CN107828726A - 一种从脂肪中分离脂肪间充质干细胞的方法 - Google Patents

一种从脂肪中分离脂肪间充质干细胞的方法 Download PDF

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姚玲玲
杨苗
孟得龙
宋丹
刘得娟
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    • C12N5/0667—Adipose-derived stem cells [ADSC]; Adipose stromal stem cells
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Abstract

一种从脂肪中分离脂肪间充质干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：取脂肪组织的获取、脂肪的获取、总前脂肪细胞获取、脂肪间充质干细胞的获得。本发明的有益之处在于：本发明中的一种从脂肪中分离脂肪间充质干细胞的方法与现有技术相比，具有以下优点：1、获得的肪间充质干细胞状态良好、稳定性良好，具有多向分化能力；2、操作方法简单易行、可重复性强；3、培养基及消化酶的配方优良。

Description

一种从脂肪中分离脂肪间充质干细胞的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种从脂肪中分离脂肪间充质干细胞的方法。
背景技术
脂肪干细胞(adipose-derived stem ceLLs，ADSCs)、ADSC多能细胞是近年来从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞。主要恢复组织细胞的修复功能，促进细胞的再生，恢复年轻面容的同时，身体机能也得到充分改善，有效改善亚健康、早衰等疾病，由内而外真正的有效抵抗衰老。
脂肪间充质干细胞的体外培养目前主要还是通过组织的机械法处理，之后通过酶消化，裂解法裂解红细胞等手段来收集脂肪干细胞群。分离过程复杂，成交高。且目前没有一个较为统一的操作规范。
发明内容
本发明的目的是提供一种取材简便，步骤简单，具有较高重复性的从脂肪中分离脂肪间充质干细胞的方法。
一种从脂肪中分离脂肪间充质干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)脂肪组织的获取：脂肪组织为专业的美容院在无菌条件下通过抽脂获得的脂肪废弃物，抽取之后以2-8℃保存，储存时间不能超过48小时；
(2)脂肪获取：对所获取的脂肪组织进行自然沉淀，去除下层非脂肪层；之后对上层脂肪组织进行2000rpm10分钟离心，去除上层油脂层，利用清洗液进行清洗下层物质，3-5遍，直到下层清洗液变为清彻；之后1500rpm，5分钟离心，吸取上层脂肪备用，并记录所得脂肪体积；
(3)总前脂肪细胞获取：在所获得的脂肪加入等体积的消化酶，37℃恒温摇床100-280rpm震荡消化20-60分钟，所得消化液1500-2000rpm离心，10分钟，收集底部细胞，得到前脂肪细胞；之后在剩余脂肪中按照体积比1:1再添加消化酶进行第二次酶消化，将第二次酶消化所得的消化液1500-2000rpm，再离心10分钟，收集底部细胞；将2次消化液收集到的底部细胞混合的到总前脂肪细胞；
(4)脂肪间充质干细胞的获得：所得的总前脂肪细胞利用培养基重悬，过滤去除杂质，之后进行细胞计数，按照3-5*10e5密度接种于T75培养瓶中，37℃，5％二氧化碳浓度进行孵育；前脂肪细胞逐渐的变化为脂肪干细胞，脂肪干细胞逐渐变为脂肪间充质干细胞。
作为一种优选的优选的方案，步骤(1)中所述脂肪组织以腹部，臀部，大腿为佳。
更为优选的是，步骤(1)中所述储存时间为小于4小时。
更为优选的是，步骤(2)中所述清洗液为PBS：双抗的体积比99：1。
更为优选的是，步骤(3)中所述消化酶的配置过程为,取100ug胶原酶I，利用100mLPBSs进行溶解，过滤后备用,酶需要在配置后一小时使用，若没有使用，尽快放置于-20℃进行保存。
更为优选的是，步骤(4)中所述培养基的配置过程为,取DMEM-F12培养基450mL加入50mL FBS配置成500mL培养基。
本发明的有益之处在于：本发明中的一种从脂肪中分离脂肪间充质干细胞的方法与现有技术相比，具有以下优点：1、获得的肪间充质干细胞状态良好、稳定性良好，具有多向分化能力；2、操作方法简单易行、可重复性强；3、培养基及消化酶的配方优良。
附图说明
图1是本发明的实施例制备的脂肪间充质干细胞孵育第三天细胞的倒置显微镜图。
具体实施方式
一种从脂肪中分离脂肪间充质干细胞的方法，包括以下步骤：
(1)试剂的配置：
清洗液：取PBS495mL加入5mL双抗配置成500mL的清洗液；
消化酶：取100ug胶原酶I，利用100mL PBSs进行溶解，过滤后备用,酶需要在配置后一小时使用，若没有使用，尽快放置于-20℃进行保存；
培养基：取DMEM-F12培养基450mL加入50mLFBS配置成500mL培养基；
(2)脂肪组织的获取：美容院无菌条件下抽取脂肪废弃物100mL，4℃保存3小时运输至实验室；
(3)脂肪获取：对所获取的脂肪组织进行自然沉淀，去除下层非脂肪层；之后对上层脂肪组织进行2000rpm10分钟离心，去除上层油脂层，利用清洗液进行清洗下层物质，3-5遍，直到下层清洗液变为清澈；之后1500rpm，5分钟离心，吸取上层脂肪备用，并记录所得脂肪体积；
(4)总前脂肪细胞的获取：在所获得的脂肪加入等体积的消化酶，37℃恒温摇床200rpm震荡消化50分钟，所得消化液2000rm离心，10分钟，收集底部细胞，得到前脂肪细胞；之后在剩余脂肪中按照体积比1:1再添加消化酶进行第二次酶消化，将第二次酶消化所得的消化液2000rpm，再离心10分钟，收集底部细胞；将2次消化液收集到的底部细胞混合的到总前脂肪细胞；
(5)脂肪间充质干细胞的获得：所得的总前脂肪细胞利用培养基重悬，过滤去除杂质，之后进行细胞计数，按照3-5*10e5密度接种于T75培养瓶中，37℃，5％二氧化碳浓度进行孵育；第三天细胞状况良好，这时前脂肪细胞逐渐的变化为脂肪干细胞，脂肪干细胞逐渐变为脂肪间充质干细胞。
应当理解，以上所描述的具体实施例仅用于解释发明，并不用于限定本发明。由发明的精神所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。

Claims (6)

1.一种从脂肪中分离脂肪间充质干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)脂肪组织的获取：脂肪组织为专业的美容院在无菌条件下通过抽脂获得的脂肪废弃物，抽取之后以2-8℃保存，储存时间不能超过48小时；
(2)脂肪的获取：对所获取的脂肪组织进行自然沉淀，去除下层非脂肪层；之后对上层脂肪组织进行2000rpm10分钟离心，去除上层油脂层，利用清洗液进行清洗下层物质，3-5遍，直到下层清洗液变为清彻；之后1500rpm，5分钟离心，吸取上层脂肪备用，并记录所得脂肪体积；
(3)总前脂肪细胞获取：在所获得的脂肪加入等体积的消化酶，37℃恒温摇床100-280rpm震荡消化20-60分钟，所得消化液1500-2000rpm离心，10分钟，收集底部细胞，得到前脂肪细胞；之后在剩余脂肪中按照体积比1:1再添加消化酶进行第二次酶消化，将第二次酶消化所得的消化液1500-2000rpm，再离心10分钟，收集底部细胞；将2次消化液收集到的底部细胞混合的到总前脂肪细胞；
(4)脂肪间充质干细胞的获得：所得的总前脂肪细胞利用培养基重悬，过滤去除杂质，之后进行细胞计数，按照3-5*10e5密度接种于T75培养瓶中，37℃，5％二氧化碳浓度进行孵育；前脂肪细胞逐渐的变化为脂肪干细胞，脂肪干细胞逐渐变为脂肪间充质干细胞。
2.根据权利要求1所述的一种从脂肪中分离脂肪间充质干细胞的方法，其特征在于，步骤(1)中所述脂肪组织以腹部，臀部，大腿为佳。
3.根据权利要求1或2所述的一种从脂肪中分离脂肪间充质干细胞的方法，其特征在于，步骤(1)中所述储存时间为小于4小时。
4.根据权利要求3所述的一种从脂肪中分离脂肪间充质干细胞的方法，其特征在于，步骤(2)中所述清洗液为PBS：双抗的体积比99：1。
5.根据权利要求4所述的一种从脂肪中分离脂肪间充质干细胞的方法，其特征在于，步骤(3)中所述消化酶的配置过程为,取100ug胶原酶I，利用100mL PBSs进行溶解，过滤后备用,酶需要在配置后一小时使用，若没有使用，尽快放置于-20℃进行保存。
6.根据权利要求5所述的一种从脂肪中分离脂肪间充质干细胞的方法，其特征在于，步骤(4)中所述培养基的配置过程为,取DMEM-F12培养基450mL加入50mL FBS配置成500mL培养基。
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