator에서 37℃, 8시간 배양되었다. 상기 insert들을 차가운 PBS를 사용하여 2회 세척하였으며, 세포들을 70% Methanol, 30% PBS가 함유된 용액으로 30분동안 고정하였다. 다음으로, 상기 insert들은 PBS로 3회 세척되었으며, hematoxylin (Sigma) 으로 30분동안 염색되었다. 상기 insert들은 증류수로 3회 세척되었으며, 비-이동 세포들은 면봉을 이용하여 제거하였다. 면도날을 이용하여 멤브레인(membrane)을 채취하고 Gel Mount (Biomeda)를 이용하여 마이크로슬라이드 위에 마운팅(mounting)하였다. Top view program이 장착된 Optinity microscope 를 사용하여 이동세포의 이미지를 수득하였다.
14. 생체 내 이미징(Intravital imaging)
14.1 이미징 시스템 및 이미징 과정
KRS에 의해 대식세포/호중구 소집(macrophage/neutrophil recruitment)이 증가되는 것을 시각화하기 위하여, K. Choe et al., 2013의 이전 연구와 동일한 공초점 레이저 현미경(Custom-built laser-scanning confocal microscope)을 사용하였다. 488 nm (MLD488 60 mW, Cobolt), 561 nm (JiveTM50mW,Cobolt) 및 640nm(MLD640100mW,Cobolt)에 대한 3개의 CW laser가 여기원(excitation source)으로 사용되었다. 2D scanning을 시행하기 위하여, fast-rotating polygonal mirror (MC-5, aluminum coated, Lincoln Laser) 및 galvanometer (6230H, Cambridge Technology)가 이용되었다. 삼색의 형광 신호를 동시에 검출하기 위하여 High-sensitive photomultiplier tube(R9110, Hamamatsu)가 사용되었다. 3개의 검출 채널들은 dichroic mirrors (FF01-442/46-25, FF02-525/50-25, FF01-585/40-25, FF01-685/40-25, Semrock) 및 bandpass filters (FF484-FDi01, FF560-Di01, FF649-Di01, Semrock)에 의하여 분할되었다. PMT 로부터 수득된 전기적 신호들은 8-bit 3-channel frame grabber (Solios, Matrox)에 의하여 디지털화 되었다. 20X (LUMFLN60XW, NA1.1, Olympus)에서 수득된 이미지들의 FOV(Field of views)는 500x500 μm2 였다. 512x512 pixel의 이미지들을 상기 이미징 시스템으로부터 수득 후, Matlab (Mathworks)으로 XY-shift compensation되었다. 정확하게 샘플 위치를 조정하기 위해, 이미징 과정동안 1μm의 해상도를 갖는 motorized XYZ translational stage (MPC-200-ROE, Sutter Instrument)가 사용되었다.
14.2 동물 모델
본 연구에서는, 대식세포 및 호중구에서 GFP 형광을 내생적으로 발현하는 LysM-GFP (Lysozyme M-GFP) 마우스가 사용되었다(N. Faust et al., 2000). 12-20주령의 수컷 LysM-GFP 마우스들에 Zoletil®(30 mg/kg) 및 xylazine (Rompun®, 10 mg/kg)을 복강내주사하여 깊게 마취시켰다. 이미징 과정동안 마우스의 체온은 homeothermic controller (PhysioSuite™, RightTemp™, Kent Scientific) 를 사용하여 37℃로 유지되었다. 털 제거에 의해 면역 반응이 일어날 가능성을 제거하기위하여, 이미징하기 적어도 12시간 전에 마우스 귀 피부를 면도하였다.
14.3 세포를 이용한 생체 이미징(Intravital imaging)
종양 세포에 의하여 증가된 KRS의 분비가 미치는 영향을 조사하기 위하여, B16F10 세포들을 KRS-myc, D12A-myc 또는 empty vector로 Lipofectamine 3000 (Invitrogen, 11668027)을 사용하여 형질전환하였다. 상기 형질전환된 B16F10세포들은 친유성 형광 염료인 Vybrant DiD solution (V-22887, Life Technologies)으로 형광표지되었으며, 이 과정은 세포 배지 1ml 당 5μL DiD 용액을 첨가하고 1시간동안 배양함으로서 수행되었다. PBS로 3회 세척한 후에, 표지된 세포들을 PBS용액에 현탁하여 준비하였다(0.4 million cells/μL). 31G microinjector를 사용하여 4x104 cell들을 마우스 귀 피부내로 주사하였다. 상기 세포 주사위치를 따라서 대식세포/호중구 소집을 시각화하기 위하여, 주사 후 90분까지 30분의 간격으로 time-lapse image를 찍었다.
15. Luminex screening assays(bead-based mulitplex kits)
RAW 246.7 세포들은 10% FBS 및 1% 항생제가 포함된 DMEM 배지를 사용하여 12 well-plate에서 12시간동안 배양되었고, 2시간동안 serum-free media에서 세포 절식(starvation)되었다. 서로 다른 양의 KRS 단백질(각각 WT, ▲N12)과 KRS exosome (5ug) 을 배지에 첨가하였다. 12시간 후에, conditioned media 를 수집하였고, 3,000g에서 10분동안 원심분리를 통해 스핀다운하였다. Mulitplex assay를 수행하기 위하여, TNF-alpha, mCRG-2, IL-6, mIL-1beta, mIL-12, mIL-10, MMP9, INF-gamma, mMIP3a 및 CXCL10에 대한 premixed bead들을 R&D Science 로부터 구입하여 제조사의 프로토콜에 따라 사용하였다. 각각의 샘플들은 BioRad Bioplex 200 system 및 software에 의하여 분석되었다.
<실시예 1>
KRS의 분비시 N-terminal의 절단
KRS 단백질은 cancer cell에서 secretion되어서 macrophage를 통한 TNF-alpha secretion과 macrophage migration을 증가시켜서 염증반응을 일으킨다고 알려져 있다. KRS는 serum starvation시에 secretion이 일어나고 TNF-alpha를 동시에 처리 했을 때 secretion이 증가되는 것으로 알려져 있다. 이러한 KRS가 어떻게 secretion이 되는 가에 대해선 아직 알려진 바가 없다. 본 발명에서는 Myc-KRS, KRS-myc plasmid를 HCT116 cell에 transfection 시킨 후 KRS의 secretion을 western blot으로 관찰 했을 때, KRS가 secretion될 시에 N-terminal이 절단되는 것을 확인하였다(도 1a 참조). 이와 같은 결과를 다시 확인하기 위해서 strep-tag가 KRS의 N-terminal에, myc-tag가 KRS의 c-terminal에 tagging 되어있는 plasmid를 만들어낸 후 실험을 하였다. 실험 결과, serum starvation 처리했을 때와 serum starvation과 TNF-alpha를 함께 처리했을 때 KRS의 N-terminal이 절단되는 것을 다시 한번 확인 하였다(도 1b 참조). 본 발명에서는 잘리는 부분을 확실히 하기 위해서, 예비 실험을 한 결과 12-13a.a 사이가 잘린다는 것을 확인 하였고, 이를 확인하기 위하여 myc-KRS WT(1-597) 또는 myc-KRS mutant(13-597, 본 발명에서 ▲N12로도 표기하며 서열번호 1의 펩타이드를 의미)를 cell에 transfection 한 후 secretion 실험을 하였다. 그 결과, 12-13a.a사이가 잘린다는 것을 다시 한번 확인하였다(도 1c 참조). KRS는 앞서 이야기 한 바와 같이 starvation 때 secretion 되고 starvation + TNF-alpha 처리시에 secretion이 증가된다. 본 발명의 도 1b에서와 같이, starvation과 TNF-alpha를 처리한 2가지의 경우에서 KRS가 잘리는 양이 일정한 것으로 확인되었다. 이를 다시 한번 확인하고 KRS를 절단(truncation)하는 신호를 확실히 하기 위해 GFP-KRS를 이용하였다. HCT116 cell에 GFP-KRS를 transfection 한 후, starvation과 TNF-alpha 처리하였다. 시간대 별로 starvation과 TNF-alpha 처리시, 동일한 양이 잘리는 것으로 확인되었다(도 1d 참조). 이를 통해 starvation이 KRS를 자르는 신호임을 확인하였다. Starvation 시에 KRS가 잘리는 것을 확실히 하기 위해서 N-renilla-KRS-C-renilla plasmid를 이용하였다. 이는 평상시엔 KRS N-terminal의 renilla 반쪽과 KRS C-terminal의 renilla 나머지 반쪽이 결합하여서 renilla luciferase activity를 가지지만 어느 한쪽이 없을 시엔 activity를 가질 수 없게 되는 구조이다. HCT116 cell에 N-renilla-KRS-C-renilla plasmid와 firefly luciferase plasmid를 transfection 한 후 실험을 진행하였다. 실험 결과, starvation 시간대 별로 renilla luciferase activity가 줄었음을 확인 할 수 있었고, 상기 결과로 KRS N-terminal이 절단되는 것을 확인하였다(도 1e 참조). 이와 같은 결과를 통해서 잘리는 과정이 KRS를 secretion 시키는 데 필수적인 부분임을 증명하였다.
<실시예 2>
Cascase-8에 의해서 절단되는 KRS
수많은 protease가 cell 안에 존재 하고 특정 protease들은 자신들이 인식할 수 있는 특정 sequence를 인식하여서 잘리는 과정을 수행한다. 본 발명에서는 KRS를 자르는 protease를 찾기 위해서 먼저 KRS sequence에 특정 sequence가 있는지 확인하였다. Multiple alignment 결과, higher eukaryotes에서 보존 되어 있는 caspase에 의해 잘릴 수 있는 sequence를 발견하였다 (도 2a 참조). Caspase의 KRS에 대한 효과를 확인하기 위해서 pan-caspase inibitor를 이용 하였다. Pan-caspase inhibitor를 처리한 후 KRS secretion과 KRS 잘리는 것이 줄어들 것인가를 확인하였다. Pan-caspase inhibitor를 처리한 결과, KRS의 secretion과 KRS가 잘리는 것이 감소한 것을 확인 할 수 있었다 (도 2b 및 도 2c 참조). Caspase에 의해서 인식되는 KRS sequence의 부분적인 mutation (D12A)을 통해서 caspase에 의해서 인식 될 수 없는 KRS의 secretion과 잘리는 과정의 감소를 확인해 보았다. 실험 결과, D12A mutant의 경우 secretion과 잘리는 과정이 감소함을 알 수 있었다(도 2d 및 2e 참조). 2가지 실험을 통해서 caspase가 KRS를 자르는 과정에 관여하고 caspase에 의해서 잘리는 것이 KRS의 secretion을 증가 시킴을 알 수 있었다. 여러가지 caspase 중에서 KRS가 가지고 있는 sequence의 경우 3, 6, 8에 의해서 잘릴 수 있는 가능성을 가지고 있다. 특정하게 Caspase-3, -6, -8, -9를 억제하는 inhibitor를 처리하고선 KRS secretion을 확인해 보았다. 실험결과 caspase-8 inhibitor만이 KRS의 secretion을 억제시키는 것을 알 수 있었다(도 2f 참조). 또한, siRNA를 이용하여 특정 caspase 단백질의 발현 양을 감소시킨 후, KRS secretion을 확인 한 결과에서도 inhibitor를 가지고 실험한 결과와 동일하게 caspase-8을 감소시킨 경우에만 KRS의 secretion이 감소되는 것을 확인하였다(도 2g 참조). Caspase-8이 starvation 환경에서 일어나는 KRS secretion 시에 KRS를 자르는 역할을 한다면 starvation 환경에서 양적인 변화나 activity에 변화가 있을 것이다. KRS를 secretion 시키는 starvation 조건에서 caspase-8은 시간이 지남에 따라 다른 caspase-3, -6, -9와는 다르게 그 양이 증가하는 것을 확인할 수 있었다(도 2h 참조). Caspase-8을 과발현시킨 후 GFP-KRS를 이용하여서 잘리는 양을 확인 했을 때, caspase-8의 양이 증가 할수록 잘리는 KRS의 양이 증가함을 알 수 있었다(도 2i 참조). 상기와 같은 실험 결과를 통해 starvation 환경에서 caspase-8이 증가하여서 KRS를 자른다는 것을 증명하였다. 이와 같은 실험들을 통해 우리는 caspase-8이 KRS를 자르는 역할을 하고, 이는 KRS가 secretion에 필수 적인 중요한 과정임을 확인하였다. 상기 결과들을 통해서 KRS가 secretion 될 시에 N-terminal 13a.a 앞 부분이 잘려지게됨과 이 과정이 KRS secretion에 중요한 key point 임을 증명하였다.
<실시예 3>
절단된 KRS의 syntenin-1과의 결합
본 발명에서는 caspase-8에 의해서 잘려지는 과정이 왜 KRS secretion에 중요한 것일까 라는 질문에 해답을 찾기 위해서 KRS의 cytokine activity를 측정하였다. IL1-beta같은 단백질의 경우, 잘리는 과정이 cytokine activity를 좌우하기 때문이다. 실험결과, KRS의 경우 WT과 ▲N12 mutant(13-597a.a)의 cytokine activity가 동일하게 나왔다. 다음으로 KRS의 잘리는 과정이 KRS와 다른 단백질 간의 binding affinity를 좌우 할 것이라고 생각했다. KRS는 이미 이전 논문을 통해서 syntenin-1 단백질과 결합 할 수 있음이 증명 되었다. Syntenin-1은 세포 내에서 결합된 단백질을 이동시키는 역할을 하는 trafficking 단백질이다. 최근에는 exosome biogenesis에 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. KRS는 c-terminal의 특정 sequnce를 가지고서 syntenin-1과 결합하게 된다. 이러한 KRS의 C-terminal은 구조상 N-terminal에 의해서 가려질 수 있는 가능성이 있다. 따라서 N-terminal이 잘려진 KRS의 경우, syntenin-1과 결합하는 sequence가 좀 더 드러나게 되고 syntenin과의 결합 친화도(binding affinity)가 증가 될 수 있을 것이다. Multiple-alignment를 통해서 이 부분 또한 caspase-8에 의해서 잘려지는 부분과 동일하게 higher eukaryotes에서 보존되어 있는 것을 확인하였다 (도 3a 참조). 또한 starvation 또는/ 및 TNF-alpha 처리시에 KRS와 syntenin-1의 binding이 증가됨을 확인하였고(도 3b 참조), starvation시의 KRS와 syntenin 간의 binding의 증가는 caspase-8 inhibitor를 처리했을 때에 줄어드는 것을 확인하였다(도 3c 참조). Caspase-8에 의해서 잘리지 않는 D12A의 경우, WT보다 syntenin-1과 binding 하는 양이 적었다(도 3d 참조). 이를 다시 한번 확인하기 위해서 BiFC(Bimolecular fluorescence complementation) assay 기법을 사용하였다. 상기 기법은 반으로 쪼개진 venus 단백질이 각각 KRS와 syntenin에 반반씩 붙어서 발현되는 KRS-vn173, syntenin-vc155 plasmid를 이용해서 KRS와 syntenin이 결합했을 시에만 venus(green) 형광빛이 나오도록 하는 방법이다. 실험결과, starvation 시엔 BiFC 형광을 확인할 수 있었으며, caspase-8 inhibitor 처리했을 때와 D12A를 사용했을 때엔 BiFC 형광을 확인 할 수 없었다(도 3e 참조). 이와 같은 결과로 잘리는 과정이 KRS-syntenin binding을 증가시킴을 확인 할 수 있었다. 이렇게 KRS와 binding이 증가되는 syntenin이 KRS secretion에 미치는 영향에 대해 실험을 하였다. Si-syntenin을 이용하여 syntenin단백질을 줄인 결과, KRS secretion은 syntenin을 줄이 않은 것에 비해 확연하게 감소하였다(도 3f 참조). 또한 실제로 KRS의 c-terminal이 syntenin과의 binding에 중요한지 확인하기 위해 KRS의 c-terminal을 잘라 버린 deletion mutant(서열번호 2의 full length 서열에 대하여 1-592 a.a에 해당, ▲c5로도 표기)를 제작하여 syntenin과의 binding을 확인 하였다. Deletion Mutant(1-592a.a, ▲c5)의 syntenin과의 binding 할 수 있는 능력은 WT에 비해 현저히 떨어짐을 확인 하였다(도 3g 참조). Syntenin과 결합할 수 없는 KRS deletion mutant(1-592a.a, ▲c5)와 KRS WT을 이용하여 secretion 정도를 확인하였다. 확인 결과, deletion mutant(▲c5)의 경우 WT에 비해 secretion 되는 양이 적었다(도 3h 참조). 이를 통해서 N-terminal이 잘리는 과정은 KRS의 c-terminal에 존재하는 syntenin binding motif를 드러나게 함으로서 syntenin과 KRS의 binding이 증가되게 됨을 밝혔고 이렇게 증가된 syntenin과의 binding은 KRS secretion에 중요함을 증명하였다.
<실시예 4>
Exosome secretion pathway를 통한 절단된 KRS의 분비
KRS가 세포외로 분비되는 수단을 알아보기 위하여, 먼저 KRS가 secretion 된 media에서 vesicle만 분리하여 전자현미경 분석을 하였다. 전자현미경 분석 결과, cup-shape 모양이 나타났다(도 4a 참조). 이는 알려진 exosome의 morphology와 같다. 엑소좀(Exosome)은 전자 현미경 분석 시에 cup-shape 모양이 나타나고, diameter는 50-150nm정도이며 density는 1.15 - 1.19g/ml의 범위에 속하는 특징을 가지고 있다. 분리된 vesicle의 dameter는 평균 147.3nm로 이 또한 exosome의 특성과 일치하는 것을 확인하였다(도 4b 참조). 마지막으로 opti-prep gradient assay를 사용하여 density를 확인 하였을 때, KRS가 검출된 vesicle은 1.09-1.15g/ml 정도의 density를 가진다. 또한 syntenin이 같은 vesicle에 존재함을 확인하였다(도 4c 참조). 이러한 결과를 통해서 KRS는 syntenin과 함께 exosome으로 secretion 됨을 증명하였다. KRS의 exosome secretion과 syntenin과의 관계를 확인하기 위해서 si-syntenin 처리 후 KRS exosome secretion을 확인하였다. 그 결과, KRS의 exosome을 통한 secretion은 si-syntenin을 처리했을 시에 감소하였다(도 4d 참조). Syntenin과 binding 하지 못하는 deletion mutant(▲c5, 1-592a.a)를 사용하여 exosome secretion을 확인 한 결과, WT에 비해 deletion mutant(▲c5, 1-592a.a)의 경우 exosome secretion이 줄어들었다(도 4e 참조). 상기 2가지의 실험을 통해서 syntenin이 단지 KRS와 같은 exosome에 존재하는 것이 아니라 KRS exosome secretion에도 관여함을 알게 되었다. 상기 도 3a 내지 도 3h에서와 같이, KRS가 절단되는 과정이 syntenin과의 binding을 증가 시켜줌을 증명하였다. 따라서 마지막으로 절단되지 않은 D12A mutant의 exosome secretion을 KRS WT과 함께 비교 하였다. D12A mutant는 KRS WT에 비하여 그 secretion이 되는 양이 현저하게 감소하였다(도 4f 참조). 따라서 이와 같은 결과를 종합해 볼 때, syntenin은 KRS exosome secretion에 중요하며, 절단되는 과정은 syntenin을 통한 KRS exosome secretion에 필수적인 역할을 함을 알 수 있었다.
<실시예 5>
KRS의 절단에 의한 KRS exosome activity의 강화
본 발명의 발명자들은 절단된 KRS가 exosome을 통해서 secretion이 되는 것을 확인하였다. Exosome은 cell-cell signaling의 매개체로 알려져 있다. Exosome은 특정 protein과 mi-RNA, tRNA 등 다양한 정보를 가지고 있다. 이런 exosome의 특성상 cell에서 다른 cell로 이러한 정보가 넘어가고, 넘어간 정보로 인해 cell은 본래와는 다른 역할을 하게 된다. KRS exosome의 기능을 확인하기 위해서, 먼저 KRS WT, truncated KRS( ▲N12(13-597a.a)) 및 KRS exosome 각각을 macrophage에 5시간 처리하여, 이들의 TNF-alpha secretion 효과를 확인하였다. 그 결과, KRS exosome이 KRS 단백질들과 같은 TNF-alpha secretion 증가효과가 있는 것을 확인하였다(도 5a 참조). 이와 같은 결과는 KRS 단백질과 KRS exosome이 같은 효과를 가지는 것을 증명한다. 이를 다시 한번 증명하기 위해서, macrophage 세포를 사용하여서 migration의 증가를 확인하였다. Wound-healing assay 결과, KRS 단백질(WT, ▲N12(13-597a.a) 각각)과 KRS exosome을 처리하고 12hr 후에 macrophge의 migration이 증가됨을 확인 하였다(도 5b 참조). KRS exosome은 KRS 단백질과 동일한 효과를 나타내었다. 2가지 실험 결과를 종합했을 때, KRS exosome에 포함되어있는 KRS 단편이 KRS exosome의 activity에 관여함 증명하였고 이는 KRS의 잘리는 과정이 결과적으로 KRS exosome의 activity에도 중요함을 알 수 있다. 따라서 caspase-8에 의해서 KRS는 절단되고 이는 syntenin과의 binding을 강화시켜서 exosome으로의 이동을 증가시켜서 KRS exosome의 activity가 강화된다.
<실시예 6>
▲ N12 KRS 및 이를 포함하는 분비성 엑소좀의 암 전이 효과
도 5에서 확인한 바와 같은 exosome으로 인한 Inflammation 효과에서 KRS의 중요성을 파악하기 위해서, 먼저 cell에 si-RNA(si-con, si-KRS 각각)를 처리하였다. si-RNA 처리 48시간 후 cell을 serum free starvation media에서 12시간 키웠다. 이 media에서 exosome을 정제한 후, 각각의 exosome에 존재하는 단백질을 분석하였다 (이하, 편의상 si-con를 처리한 세포의 media에서 정제한 exosome을 si-con exosome, si-KRS를 처리한 세포의 media에서 정제한 exosome을 si-KRS exosome이라고 명명함). 분석결과, exosome에 존재하는 KRS 단백질은 si-KRS를 처리한 cell에서 정제한 exosome에서 줄어든 것을 확인하였다 (도 6a).
줄어든 KRS 단백질만큼 exosome inflammation effect가 줄어드는 것을 확인하기 위해 macrophage에서의 TNF-alpha secretion과 migration effect를 확인하였다 (도 6b, 도 6c). 확인 결과, si-KRS exosome을 macrophgae에 처리했을 때, si-con exosome에 비해 macrophage의 TNF-alpha secretion이 줄어들었고, migration 효과도 줄어듬을 알 수 있었다(도 6b, 도 6c). 따라서 KRS는 exosome inflammation activity에 중요한 부분을 차지한다.
이러한 exosome effect에 중요한 KRS의 효과를 실제 세포와 동물모델에서 확인하기 위해서 Intravital confocal visualization of macrophage and neutrophil recruitment 실험을 실시하였다. 실험을 위하여 먼저 B16F10 cell (Mus musculus skin melanoma)을 이용하였다. 일반적인 human cancer cell을 이용하여 mouse 실험을 할 경우, 종 차이에 의한 면역반응이 일어나기 때문에 B16F10 cell을 이용하였다. B16F10 cell에 KRS WT-myc, KRS D12A-myc 를 형질전환 시키고 24시간을 키웠다. 24시간 후, 각각의 세포를 LysM-GFP (Lysozyme M-GFP) mouse (macrophage와 neutrophil에 GFP가 발현되는 mouse)의 귀 뒤쪽 피부에 4x104개의 세포를 주입한다. 주입 후 time course동안 macrophage와 neutrophil이 모여드는 것을 확인하였다. 확인 결과, KRS WT-myc을 형질전환시킨 세포를 주입한 경우 KRS D12A-myc 을 주입했을 때보다 최대 2배정도 많은 macrophage와 neutrophil이 모여드는 것을 확인 할 수 있었다(도 6d). 이 결과를 통해서 우리는 다시 한번 KRS가 exosome을 통한 cancer related inflammation에 중요함을 밝혔다.
이러한 KRS에 의한 inflammation의 정확한 mechanism을 확인하기 위해서 KRS 단백질 (KRS-WT, KRS▲N12), KRS exosome을 이용하여 다양한 inflammatory cytokine secretion을 확인하였다. 도 6e에서 보는 바와 같이 KRS단백질과 KRS exosome은 macrophage에서 TNF-alpha 뿐만 아니라 IL-6, mCRG-2, MMP9을 secretion 시켰다. Mouse CRG-2는 cxc chemokine에 속하는 단백질로 macrophage recruitment를 강화 시키는 역할을 한다. 실제 tumor microenvironment에서 많은 수의 macrophage는 cancer metastasis와 poor prognosis와 연관 관계가 있다는 보고가 있다. IL-6는 cancer cell에 작용하여 E-cadherin을 낮추게 된다. E-cadherin의 감소는 cancer metastasis에 중요한 과정 중 하나이며, 이는 cancer cell motility 증가시켜주는 Epithelial-mesenchymal transition (EMT) mechanism의 중요한 marker 중 하나이다. MMP9은 extracellular matrix degradation과 vascular remodeling에 중요한 역할을 한다. 따라서 KRS가 발현된 exosome(즉, KRS exosome)에 의해서 macrophage로부터 secretion된 cytokine들은 모두 cancer cell의 metastasis를 도와주는 역할을 하고 있다는 것을 알수 있다. 즉 KRS가 발현된 exosome에 의해서 일어난 inflammation 반응은 cancer cell metastasis를 도와 주는 역할을 할 것이라 예상되며, exosome activity에 중요한 역할을 하는 KRS는 cancer metastasis에 중요한 역할을 할 것으로 생각된다.
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하며 암세포로부터 분비되는 라이실 티알엔에이 합성효소(KRS) 단편, 상기 KRS 단편을 포함하는 마이크로베지클 및 이들을 이용하여 암 진단에 필요한 정보를 제공하고 암 전이 억제제를 스크리닝하는 방법에 관한 것으로, 본 발명은 암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위한 진단 키트 개발 또는 암 전이 억제제 개발에 유용하게 이용될 수 있어 산업상 이용가능성이 크다.
<110> Medicinal Bioconvergence Research Center <120> Novel lysyl tRNA synthetase fragment and microvesicle comprising the same <130> NP15-0047 <150> 10-2014-0064612 <151> 2014-05-28 <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 585 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Truncated KRS (13-597a.a) <400> 1 Gly Ser Glu Pro Lys Leu Ser Lys Asn Glu Leu Lys Arg Arg Leu Lys 1 5 10 15 Ala Glu Lys Lys Val Ala Glu Lys Glu Ala Lys Gln Lys Glu Leu Ser 20 25 30 Glu Lys Gln Leu Ser Gln Ala Thr Ala Ala Ala Thr Asn His Thr Thr 35 40 45 Asp Asn Gly Val Gly Pro Glu Glu Glu Ser Val Asp Pro Asn Gln Tyr 50 55 60 Tyr Lys Ile Arg Ser Gln Ala Ile His Gln Leu Lys Val Asn Gly Glu 65 70 75 80 Asp Pro Tyr Pro His Lys Phe His Val Asp Ile Ser Leu Thr Asp Phe 85 90 95 Ile Gln Lys Tyr Ser His Leu Gln Pro Gly Asp His Leu Thr Asp Ile 100 105 110 Thr Leu Lys Val Ala Gly Arg Ile His Ala Lys Arg Ala Ser Gly Gly 115 120 125 Lys Leu Ile Phe Tyr Asp Leu Arg Gly Glu Gly Val Lys Leu Gln Val 130 135 140 Met Ala Asn Ser Arg Asn Tyr Lys Ser Glu Glu Glu Phe Ile His Ile 145 150 155 160 Asn Asn Lys Leu Arg Arg Gly Asp Ile Ile Gly Val Gln Gly Asn Pro 165 170 175 Gly Lys Thr Lys Lys Gly Glu Leu Ser Ile Ile Pro Tyr Glu Ile Thr 180 185 190 Leu Leu Ser Pro Cys Leu His Met Leu Pro His Leu His Phe Gly Leu 195 200 205 Lys Asp Lys Glu Thr Arg Tyr Arg Gln Arg Tyr Leu Asp Leu Ile Leu 210 215 220 Asn Asp Phe Val Arg Gln Lys Phe Ile Ile Arg Ser Lys Ile Ile Thr 225 230 235 240 Tyr Ile Arg Ser Phe Leu Asp Glu Leu Gly Phe Leu Glu Ile Glu Thr 245 250 255 Pro Met Met Asn Ile Ile Pro Gly Gly Ala Val Ala Lys Pro Phe Ile 260 265 270 Thr Tyr His Asn Glu Leu Asp Met Asn Leu Tyr Met Arg Ile Ala Pro 275 280 285 Glu Leu Tyr His Lys Met Leu Val Val Gly Gly Ile Asp Arg Val Tyr 290 295 300 Glu Ile Gly Arg Gln Phe Arg Asn Glu Gly Ile Asp Leu Thr His Asn 305 310 315 320 Pro Glu Phe Thr Thr Cys Glu Phe Tyr Met Ala Tyr Ala Asp Tyr His 325 330 335 Asp Leu Met Glu Ile Thr Glu Lys Met Val Ser Gly Met Val Lys His 340 345 350 Ile Thr Gly Ser Tyr Lys Val Thr Tyr His Pro Asp Gly Pro Glu Gly 355 360 365 Gln Ala Tyr Asp Val Asp Phe Thr Pro Pro Phe Arg Arg Ile Asn Met 370 375 380 Val Glu Glu Leu Glu Lys Ala Leu Gly Met Lys Leu Pro Glu Thr Asn 385 390 395 400 Leu Phe Glu Thr Glu Glu Thr Arg Lys Ile Leu Asp Asp Ile Cys Val 405 410 415 Ala Lys Ala Val Glu Cys Pro Pro Pro Arg Thr Thr Ala Arg Leu Leu 420 425 430 Asp Lys Leu Val Gly Glu Phe Leu Glu Val Thr Cys Ile Asn Pro Thr 435 440 445 Phe Ile Cys Asp His Pro Gln Ile Met Ser Pro Leu Ala Lys Trp His 450 455 460 Arg Ser Lys Glu Gly Leu Thr Glu Arg Phe Glu Leu Phe Val Met Lys 465 470 475 480 Lys Glu Ile Cys Asn Ala Tyr Thr Glu Leu Asn Asp Pro Met Arg Gln 485 490 495 Arg Gln Leu Phe Glu Glu Gln Ala Lys Ala Lys Ala Ala Gly Asp Asp 500 505 510 Glu Ala Met Phe Ile Asp Glu Asn Phe Cys Thr Ala Leu Glu Tyr Gly 515 520 525 Leu Pro Pro Thr Ala Gly Trp Gly Met Gly Ile Asp Arg Val Ala Met 530 535 540 Phe Leu Thr Asp Ser Asn Asn Ile Lys Glu Val Leu Leu Phe Pro Ala 545 550 555 560 Met Lys Pro Glu Asp Lys Lys Glu Asn Val Ala Thr Thr Asp Thr Leu 565 570 575 Glu Ser Thr Thr Val Gly Thr Ser Val 580 585 <210> 2 <211> 597 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> KRS (Genbank Accession No. NP_005539.1) <400> 2 Met Ala Ala Val Gln Ala Ala Glu Val Lys Val Asp Gly Ser Glu Pro 1 5 10 15 Lys Leu Ser Lys Asn Glu Leu Lys Arg Arg Leu Lys Ala Glu Lys Lys 20 25 30 Val Ala Glu Lys Glu Ala Lys Gln Lys Glu Leu Ser Glu Lys Gln Leu 35 40 45 Ser Gln Ala Thr Ala Ala Ala Thr Asn His Thr Thr Asp Asn Gly Val 50 55 60 Gly Pro Glu Glu Glu Ser Val Asp Pro Asn Gln Tyr Tyr Lys Ile Arg 65 70 75 80 Ser Gln Ala Ile His Gln Leu Lys Val Asn Gly Glu Asp Pro Tyr Pro 85 90 95 His Lys Phe His Val Asp Ile Ser Leu Thr Asp Phe Ile Gln Lys Tyr 100 105 110 Ser His Leu Gln Pro Gly Asp His Leu Thr Asp Ile Thr Leu Lys Val 115 120 125 Ala Gly Arg Ile His Ala Lys Arg Ala Ser Gly Gly Lys Leu Ile Phe 130 135 140 Tyr Asp Leu Arg Gly Glu Gly Val Lys Leu Gln Val Met Ala Asn Ser 145 150 155 160 Arg Asn Tyr Lys Ser Glu Glu Glu Phe Ile His Ile Asn Asn Lys Leu 165 170 175 Arg Arg Gly Asp Ile Ile Gly Val Gln Gly Asn Pro Gly Lys Thr Lys 180 185 190 Lys Gly Glu Leu Ser Ile Ile Pro Tyr Glu Ile Thr Leu Leu Ser Pro 195 200 205 Cys Leu His Met Leu Pro His Leu His Phe Gly Leu Lys Asp Lys Glu 210 215 220 Thr Arg Tyr Arg Gln Arg Tyr Leu Asp Leu Ile Leu Asn Asp Phe Val 225 230 235 240 Arg Gln Lys Phe Ile Ile Arg Ser Lys Ile Ile Thr Tyr Ile Arg Ser 245 250 255 Phe Leu Asp Glu Leu Gly Phe Leu Glu Ile Glu Thr Pro Met Met Asn 260 265 270 Ile Ile Pro Gly Gly Ala Val Ala Lys Pro Phe Ile Thr Tyr His Asn 275 280 285 Glu Leu Asp Met Asn Leu Tyr Met Arg Ile Ala Pro Glu Leu Tyr His 290 295 300 Lys Met Leu Val Val Gly Gly Ile Asp Arg Val Tyr Glu Ile Gly Arg 305 310 315 320 Gln Phe Arg Asn Glu Gly Ile Asp Leu Thr His Asn Pro Glu Phe Thr 325 330 335 Thr Cys Glu Phe Tyr Met Ala Tyr Ala Asp Tyr His Asp Leu Met Glu 340 345 350 Ile Thr Glu Lys Met Val Ser Gly Met Val Lys His Ile Thr Gly Ser 355 360 365 Tyr Lys Val Thr Tyr His Pro Asp Gly Pro Glu Gly Gln Ala Tyr Asp 370 375 380 Val Asp Phe Thr Pro Pro Phe Arg Arg Ile Asn Met Val Glu Glu Leu 385 390 395 400 Glu Lys Ala Leu Gly Met Lys Leu Pro Glu Thr Asn Leu Phe Glu Thr 405 410 415 Glu Glu Thr Arg Lys Ile Leu Asp Asp Ile Cys Val Ala Lys Ala Val 420 425 430 Glu Cys Pro Pro Pro Arg Thr Thr Ala Arg Leu Leu Asp Lys Leu Val 435 440 445 Gly Glu Phe Leu Glu Val Thr Cys Ile Asn Pro Thr Phe Ile Cys Asp 450 455 460 His Pro Gln Ile Met Ser Pro Leu Ala Lys Trp His Arg Ser Lys Glu 465 470 475 480 Gly Leu Thr Glu Arg Phe Glu Leu Phe Val Met Lys Lys Glu Ile Cys 485 490 495 Asn Ala Tyr Thr Glu Leu Asn Asp Pro Met Arg Gln Arg Gln Leu Phe 500 505 510 Glu Glu Gln Ala Lys Ala Lys Ala Ala Gly Asp Asp Glu Ala Met Phe 515 520 525 Ile Asp Glu Asn Phe Cys Thr Ala Leu Glu Tyr Gly Leu Pro Pro Thr 530 535 540 Ala Gly Trp Gly Met Gly Ile Asp Arg Val Ala Met Phe Leu Thr Asp 545 550 555 560 Ser Asn Asn Ile Lys Glu Val Leu Leu Phe Pro Ala Met Lys Pro Glu 565 570 575 Asp Lys Lys Glu Asn Val Ala Thr Thr Asp Thr Leu Glu Ser Thr Thr 580 585 590 Val Gly Thr Ser Val 595 <210> 3 <211> 625 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> KRS isoform(Genbank Accession No. NP_001123561.1) <400> 3 Met Leu Thr Gln Ala Ala Val Arg Leu Val Arg Gly Ser Leu Arg Lys 1 5 10 15 Thr Ser Trp Ala Glu Trp Gly His Arg Glu Leu Arg Leu Gly Gln Leu 20 25 30 Ala Pro Phe Thr Ala Pro His Lys Asp Lys Ser Phe Ser Asp Gln Arg 35 40 45 Ser Glu Leu Lys Arg Arg Leu Lys Ala Glu Lys Lys Val Ala Glu Lys 50 55 60 Glu Ala Lys Gln Lys Glu Leu Ser Glu Lys Gln Leu Ser Gln Ala Thr 65 70 75 80 Ala Ala Ala Thr Asn His Thr Thr Asp Asn Gly Val Gly Pro Glu Glu 85 90 95 Glu Ser Val Asp Pro Asn Gln Tyr Tyr Lys Ile Arg Ser Gln Ala Ile 100 105 110 His Gln Leu Lys Val Asn Gly Glu Asp Pro Tyr Pro His Lys Phe His 115 120 125 Val Asp Ile Ser Leu Thr Asp Phe Ile Gln Lys Tyr Ser His Leu Gln 130 135 140 Pro Gly Asp His Leu Thr Asp Ile Thr Leu Lys Val Ala Gly Arg Ile 145 150 155 160 His Ala Lys Arg Ala Ser Gly Gly Lys Leu Ile Phe Tyr Asp Leu Arg 165 170 175 Gly Glu Gly Val Lys Leu Gln Val Met Ala Asn Ser Arg Asn Tyr Lys 180 185 190 Ser Glu Glu Glu Phe Ile His Ile Asn Asn Lys Leu Arg Arg Gly Asp 195 200 205 Ile Ile Gly Val Gln Gly Asn Pro Gly Lys Thr Lys Lys Gly Glu Leu 210 215 220 Ser Ile Ile Pro Tyr Glu Ile Thr Leu Leu Ser Pro Cys Leu His Met 225 230 235 240 Leu Pro His Leu His Phe Gly Leu Lys Asp Lys Glu Thr Arg Tyr Arg 245 250 255 Gln Arg Tyr Leu Asp Leu Ile Leu Asn Asp Phe Val Arg Gln Lys Phe 260 265 270 Ile Ile Arg Ser Lys Ile Ile Thr Tyr Ile Arg Ser Phe Leu Asp Glu 275 280 285 Leu Gly Phe Leu Glu Ile Glu Thr Pro Met Met Asn Ile Ile Pro Gly 290 295 300 Gly Ala Val Ala Lys Pro Phe Ile Thr Tyr His Asn Glu Leu Asp Met 305 310 315 320 Asn Leu Tyr Met Arg Ile Ala Pro Glu Leu Tyr His Lys Met Leu Val 325 330 335 Val Gly Gly Ile Asp Arg Val Tyr Glu Ile Gly Arg Gln Phe Arg Asn 340 345 350 Glu Gly Ile Asp Leu Thr His Asn Pro Glu Phe Thr Thr Cys Glu Phe 355 360 365 Tyr Met Ala Tyr Ala Asp Tyr His Asp Leu Met Glu Ile Thr Glu Lys 370 375 380 Met Val Ser Gly Met Val Lys His Ile Thr Gly Ser Tyr Lys Val Thr 385 390 395 400 Tyr His Pro Asp Gly Pro Glu Gly Gln Ala Tyr Asp Val Asp Phe Thr 405 410 415 Pro Pro Phe Arg Arg Ile Asn Met Val Glu Glu Leu Glu Lys Ala Leu 420 425 430 Gly Met Lys Leu Pro Glu Thr Asn Leu Phe Glu Thr Glu Glu Thr Arg 435 440 445 Lys Ile Leu Asp Asp Ile Cys Val Ala Lys Ala Val Glu Cys Pro Pro 450 455 460 Pro Arg Thr Thr Ala Arg Leu Leu Asp Lys Leu Val Gly Glu Phe Leu 465 470 475 480 Glu Val Thr Cys Ile Asn Pro Thr Phe Ile Cys Asp His Pro Gln Ile 485 490 495 Met Ser Pro Leu Ala Lys Trp His Arg Ser Lys Glu Gly Leu Thr Glu 500 505 510 Arg Phe Glu Leu Phe Val Met Lys Lys Glu Ile Cys Asn Ala Tyr Thr 515 520 525 Glu Leu Asn Asp Pro Met Arg Gln Arg Gln Leu Phe Glu Glu Gln Ala 530 535 540 Lys Ala Lys Ala Ala Gly Asp Asp Glu Ala Met Phe Ile Asp Glu Asn 545 550 555 560 Phe Cys Thr Ala Leu Glu Tyr Gly Leu Pro Pro Thr Ala Gly Trp Gly 565 570 575 Met Gly Ile Asp Arg Val Ala Met Phe Leu Thr Asp Ser Asn Asn Ile 580 585 590 Lys Glu Val Leu Leu Phe Pro Ala Met Lys Pro Glu Asp Lys Lys Glu 595 600 605 Asn Val Ala Thr Thr Asp Thr Leu Glu Ser Thr Thr Val Gly Thr Ser 610 615 620 Val 625 <210> 4 <211> 298 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Syntenin-1 <400> 4 Met Ser Leu Tyr Pro Ser Leu Glu Asp Leu Lys Val Asp Lys Val Ile 1 5 10 15 Gln Ala Gln Thr Ala Phe Ser Ala Asn Pro Ala Asn Pro Ala Ile Leu 20 25 30 Ser Glu Ala Ser Ala Pro Ile Pro His Asp Gly Asn Leu Tyr Pro Arg 35 40 45 Leu Tyr Pro Glu Leu Ser Gln Tyr Met Gly Leu Ser Leu Asn Glu Glu 50 55 60 Glu Ile Arg Ala Asn Val Ala Val Val Ser Gly Ala Pro Leu Gln Gly 65 70 75 80 Gln Leu Val Ala Arg Pro Ser Ser Ile Asn Tyr Met Val Ala Pro Val 85 90 95 Thr Gly Asn Asp Val Gly Ile Arg Arg Ala Glu Ile Lys Gln Gly Ile 100 105 110 Arg Glu Val Ile Leu Cys Lys Asp Gln Asp Gly Lys Ile Gly Leu Arg 115 120 125 Leu Lys Ser Ile Asp Asn Gly Ile Phe Val Gln Leu Val Gln Ala Asn 130 135 140 Ser Pro Ala Ser Leu Val Gly Leu Arg Phe Gly Asp Gln Val Leu Gln 145 150 155 160 Ile Asn Gly Glu Asn Cys Ala Gly Trp Ser Ser Asp Lys Ala His Lys 165 170 175 Val Leu Lys Gln Ala Phe Gly Glu Lys Ile Thr Met Thr Ile Arg Asp 180 185 190 Arg Pro Phe Glu Arg Thr Ile Thr Met His Lys Asp Ser Thr Gly His 195 200 205 Val Gly Phe Ile Phe Lys Asn Gly Lys Ile Thr Ser Ile Val Lys Asp 210 215 220 Ser Ser Ala Ala Arg Asn Gly Leu Leu Thr Glu His Asn Ile Cys Glu 225 230 235 240 Ile Asn Gly Gln Asn Val Ile Gly Leu Lys Asp Ser Gln Ile Ala Asp 245 250 255 Ile Leu Ser Thr Ser Gly Thr Val Val Thr Ile Thr Ile Met Pro Ala 260 265 270 Phe Ile Phe Glu His Ile Ile Lys Arg Met Ala Pro Ser Ile Met Lys 275 280 285 Ser Leu Met Asp His Thr Ile Pro Glu Val 290 295 <210> 5 <211> 1758 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence for truncated KRS (13-597a.a) <400> 5 ggcagcgagc cgaaactgag caagaatgag ctgaagagac gcctgaaagc tgagaagaaa 60 gtagcagaga aggaggccaa acagaaagag ctcagtgaga aacagctaag ccaagccact 120 gctgctgcca ccaaccacac cactgataat ggtgtgggtc ctgaggaaga gagcgtggac 180 ccaaatcaat actacaaaat ccgcagtcaa gcaattcatc agctgaaggt caatggggaa 240 gacccatacc cacacaagtt ccatgtagac atctcactca ctgacttcat ccaaaaatat 300 agtcacctgc agcctgggga tcacctgact gacatcacct taaaggtggc aggtaggatc 360 catgccaaaa gagcttctgg gggaaagctc atcttctatg atcttcgagg agagggggtg 420 aagttgcaag tcatggccaa ttccagaaat tataaatcag aagaagaatt tattcatatt 480 aataacaaac tgcgtcgggg agacataatt ggagttcagg ggaatcctgg taaaaccaag 540 aagggtgagc tgagcatcat tccgtatgag atcacactgc tgtctccctg tttgcatatg 600 ttacctcatc ttcactttgg cctcaaagac aaggaaacaa ggtatcgcca gagatacttg 660 gacttgatcc tgaatgactt tgtgaggcag aaatttatca tccgctctaa gatcatcaca 720 tatataagaa gtttcttaga tgagctggga ttcctagaga ttgaaactcc catgatgaac 780 atcatcccag ggggagccgt ggccaagcct ttcatcactt atcacaacga gctggacatg 840 aacttatata tgagaattgc tccagaactc tatcataaga tgcttgtggt tggtggcatc 900 gaccgggttt atgaaattgg acgccagttc cggaatgagg ggattgattt gacgcacaat 960 cctgagttca ccacctgtga gttctacatg gcctatgcag actatcacga tctcatggaa 1020 atcacggaga agatggtttc agggatggtg aagcatatta caggcagtta caaggtcacc 1080 taccacccag atggcccaga gggccaagcc tacgatgttg acttcacccc acccttccgg 1140 cgaatcaaca tggtagaaga gcttgagaaa gccctgggga tgaagctgcc agaaacgaac 1200 ctctttgaaa ctgaagaaac tcgcaaaatt cttgatgata tctgtgtggc aaaagctgtt 1260 gaatgccctc cacctcggac cacagccagg ctccttgaca agcttgttgg ggagttcctg 1320 gaagtgactt gcatcaatcc tacattcatc tgtgatcacc cacagataat gagccctttg 1380 gctaaatggc accgctctaa agagggtctg actgagcgct ttgagctgtt tgtcatgaag 1440 aaagagatat gcaatgcgta tactgagctg aatgatccca tgcggcagcg gcagcttttt 1500 gaagaacagg ccaaggccaa ggctgcaggt gatgatgagg ccatgttcat agatgaaaac 1560 ttctgtactg ccctggaata tgggctgccc cccacagctg gctggggcat gggcattgat 1620 cgagtcgcca tgtttctcac ggactccaac aacatcaagg aagtacttct gtttcctgcc 1680 atgaaacccg aagacaagaa ggagaatgta gcaaccactg atacactgga aagcacaaca 1740 gttggcactt ctgtctag 1758 <210> 6 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> KRS-C-terminal <400> 6 Val Gly Thr Ser Val 1 5

Claims (10)

  1. 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진, 암세포로부터 분비되는 라이실 티알엔에이 합성효소 단편.
  2. 제1항의 라이실 티알엔에이 합성효소 단편을 포함하는 암의 암세포에서 분비되는 마이크로베지클.
  3. 제2항에 있어서, 상기 마이크로베지클은 엑소좀인 것을 특징으로 하는 마이크로베지클.
  4. 제2항에 있어서, 상기 암은 유방암, 대장암, 폐암, 소세포폐암, 위암, 간암, 혈액암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문부근암, 결장암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암, 질암, 음문암종, 호지킨병, 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장암, 수뇨관 암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, CNS종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간신경교종 및 뇌하수체 선종으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 마이크로베지클.
  5. (a) 암이 의심되는 개체로부터 채취된 생물학적 시료에서 마이크로베지클을 분리하는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계의 마이크로베지클을 파쇄하여 제1항의 라이실 티알엔에이 합성효소 단편 수준 또는 상기 단편을 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    (c) 상기 단편 수준 또는 상기 단편을 암호화하는 유전자의 발현 수준을 정상 대조구 시료의 상기 단편 수준 또는 상기 단편을 암호화하는 유전자의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는 암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  6. (A) 제1항의 라이실 티알엔에이 합성효소(KRS) 단편, 신테닌(syntenin) 및 시험제제를 접촉시키는 단계;
    (B) 상기 KRS 단편과 신테닌의 결합수준의 변화를 측정하는 단계; 및
    (C) 상기 KRS 단편과 신테닌의 결합수준을 변화시킨 시험제제를 암세포에 접촉시켜, 상기 암세포로부터 제2항의 마이크로베지클이 분비되는지 여부를 확인하는 단계;
    를 포함하는 암 전이 억제제 스크리닝 방법.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 제6항에 있어서, 상기 (A)단계의 신테닌은 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 암 전이 억제제 스크리닝 방법.
  10. 제6항에 있어서, 상기 방법은
    (D) 상기 (C) 단계에서 마이크로베지클 분비를 억제하는 것으로 확인된 시험제제를 암을 가지고 있는 인간을 제외한 동물에 투여하여 암 전이의 예방 또는 치료 효과를 나타내는지 검사하는 단계;
    를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 암 전이 억제제 스크리닝 방법.
KR1020150074892A 2014-05-28 2015-05-28 신규한 라이실 티알엔에이 합성효소 단편 및 이를 포함하는 마이크로베지클 KR101787468B1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20140064612 2014-05-28
KR1020140064612 2014-05-28

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20150137028A KR20150137028A (ko) 2015-12-08
KR101787468B1 true KR101787468B1 (ko) 2017-11-15

Family

ID=54699281

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020150074892A KR101787468B1 (ko) 2014-05-28 2015-05-28 신규한 라이실 티알엔에이 합성효소 단편 및 이를 포함하는 마이크로베지클

Country Status (3)

Country Link
US (1) US20170073659A1 (ko)
KR (1) KR101787468B1 (ko)
WO (1) WO2015183019A1 (ko)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102318328B1 (ko) * 2020-04-13 2021-10-27 고려대학교 산학협력단 Gcc2 단백질을 과발현하는 엑소좀 기반 암 진단 또는 예후 예측용 마커 조성물
KR102184428B1 (ko) * 2020-05-25 2020-11-30 주식회사 씨케이엑소젠 중배엽줄기세포 유래의 엑소좀 생산방법 및 이로부터 제조된 배양액

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2013513390A (ja) 2009-12-11 2013-04-22 エータイアー ファーマ， インコーポレイテッド 炎症を調節するためのアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2575857B1 (en) * 2010-06-01 2018-01-24 aTyr Pharma, Inc. Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of lysyl-trna synthetases

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2013513390A (ja) 2009-12-11 2013-04-22 エータイアー ファーマ， インコーポレイテッド 炎症を調節するためのアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ

Also Published As

Publication number Publication date
WO2015183019A1 (ko) 2015-12-03
US20170073659A1 (en) 2017-03-16
KR20150137028A (ko) 2015-12-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Mazroui et al. Caspase-mediated cleavage of HuR in the cytoplasm contributes to pp32/PHAP-I regulation of apoptosis
Huang et al. M-Phase Phosphoprotein 9 regulates ciliogenesis by modulating CP110-CEP97 complex localization at the mother centriole
Shi et al. Decreased expression of eukaryotic initiation factor 3f deregulates translation and apoptosis in tumor cells
Dagda et al. A developmentally regulated, neuron-specific splice variant of the variable subunit Bβ targets protein phosphatase 2A to mitochondria and modulates apoptosis
Dovrat et al. 14-3-3 and β-catenin are secreted on extracellular vesicles to activate the oncogenic Wnt pathway
Rötzer et al. Adducin is required for desmosomal cohesion in keratinocytes
Thomsen et al. A conserved N‐terminal motif is required for complex formation between FUS, EWSR1, TAF15 and their oncogenic fusion proteins
Lin et al. Nuclear localization of the parafibromin tumor suppressor protein implicated in the hyperparathyroidism-jaw tumor syndrome enhances its proapoptotic function
JP6463685B2 (ja) 合成致死性および癌の治療
KR20090064378A (ko) 유방암 관련 유전자 및 폴리펩티드
Shoubridge et al. Mutations in the nuclear localization sequence of the Aristaless related homeobox; sequestration of mutant ARX with IPO13 disrupts normal subcellular distribution of the transcription factor and retards cell division
Gong et al. Vangl2 limits chaperone-mediated autophagy to balance osteogenic differentiation in mesenchymal stem cells
Brocardo et al. Adenomatous polyposis coli protein regulates the cellular response to DNA replication stress
Xiao et al. Identification of cell-specific targets of sumoylation during mouse spermatogenesis
Lee et al. Abnormal triaging of misfolded proteins by adult neuronal ceroid lipofuscinosis-associated DNAJC5/CSPα mutants causes lipofuscin accumulation
KR101787468B1 (ko) 신규한 라이실 티알엔에이 합성효소 단편 및 이를 포함하는 마이크로베지클
Schwamborn et al. The interaction of mPar3 with the ubiquitin ligase Smurf2 is required for the establishment of neuronal polarity
WO2008023841A1 (en) Breast cancer-associated gene, melk, and its interactions with bcl-g
US20210071260A1 (en) Treatment targeting oncology and neurodegeneration
Nagahama et al. The AAA-ATPase NVL2 is a component of pre-ribosomal particles that interacts with the DExD/H-box RNA helicase DOB1
US20050003387A1 (en) Methods and compositions for modulating apoptosis
KR20160083742A (ko) Emt 저해제 스크리닝 방법
Li et al. MiR-296-3p promotes the development and progression of preeclampsia via targeting the CEMIP.
WO2014122275A1 (en) Method for the diagnosis and monitoring of autoinmune diseases
Kaida et al. A Truncated Form of the p27 Cyclin-Dependent Kinase Inhibitor Translated from Pre-mRNA Causes G2-Phase Arrest

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant