CN117050933A - 一种干细胞培养基及其应用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及细胞培养技术领域，具体提供了一种干细胞培养基及其应用方法，干细胞培养基由重量份数为31~36%的干细胞培养基A和补足余量的干细胞培养基B组成，干细胞培养基的应用方法分三步分别加入干细胞培养基A、干细胞培养基和干细胞培养基B。本发明的培养基针对复苏后甚至反复冻融后的子宫内膜干细胞，通过本发明特定比例的各生物碱配合本发明的其他组分，一方面，利用其激发生物活性，多方位的刺激子宫内膜干细胞；另一方面，利用其抑制细胞分裂增殖的毒性，暂时减少子宫内膜干细胞的各细胞内生物活性物质的消耗；共同作用，提高复苏后甚至反复冻融后子宫内膜干细胞的存活率。
Description
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及一种干细胞培养基及其应用方法。
背景技术
干细胞是一种未充分分化，尚不成熟的细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，在一定条件下，可以分化成多种功能细胞。根据干细胞所处的发育阶段分为胚胎干细胞和成体干细胞。子宫内膜干细胞是一种成体干细胞，使子宫内膜具有很强的再生能力。子宫内膜再生和分化为其他组织的潜能已得到越来越多的关注并可能成为子宫内膜过薄和内膜病变患者进行内膜修复替代治疗的手段。
为了使子宫内膜干细胞暂时脱离生长状态，保存其细胞特性并在需要的时候再复苏细胞，常常利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮中低温保存，这样可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种。然而，在冻结时，细胞内水分透出，冰晶形成造成细胞损伤，在复苏细胞时，水分渗入细胞内形成胞内再结晶也造成细胞损伤，在储运和分批次使用干细胞时更是需要反复冻融，加大了对细胞的损伤，使复苏后细胞的存活率较低，即便存活其增殖能力往往不高。
现有的技术未关注通过特殊培养基培养冻融的子宫内膜干细胞来改善冻融后干细胞的存活和增殖能力。因此，提供一种提高复苏后甚至反复冻融后子宫内膜干细胞的存活率和增殖能力的培养基及其应用方法具有重要的现实意义。
发明内容
为了解决上述问题，一方面，本发明提供了一种干细胞培养基，所述干细胞培养基由重量份数为31~36%的干细胞培养基A和补足余量的干细胞培养基B组成；
所述干细胞培养基A由以下组分组成：
重量份数为63~69%的水基DMEM(H)细胞培养基、重量份数为0.2~0.6%的L-丝氨酸、重量份数为0.3~0.7%的钴胺素、重量份数为0.3~0.5%的乌头碱、重量份数为1.1~1.3%的次乌头碱、重量份数为0.2~0.5%的新乌头碱、重量份数为0.4~0.7%的苯甲酰次乌头原碱、重量份数为0.2~0.4%的苯甲酰乌头原碱、重量份数为0.7~0.9%的苯甲酰新乌头原碱和补足余量的纯水；
所述干细胞培养基B由以下组分组成：
重量份数为35~40%的子宫内膜干细胞破碎离心的上清液和补足余量的水基DMEM(H)细胞培养基。
进一步地，所述子宫内膜干细胞破碎离心的上清液的制备方法为：
步骤一：将子宫内膜干细胞和重量份数为所述子宫内膜干细胞的重量份数的2%的蛋白酶抑制剂放入超声波细胞破碎仪，加入重量为子宫内膜干细胞重量10倍的纯水，24℃下，23KHz超声波破碎17min，得干细胞破碎液；
步骤二：将所述干细胞破碎液放入离心机，每5ml离心4min，转速7400~7900r/min，取上清液得所述子宫内膜干细胞破碎离心的上清液。
进一步地，所述干细胞培养基由重量份数为34%的干细胞培养基A和补足余量的干细胞培养基B组成。
进一步地，在所述干细胞培养基A中，所述水基DMEM(H)细胞培养基的重量份数为67%。
进一步地，在所述干细胞培养基A中，所述L-丝氨酸的重量份数为0.4%、所述钴胺素的重量份数为0.5%。
进一步地，在所述干细胞培养基A中，所述乌头碱的重量份数为0.4%、所述次乌头碱的重量份数为1.2%、所述新乌头碱的重量份数为0.3%。
进一步地，在所述干细胞培养基A中，所述苯甲酰次乌头原碱的重量份数为0.6%、所述苯甲酰乌头原碱的重量份数为0.3%、所述苯甲酰新乌头原碱的重量份数为0.8%。
进一步地，在所述干细胞培养基B中，所述子宫内膜干细胞破碎离心的上清液的重量份数为38%。
另一方面，本发明提供了一种上述干细胞培养基的应用方法，所述干细胞培养基的应用方法包括：
步骤一：从-196℃液氮中取出装有子宫内膜干细胞的冻存管，放入37℃温水轻晃在90s内融化复苏，打开盖子，用吸管吸出子宫内膜干细胞悬液加到离心管，向离心管加入4倍的所述子宫内膜干细胞悬液重量的37℃的干细胞培养基A，用移液枪吹打混匀后，每5ml放入离心机中，1000rpm离心5min后弃去上清液；
步骤二：向离心管中的剩余部分加入9倍的所述剩余部分重量的37℃的干细胞培养基重悬细胞后，倒入培养瓶中；
步骤三：向所述培养瓶中加入12倍的所述剩余部分重量的37℃的干细胞培养基B，用浓度为7.4%的NaHCO3溶液调整pH值为7.3后，36.5℃下，放入5%CO2的180rpm的摇床中培养，完成应用。
附子在中草药领域被称为“回阳救逆第一品”，其含有乌头碱、次乌头碱、新乌头碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰乌头原碱和苯甲酰新乌头原碱，这些生物碱既是抑制细胞分裂增殖的有毒物质，又是其刺激各受体激发生物活性的有效物质。
通过本发明能够带来如下有益效果：
本发明的培养基针对复苏后甚至反复冻融后的子宫内膜干细胞，通过本发明特定比例的各生物碱配合本发明的其他组分，一方面，利用其激发生物活性，多方位的刺激子宫内膜干细胞；另一方面，利用其抑制细胞分裂增殖的毒性，暂时减少子宫内膜干细胞的各细胞内生物活性物质的消耗；共同作用，提高复苏后甚至反复冻融后子宫内膜干细胞的存活率。
本发明培养基中特定比例的L-丝氨酸有助于提高活细胞的密度，避免本发明的子宫内膜干细胞在获得足够稀释前，因细胞密度过大而减少存活率；本发明培养基中特定比例的钴胺素有助于细胞低密度下生长，避免后期为了减弱本发明的生物碱毒性而较大稀释后细胞因密度过低而减少存活率。
本发明培养基使用了子宫内膜干细胞破碎离心的上清液，在提供大量细胞活性物质和蛋白质来减低本发明的生物碱毒性的同时，降低了本发明子宫内膜干细胞对外加物质的不良反应。
本发明的干细胞培养基的应用方法，在细胞刚复苏时单独使用本发明的干细胞培养基A，最大化的降低冻融对细胞活性的破坏；在重悬细胞时使用本发明的干细胞培养基，较柔和的继续刺激细胞活性的同时为后面的进一步降低生物碱的效果做过渡；在细胞摇床培养前加入本发明的干细胞培养基B，降低生物碱效果，为后续细胞的增殖创造条件。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为本发明的水基DMEM(H)细胞培养基的除水以外的成分图。
具体实施方式
此处为了更清楚的阐释本发明的整体构思，下面以实施例的方式对本发明的整体方案进行详细说明；在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本发明更为彻底的理解；然而，对于本领域技术人员来说显而易见的是，本发明可以无需一个或多个这些细节而得以实施；在其他的例子中，为了避免与本发明发生混淆，对于本领域公知的一些技术特征未进行描述。
本发明中：超声波细胞破碎仪购自宁波欧蓝科技有限公司，型号JY92-IIN；蛋白酶抑制剂购自赛默飞世尔科技有限公司，型号为蛋白酶抑制剂浓缩液（含EDTA），货号78438；测含氮量用的全自动凯氏定氮仪购自杭州绿博仪器有限公司，型号KDN-520；子宫内膜干细胞购自武汉普诺赛生命科技有限公司，货号为CP-H230，活细胞密度为5×107/ml；离心机购自常州金坛三和仪器有限公司，功率600W；苦参碱购自西安佰斯特生物科技有限公司，货号KS01；胎牛血清购自南京森贝伽生物科技有限公司，编号BC-SE-FBS01C；水基DMEM(H)细胞培养基的除水以外成分如图1所示，本发明乌头碱、次乌头碱、新乌头碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱均为有效含量98%的粉末，简单搅拌即可融入液体体系。
如未特殊说明，下述实施例中各原料组分均可通过商业途径购得，所使用的实验仪器均为实验室常规实验仪器，性能测试方法为本领域已知测试方法。
优选的实施方式如下：
实施例1：
采用以下方法制备获得子宫内膜干细胞破碎离心的上清液：
步骤一：将子宫内膜干细胞和重量份数为子宫内膜干细胞的重量份数的2%的蛋白酶抑制剂放入超声波细胞破碎仪，加入重量为子宫内膜干细胞重量10倍的纯水，24℃下，23KHz超声波破碎17min，得干细胞破碎液；
步骤二：将干细胞破碎液放入离心机，每5ml离心4min，转速7700r/min，取上清液，通过增减纯水调整含氮量为80mg/L，得子宫内膜干细胞破碎离心的上清液。
准备干细胞培养基如下：
干细胞培养基由重量份数为34%的干细胞培养基A和补足余量的干细胞培养基B组成；
干细胞培养基A由以下组分组成：
重量份数为67%的水基DMEM(H)细胞培养基、重量份数为0.4%的L-丝氨酸、重量份数为0.5%的钴胺素、重量份数为0.4%的乌头碱、重量份数为1.2%的次乌头碱、重量份数为0.3%的新乌头碱、重量份数为0.6%的苯甲酰次乌头原碱、重量份数为0.3%的苯甲酰乌头原碱、重量份数为0.8%的苯甲酰新乌头原碱和补足余量的纯水；
干细胞培养基B由以下组分组成：
重量份数为38%的子宫内膜干细胞破碎离心的上清液和补足余量的水基DMEM(H)细胞培养基。
采用以下方法应用干细胞培养基：
步骤一：从-196℃液氮中取出装有子宫内膜干细胞的冻存管，放入37℃温水轻晃在90s内融化复苏，打开盖子，用吸管吸出子宫内膜干细胞悬液加到离心管，向离心管加入4倍的子宫内膜干细胞悬液重量的37℃的干细胞培养基A，用移液枪吹打混匀后，每5ml放入离心机中，1000rpm离心5min后弃去上清液；
步骤二：向离心管中的剩余部分加入9倍的剩余部分重量的37℃的干细胞培养基重悬细胞后，倒入培养瓶中；
步骤三：向培养瓶中加入12倍的剩余部分重量的37℃的干细胞培养基B，用浓度为7.4%的NaHCO3溶液调整pH值为7.3后，36.5℃下，放入5%CO2的180rpm的摇床中培养，完成应用。
实施例2-25：
实施例2与实施例1的区别仅在于，干细胞培养基由重量份数为31%的干细胞培养基A和补足余量的干细胞培养基B组成；
实施例3与实施例1的区别仅在于，干细胞培养基由重量份数为36%的干细胞培养基A和补足余量的干细胞培养基B组成；
实施例4与实施例1的区别仅在于，在干细胞培养基A中，水基DMEM(H)细胞培养基的重量份数为63%；
实施例5与实施例1的区别仅在于，在干细胞培养基A中，水基DMEM(H)细胞培养基的重量份数为69%；
实施例6与实施例1的区别仅在于，在干细胞培养基A中，L-丝氨酸的重量份数为0.2%；
实施例7与实施例1的区别仅在于，在干细胞培养基A中，L-丝氨酸的重量份数为0.6%；
实施例8与实施例1的区别仅在于，在干细胞培养基A中，钴胺素的重量份数为0.3%；
实施例9与实施例1的区别仅在于，在干细胞培养基A中，钴胺素的重量份数为0.7%；
实施例10与实施例1的区别仅在于，在干细胞培养基A中，乌头碱的重量份数为0.3%；
实施例11与实施例1的区别仅在于，在干细胞培养基A中，乌头碱的重量份数为0.5%；
实施例12与实施例1的区别仅在于，在干细胞培养基A中，次乌头碱的重量份数为1.1%；
实施例13与实施例1的区别仅在于，在干细胞培养基A中，次乌头碱的重量份数为1.3%；
实施例14与实施例1的区别仅在于，在干细胞培养基A中，新乌头碱的重量份数为0.2%；
实施例15与实施例1的区别仅在于，在干细胞培养基A中，新乌头碱的重量份数为0.5%；
实施例16与实施例1的区别仅在于，在干细胞培养基A中，苯甲酰次乌头原碱的重量份数为0.4%；
实施例17与实施例1的区别仅在于，在干细胞培养基A中，苯甲酰次乌头原碱的重量份数为0.7%；
实施例18与实施例1的区别仅在于，在干细胞培养基A中，苯甲酰乌头原碱的重量份数为0.2%；
实施例19与实施例1的区别仅在于，在干细胞培养基A中，苯甲酰乌头原碱的重量份数为0.4%；
实施例20与实施例1的区别仅在于，在干细胞培养基A中，苯甲酰新乌头原碱的重量份数为0.7%；
实施例21与实施例1的区别仅在于，在干细胞培养基A中，苯甲酰新乌头原碱的重量份数为0.9%；
实施例22与实施例1的区别仅在于，在干细胞培养基B中，子宫内膜干细胞破碎离心的上清液的重量份数为35%；
实施例23与实施例1的区别仅在于，在干细胞培养基B中，子宫内膜干细胞破碎离心的上清液的重量份数为40%；
实施例24与实施例1的区别仅在于，子宫内膜干细胞破碎离心的上清液的制备方法中，离心机转速为7400r/min；
实施例25与实施例1的区别仅在于，子宫内膜干细胞破碎离心的上清液的制备方法中，离心机转速为7900r/min。
对比例1-25：
对比例1与实施例1的区别仅在于，干细胞培养基由重量份数为40%的干细胞培养基A和补足余量的干细胞培养基B组成；
对比例2与实施例1的区别仅在于，在干细胞培养基A中，水基DMEM(H)细胞培养基的重量份数为75%；
对比例3与实施例1的区别仅在于，在干细胞培养基A中，L-丝氨酸的重量份数为0.9%；
对比例4与实施例1的区别仅在于，在干细胞培养基A中，钴胺素的重量份数为1%；
对比例5与实施例1的区别仅在于，在干细胞培养基A中，乌头碱的重量份数为0.8%；
对比例6与实施例1的区别仅在于，在干细胞培养基A中，次乌头碱的重量份数为1.5%；
对比例7与实施例1的区别仅在于，在干细胞培养基A中，新乌头碱的重量份数为0.8%；
对比例8与实施例1的区别仅在于，在干细胞培养基A中，苯甲酰次乌头原碱的重量份数为1%；
对比例9与实施例1的区别仅在于，在干细胞培养基A中，苯甲酰乌头原碱的重量份数为0.6%；
对比例10与实施例1的区别仅在于，在干细胞培养基A中，苯甲酰新乌头原碱的重量份数为1.3%；
对比例11与实施例1的区别仅在于，在干细胞培养基B中，子宫内膜干细胞破碎离心的上清液的重量份数为45%；
对比例12与实施例1的区别仅在于，子宫内膜干细胞破碎离心的上清液的制备方法中，离心机转速为8500r/min；
对比例13与实施例1的区别仅在于，子宫内膜干细胞破碎离心的上清液的制备方法中，超声波破碎的频率为20KHz；
对比例14与实施例1的区别仅在于，子宫内膜干细胞破碎离心的上清液的制备方法中，超声波破碎的频率为25KHz；
对比例15与实施例1的区别仅在于，干细胞培养基的应用方法中，向离心管加入2倍的子宫内膜干细胞悬液重量的37℃的干细胞培养基A；
对比例16与实施例1的区别仅在于，干细胞培养基的应用方法中，向离心管加入6倍的子宫内膜干细胞悬液重量的37℃的干细胞培养基A；
对比例17与实施例1的区别仅在于，干细胞培养基的应用方法中，向离心管中的剩余部分加入6倍的剩余部分重量的37℃的干细胞培养基重悬细胞；
对比例18与实施例1的区别仅在于，干细胞培养基的应用方法中，向离心管中的剩余部分加入12倍的剩余部分重量的37℃的干细胞培养基重悬细胞；
对比例19与实施例1的区别仅在于，干细胞培养基的应用方法中，向培养瓶中加入8倍的剩余部分重量的37℃的干细胞培养基B；
对比例20与实施例1的区别仅在于，干细胞培养基的应用方法中，向培养瓶中加入16倍的剩余部分重量的37℃的干细胞培养基B；
对比例21与实施例1的区别仅在于，将乌头碱、次乌头碱、新乌头碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰乌头原碱和苯甲酰新乌头原碱换为等重量的苦参碱；
对比例22与实施例1的区别仅在于，将子宫内膜干细胞破碎离心的上清液换为等重量的胎牛血清；
对比例23与实施例1的区别仅在于，干细胞培养基的应用方法的步骤一中的干细胞培养基A和步骤三中的干细胞培养基B均换为等重量的干细胞培养基；
对比例24与实施例1的区别仅在于，干细胞培养基的应用方法的步骤一中的干细胞培养基A、步骤二中的干细胞培养基和步骤三中的干细胞培养基B，均换为等重量的购自武汉普诺赛生命科技有限公司，货号为CM-H230的市售干细胞培养基；
对比例25与实施例1的区别仅在于，干细胞培养基的应用方法中，冻存管内装有的子宫内膜干细胞换为等重量的相同冻存条件冻存的购自武汉普诺赛生命科技有限公司的脂肪间充质干细胞，货号CP-H202。
本发明所用的冻存干细胞，冻存时使用冻存液将干细胞密度调至5×106个/ml，每管1ml，直接将冻存管放入超低温冰箱，降温速度5℃/min，到-80℃后直接转移入-196℃液氮保存40天。冻存液购自武汉普诺赛生命科技有限公司的无血清非程序冻存液，货号PB180438。
对上述各示例摇床中培养的干细胞各取12组，每组1ml，取1~6组测试存活率和增殖能力，7~12组按照本发明中相同的冻存方法再次冻存40天，反复冻融至第三次后，再按本发明各示例的培养基应用方法操作后，测试7~12组的反复冻融的存活率和增殖能力。
存活率测试：
对各示例1~3组和7~9组做细胞重悬，每1ml细胞悬液加入购自武汉普诺赛生命科技有限公司台盼蓝染液2滴，室温下染4min，染色过的细胞材料，取一滴细胞悬液置玻片上，加盖玻片后放高倍镜下观察；死亡的细胞着浅蓝色并膨大，无光泽；活细胞不着色并保持正常形态，有光泽；计活和死细胞数，按细胞活率（%）=未染色的细胞数/观察的细胞总数×100%的公式计算出细胞活率。
各示例存活率测试结果见表1。在表1中，存活率测试结果取各示例1~3组结果的平均值和7~9组结果的平均值并保留至整数位。试验数据采用SPSS25进行单因素标准差分析和LSD多重比较，P＜0 .05为差异显著性标识。各平均值所使用的多组数据的标准差均小于0.9，较为集中，因此可以用各示例1~3组结果的平均值和7~9组结果的平均值来代表各示例1~3组结果和7~9组结果。
表1：各示例的存活率测试结果：
由表1中的数据可知，相较于其他各示例，单次冻融后本发明实施例1~25的细胞存活率明显更高，LSD多重比较也具有显著差异；反复冻融后本发明实施例1~25也有较其他技术方案明显突出的存活率，LSD多重比较也具有显著差异。本发明实施例1的单次冻融存活率和反复冻融组存活率均明显高于本发明其他实施例，LSD多重比较也具有显著差异。
增殖能力测试：
本发明实施例1具有的细胞存活率最高，为进一步筛选实施范围，并验证本发明实施例对其他示例的优越性，对各示例的4~6组和10~12组进行细胞重悬后按照1×103个/每孔的的密度接种于96孔板，加入适量购自武汉普诺赛生命科技有限公司，货号为CM-H230的市售干细胞培养基，使其贴壁生长。计算细胞增殖倍率达1.5的时间，计至200h。
各示例增殖能力测试结果见表2。在表2中，增殖能力测试结果取各示例4~6组结果的平均值和10~12组结果的平均值并保留至整数位。
表2：各示例的增殖能力测试结果：
由表2中的数据可知，相较于其他各示例，单次冻融后和反复冻融后本发明实施例1~25的细胞增殖倍率达1.5的时间都更短，LSD多重比较也都具有显著差异（超过200h的记为200h），本发明实施例1~25的子宫内膜干细胞单次冻融后和反复冻融后有较其他技术方案突出的增殖能力。进一步的本发明实施例1相对与本发明的其他实施例的细胞增殖倍率达1.5的时间更短，LSD多重比较也具有显著差异，本发明实施例1的子宫内膜干细胞有较其他实施例方案突出的增殖能力。
综上，本发明最佳的实施方式为实施例1。需要注意的是，本发明为针对人子宫内膜干细胞的优选实验，本发明的实施方式对人子宫内膜干细胞的效果显著优于其他种类干细胞。
以上所述仅为本发明的实施例而已，并不用于限制本发明；对于本领域技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化；凡在本发明的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的权利要求范围之内。
Claims (9)
1.一种干细胞培养基，其特征在于，所述干细胞培养基由重量份数为31~36%的干细胞培养基A和补足余量的干细胞培养基B组成；
所述干细胞培养基A由以下组分组成：
重量份数为63~69%的水基DMEM(H)细胞培养基、重量份数为0.2~0.6%的L-丝氨酸、重量份数为0.3~0.7%的钴胺素、重量份数为0.3~0.5%的乌头碱、重量份数为1.1~1.3%的次乌头碱、重量份数为0.2~0.5%的新乌头碱、重量份数为0.4~0.7%的苯甲酰次乌头原碱、重量份数为0.2~0.4%的苯甲酰乌头原碱、重量份数为0.7~0.9%的苯甲酰新乌头原碱和补足余量的纯水；
所述干细胞培养基B由以下组分组成：
重量份数为35~40%的子宫内膜干细胞破碎离心的上清液和补足余量的水基DMEM(H)细胞培养基。
2.根据权利要求1所述的干细胞培养基，其特征在于，所述子宫内膜干细胞破碎离心的上清液的制备方法为：
步骤一：将子宫内膜干细胞和重量份数为所述子宫内膜干细胞的重量份数的2%的蛋白酶抑制剂放入超声波细胞破碎仪，加入重量为子宫内膜干细胞重量10倍的纯水，24℃下，23KHz超声波破碎17min，得干细胞破碎液；
步骤二：将所述干细胞破碎液放入离心机，每5ml离心4min，转速7400~7900r/min，取上清液得所述子宫内膜干细胞破碎离心的上清液。
3.根据权利要求1所述的干细胞培养基，其特征在于，所述干细胞培养基由重量份数为34%的干细胞培养基A和补足余量的干细胞培养基B组成。
4.根据权利要求1所述的干细胞培养基，其特征在于，在所述干细胞培养基A中，所述水基DMEM(H)细胞培养基的重量份数为67%。
5.根据权利要求1所述的干细胞培养基，其特征在于，在所述干细胞培养基A中，所述L-丝氨酸的重量份数为0.4%、所述钴胺素的重量份数为0.5%。
6.根据权利要求1所述的干细胞培养基，其特征在于，在所述干细胞培养基A中，所述乌头碱的重量份数为0.4%、所述次乌头碱的重量份数为1.2%、所述新乌头碱的重量份数为0.3%。
7.根据权利要求1所述的干细胞培养基，其特征在于，在所述干细胞培养基A中，所述苯甲酰次乌头原碱的重量份数为0.6%、所述苯甲酰乌头原碱的重量份数为0.3%、所述苯甲酰新乌头原碱的重量份数为0.8%。
8.根据权利要求1所述的干细胞培养基，其特征在于，在所述干细胞培养基B中，所述子宫内膜干细胞破碎离心的上清液的重量份数为38%。
9.一种如权利要求1~8任一所述的干细胞培养基的应用方法，其特征在于，所述干细胞培养基的应用方法包括：
步骤一：从-196℃液氮中取出装有子宫内膜干细胞的冻存管，放入37℃温水轻晃在90s内融化复苏，打开盖子，用吸管吸出子宫内膜干细胞悬液加到离心管，向离心管加入4倍的所述子宫内膜干细胞悬液重量的37℃的干细胞培养基A，用移液枪吹打混匀后，每5ml放入离心机中，1000rpm离心5min后弃去上清液；
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步骤三：向所述培养瓶中加入12倍的所述剩余部分重量的37℃的干细胞培养基B，用浓度为7.4%的NaHCO3溶液调整pH值为7.3后，36.5℃下，放入5%CO2的180rpm的摇床中培养，完成应用。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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