CN107050516A - 一种富含脂肪干细胞和细胞外基质的脂肪凝胶制备方法 - Google Patents

一种富含脂肪干细胞和细胞外基质的脂肪凝胶制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种富含脂肪干细胞和细胞外基质的脂肪凝胶制备方法，通过物理切割方法将移植脂肪材料中的成熟脂肪细胞及细胞外基质进行破碎，使用脂肪乳化器进行过滤乳化，去除脂肪中未破碎成分，得乳糜状脂肪，采用絮凝沉淀技术，使用聚乙二醇将乳糜状脂肪中的油脂汇集并去除，得富含脂肪干细胞和细胞外基质的脂肪凝胶，本方法获取的脂肪凝胶因为去除成熟的脂肪细胞及油脂，使原有脂肪体积浓缩了近十倍，脂肪干细胞及细胞外基质含量远高于普通脂肪，为脂肪移植填充提供了良好的材料。

Description

一种富含脂肪干细胞和细胞外基质的脂肪凝胶制备方法
技术领域
本发明属于脂肪移植和干细胞治疗领域，尤其涉及一种富含脂肪干细胞和细胞外基质的脂肪凝胶制备方法。
背景技术
脂肪干细胞和基质血管片段细胞在干细胞治疗领域的应用越发广泛，尤其是基质血管片段细胞的应用已在众多国家展开临床试验，其在提高脂肪移植后保存率以及创面修复方面优势明显：1、脂肪组织新鲜分离得到的脂肪干细胞中含有大量的、具有生物学活性的自体脂肪干细胞；2、来源于自身脂肪组织，无免疫排斥反应；3、人体内储量丰富；4、无需体外培养，降低细菌污染的风险。
然而现有技术在获取脂肪凝胶的过程较为复杂，成本较高，对于脂肪凝胶的提取不能达到很好的效果，尤其是不能够去除成熟的脂肪细胞及油脂，因此，不能为脂肪移植提供更好的材料。
发明内容
为了解决上述问题，本发明旨在提供一种富含脂肪干细胞和细胞外基质的脂肪凝胶制备方法，包括以下步骤：
1）用带螺纹注射器抽取移植用脂肪颗粒，在抽取的脂肪颗粒中添加肝素钠，上、下颠倒带螺纹注射器将其混匀；
2）将上述脂肪颗粒放入第一离心管中，以1200g/min速度离心3min，离心后，脂肪颗粒分为上、下两层，去除下层膨胀液后，将上层的脂肪颗粒转移至第一注射器中；
3）将装有脂肪颗粒的带螺纹注射器与第二注射器通过脂肪破碎器连接，推动含有脂肪颗粒的带螺纹注射器的活塞，将脂肪颗粒通过脂肪破碎器推注至对侧的第一注射器中，推注速度为5-10ml/s，如此反复推注50次，得到破碎脂肪；
4）将装有破碎脂肪的第二注射器拧下，通过脂肪乳化器与第三注射器对接，推动含有破碎脂肪的第二注射器活塞，将破碎脂肪通过脂肪乳化器推注至第三注射器中，推注速度为5-10ml/s，乳化一次，得到乳糜状脂肪；
5）将乳糜状脂肪放入到第二离心管中，按照乳糜状脂肪的体积，加入聚乙二醇进行脂肪萃取，将乳糜状脂肪和聚乙二醇的混合物上下缓慢颠倒，可见黄色油脂汇集，并有絮状物生成，完成油脂的抽提；
6）将油脂抽提后混合液装入第四注射器以3000g/min的速度离心10min，离心后，混合液分为上、中、下三层，下层为萃取剂层，中层为脂肪凝胶层，上层为油脂层；
7）轻推第四注射器，去掉下层的萃取剂后，将第四注射器与第五注射器通
过三通对接，收取中层脂肪凝胶层进入第五注射器中，得到高度浓缩的脂肪凝胶。
进一步地，所述步骤1）中的肝素钠浓度为10U/ml。
进一步地，所述步骤3）中的脂肪颗粒通过脂肪破碎器进行脂肪破碎。
进一步地，所述步骤4）中的破碎脂肪通过脂肪乳化器进行乳化和过滤，乳化器的孔径大小为0.6mm，乳化器上孔的数量为9个。
进一步地，所述步骤5）中乳糜状脂肪的体积与聚乙二醇的体积的比例为10:1，用于乳糜状脂肪的絮凝沉淀，从而进行油脂的抽提。
进一步地，所述步骤7）中的中层为高度浓缩的脂肪来源于干细胞和细胞外基质的移植材料。
优选地，所述移植材料用于面部年轻化及软组织损伤修复。
进一步地，所述第一注射器、第二注射器、第三注射器、第四注射器、第五注射器、第一离心管以及第二离心管，在使用前均经过杀菌消毒，并放置于密闭袋中备用。
进一步地，本发明的一种富含脂肪干细胞和细胞外基质的脂肪凝胶脂肪填充材料，其制备方法为上述所述的方法。
本发明的一种富含脂肪干细胞和细胞外基质的脂肪凝胶制备方法的优点在于：
1.本发明在获取脂肪颗粒后，采取了离心的方式，在简单的操作流程下，致使脂肪颗粒先出现简单的分层后，随即去除脂肪颗粒中多余的膨胀液后，为后续的操作提供更为优质的脂肪颗粒。
2.本发明中的脂肪颗粒采用的是特殊结构的专用脂肪破碎器，将脂肪颗粒破碎的更彻底、更均匀。
3.本发明中破碎的脂肪可以通过脂肪乳化器进行乳化操作，而且本发明提供的脂肪乳化器不仅具有乳化破碎脂肪的功能，而且脂肪乳化器上设置有多个孔，孔所在的板相当于筛网，可用来对乳化后的脂肪进行过滤。
4.本发明采用乳糜状脂肪与聚乙二醇的体积比为10:1的比例设置，可对乳糜状脂肪进行油脂的抽提。
5.本发明中采用了3000g/min的离心速率对乳糜状脂肪进行离心，使得乳糜状脂肪达到最佳的分层效果。
6、本发明中采用的注射器在使用前均经过杀菌消毒，并放置于密闭袋中，保证了操作过程的严谨度。
7、本发明采用的脂肪凝胶制备方法不仅操作简单，而且制得的脂肪凝胶比原有的脂肪体积浓缩了近10倍，为脂肪移植填充提供了良好的材料。
具体实施方式
以下将结合对比例和实施例，对本发明的富含脂肪干细胞和细胞外基质的脂肪凝胶制备方法进行进一步地详细说明。
本发明旨在提供一种富含脂肪干细胞和细胞外基质的脂肪凝胶制备方法，包括以下步骤：
1）用带螺纹注射器抽取移植用脂肪颗粒，在抽取的脂肪颗粒中添加肝素钠，上、下颠倒带螺纹注射器将其混匀；
2）将上述脂肪颗粒放入第一离心管中，以1200g/min速度离心3min，离心后，脂肪颗粒分为上、下两层，去除下层膨胀液后，将上层的脂肪颗粒转移至第一注射器中；
3）将装有脂肪颗粒的带螺纹注射器与第二注射器通过脂肪破碎器连接，推动含有脂肪颗粒的带螺纹注射器的活塞，将脂肪颗粒通过脂肪破碎器推注至对侧的第一注射器中，推注速度为5-10ml/s，如此反复推注50次，得到破碎脂肪；
4）将装有破碎脂肪的第二注射器拧下，通过脂肪乳化器与第三注射器对接，推动含有破碎脂肪的第二注射器活塞，将破碎脂肪通过脂肪乳化器推注至第三注射器中，推注速度为5-10ml/s，乳化一次，得到乳糜状脂肪；
5）将乳糜状脂肪放入到第二离心管中，按照乳糜状脂肪的体积，加入一定量的聚乙二醇进行脂肪萃取，将乳糜状脂肪和聚乙二醇的混合物上下缓慢颠倒，可见黄色油脂汇集，并有絮状物生成，完成油脂的抽提；
6）将油脂抽提后装有混合液装入第四注射器以3000g/min的速度离心10min，离心后，混合液分为上、中、下三层，下层为萃取剂层，中层为脂肪凝胶层，上层为油脂层；
7）轻推第四注射器，去掉下层的萃取剂后，将第四注射器与第五注射器通过三通对接，收取中层脂肪凝胶层进入第五注射器中，得到高度浓缩的脂肪凝胶。
所述步骤1）中的肝素钠浓度为10U/ml。
所述步骤3）中的脂肪颗粒通过脂肪破碎器进行脂肪破碎。
所述步骤4）中的破碎脂肪通过脂肪乳化器进行乳化和过滤，乳化器的孔径大小为0.6mm，乳化器上孔的数量为9个。
优选地，所述步骤5）中乳糜状脂肪的体积与聚乙二醇的体积的比例为10:1，用于乳糜状脂肪的絮凝沉淀，从而进行油脂的抽提。
所述步骤7）中的中层为高度浓缩的脂肪来源于干细胞和细胞外基质的移植材料。
所述移植材料用于面部年轻化及软组织损伤修复。
所述第一注射器、第二注射器、第三注射器、第四注射器、第五注射器、第一离心管以及第二离心管，在使用前均经过杀菌消毒，并放置于密闭袋中备用。
本发明所提供的过滤器可用做乳化器，通过过滤的方式从而达到乳化的效果。
本发明的一种富含脂肪干细胞和细胞外基质的脂肪凝胶脂肪填充材料，其制备方法为上述所述的方法。
以下，将通过不同的对比例，说明乳糜状脂肪的体积与聚乙二醇的体积的比例分别为8:1、10:1、12:1的三种情况下对油脂抽取的结果有何不同作出相应地对比。
为保证对比结果的唯一性、正确性，本发明操作过程中除了乳糜状脂肪的体积与聚乙二醇的体积的体积比不同之外，其他的数据因素均相同。
对比例一
一种富含脂肪干细胞和细胞外基质的脂肪凝胶制备方法，包括以下步骤：
1）用带螺纹注射器抽取移植用脂肪颗粒，在抽取的脂肪颗粒中添加肝素钠，所述肝素钠浓度为10U/ml，上、下颠倒带螺纹注射器将其混匀；
2）将上述脂肪颗粒放入第一离心管中，以1200g/min速度离心3min，离心后，脂肪颗粒分为上、下两层，去除下层膨胀液后，将上层的脂肪颗粒转移至第一注射器中；
3）将装有脂肪颗粒的带螺纹注射器与第二注射器通过脂肪破碎器连接，推动含有脂肪颗粒的带螺纹注射器的活塞，将脂肪颗粒通过脂肪破碎器推注至对侧的第一注射器中，推注速度为5-10ml/s，如此反复推注50次，得到破碎脂肪；
4）将装有破碎脂肪的第二注射器拧下，通过脂肪乳化器与第三注射器对接，推动含有破碎脂肪的第二注射器活塞，将破碎脂肪通过脂肪乳化器推注至第三注射器中，推注速度为5-10ml/s，乳化一次，得到乳糜状脂肪；
5）将乳糜状脂肪放入到第二离心管中，按照乳糜状脂肪的体积，加入聚乙二醇进行脂肪萃取，所述乳糜状脂肪与聚乙二醇的体积比为8:1，将乳糜状脂肪和聚乙二醇的混合物上下缓慢颠倒，可见黄色油脂汇集，并有絮状物生成，完成油脂的抽提；
6）将油脂抽提后装有混合液装入第四注射器以3000g/min的速度离心10min，离心后，混合液分为上、中、下三层，下层为萃取剂层，中层为脂肪凝胶层，上层为油脂层；
7）轻推第四注射器，去掉下层的萃取剂后，将第四注射器与第五注射器通过三通对接，收取中层脂肪凝胶层进入第五注射器中，得到高度浓缩的脂肪凝胶。
本对比例中采用的乳糜状脂肪体积与聚乙二醇体积的体积比为8:1，由上述描述过程中聚乙二醇与乳糜状脂肪的结合，油脂抽提能力较强，通过聚乙二醇对乳糜状脂肪的絮凝沉淀，从而排除乳糜状脂肪中除脂肪外的有机物质，通过操作发现，乳糜状脂肪后期被离心分层后，上层油脂层很清澈，并且明显发现，下层的聚乙二醇层较厚，乳糜状脂肪中的有机高分子物质被絮凝沉淀后，剩余了大量的聚乙二醇。
对比例二
一种富含脂肪干细胞和细胞外基质的脂肪凝胶制备方法，包括以下步骤：
1）用带螺纹注射器抽取移植用脂肪颗粒，在抽取的脂肪颗粒中添加肝素钠，所述肝素钠浓度为10U/ml，上、下颠倒带螺纹注射器将其混匀；
2）将上述脂肪颗粒放入第一离心管中，以1200g/min速度离心3min，离心后，脂肪颗粒分为上、下两层，去除下层膨胀液后，将上层的脂肪颗粒转移至第一注射器中；
3）将装有脂肪颗粒的带螺纹注射器与第二注射器通过脂肪破碎器连接，推动含有脂肪颗粒的带螺纹注射器的活塞，将脂肪颗粒通过脂肪破碎器推注至对侧的第一注射器中，推注速度为5-10ml/s，如此反复推注50次，得到破碎脂肪；
4）将装有破碎脂肪的第二注射器拧下，通过脂肪乳化器与第三注射器对接，推动含有破碎脂肪的第二注射器活塞，将破碎脂肪通过脂肪乳化器推注至第三注射器中，推注速度为5-10ml/s，乳化一次，得到乳糜状脂肪；
5）将乳糜状脂肪放入到第二离心管中，按照乳糜状脂肪的体积，加入聚乙二醇进行脂肪萃取，所述乳糜状脂肪与聚乙二醇的体积比为10:1，将乳糜状脂肪和聚乙二醇的混合物上下缓慢颠倒，可见黄色油脂汇集，并有絮状物生成，完成油脂的抽提；
6）将油脂抽提后装有混合液装入第四注射器以3000g/min的速度离心10min，离心后，混合液分为上、中、下三层，下层为萃取剂层，中层为脂肪凝胶层，上层为油脂层；
7）轻推第四注射器，去掉下层的萃取剂后，将第四注射器与第五注射器通过三通对接，收取中层脂肪凝胶层进入第五注射器中，得到高度浓缩的脂肪凝胶。
本对比例中采用的乳糜状脂肪体积与聚乙二醇体积的体积比为10:1，由上述描述过程中聚乙二醇与乳糜状脂肪的结合，油脂抽提能力较强，通过聚乙二醇对乳糜状脂肪的絮凝沉淀，从而排除乳糜状脂肪中除脂肪外的有机物质，通过操作发现，乳糜状脂肪后期被离心分层后，上层油脂层很清澈，并且明显发现，下层的聚乙二醇层相比对比例一中的聚乙二醇层较薄，乳糜状脂肪中的有机高分子物质被絮凝沉淀后，几乎没有聚乙二醇的剩余。
对比例三
一种富含脂肪干细胞和细胞外基质的脂肪凝胶制备方法，包括以下步骤：
1）用带螺纹注射器抽取移植用脂肪颗粒，在抽取的脂肪颗粒中添加肝素钠，所述肝素钠浓度为10U/ml，上、下颠倒带螺纹注射器将其混匀；
2）将上述脂肪颗粒放入第一离心管中，以1200g/min速度离心3min，离心后，脂肪颗粒分为上、下两层，去除下层膨胀液后，将上层的脂肪颗粒转移至第一注射器中；
3）将装有脂肪颗粒的带螺纹注射器与第二注射器通过脂肪破碎器连接，推动含有脂肪颗粒的带螺纹注射器的活塞，将脂肪颗粒通过脂肪破碎器推注至对侧的第一注射器中，推注速度为5-10ml/s，如此反复推注50次，得到破碎脂肪；
4）将装有破碎脂肪的第二注射器拧下，通过脂肪乳化器与第三注射器对接，推动含有破碎脂肪的第二注射器活塞，将破碎脂肪通过脂肪乳化器推注至第三注射器中，推注速度为5-10ml/s，乳化一次，得到乳糜状脂肪；
5）将乳糜状脂肪放入到第二离心管中，按照乳糜状脂肪的体积，加入聚乙二醇进行脂肪萃取，所述乳糜状脂肪与聚乙二醇的体积比为12:1，将乳糜状脂肪和聚乙二醇的混合物上下缓慢颠倒，可见黄色油脂汇集，并有絮状物生成，完成油脂的抽提；
6）将油脂抽提后装有混合液装入第四注射器以3000g/min的速度离心10min，离心后，混合液分为上、中、下三层，下层为萃取剂层，中层为脂肪凝胶层，上层为油脂层；
7）推第四注射器，去掉下层的萃取剂后，将第四注射器与第五注射器通过三通对接，收取中层脂肪凝胶层进入第五注射器中，得到高度浓缩的脂肪凝胶。
本对比例中采用的乳糜状脂肪体积与聚乙二醇体积的体积比为12:1，由上述描述过程中聚乙二醇与乳糜状脂肪的结合，油脂抽提能力较弱，通过聚乙二醇对乳糜状脂肪的絮凝沉淀，从而排除乳糜状脂肪中除脂肪外的有机物质，通过操作发现，乳糜状脂肪后期被离心分层后，上层油脂层较为浑浊，并且明显发现，下层的聚乙二醇层较薄，乳糜状脂肪中的部分有机高分子物质没有被絮凝沉淀，部分脂肪碎片存在于油脂层中。
通过上述对比例一、对比例二、对比例三的描述以及结果对比后发现，当乳糜状脂肪体积与聚乙二醇体积的体积比为8:1时，乳糜状脂肪中的有机高分子物质被絮凝沉淀，乳糜状脂肪后期被离心分层后，下层的在聚乙二醇层较厚，即剩余有大量的聚乙二醇，所以，从原料节省的角度来说，此体积比在本发明中不是最佳的体积比。
当乳糜状脂肪体积与聚乙二醇体积的体积比为12:1时，乳糜状脂肪中的有机高分子物质并没有完全被絮凝沉淀，乳糜状脂肪后期被离心分层后，上层的在聚乙二醇层较薄，即聚乙二醇的量不满足实验操作的要求，所以，此体积比在本发明中是不能解决发明操作过程中问题的体积比。
当乳糜状脂肪体积与聚乙二醇体积的体积比为10:1时，乳糜状脂肪中的有机高分子物质被絮凝沉淀，乳糜状脂肪后期被离心分层后，下层的在聚乙二醇层较对比例一薄，即剩余较少的聚乙二醇，所以，从原料节省的角度来说，此体积比在本发明中是最佳的体积比。
当乳糜状脂肪体积与聚乙二醇体积的体积比大于10:1时，乳糜状脂肪体积较多，聚乙二醇体积较少，这样的话，两者混匀后，因为聚乙二醇体积少于乳糜状脂肪体积，将导致油脂抽提的能力变弱，会有部分有机成份没有抽提干净。由此，离心后的上层油脂层不是很清澈，并有部分脂肪碎片存在于油脂层中。
当乳糜状脂肪体积与聚乙二醇体积的体积比小于10:1时，聚乙二醇体积多于乳糜状脂肪的体积，油脂抽提会彻底一些。由此，离心后的上层油脂层会更清澈。但是相应地会有大量的聚乙二醇体积剩余，则造成了原料的浪费。
由此，可知，本发明中乳糜状脂肪体积与聚乙二醇体积的体积比为10:1，是本发明的最佳体积比。
以下，将通过不同的实施例，说明油脂抽提后的乳糜状混合液以3000g/min、3500g/min、2500g/min的速度离心10min三种情况下，对离心分层后所得到的的结果的不同作出相应地对比。
为保证对比结果的唯一性、正确性，本发明操作过程中除了油脂抽提后的乳糜状混合液分别以3000g/min、3500g/min、2500g/min的速度离心不同之外，其他的数据因素均相同。
实施例一
一种富含脂肪干细胞和细胞外基质的脂肪凝胶制备方法，包括以下步骤：
1）用带螺纹注射器抽取移植用脂肪颗粒，在抽取的脂肪颗粒中添加肝素钠，所述肝素钠浓度为10U/ml，上、下颠倒带螺纹注射器将其混匀；
2）将上述脂肪颗粒放入第一离心管中，以1200g/min速度离心3min，离心后，脂肪颗粒分为上、下两层，去除下层膨胀液后，将上层的脂肪颗粒转移至第一注射器中；
3）将装有脂肪颗粒的带螺纹注射器与第二注射器通过脂肪破碎器连接，推动含有脂肪颗粒的带螺纹注射器的活塞，将脂肪颗粒通过脂肪破碎器推注至对侧的第一注射器中，推注速度为5-10ml/s，如此反复推注50次，得到破碎脂肪；
4）将装有破碎脂肪的第二注射器拧下，通过脂肪乳化器与第三注射器对接，推动含有破碎脂肪的第二注射器活塞，将破碎脂肪通过脂肪乳化器推注至第三注射器中，推注速度为5-10ml/s，乳化一次，得到乳糜状脂肪；
5）将乳糜状脂肪放入到第二离心管中，按照乳糜状脂肪的体积，加入聚乙二醇进行脂肪萃取，所述乳糜状脂肪与聚乙二醇的体积比为10:1，将乳糜状脂肪和聚乙二醇的混合物上下缓慢颠倒，可见黄色油脂汇集，并有絮状物生成，完成油脂的抽提；
6）将油脂抽提后装有混合液装入第四注射器以3000g/min的速度离心10min，离心后，混合液分为上、中、下三层，下层为萃取剂层，中层为脂肪凝胶层，上层为油脂层；
7）推第四注射器，去掉下层的萃取剂后，将第四注射器与第五注射器通过三通对接，收取中层脂肪凝胶层进入第五注射器中，得到高度浓缩的脂肪凝胶。
本实施例中采用的离心速度为3000g/min，通过操作发现，所得到的中层脂肪凝胶层，收取中层脂肪凝胶层后所得到的的高度浓缩的脂肪凝胶是原有脂肪体积的十分之一，并且上层油脂层较为清澈。
实施例二
一种富含脂肪干细胞和细胞外基质的脂肪凝胶制备方法，包括以下步骤：
1）用带螺纹注射器抽取移植用脂肪颗粒，在抽取的脂肪颗粒中添加肝素钠，所述肝素钠浓度为10U/ml，上、下颠倒带螺纹注射器将其混匀；
2）将上述脂肪颗粒放入第一离心管中，以1200g/min速度离心3min，离心后，脂肪颗粒分为上、下两层，去除下层膨胀液后，将上层的脂肪颗粒转移至第一注射器中；
3）将装有脂肪颗粒的带螺纹注射器与第二注射器通过脂肪破碎器连接，推动含有脂肪颗粒的带螺纹注射器的活塞，将脂肪颗粒通过脂肪破碎器推注至对侧的第一注射器中，推注速度为5-10ml/s，如此反复推注50次，得到破碎脂肪；
4）将装有破碎脂肪的第二注射器拧下，通过脂肪乳化器与第三注射器对接，推动含有破碎脂肪的第二注射器活塞，将破碎脂肪通过脂肪乳化器推注至第三注射器中，推注速度为5-10ml/s，乳化一次，得到乳糜状脂肪；
5）将乳糜状脂肪放入到第二离心管中，按照乳糜状脂肪的体积，加入聚乙二醇进行脂肪萃取，所述乳糜状脂肪与聚乙二醇的体积比为10:1，将乳糜状脂肪和聚乙二醇的混合物上下缓慢颠倒，可见黄色油脂汇集，并有絮状物生成，完成油脂的抽提；
6）将油脂抽提后装有混合液装入第四注射器以3500g/min的速度离心10min，离心后，混合液分为上、中、下三层，下层为萃取剂层，中层为脂肪凝胶层，上层为油脂层；
7）推第四注射器，去掉下层的萃取剂后，将第四注射器与第五注射器通过三通对接，收取中层脂肪凝胶层进入第五注射器中，得到高度浓缩的脂肪凝胶。
本实施例中采用的离心速度为3500g/min，加大了相应地离心速度，相应地对离心装置的性能要求更高，通过操作发现，所得到的中层脂肪凝胶层，收取中层脂肪凝胶层后所得到的的高度浓缩的脂肪凝胶仍然是原有脂肪体积的十分之一，并且上层油脂层较为清澈,但从操作过程中节省能量的角度，此离心速度并不是最佳的离心速度。
实施例三
一种富含脂肪干细胞和细胞外基质的脂肪凝胶制备方法，包括以下步骤：
1）用带螺纹注射器抽取移植用脂肪颗粒，在抽取的脂肪颗粒中添加肝素钠，所述肝素钠浓度为10U/ml，上、下颠倒带螺纹注射器将其混匀；
2）将上述脂肪颗粒放入第一离心管中，以1200g/min速度离心3min，离心后，脂肪颗粒分为上、下两层，去除下层膨胀液后，将上层的脂肪颗粒转移至第一注射器中；
3）将装有脂肪颗粒的带螺纹注射器与第二注射器通过脂肪破碎器连接，推动含有脂肪颗粒的带螺纹注射器的活塞，将脂肪颗粒通过脂肪破碎器推注至对侧的第一注射器中，推注速度为5-10ml/s，如此反复推注50次，得到破碎脂肪；
4）将装有破碎脂肪的第二注射器拧下，通过脂肪乳化器与第三注射器对接，推动含有破碎脂肪的第二注射器活塞，将破碎脂肪通过脂肪乳化器推注至第三注射器中，推注速度为5-10ml/s，乳化一次，得到乳糜状脂肪；
5）将乳糜状脂肪放入到第二离心管中，按照乳糜状脂肪的体积，加入聚乙二醇进行脂肪萃取，所述乳糜状脂肪与聚乙二醇的体积比为10:1，将乳糜状脂肪和聚乙二醇的混合物上下缓慢颠倒，可见黄色油脂汇集，并有絮状物生成，完成油脂的抽提；
6）将油脂抽提后装有混合液装入第四注射器以2500g/min的速度离心10min，离心后，混合液分为上、中、下三层，下层为萃取剂层，中层为脂肪凝胶层，上层为油脂层；
7）推第四注射器，去掉下层的萃取剂后，将第四注射器与第五注射器通过三通对接，收取中层脂肪凝胶层进入第五注射器中，得到高度浓缩的脂肪凝胶。
本实施例中采用的离心速度为2500g/min，相比于实施例一、二，此离心速速对装置的性能要求最低，但是，通过操作发现，所得到的中层脂肪凝胶层，收取中层脂肪凝胶层后所得到的的高度浓缩的脂肪凝胶是原有脂肪体积的八分之一，并没有达到最好的浓缩效果, 并且上层油脂层较为浑浊。
通过离心的方式，使絮状脂肪碎片形成沉淀，离心转速越高，上层油脂层越清澈，中层脂肪凝胶层体积越小。而转速过低时，上层油脂层会浑浊，脂肪凝胶层体积较大。但是离心转速不宜太高，否则将造成离心装置的过度磨损，大大地减短离心装置的使用寿命。
因此，通过实施例一、实施例二、实施例三的结果对比后，发现当离心速度为3000g/min时，能够达到最好的浓缩效果，而且对离心装置的性能要求也不是很高。
因此，离心速度为3000g/min是最佳的离心速度。
本发明公开了一种富含脂肪干细胞和细胞外基质的脂肪凝胶制备方法，通过物理切割方法将移植脂肪材料中的成熟脂肪细胞及细胞外基质进行破碎，使用脂肪乳化器进行过滤乳化，去除脂肪中未破碎成分，得乳糜状脂肪，采用絮凝沉淀技术，使用聚乙二醇将乳糜状脂肪中的油脂汇集并去除，得富含脂肪干细胞和细胞外基质的脂肪凝胶，本方法获取的脂肪凝胶因为去除成熟的脂肪细胞及油脂，使原有脂肪体积浓缩了近十倍，脂肪干细胞及细胞外基质含量远高于普通脂肪，为脂肪移植填充提供了良好的材料。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、 或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个 或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

Claims (9)

1.一种富含脂肪干细胞和细胞外基质的脂肪凝胶制备方法，包括以下步骤：
1）用带螺纹注射器抽取移植用脂肪颗粒，在抽取的脂肪颗粒中添加肝素钠，上、下颠倒带螺纹注射器将其混匀；
2）将上述脂肪颗粒放入第一离心管中，以1200g/min速度离心3min，离心后，脂肪颗粒分为上、下两层，去除下层膨胀液后，将上层的脂肪颗粒转移至第一注射器中；
3）将装有脂肪颗粒的带螺纹注射器与第二注射器通过脂肪破碎器连接，推动含有脂肪颗粒的带螺纹注射器的活塞，将脂肪颗粒通过脂肪破碎器推注至对侧的第一注射器中，推注速度为5-10ml/s，如此反复推注50次，得到破碎脂肪；
4）将装有破碎脂肪的第二注射器拧下，通过脂肪乳化器与第三注射器对接，推动含有破碎脂肪的第二注射器活塞，将破碎脂肪通过脂肪乳化器推注至第三注射器中，推注速度为5-10ml/s，乳化一次，得到乳糜状脂肪；
5）将乳糜状脂肪放入到第二离心管中，按照乳糜状脂肪的体积，加入聚乙二醇进行脂肪萃取，将乳糜状脂肪和聚乙二醇的混合物上下缓慢颠倒，可见黄色油脂汇集，并有絮状物生成，完成油脂的抽提；
6）将油脂抽提后装有混合液装入第四注射器以3000g/min的速度离心10min，离心后，混合液分为上、中、下三层，下层为萃取剂层，中层为脂肪凝胶层，上层为油脂层；
7）轻推第四注射器，去掉下层的萃取剂后，将第四注射器与第五注射器通过三通对接，收取中层脂肪凝胶层进入第五注射器中，得到高度浓缩的脂肪凝胶。
2.根据权利要求1所述的脂肪凝胶制备方法，其特征在于，所述步骤1）中的肝素钠浓度为10U/ml。
3.根据权利要求1所述的脂肪凝胶制备方法，其特征在于，所述步骤3）中的脂肪颗粒通过脂肪破碎器进行脂肪破碎。
4.根据权利要求1所述的脂肪凝胶制备方法，其特征在于，所述步骤4）中的破碎脂肪通过脂肪乳化器进行乳化和过滤，乳化器的孔径大小为0.6mm，乳化器上孔的数量为9。
5.根据权利要求1所述的脂肪凝胶制备方法，其特征在于，所述步骤5）中乳糜状脂肪的体积与聚乙二醇的体积的比例为10:1，用于乳糜状脂肪的絮凝沉淀，从而进行油脂的抽提。
6.根据权利要求1所述的脂肪凝胶制备方法，其特征在于，所述步骤7）中的中层为高度浓缩的脂肪来源于干细胞和细胞外基质的移植材料。
7.根据权利要求6所述的脂肪凝胶制备方法，其特征在于，所述移植材料用于面部年轻化及软组织损伤修复。
8.根据权利要求1所述的脂肪凝胶制备方法，其特征在于，所述第一注射器、第二注射器、第三注射器、第四注射器、第五注射器、第一离心管以及第二离心管，在使用前均经过杀菌消毒，并放置于密闭袋中备用。
9.一种富含脂肪干细胞和细胞外基质的脂肪凝胶脂肪填充材料，其采用权利要求1-8所述的方法制备。
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