CN109022350B - 一种提取及培养小鼠高纯度原代肾小管上皮细胞的方法及培养基 - Google Patents
一种提取及培养小鼠高纯度原代肾小管上皮细胞的方法及培养基 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109022350B CN109022350B CN201810952148.3A CN201810952148A CN109022350B CN 109022350 B CN109022350 B CN 109022350B CN 201810952148 A CN201810952148 A CN 201810952148A CN 109022350 B CN109022350 B CN 109022350B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- culture medium
- epithelial cells
- tubular epithelial
- renal tubular
- extracting
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 210000004926 tubular epithelial cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 32
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 title claims abstract description 19
- 238000012258 culturing Methods 0.000 title claims abstract description 10
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 title claims description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 title abstract description 11
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims abstract description 9
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims abstract description 9
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 claims abstract description 7
- 239000005556 hormone Substances 0.000 claims abstract description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 7
- 239000002994 raw material Substances 0.000 claims abstract description 7
- APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N Amphotericin-B Natural products O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1C=CC=CC=CC=CC=CC=CC=C[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N 0.000 claims abstract description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims abstract description 4
- 102000009024 Epidermal Growth Factor Human genes 0.000 claims abstract description 4
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 claims abstract description 4
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 claims abstract description 4
- 239000000654 additive Substances 0.000 claims abstract description 4
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 229960003942 amphotericin b Drugs 0.000 claims abstract description 4
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 claims abstract description 4
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 claims abstract description 4
- 229910052711 selenium Inorganic materials 0.000 claims abstract description 4
- 239000011669 selenium Substances 0.000 claims abstract description 4
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 claims abstract description 4
- JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N hydrocortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N 0.000 claims description 6
- UCTWMZQNUQWSLP-VIFPVBQESA-N (R)-adrenaline Chemical compound CNC[C@H](O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 UCTWMZQNUQWSLP-VIFPVBQESA-N 0.000 claims description 3
- 229930182837 (R)-adrenaline Natural products 0.000 claims description 3
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 claims description 3
- 229960005139 epinephrine Drugs 0.000 claims description 3
- 229960000890 hydrocortisone Drugs 0.000 claims description 3
- 150000003180 prostaglandins Chemical class 0.000 claims description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 21
- 208000009304 Acute Kidney Injury Diseases 0.000 abstract description 4
- 208000020832 chronic kidney disease Diseases 0.000 abstract description 4
- 230000006378 damage Effects 0.000 abstract description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 abstract description 4
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 abstract description 3
- 208000014674 injury Diseases 0.000 abstract description 3
- 208000033626 Renal failure acute Diseases 0.000 abstract 1
- 201000011040 acute kidney failure Diseases 0.000 abstract 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 12
- 210000005084 renal tissue Anatomy 0.000 description 10
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 8
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 6
- 230000007705 epithelial mesenchymal transition Effects 0.000 description 5
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 4
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 3
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 3
- 102000000905 Cadherin Human genes 0.000 description 2
- 108050007957 Cadherin Proteins 0.000 description 2
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 2
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 2
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 2
- 238000010009 beating Methods 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 239000003344 environmental pollutant Substances 0.000 description 2
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 235000003642 hunger Nutrition 0.000 description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 231100000719 pollutant Toxicity 0.000 description 2
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010002660 Anoxia Diseases 0.000 description 1
- 241000976983 Anoxia Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 1
- 230000007953 anoxia Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 210000003098 myoblast Anatomy 0.000 description 1
- 210000000651 myofibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 230000037351 starvation Effects 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 231100000027 toxicology Toxicity 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0684—Cells of the urinary tract or kidneys
- C12N5/0686—Kidney cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/05—Inorganic components
- C12N2500/10—Metals; Metal chelators
- C12N2500/20—Transition metals
- C12N2500/24—Iron; Fe chelators; Transferrin
- C12N2500/25—Insulin-transferrin; Insulin-transferrin-selenium
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/11—Epidermal growth factor [EGF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及一种提取及培养小鼠高纯度原代肾小管上皮细胞的方法及培养基，该培养基由以下各原料混合而成：500 mL DMEM/Ham´s F12培养基、两性离子缓冲液5mL、胎牛血清50mL、庆大霉素500uL、两性霉素B 500uL、表皮生长因子50uL、胰岛素‑转铁蛋白‑硒添加剂50uL和激素混合物5mL。本发明还提供了使用上述培养基提取及培养高纯度原代肾小管上皮细胞的方法。有益效果为，采用本发明的高选择性的培养基，可提取及培养出纯度高达92%以上的小鼠原代肾小管上皮细胞，培养得到的高纯度原代肾小管上皮细胞是研究急性肾损伤或慢性肾脏病损伤机制的较好工具细胞。
Description
技术领域
本发明涉及原代肾小管上皮细胞的提取及培养领域，具体涉及一种提取及培养小鼠高纯度原代肾小管上皮细胞的方法及培养基。
背景技术
传统的肾小管上皮细胞系虽然构建简单，使用较普遍，但是这些细胞系丧失部分功能，只能部分表达某几种转运和代谢相关酶，且从体内分离的时间相对较长，因此不足以模仿体内的真实情况，得到的研究结果参考性差。此外，传统的原代肾小管上皮细胞提取技术得到的肾小管上皮细胞系中掺杂有较多其他细胞，纯度仅60%左右，用于研究时难免受其他杂质细胞的影响。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种提取及培养小鼠高纯度原代肾小管上皮细胞的方法及培养基，旨在提供一种功能上与其在体内的情况更为接近且纯度更高的肾小管上皮细胞，以更好的用于研究急性肾损伤或慢性肾脏病肾小管上皮细胞的损伤机质，以及用于药厂研发药物时药理和毒理的考察。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种培养小鼠高纯度原代肾小管上皮细胞的培养基，其由以下各原料混合而成：500 mL DMEM/Ham´s F12培养基、两性离子缓冲液5mL、胎牛血清50mL、庆大霉素500uL、两性霉素B 500uL、表皮生长因子50uL、胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂50uL和激素混合物5mL。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以有如下具体选择。
具体的，所述激素混合物由以下各原料混合而成：HBSS缓冲液28.5mL、两性离子缓冲剂0.5mL、前列腺素E2 1mL、 Trijod-Thyronine 5mL、氢化可的松5mL和肾上腺素5mL。
本发明还提供了一种提取小鼠高纯度原代肾小管上皮细胞的方法，其包括如下步骤：
（1）小鼠经颈椎脱臼处死后于流动水冲洗减少毛发中的污染物，再于75%酒精中浸泡10min，然后在细胞台中将小鼠沿腹中线剪开后取出肾脏浸于PBS中，用镊子去除肾包膜，并将剩下的肾组织剁碎；
（2）在细胞培养箱中将剪碎的肾组织使用0.2%的胶原酶IV消化1h，每15min吹打一次使其消化更均匀，随后，先后使用70um和40um的筛网进行过滤去除未消化组织以及肾小球，得悬液；
（3）将悬液进行1200rpm*8min离心处理，然后加入红细胞裂解液吹打混匀后静置5min，然后加入PBS终止红细胞裂解液的消化作用；
（4）将经红细胞裂解处理后的样品进行1200rpm*8min离心处理，然后再加入PBS进行洗涤；
（5）将加入PBS洗涤的样品进行1200rpm*8min离心，然后加入10mL上述的培养基进行重悬；
（6）将重悬液加入1029 Corning培养皿中放于细胞培养箱贴壁1h使巨噬细胞贴壁去除；
（7）将1029培养皿中的培养基轻轻吸入到3003 Corning培养皿中培养，三天后进行第一次换液，期间勿动，之后隔天换液一次，直至长到需要的程度（通常是至少长满培养皿面积的60%以上），即可得到纯化的原代肾小管上皮细胞。建议2代以内使用，最好不传代使用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明采用高选择性的培养基，使得到的小鼠原代肾小管上皮细胞的纯度高达92%以上，使其成为研究急性肾损伤或慢性肾脏病损伤机制的较好工具细胞。
附图说明
图1为本发明提取的小鼠原代肾小管上皮细胞在EMT模型建立过程中的细胞形态及生长状态的显微图片；
图2为饥饿处理及TGF-β刺激前后的小鼠原代肾小管上皮细胞的细胞免疫荧光爬片；
图3为透射电镜下观察到的样本细胞形态。
具体实施方式
以下结合附图及具体实施例对本发明提供的技术方案作进一步的详细描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1
一种培养小鼠高纯度原代肾小管上皮细胞的培养基，其由以下各原料混合而成：500 mL DMEM/Ham´s F12培养基、两性离子缓冲液5mL、胎牛血清50mL、庆大霉素500uL、两性霉素B 500uL、表皮生长因子50uL、胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂50uL和激素混合物5mL。其中，所述激素混合物由以下各原料混合而成：HBSS缓冲液28.5mL、两性离子缓冲剂0.5mL、前列腺素E2 1mL、 Trijod-Thyronine 5mL、氢化可的松5mL和肾上腺素5mL。
实施例2
一种提取小鼠高纯度原代肾小管上皮细胞的方法，其包括如下步骤：
（1）小鼠经颈椎脱臼处死后于流动水冲洗减少毛发中的污染物，再于75%酒精中浸泡10min，然后在细胞台中将小鼠沿腹中线剪开后取出肾脏浸于PBS中，用镊子去除肾包膜，并将剩下的肾组织剁碎；
（2）在细胞培养箱中将剪碎的肾组织使用0.2%的胶原酶IV消化1h，每15min吹打一次使其消化更均匀，随后，先后使用70um和40um的筛网进行过滤去除未消化组织以及肾小球，得悬液；
（3）将悬液进行1200rpm*8min离心处理，然后加入红细胞裂解液吹打混匀后静置5min，然后加入PBS终止红细胞裂解液的消化作用；
（4）将经红细胞裂解处理后的样品进行1200rpm*8min离心处理，然后再加入PBS进行洗涤；
（5）将加入PBS洗涤的样品进行1200rpm*8min离心，然后加入10mL上述的培养基进行重悬；
（6）将重悬液加入1029 Corning培养皿中放于细胞培养箱贴壁1h使巨噬细胞贴壁去除；
（7）将1029培养皿中的培养基轻轻吸入到3003 Corning培养皿中培养，三天后进行第一次换液，期间勿动，之后隔天换液一次，直至长满培养皿面积的60%或以上，即得纯化的原代肾小管上皮细胞，建议2代以内使用，最好不传代使用。
实施例3
使用本发明实施例2得到的小鼠原代肾小管上皮细胞建立缺氧及完成上皮间充质转分化（Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT）模型。EMT模型中，将小鼠原代肾小管上皮细胞提取后种于细胞六孔板中，第三天换液，细胞铺满孔底约40%，第五天换液铺满70%（上皮细胞的形态及生长状况如图1所示，细胞的透射电镜形态如图3所示，从图1可知在显微镜下可以观察到鹅卵石样细胞，形态单一，生长状态良好，从图3可知，在透射电镜下可观察到样本细胞形态均一，根据细胞内的细胞器基本可以排除肌成细胞的可能，即说明样本中主要是原代肾小管上皮细胞）；使用1%血清的培养基饥饿12h后加TGF-β 10ng/ml刺激24h后收取其RNA和蛋白、以及制作细胞免疫荧光爬片（细胞免疫荧光爬片如图2所示，从图2可知细胞荧光显示其上皮表型E-cadherin表达阳性，并且在TGF-β刺激后转分化为肌成纤维细胞，其上皮表型消失）。RT-PCR发现TGF-β，FN均增加，western中FN等纤维化相关指标也增加。免疫荧光发现上皮细胞标志物E-cadherin减少，而TGF-β刺激后的α-SMA表达增加，证明模型建立成功。以上EMT模型的建立，也表明通过本发明提供的方法培养得到的原代肾小管上皮细胞具有较好的生物活性，可用作研究急性肾损伤或慢性肾脏病损伤机制的较好工具细胞。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (1)
1.一种培养小鼠高纯度原代肾小管上皮细胞的培养基，其特征在于，由以下各原料混合而成：500 mL DMEM/Ham´s F12培养基、两性离子缓冲液5mL、胎牛血清50mL、庆大霉素500uL、两性霉素B 500uL、表皮生长因子50uL、胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂50uL和激素混合物5mL，所述激素混合物由以下各原料混合而成：HBSS缓冲液28.5mL、两性离子缓冲剂0.5mL、前列腺素E2 1mL、 Trijod-Thyronine 5mL、氢化可的松5mL和肾上腺素5mL。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810952148.3A CN109022350B (zh) | 2018-08-21 | 2018-08-21 | 一种提取及培养小鼠高纯度原代肾小管上皮细胞的方法及培养基 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810952148.3A CN109022350B (zh) | 2018-08-21 | 2018-08-21 | 一种提取及培养小鼠高纯度原代肾小管上皮细胞的方法及培养基 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN109022350A CN109022350A (zh) | 2018-12-18 |
| CN109022350B true CN109022350B (zh) | 2021-08-20 |
Family
ID=64626606
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201810952148.3A Active CN109022350B (zh) | 2018-08-21 | 2018-08-21 | 一种提取及培养小鼠高纯度原代肾小管上皮细胞的方法及培养基 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN109022350B (zh) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110241071B (zh) * | 2019-06-28 | 2021-02-23 | 武汉赛尔朗灵科技有限公司 | 一种人正常肾小管原代细胞及其体外分离培养和应用 |
| CN118028217A (zh) * | 2024-02-29 | 2024-05-14 | 武汉普诺赛生命科技有限公司 | 一种肾小管上皮细胞完全培养基及其应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104694460A (zh) * | 2015-02-13 | 2015-06-10 | 武汉大学深圳研究院 | 人或哺乳动物正常上皮细胞的培养基、培养方法、正常上皮细胞及其应用 |
-
2018
- 2018-08-21 CN CN201810952148.3A patent/CN109022350B/zh active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104694460A (zh) * | 2015-02-13 | 2015-06-10 | 武汉大学深圳研究院 | 人或哺乳动物正常上皮细胞的培养基、培养方法、正常上皮细胞及其应用 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 原代肾小管上皮细胞的提取和培养方法的优化;曲玥阳等;《沈阳农业大学学报》;20180215;第49卷(第1期);27-33 * |
| 大鼠肾小管上皮细胞分离及其体外原代培养;张元元等;《现代医药卫生》;20121230(第24期);3742-3744 * |
| 大鼠近端肾小管上皮细胞的原代培养和鉴定;王光兰等;《中国老年学杂志》;20100210(第03期);334-336 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN109022350A (zh) | 2018-12-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN106754674B (zh) | 从人胎盘羊膜制备羊膜间充质干细胞的方法及其应用 | |
| CN109880797A (zh) | 一种制备人脐带间充质干细胞外泌体的方法 | |
| CN104450611B (zh) | 一种人羊膜间充质干细胞原代分离及培养方法 | |
| CN114317443B (zh) | 乳腺癌类器官培养液及其培养试剂组合和培养方法 | |
| WO2016049986A1 (zh) | 一种脐带间充质干细胞的分离方法 | |
| CN107164319B (zh) | 一种原代培养犬脐带来源的间充质干细胞的方法 | |
| CN106801032B (zh) | 人羊膜上皮干细胞库的构建方法 | |
| CN104560869B (zh) | 一种制备绒毛膜间充质干细胞的方法 | |
| CN109022350B (zh) | 一种提取及培养小鼠高纯度原代肾小管上皮细胞的方法及培养基 | |
| CN112430567A (zh) | 一种尿源性肾干细胞的培养方法及其应用 | |
| CN112063583B (zh) | 一种从脂肪组织中高效分离提取脂肪间充质干细胞的方法 | |
| CN105112355B (zh) | 一种黑色素细胞的培养方法 | |
| CN105543164A (zh) | 一种原代奶牛乳腺上皮细胞的分离培养方法 | |
| CN102051344A (zh) | 一组人成骨肉瘤细胞系及小鼠体内移植模型 | |
| CN104818244A (zh) | 一种羊膜上皮细胞分离、培养的方法 | |
| CN102965337A (zh) | 分离提取人皮下脂肪间充质干细胞的方法和提取专用培养基 | |
| CN103305461A (zh) | 一种以月经产物制备间充质干细胞的方法 | |
| CN105907710A (zh) | 一种人脂肪间充质干细胞的分离培养方法 | |
| CN104472474A (zh) | 一种人脂肪间充质干细胞冻存液 | |
| CN116948945A (zh) | 一种肾小管上皮原代细胞的提取方法及其应用 | |
| CN115181722B (zh) | 一种鹅骨骼肌卫星细胞的体外分离和培养方法 | |
| CN116836934A (zh) | 骨肉瘤类器官培养液、培养试剂组合及培养方法 | |
| CN106906177B (zh) | 一种裸鼹鼠睾丸间质细胞分离纯化及培养方法 | |
| CN104818243A (zh) | 一种胎盘源胎儿干细胞的分离方法 | |
| KR20240055017A (ko) | 폐 조직으로부터 세포를 수득하는 방법 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |