CN109022350B - 一种提取及培养小鼠高纯度原代肾小管上皮细胞的方法及培养基 - Google Patents

一种提取及培养小鼠高纯度原代肾小管上皮细胞的方法及培养基 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种提取及培养小鼠高纯度原代肾小管上皮细胞的方法及培养基，该培养基由以下各原料混合而成：500 mL DMEM/Ham´s F12培养基、两性离子缓冲液5mL、胎牛血清50mL、庆大霉素500uL、两性霉素B 500uL、表皮生长因子50uL、胰岛素‑转铁蛋白‑硒添加剂50uL和激素混合物5mL。本发明还提供了使用上述培养基提取及培养高纯度原代肾小管上皮细胞的方法。有益效果为，采用本发明的高选择性的培养基，可提取及培养出纯度高达92%以上的小鼠原代肾小管上皮细胞，培养得到的高纯度原代肾小管上皮细胞是研究急性肾损伤或慢性肾脏病损伤机制的较好工具细胞。

Description

一种提取及培养小鼠高纯度原代肾小管上皮细胞的方法及培 养基
技术领域
本发明涉及原代肾小管上皮细胞的提取及培养领域，具体涉及一种提取及培养小鼠高纯度原代肾小管上皮细胞的方法及培养基。
背景技术
传统的肾小管上皮细胞系虽然构建简单，使用较普遍，但是这些细胞系丧失部分功能，只能部分表达某几种转运和代谢相关酶，且从体内分离的时间相对较长，因此不足以模仿体内的真实情况，得到的研究结果参考性差。此外，传统的原代肾小管上皮细胞提取技术得到的肾小管上皮细胞系中掺杂有较多其他细胞，纯度仅60%左右，用于研究时难免受其他杂质细胞的影响。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种提取及培养小鼠高纯度原代肾小管上皮细胞的方法及培养基，旨在提供一种功能上与其在体内的情况更为接近且纯度更高的肾小管上皮细胞，以更好的用于研究急性肾损伤或慢性肾脏病肾小管上皮细胞的损伤机质，以及用于药厂研发药物时药理和毒理的考察。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种培养小鼠高纯度原代肾小管上皮细胞的培养基，其由以下各原料混合而成：500 mL DMEM/Ham´s F12培养基、两性离子缓冲液5mL、胎牛血清50mL、庆大霉素500uL、两性霉素B 500uL、表皮生长因子50uL、胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂50uL和激素混合物5mL。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以有如下具体选择。
具体的，所述激素混合物由以下各原料混合而成：HBSS缓冲液28.5mL、两性离子缓冲剂0.5mL、前列腺素E2 1mL、 Trijod-Thyronine 5mL、氢化可的松5mL和肾上腺素5mL。
本发明还提供了一种提取小鼠高纯度原代肾小管上皮细胞的方法，其包括如下步骤：
（1）小鼠经颈椎脱臼处死后于流动水冲洗减少毛发中的污染物，再于75%酒精中浸泡10min，然后在细胞台中将小鼠沿腹中线剪开后取出肾脏浸于PBS中，用镊子去除肾包膜，并将剩下的肾组织剁碎；
（2）在细胞培养箱中将剪碎的肾组织使用0.2%的胶原酶IV消化1h，每15min吹打一次使其消化更均匀，随后，先后使用70um和40um的筛网进行过滤去除未消化组织以及肾小球，得悬液；
（3）将悬液进行1200rpm*8min离心处理，然后加入红细胞裂解液吹打混匀后静置5min，然后加入PBS终止红细胞裂解液的消化作用；
（4）将经红细胞裂解处理后的样品进行1200rpm*8min离心处理，然后再加入PBS进行洗涤；
（5）将加入PBS洗涤的样品进行1200rpm*8min离心，然后加入10mL上述的培养基进行重悬；
（6）将重悬液加入1029 Corning培养皿中放于细胞培养箱贴壁1h使巨噬细胞贴壁去除；
（7）将1029培养皿中的培养基轻轻吸入到3003 Corning培养皿中培养，三天后进行第一次换液，期间勿动，之后隔天换液一次，直至长到需要的程度（通常是至少长满培养皿面积的60%以上），即可得到纯化的原代肾小管上皮细胞。建议2代以内使用，最好不传代使用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明采用高选择性的培养基，使得到的小鼠原代肾小管上皮细胞的纯度高达92%以上，使其成为研究急性肾损伤或慢性肾脏病损伤机制的较好工具细胞。
附图说明
图1为本发明提取的小鼠原代肾小管上皮细胞在EMT模型建立过程中的细胞形态及生长状态的显微图片；
图2为饥饿处理及TGF-β刺激前后的小鼠原代肾小管上皮细胞的细胞免疫荧光爬片；
图3为透射电镜下观察到的样本细胞形态。
具体实施方式
以下结合附图及具体实施例对本发明提供的技术方案作进一步的详细描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1
一种培养小鼠高纯度原代肾小管上皮细胞的培养基，其由以下各原料混合而成：500 mL DMEM/Ham´s F12培养基、两性离子缓冲液5mL、胎牛血清50mL、庆大霉素500uL、两性霉素B 500uL、表皮生长因子50uL、胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂50uL和激素混合物5mL。其中，所述激素混合物由以下各原料混合而成：HBSS缓冲液28.5mL、两性离子缓冲剂0.5mL、前列腺素E2 1mL、 Trijod-Thyronine 5mL、氢化可的松5mL和肾上腺素5mL。
实施例2
一种提取小鼠高纯度原代肾小管上皮细胞的方法，其包括如下步骤：
（1）小鼠经颈椎脱臼处死后于流动水冲洗减少毛发中的污染物，再于75%酒精中浸泡10min，然后在细胞台中将小鼠沿腹中线剪开后取出肾脏浸于PBS中，用镊子去除肾包膜，并将剩下的肾组织剁碎；
（2）在细胞培养箱中将剪碎的肾组织使用0.2%的胶原酶IV消化1h，每15min吹打一次使其消化更均匀，随后，先后使用70um和40um的筛网进行过滤去除未消化组织以及肾小球，得悬液；
（3）将悬液进行1200rpm*8min离心处理，然后加入红细胞裂解液吹打混匀后静置5min，然后加入PBS终止红细胞裂解液的消化作用；
（4）将经红细胞裂解处理后的样品进行1200rpm*8min离心处理，然后再加入PBS进行洗涤；
（5）将加入PBS洗涤的样品进行1200rpm*8min离心，然后加入10mL上述的培养基进行重悬；
（6）将重悬液加入1029 Corning培养皿中放于细胞培养箱贴壁1h使巨噬细胞贴壁去除；
（7）将1029培养皿中的培养基轻轻吸入到3003 Corning培养皿中培养，三天后进行第一次换液，期间勿动，之后隔天换液一次，直至长满培养皿面积的60%或以上，即得纯化的原代肾小管上皮细胞，建议2代以内使用，最好不传代使用。
实施例3
使用本发明实施例2得到的小鼠原代肾小管上皮细胞建立缺氧及完成上皮间充质转分化（Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT）模型。EMT模型中，将小鼠原代肾小管上皮细胞提取后种于细胞六孔板中，第三天换液，细胞铺满孔底约40%，第五天换液铺满70%（上皮细胞的形态及生长状况如图1所示，细胞的透射电镜形态如图3所示，从图1可知在显微镜下可以观察到鹅卵石样细胞，形态单一，生长状态良好，从图3可知，在透射电镜下可观察到样本细胞形态均一，根据细胞内的细胞器基本可以排除肌成细胞的可能，即说明样本中主要是原代肾小管上皮细胞）；使用1%血清的培养基饥饿12h后加TGF-β 10ng/ml刺激24h后收取其RNA和蛋白、以及制作细胞免疫荧光爬片（细胞免疫荧光爬片如图2所示，从图2可知细胞荧光显示其上皮表型E-cadherin表达阳性，并且在TGF-β刺激后转分化为肌成纤维细胞，其上皮表型消失）。RT-PCR发现TGF-β，FN均增加，western中FN等纤维化相关指标也增加。免疫荧光发现上皮细胞标志物E-cadherin减少，而TGF-β刺激后的α-SMA表达增加，证明模型建立成功。以上EMT模型的建立，也表明通过本发明提供的方法培养得到的原代肾小管上皮细胞具有较好的生物活性，可用作研究急性肾损伤或慢性肾脏病损伤机制的较好工具细胞。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种培养小鼠高纯度原代肾小管上皮细胞的培养基，其特征在于，由以下各原料混合而成：500 mL DMEM/Ham´s F12培养基、两性离子缓冲液5mL、胎牛血清50mL、庆大霉素500uL、两性霉素B 500uL、表皮生长因子50uL、胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂50uL和激素混合物5mL，所述激素混合物由以下各原料混合而成：HBSS缓冲液28.5mL、两性离子缓冲剂0.5mL、前列腺素E2 1mL、 Trijod-Thyronine 5mL、氢化可的松5mL和肾上腺素5mL。
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