CN109276758A - 一种经血干细胞膜片的制备方法 - Google Patents

一种经血干细胞膜片的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种经血干细胞膜片的制备方法，包括以下步骤：制备适合干细胞的培养基；进行经血干细胞膜片制备工作，与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：整体操作方法简单，可以提高局部经血干细胞浓度，延长经血干细胞作用时间。

Description

一种经血干细胞膜片的制备方法
技术领域
本发明是一种经血干细胞膜片的制备方法，属于生物技术领域。
背景技术
经血干细胞是来源于女性经血中的干细胞，具有活性高、分泌因子能力强等特点。经血干细胞膜片利用自身经血干细胞分泌的细胞外基质，完整的保留细胞外基质和细胞间连接，生物相容性好，而且干细胞活性和增殖能力增强，经血干细胞作为治疗严重子宫内膜损伤的活性成分，具有获取方便的优点，其可以补充局部干细胞数量，并分泌生长因子改善局部微环境及免疫调节等作用。经血干细胞分泌因子能力更强，而且分泌的因子更符合子宫内膜修复的需要。经血干细胞自身分泌的细胞外基质支架具有良好的生物相容性、可降解性及安全性。为经血干细胞提供支持位点，提高局部经血干细胞浓度，延长经血干细胞作用时间。
中国专利CN 108261566 A提出了一种经血干细胞膜片的制备方法，但是其操作繁琐，不易推广。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明目的是提供一种经血干细胞膜片的制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为了实现上述目的，本发明是通过如下的技术方案来实现：一种经血干细胞膜片的制备方法，包括以下步骤：
制备适合干细胞的培养基；
进行经血干细胞膜片制备工作。
进一步地，制备适合干细胞的培养基的具体步骤为：首先将培养皿放置在电热烤箱内物品然后加热到160℃以上，并保持90－120分钟，然后在一个容器中加入比预期培养基总体积少5％的双蒸水，在室温的水中加入干粉培养基，轻轻搅拌，加NaHCO3到培养基中，用双蒸水稀释到合适的体积，搅拌溶解，通过缓慢搅拌加入NaOH 或HCL调节pH值，由于pH值在过滤时会上升0.1到0.3，因而调节pH值使它比最终想要的pH值低0.2到0.3，然后在培养基中加入血清，所述血清为小牛血清、新牛血清或胎牛血清，胎牛血清取自剖腹产的胎牛，新牛血清取自出生24小时之内的新生牛，小牛血清取自出生10－30天的小牛，通过血清向培养基内的细胞提供氨基酸、维生素、无机物、脂类物质、核酸衍生物。
进一步地，进行经血干细胞膜片制备工作的具体步骤为：取经过稳定的经血，作离心分离15～30分钟，每分钟转速为2500～3 000转，取得固形物，去除血浆，用水使固形物沉渣溶解，取白膜层，分别置于50ml离心管内，加生理盐水混匀，将白细胞悬液离心，弃上清液，沉淀用生理盐水清洗三遍，取培养基将细胞沉淀，然后将最终制备的培养基放置在消毒后的培养皿中，放置于培养箱中培养，待细胞生长旺盛以后，再换成无血清培养液，细胞转入无血清培养基培养要有一个适应过程，要逐步降低血清浓度，从10%减少到5%，3%，1%，直至无血清培养，在降低过程中要观察细胞形态是否发生变化，是否有部分细胞死亡，存活细胞是否还保持原有的功能和生物学特性，细胞转入无血清培养之前，要留有种子细胞，种子细胞按常规培养于含血清的培养基中，以保证细胞的特性不发生变化，待细胞融合度达到要求后，在新的培养皿中进行传代培养，培养至3-6代时，进行经血干细胞膜片制备。
本发明的有益效果：本发明的一种经血干细胞膜片的制备方法，整体操作方法简单，可以提高局部经血干细胞浓度，延长经血干细胞作用时间。
具体实施方式
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。
本发明提供一种技术方案：一种经血干细胞膜片的制备方法，包括以下步骤：
制备适合干细胞的培养基，现代生物技术均通过细胞作为载体来进行，无论是基因治疗、干细胞、克隆技术都在细胞内进行的。细胞的生长需要一定的营养环境，用于维持细胞生长的营养基质称为培养基，即指所有用于各种目的的体外培养、保存细胞用的物质，就其本意上讲为人工模拟体内生长的营养环境，使细胞在此环境中有生长和繁殖的能力。它是提供细胞营养和促进细胞生长增殖的物质基础。细胞培养基其组成成分主要有：水、氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子及其他一些入核酸降解物、激素等，制备适合干细胞的培养基是实验的关键；
进行经血干细胞膜片制备工作。
制备适合干细胞的培养基的具体步骤为：首先将培养皿放置在电热烤箱内物品然后加热到160℃以上，并保持90－120分钟，然后在一个容器中加入比预期培养基总体积少5％的双蒸水，在室温的水中加入干粉培养基，轻轻搅拌，加NaHCO3到培养基中，用双蒸水稀释到合适的体积，搅拌溶解，通过缓慢搅拌加入NaOH 或HCL调节pH值，由于pH值在过滤时会上升0.1到0.3，因而调节pH值使它比最终想要的pH值低0.2到0.3，然后在培养基中加入血清，所述血清为小牛血清、新牛血清或胎牛血清，胎牛血清取自剖腹产的胎牛，新牛血清取自出生24小时之内的新生牛，小牛血清取自出生10－30天的小牛，通过血清向培养基内的细胞提供氨基酸、维生素、无机物、脂类物质、核酸衍生物。
进行经血干细胞膜片制备工作的具体步骤为：取经过稳定的经血，作离心分离15～30分钟，每分钟转速为2500～3 000转，取得固形物，去除血浆，用水使固形物沉渣溶解，取白膜层，分别置于50ml离心管内，加生理盐水混匀，将白细胞悬液离心，弃上清液，沉淀用生理盐水清洗三遍，取培养基将细胞沉淀，然后将最终制备的培养基放置在消毒后的培养皿中，放置于培养箱中培养，待细胞生长旺盛以后，再换成无血清培养液，细胞转入无血清培养基培养要有一个适应过程，要逐步降低血清浓度，从10%减少到5%，3%，1%，直至无血清培养，在降低过程中要观察细胞形态是否发生变化，是否有部分细胞死亡，存活细胞是否还保持原有的功能和生物学特性，细胞转入无血清培养之前，要留有种子细胞，种子细胞按常规培养于含血清的培养基中，以保证细胞的特性不发生变化，待细胞融合度达到要求后，在新的培养皿中进行传代培养，培养至3-6代时，进行经血干细胞膜片制备。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点,对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (3)

1.一种经血干细胞膜片的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
制备适合干细胞的培养基；
进行经血干细胞膜片制备工作。
2.根据权利要求1所述的一种经血干细胞膜片的制备方法，其特征在于：制备适合干细胞的培养基的具体步骤为：首先将培养皿放置在电热烤箱内物品然后加热到160℃以上，并保持90－120分钟，然后在一个容器中加入比预期培养基总体积少5％的双蒸水，在室温的水中加入干粉培养基，轻轻搅拌，加NaHCO3到培养基中，用双蒸水稀释到合适的体积，搅拌溶解，通过缓慢搅拌加入NaOH 或HCL调节pH值，由于pH值在过滤时会上升0.1到0.3，因而调节pH值使它比最终想要的pH值低0.2到0.3，然后在培养基中加入血清，所述血清为小牛血清、新牛血清或胎牛血清，胎牛血清取自剖腹产的胎牛，新牛血清取自出生24小时之内的新生牛，小牛血清取自出生10－30天的小牛，通过血清向培养基内的细胞提供氨基酸、维生素、无机物、脂类物质、核酸衍生物。
3.根据权利要求1所述的一种经血干细胞膜片的制备方法，其特征在于：进行经血干细胞膜片制备工作的具体步骤为：取经过稳定的经血，作离心分离15～30分钟，每分钟转速为2500～3 000转，取得固形物，去除血浆，用水使固形物沉渣溶解，取白膜层，分别置于50ml离心管内，加生理盐水混匀，将白细胞悬液离心，弃上清液，沉淀用生理盐水清洗三遍，取培养基将细胞沉淀，然后将最终制备的培养基放置在消毒后的培养皿中，放置于培养箱中培养，待细胞生长旺盛以后，再换成无血清培养液，细胞转入无血清培养基培养要有一个适应过程，要逐步降低血清浓度，从10%减少到5%，3%，1%，直至无血清培养，在降低过程中要观察细胞形态是否发生变化，是否有部分细胞死亡，存活细胞是否还保持原有的功能和生物学特性，细胞转入无血清培养之前，要留有种子细胞，种子细胞按常规培养于含血清的培养基中，以保证细胞的特性不发生变化，待细胞融合度达到要求后，在新的培养皿中进行传代培养，培养至3-6代时，进行经血干细胞膜片制备。
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