KR101667224B1

KR101667224B1 - 혈전성 질병을 방지하기 위한 약학 조성물 및 그의 제조 및 용도

Info

Publication number: KR101667224B1
Application number: KR1020127008858A
Authority: KR
Inventors: 바이핑 마; 유웬 콩; 리핑 강; 웨 가오; 다웨이 탄; 천지 슝; 양 자오
Original assignee: 인스티튜트 오브 레디에이션 메디슨, 아카데미 오브 밀리터리 메디컬 사이언시즈, 피엘에이
Priority date: 2009-09-07
Filing date: 2009-09-07
Publication date: 2016-10-18
Also published as: JP5606532B2; WO2011026259A1; EP2476422B1; JP2013503821A; US20120316122A1; KR20120056290A; EP2476422A4; EP2476422A1; HK1167085A1

Abstract

본 발명은 혈전성 질병의 방지를 위한 약학 조성물 및 이의 제조 방법 및 용도에 관한 것이다. 상기 약학 조성물은 주로 티모사포닌 AIII 및 티모사포닌 BII, 및 임의로 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하며, 상기 티모사포닌 AIII의 양이 상기 티모사포닌 BII의 양 이상임을 특징으로 한다. 본 발명은 또한 혈전성 질병의 예방 또는 치료를 위한 약제 또는 생성물의 제조에 있어서 티모사포닌 AIII 및 티모사포닌 BII의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 약학 조성물은 혈전성 질병의 예방 또는 치료의 효과를 일으킬 뿐만 아니라 환자에게서 출혈 또는 출혈 성향을 경감시킬 수 있다.

Description

혈전성 질병을 방지하기 위한 약학 조성물 및 그의 제조 및 용도{PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS FOR COMBATING THROMBOTIC DISEASES AND THEIR PREPARATION AND USES}

본 발명은 혈전성 질병을 방지하기 위한 약학 조성물, 그의 제조 방법, 및 그의 용도, 특히 티모사포닌 AIII 및 티모사포닌 BII를 포함하는 약학 조성물, 그의 제조 방법, 및 혈전성 질병의 예방 또는 치료를 위한 약제의 제조를 위한 그의 용도에 관한 것이다.

혈소판의 부착, 응집 및 방출 반응은 혈전증에 이르게 한다. 혈전증은 심근 경색, 뇌졸중 등과 같은 많은 인간 뇌혈관 질병의 주요 병인이며 당뇨병 및 혈관염과 같은 몇몇 중요 질병들의 악화 인자이다. 혈전방지 요법은 이들 질병의 주요 요법들 중 하나이다. 혈소판 응집의 억제, 응고방지, 및 혈전용해는 혈전성 질병의 치료를 위한 3 가지 주요 원칙이며, 여기에서 혈소판 응집 방지가 현저한 치료 효과를 갖는 가장 널리 보급된 요법이며, 관련 약물의 연구 및 개발이 가장 활발하다. 가장 초기의 사이클로옥시게나제 억제제로서의 아스피린에서부터 ADP 수용체 길항물질로서 티클로피딘, 혈소판 GPIIb/IIIa 수용체 길항물질로서 티로피반뿐만 아니라 PGE1, PGI2 등과 같은 일련의 프로스타글란딘에 이르는 많은 약물들이 심장 및 뇌혈관 질병의 임상 치료에 널리 사용되고 있다.

한약재인 리조메 아네마레나에(Rhizome anemarrhenae)(지모)는 백합과 지모속의 다년초 지모(Anemarrhena asphodeloides Bge .)의 뿌리줄기이며, 여기에서 주요 활성 성분은 스테로이드성 사포닌이다. 지금까지, 지모로부터 분리되고 동정된 수십 개의 스테로이드성 사포닌 및 사포제닌뿐만 아니라 플라본, 올리고사카라이드, 폴리사카라이드, 지방산 등이 문헌에 보고되었다.

지아닝 장(Jianying ZHANG) 등은 티모사포닌 Ia, BI, BII, BIII 및 AIII과 같은 단일 화합물이 인간 혈소판 응집에 대한 현저한 활성 및 연장된 혈액 응고 시간을 가짐을 보고하였다(Jianying ZHANG, et al, Clinica Chimica Acta, 1999; 289: 79-88).

티모사포닌 AIII, B 및 BII는 하기의 구조를 갖는다:

바이핑 마(Baiping MA) 등은 단일 화합물 티모사포닌 BII가 대뇌 허혈이 있는 래트의 신경 증상을 현저하게 개선시키고, 뇌경색 영역을 감소시키며, 뇌부종을 경감시킬 수 있으며; 혈류학을 현저하게 개선시키고, 대뇌 허혈에 의해 유발된 염증성 손상을 경감시킬 수 있고; 뇌졸중(발작)의 예방에 사용될 수 있음을 보고하였다(중국 특허 출원 제 200410037347.X 호).

왕쉥 첸(Wansheng CHEN) 등은 뇌졸중의 예방 및 치료를 위한 약제의 제조를 위한 총 티모사포닌의 용도를 보고하였다(중국 특허 출원 공개 제 CN1451384A 호, 출원 번호 03116824.8). 상기 출원에서, 개시된 총 티모사포닌은 티모사포닌 BII, E, B, AIII 함량의 합이 ≥50%임을 특징으로 한다.

왕쉥 첸 등은 지모 추출물(티모사포닌 BII, E1 및 B 함유, 그의 비는 78-92:7-12:0-6이다)의 주사가 래트의 허혈성 재관류 손상에 의해 유발된 행동 증상을 현저하게 개선시킬 수 있고, 뇌 경색 영역을 감소시키며, 대뇌 허혈 래트에서 뇌부종을 경감시킬 수 있고, 허혈성 뇌혈관 질병의 치료에 사용될 수 있음을 또한 보고하였다(중국 특허 출원 공개 제 CN1628790A 호, 출원 번호 200410054146.0).

지금까지 티모사포닌 BII와 함께 주요 활성 성분으로서 티모사포닌 AIII를 포함하는 혈전방지 약물은 발견되지 않았다. 따라서, 상기 임상적 필요는 티모사포닌 BII와 함께 주요 활성 성분으로서 티모사포닌 AIII를 포함하는 혈전방지 약물을 제공하여 충족될 것이다.

본 발명의 하나의 목적은 혈전성 질병의 예방 또는 치료를 위한, 티모사포닌 AIII 및 티모사포닌 BII를 주로 포함하는 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 약학 조성물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가의 또 다른 목적은 혈전성 질병의 예방 또는 치료를 위한 약제의 제조에 있어서 본 발명의 약학 조성물의 용도를 제공하는 것이다.

수년간 예의 검토한 결과, 본 발명의 발명자들은 티모사포닌 AIII 및 티모사포닌 BII의 조합이, 상기 티모사포닌 AIII의 양이 상기 티모사포닌 BII의 양 이상인 한, 혈전성 질병을 방지하는데 사용되며, 상기와 같은 조합은 만족스러운 혈전 방지 효과를 생성시킬 뿐만 아니라 혈전방지제의 사용에서 대개 발생하는 출혈 또는 출혈 성향을 또한 경감시킬 수 있음을 처음으로 발견하고 확인하였다.

도 1은 다양한 마우스 그룹에서 콜라겐의 미 정맥 주사에 의한 치사 시간의 산포도이다.
도 2는 다양한 마우스 그룹에서 미 정맥의 출혈 시간의 산포도이다.

하나의 태양에서, 본 발명은 유효량의 티모사포닌 AIII 및 티모사포닌 BII, 및 임의로 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하며, 상기 티모사포닌 AIII의 양이 상기 티모사포닌 BII의 양 이상임을 특징으로 하는, 혈전성 질병의 예방 또는 치료를 위한 약학 조성물을 제공한다.

하나의 실시태양에서, 티모사포닌 AIII 및 티모사포닌 BII를 모두 티모사포닌 추출물의 형태로 본 발명의 약학 조성물에 사용한다. 상기 실시태양에서, 상기 약학 조성물은 단지 유효량의, 티모사포닌 AIII를 포함하는 추출물 및 티모사포닌 BII를 포함하는 추출물만을 포함하고 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하지 않을 수도 있다.

또 다른 실시태양에서, 본 발명의 약학 조성물 중의 티모사포닌 AIII 대 티모사포닌 BII의 중량비는 1:1 내지 10:1이다.

또 다른 실시태양에서, 본 발명의 약학 조성물 중의 티모사포닌 AIII 대 티모사포닌 BII의 중량비는 2:1 내지 5:1이다.

또 다른 실시태양에서, 본 발명의 약학 조성물 중의 티모사포닌 AIII 대 티모사포닌 BII의 중량비는 3:1이다.

또 다른 태양에서, 본 발명은 목적하는 양의 티모사포닌 AIII를 함유하는 추출물 및 목적하는 양의 티모사포닌 BII를 함유하는 추출물을 혼합하고, 필요에 따라 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제를 임의로 첨가하고, 이어서 상기 혼합물을 적합한 방법에 의해 목적하는 제제로 제형화함을 포함하는, 본 발명의 약학 조성물의 제조 방법을 제공한다.

하나의 실시태양에서, 본 발명의 약학 조성물의 제조 방법은 목적하는 양의 티모사포닌 AIII 화합물 및 티모사포닌 BII 화합물을 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제와 함께 혼합하고, 이어서 상기 혼합물을 적합한 방법에 의해 목적하는 제제로 제형화함을 포함한다.

또 다른 실시태양에서, 본 발명의 약학 조성물의 제조 방법은 하기의 단계들을 포함한다:

적합한 추출 방법에 의해 지모의 달임 부분, 신선한 뿌리줄기, 섬유 뿌리 등을 추출하고, 생성된 추출액을 여과하고, 상기 여액을 수거하고, 이어서 상기 여액을 거대다공성 흡착성 수지 컬럼에 로딩하고, 적합한 용매로 용출시키고, 상응하는 성분을 수거하고, 이를 분리시켜 주로 티모사포닌 BII를 포함하는 지모의 1차 총 사포닌을 수득하는 단계;

충분한 기간 동안 천연 발효, 효소 전환, 완충 염 전환, 산 가수분해, 또는 이들의 조합을 사용함으로써 상기 성분들을 성분치환시켜 지모의 2차 총 사포닌을 수득하는 단계; 및

상기 지모의 1차 총 사포닌 및 2차 총 사포닌을 특정 비로 혼합하여 본 발명의 약학 조성물을 수득하는 단계.

하나의 특정한 실시태양에서, 본 발명의 약학 조성물의 제조 방법은 하기의 단계들을 포함한다:

40 내지 70%의 C₁-C₄ 알콜 또는 40 내지 70%의 아세톤으로 지모의 달임 부분, 신선한 뿌리줄기 또는 섬유 뿌리를 추출하고, 생성된 추출액을 여과하고, 상기 여액을 수거 및 원심분리하고, 이어서 상기 상등액을 거대다공성 흡착성 수지 컬럼에 로딩하고, 물, 20 내지 90% C₁-C₄ 알콜 및 10 내지 80% 아세톤으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 용매로 구배 용출시키고, 50 내지 90% C₁-C₄ 알콜 성분 또는 35 내지 80% 아세톤 성분을 수거하여 지모의 1차 총 사포닌을 수득하는 단계;

상기 성분들을 충분한 시간 동안 β-글루카나제, β-글루코시다제, 펙티나제, 셀룰라제, 에멀신 및 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger) 또는 미생물로 이루어진 그룹 중에서 선택된 효소로 성분치환하고, 전환 액체를 원심분리시켜 지모의 2차 총 사포닌을 수득하는 단계; 및

40 내지 70%의 에탄올로 지모의 달임 부분, 신선한 뿌리줄기 또는 섬유 뿌리를 추출하고, 생성된 추출액을 여과하고, 상기 여액을 수거하고, 감압 하에서 원심분리하고, 이어서 90 내지 100% 에탄올을 첨가하고, 원심분리하고, 이어서 상기 상등액을 거대다공성 흡착성 수지 컬럼에 로딩하고, 20 내지 95% 에탄올 구배로 용출시키고, 50 내지 90% 에탄올 성분을 수거하여 지모의 1차 총 사포닌을 수득하는 단계;

상기 성분들을 1 시간 이상 동안 β-글루카나제, β-글루코시다제, 펙티나제, 셀룰라제, 에멀신 및 아스퍼질러스 니거 또는 미생물로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 효소로 성분치환하고, 상기 전환 액체를 원심분리시켜 지모의 2차 총 사포닌을 수득하는 단계; 및

또 다른 태양에서, 본 발명은 혈전성 질병의 예방 또는 치료를 위한 약제의 제조에서 티모사포닌 AIII 및 티모사포닌 BII의 용도를 제공하며, 여기에서 상기 제조된 약제 중의 상기 티모사포닌 AIII의 양은 티모사포닌 BII의 양 이상이다.

하나의 실시태양에서, 상기 제조된 약제 중의 티모사포닌 AIII 대 티모사포닌 BII의 중량비는 1:1 내지 10:1이다.

또 다른 실시태양에서, 상기 제조된 약제 중의 티모사포닌 AIII 대 티모사포닌 BII의 중량비는 2:1 내지 5:1이다.

또 다른 실시태양에서, 상기 제조된 약제 중의 티모사포닌 AIII 대 티모사포닌 BII의 중량비는 3:1이다.

또 다른 실시태양에서, 상기 혈전성 질병 또는 혈전 관련 질병은 예를 들어 관상동맥 질병, 협심증, 심근 경색, 뇌졸중, 뇌혈전증, 폐 색전증, 당뇨병 및 혈관염을 포함한다.

본 발명에 사용된 "유효량"이란 용어는 혈전성 질병의 임상적인 예방 또는 치료를 성취할 수 있는 병용된 티모사포닌 AIII 및 티모사포닌 BII의 양을 지칭한다.

당해 분야의 숙련가들의 경우, 본 발명의 약학 조성물을 당해 분야의 다양한 통상적인 방법에 의해 다양한 종류의 투여형, 예를 들어 경구 제제, 예를 들어 정제, 캡슐, 용액, 현탁액 및 과립; 비 경구 투여용 투여형, 예를 들어 주사, 연고, 패치로 쉽게 제형화할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물을 당해 분야의 다양한 투여 경로를 통해 사용할 수 있다.

상기 약학 조성물 또는 그의 제제를 상기 제제가 필요한 환자에게 경구 투여 또는 비 경구 투여에 의해 제공할 수 있다. 성인의 경우, 한 사람에 대한 상기 제제의 1일 경구 용량은 150 ㎎ 내지 450 ㎎, 예를 들어 약 300 ㎎이다.

티모사포닌 AIII가 시험관 내에서 혈소판 응집을 현저하게 억제할 수 있고, 혈소판 응집을 방지하기 위한 PGE1의 효과를 개선시킬 수 있으며, 현저한 혈전방지 활성을 가질 수 있는 반면; 티모사포닌 BII는 시험관 내에서 혈소판 응집을 억제할 수 없지만 생체 내에서 혈관을 확장시키고 혈류학을 개선시킬 수 있으며, 혈관 내피세포 상에서 백혈구의 부착을 감소시킬 수 있음이 연구를 통해 입증되었다. 따라서, 본 발명에서, 상이한 작용 기전 및 표적을 갖는 티모사포닌 AIII 및 티모사포닌 BII를 특정 비로 병용하며 따라서 생체 내에서 적은 출혈 성향과 함께 효능 있는 혈전방지 효과를 획득할 수 있다.

따라서, 본 발명의 약학 조성물은 혈전성 질병의 예방 또는 치료를 성취할 수 있을 뿐만 아니라 환자의 출혈 또는 출혈 성향을 경감시킬 수 있다.

본 발명을 수행하기 위한 실시예

하기의 실시예들은 본 발명을 추가로 예시하기 위해 사용되나, 이들 실시예는 본 발명을 어떠한 식으로도 제한하고자 하지 않다.

구체적으로 달리 나타내지 않는 한, 본문에서 백분율 또는 부는 중량 백분율 또는 중량 부를 지칭하며, 조성물 중의 성분 함량의 합은 100%와 같다.

실시예 1

마우스에서 미 정맥의 출혈 시간 및 콜라겐 미 정맥 주사에 의한 치사 시간에 대한 본 발명의 약학 조성물의 효과

I. 실험 물질 및 방법

1. 실험 물질

티모사포닌 AIII 및 BII 단일 화합물을 공지된 방법에 따라 제조하였으며(Acta Pharmaceutica Sinica, 1996; 31(4): 271-277; Chem Pharm Bull, 1963, 11: 1221), 이들 2 개의 화합물은 모두 98.5% 초과의 순도를 가졌고; 체중 280 내지 320 g의 수컷 위스타(Wistar) 래트, 체중 22 내지 24 g의 수컷 쿤밍(Kunming) 마우스가 군사의학과학원의 동물 사육 센터(the Animal Breeding Center of the Academy of Military Medical Sciences)에 의해 제공되었다. 아드레날린을 베이징 양강 제약 회사(Beijing Yongkang Pharmaceutical Co., Ltd.)로부터 구입하였다. 콜라겐은 자체 제조된 래트 꼬리 콜라겐이었다. PBS를 티안웨이시다이 캄파니(Tianweishidai Company)로부터 구입하였다. 헤파린은 시그마 캄파니(Sigma Company)로부터 구입하였다. 생리 식염수를 샹동 지보 파마슈티칼 팩토리(Shandong Zibo Pharmaceutical Factory)로부터 구입하였다. 아스피린은 쉬지아주앙 제약 회사의 오우이 파마슈티칼 캄파니(Ouyi Pharmaceutical Company of Shijiazhuang Pharmaceutical Group Ltd)로부터 구입하였다.

2. 동물 배치

위스타 래트를 7 개의 그룹으로 무작위 분류하였다: 대조용 그룹, 아스피린 그룹(ASP, 40 ㎎/㎏), AIII 그룹(40 ㎎/㎏), BII 그룹(40 ㎎/㎏), 1:1 그룹(AIII 대 BII의 중량비, 40 ㎎/㎏), 1:3 그룹(AIII 대 BII의 중량비, 40 ㎎/㎏), 3:1 그룹(AIII 대 BII의 중량비, 40 ㎎/㎏). 연속적인 위 투여를 하루에 한 번 7일간 수행하였으며, 실험을 7일째 투여 1 시간 후에 수행하였다. 대조군에게 동일한 부피의 생리식염수를 투여하였다.

3. 실험 방법

3.1 혈소판의 최대 응집 속도의 탐색

상기 7일째 투여 1 시간 후에 위스타 래트를 펜토바르비탈 나트륨(40 내지 60 ㎎/㎏)의 복강 내 주사에 의해 마취시키고, 혈액 샘플을 심장으로부터 채혈하고, 3.8% 나트륨 시트레이트(부피 비: 1:9)로 응고 방지시켰다. 원심분리를 800 rpm 하에 실온에서 10 분간 수행하여 혈소판 풍부 혈장(PRP)을 분리시키고, 이어서 원심분리를 3000 rpm 하 실온에서 20 분간 다시 수행하여 혈소판 결핍 혈장(PPP)을 분리시켰다. F-820 혈구계를 사용하여 카운팅을 수행하고 PRP를 3.0 x 10¹¹/L의 농도를 갖도록 PPP로 조절하였다.

크로노로그(Chronolog) 혈소판 응집 분석기 시험: 혈소판 현탁액을 3.0 x 10¹¹/L의 농도를 갖도록 혈장으로 조절하고, 상기 혈소판 응집 분석기를 켜고 30 분간 예열하고, PPP를 블랭크 대조군으로서 사용하여 투과율을 100%로 조절하였다. 혈소판 현탁액 450 ㎕를 취하고, 교반 막대로 교반하고 37 ℃에서 3 분간 예열하고, 유도제(50 ㎕) ADP 제(최종 농도: 20 μM)를 별도로 가하고, 이어서 5 분 다이어그램을 기록하고, 1 분, 3 분 및 5 분째의 응집 속도 및 최대 응집 속도를 판독하였다.

3.2 동맥-정맥 우회로 혈전증의 실험

래트를 2% 펜토바르비탈 나트륨 용액 (30 내지 40 ㎎/㎏)의 복강 내 주사에 의해 마취시키고, 뒤로 누운 자세로 고정하고, 우측 총경동맥 및 좌측 바깥 경정맥을 분리시키고, 폴리에틸렌관의 세 부분을 연결하고, 그의 한쪽 단부를 상기 우측 총경동맥에 삽입하고 그의 다른 단부를 상기 좌측 바깥 경정맥에 삽입하며, 상기 폴리에틸렌 관을 상기 두 단부에서 25 u/㎖ 헤파린(생리식염수를 사용하여 새로 제조한 것)으로 충전하였으며, 상기 중간 부분의 길이는 10 ㎝이었고, 길이 8 ㎝의 7^# 봉합사(칭량한 것)를, 생리 식염수가 충전된 상기 관(주의: 기포가 없도록 해야 한다)에 넣어, 동맥-정맥 우회로를 설치하였다. 상기 관을 15 분 후에 해체하고, 혈전을 꺼내어, 습윤 여과지 상에 바르고, 잔류 혈액은 제거하고, 양피지 상에 놓고 칭량하여 그의 습윤 중량을 획득하였다. 이어서, 상기를 건조 오븐에 넣고 60 ℃에서 1 시간 동안 항량 건조시키고, 냉각시키고 칭량하여 상기 혈전의 건조 중량을 획득하였다.

3.3 마우스에서 미 정맥 출혈 시간의 시험

마우스를 7 개의 그룹으로 무작위 분류하였다: 대조용 그룹, 아스피린 그룹(ASP, 40 ㎎/㎏), AIII 그룹(40 ㎎/㎏), BII 그룹(40 ㎎/㎏), 1:1 그룹(AIII 대 BII의 중량비, 40 ㎎/㎏), 1:3 그룹(AIII 대 BII의 중량비, 40 ㎎/㎏), 3:1 그룹(AIII 대 BII의 중량비, 40 ㎎/㎏). 연속적인 위 투여를 하루에 두 번 5일간 수행하였으며, 실험을 6일째 투여 1 시간 후에 수행하였다. 대조군에게 동일한 부피의 생리식염수를 투여하였다. 모든 약물 비는 AIII 대 BII이었다.

마우스를 펜토바르비탈 나트륨(40 내지 60 ㎎/㎏)으로 마취시키고, 따뜻하고 편안한 패드에 놓고, 마우스의 꼬리가 2.25 내지 2.5 ㎜의 직경을 갖는 위치에서 꼬리 끝을 절단하고, PBS(37 ℃)에 즉시 넣고, 시간측정을 시작하였다. 10 분 이내에 지혈 시간 및 재출혈 시간이 관찰되었으며, 마우스의 출혈 부피는 헤모글로빈 부피에 의해 추정되었다. 10 분 이내에 출혈이 멈추지 않는다면, 압박에 의해 지혈을 수행하고, 지혈 시간을 600 초로서 기록하였다.

3.4 콜라겐의 미 정맥 주사에 의한 마우스의 치사 시간

마우스를 7 개의 그룹으로 무작위 분류하였다: 대조용 그룹, 아스피린 그룹(ASP, 40 ㎎/㎏), AIII 그룹(40 ㎎/㎏), BII 그룹(40 ㎎/㎏), 1:1 그룹(AIII 대 BII의 중량비, 40 ㎎/㎏), 1:3 그룹(AIII 대 BII의 중량비, 40 ㎎/㎏), 3:1 그룹(AIII 대 BII의 중량비, 40 ㎎/㎏). 연속적인 위 투여를 하루에 두 번 5일간 수행하였으며, 실험을 6일째 투여 1 시간 후에 수행하였다. 대조군에게 동일한 부피의 생리식염수를 투여하였다.

마우스를 마우스-고정 틀 상에 고정하고, 콜라겐(0.5 ㎎/㎏) 및 아드레날린(60 ug/㎏)으로 이루어진 혈전형성제(100 ㎍/마우스)를 미 정맥 주사에 의해 투여하였다. 마우스의 증상, 증상 발생 시간, 및 치사 시간을 10 분 이내에 관찰하고, 10 분 후에 죽은 마우스는 생존으로서 간주하였다.

II. 실험 결과

1. 마우스의 혈소판 응집 속도에 대한 위 투여를 통한 티모사포닌의 효과

혈액 샘플을 티모사포닌의 최종 위 투여 1 시간 후에 마취된 마우스의 심장으로부터 채혈하고 분석하여, 투여 후 ADP(20 μ)에 의해 유발된 혈소판 응집의 속도를 측정하였다. 상기 결과는 대조군과 비교 시, 상기 AIII 그룹, 3:1 그룹 및 1:1 그룹의 최대 응집 속도가 현저하게 감소하였으며, 이때 상기 AIII 그룹 및 3:1 그룹의 혈소판 응집 억제 효과는 아스피린 그룹의 경우와 같음을 보였다. 이는 티모사포닌 AIII의 혈소판 응집 억제 효과가 BII의 경우보다 크지만, 상기 3:1 그룹은 여전히 혈소판 응집을 방지하는 현저한 활성을 가짐을 가리킨다.

생체 내 투여에 의한 혈전증에 대한 본 발명의 약학 조성물의 효과
그룹	수	최대 응집 속도 (%)
대조용 그룹	6	54.9±5.8
ASP 40 mg/Kg 그룹	6	40.8±7.6**
AIII 40 mg/Kg 그룹	6	39.8±5.0**
BII 40 mg/Kg 그룹	6	50.8±6.7
1:1 40 mg/Kg 그룹	6	44.5±9.4*
1:3 40 mg/Kg 그룹	6	48.3±5.6
3:1 40 mg/Kg 그룹	6	42.2±4.5**
주: 대조용 그룹과 비교 시: ^*P<0.01, ^P<0.05

2. 동맥-정맥 우회로 혈전증의 실험

정상적인 대조군과 비교 시, 모든 투여 그룹의 혈전 습윤 중량 및 건조 중량은 하락하는 경향을 나타내었으며, 이때 상기 AIII 그룹 및 3:1 그룹의 혈전 습윤 중량은 대조용 그룹의 경우와 현저하게 상이하였고, 상기 1:1 그룹은 차이가 있었으나, 상기 BII 그룹 및 1:3 그룹은 상기 대조용 그룹과 비교 시 통계학적 유의수준을 나타내지 않았다. 상기 실험 결과로부터 AIII이 혈전방지 태양에 주된 역할을 했음을 알 수 있다. 상기 AIII 그룹의 혈전 습윤 중량은 양성 대조용 약물인 아스피린의 경우보다 작았으며, 이는 AIII이 혈전방지 태양에 있어서 아스피린보다 양호함을 가리킨다. 상기 구체적인 실험 결과를 표 2에 나타낸다.

생체 내 투여에 의한 혈전증에 대한 본 발명의 약학 조성물의 효과
그룹	수	혈전 습윤 중량 (mg)	혈전 건조 중량 (mg)
대조용 그룹	11	117.12±38.33	35.9±8.35
ASP 40 mg/Kg 그룹	11	79.74±18.95**	25.5±7.37**
AIII 40 mg/Kg 그룹	8	4.29±22.58**	24.4±6.30**
BII 40 mg/Kg 그룹	9	90.39±29.59	28.6±7.82
1:1 40 mg/Kg 그룹	8	87.75±14.24*	29.6±6.52
3:1 40 mg/Kg 그룹	7	70.31±12.73**	26.6±8.10*
1:3 40 mg/Kg 그룹	6	88.60±17.17	29.5±5.35
주: 대조용 그룹과 비교 시: ^*P<0.01, ^P<0.05

3.3 마우스에서 콜라겐의 미 정맥 주사에 의한 치사 시간의 실험

혈전형성제의 미 정맥 주사 후, 마우스는 가쁜 호흡, 들뜸, 돌기 및 안구 돌출과 같은 증상을 보였으며, 이어서 곧 죽었다. 대조용 그룹의 평균 치사 시간은 129.3±26.9s인 반면, BII 및 AIII를 단독으로 투여한 동물들의 치사 시간은 현저하게 증가하여, 각각 259.1±169.9s 및 237.9±125.1s이었고, 이는 상기 대조용 그룹의 경우와 현저하게 상이하였다. 상기 두 약물의 조합을 투여한 동물의 치사 시간도 또한 상기 대조용 그룹과 비교하여 어느 정도 연장되었으나, 상기 3:1 그룹을 제외하고, 그들의 효과는 단일 약물을 투여한 그룹의 경우보다 열등하였다. 상기 3:1 그룹의 치사 시간 및 생존율은 단일 약물을 투여한 그룹들의 경우와 유사하였으며, 이는 AIII이 상기 약물들의 조합에서 주된 역할을 함을 가리켰다. 상기 그룹들의 구체적인 생존율 및 치사 시간을 표 3 및 도 1에 나타낸다.

마우스에서 콜라겐의 미 정맥 주사에 의한 치사 시간에 대한 생체 내 투여된 약학 조성물의 효과
그룹	수	치사 시간 (s)
대조용 그룹	15	129.3±26.9
ASP 40 mg/Kg 그룹	15	244.6±195.3 ^∽
AIII 40 mg/Kg 그룹	14	237.9±125.1 ^∽∽
BII 40 mg/Kg 그룹	14	259.1±169.9 ^∽∽
1:1 40 mg/Kg 그룹	13	198.6±140.2
3:1 40 mg/Kg 그룹	13	254.6±199.5 ^∽
1:3 40 mg/Kg 그룹	12	142.7±56.9
주: 대조용 그룹과 비교 시: ^*P<0.01, ^P<0.05

3.2 마우스에서 미 정맥 출혈 시간의 실험

상기 대조용 그룹의 평균 지혈 시간은 88.9±45.9s이었으며, 상기 투여 그룹의 출혈 시간은 대조용 그룹에 비해 현저하게 연장되었고, 양성 대조군으로서 상기 아스피린 그룹은 277.4±188.5s의 평균 지혈 시간을 가졌으며, 이는 상기 정상 대조용 그룹과 매우 현저하게 상이하였다. BII 및 AIII을 단독으로 투여한 경우의 평균 지혈 시간은 상기 양성 대조군의 경우보다 더 컸으며, 이는 티모사포닌 BII 또는 AIII의 단일 투여가 현저한 출혈 성향이 있음을 가리켰다. 상기 대조용 그룹에 비해, 상기 약물 조합의 출혈 시간은 또한 어느 정도 연장되었으나, 출혈 부피는 단일 약물 및 아스피린 그룹을 투여한 그룹들의 경우보다 현저하게 적었다. 이는 티모사포닌 BII 및 AIII이 효능 있는 혈전방지 효과를 갖지만, 이들은 또한 현저한 출혈 성향이 있으며; 이들의 합리적인 조합(상기 3:1 그룹)은 혈전방지 활성을 가지며 현저하게 적은 출혈 시간 및 총 출혈 부피를 가짐을 가리켰다. 구체적인 결과를 표 4 및 도 2에 나타낸다.

마우스에서 미 정맥 출혈 시간 및 출혈 부피에 대한 생체 내 투여된 약학 조성물의 효과
그룹	수	지혈 시간 (s)	출혈 부피 (㎕)
대조용 그룹	17	88.9±45.9	11.3±8.3
ASP 40 mg/Kg 그룹	17	277.4±188.5^***	13.5±13.8
AIII 40 mg/Kg 그룹	17	396.6±208.9^***	21.3±29.6
BII 40 mg/Kg 그룹	17	325.1±200.6^***	10.7±9.8
1:1 40 mg/Kg 그룹	17	209.9±148.0^**§§	6.0±5.2§§
3:1 40 mg/Kg 그룹	16	200.3±162.0^*#§§	5.5±6.5#§§
1:3 40 mg/Kg 그룹	17	209.7±206.7^*§§	11.6±13.7§§
주: 대조용 그룹과 비교 시: ^*P<0.001, ^P<0.01, ^*P<0.05 BII 그룹과 비교 시: ###P<0.001; ##P<0.01; #P<0.05 AIII 그룹과 비교 시: §§§P<0.001; §§P<0.01; §P<0.05

III. 논의

시험관 내 활성 선별에서 티모사포닌 AIII은 혈소판 응집에 대해 현저한 억제 효과를 갖는 반면, 티모사포닌 BII는 현저한 혈관 확장 효과를 가짐을 발견하였다. 동물 생체 내 실험 결과는 티모사포닌 AIII이 래트에서 생체 내 혈소판 응집의 억제 및 동맥-정맥 우회로 혈전증의 방지에 가장 강한 활성을 가지며, BII는 보다 약한 활성을 갖고, 티모사포닌들의 상이한 조합, 특히 티모사포닌 AIII 및 BII의 3:1 조합이 또한 혈소판 응집 억제 및 혈전증 방지의 활성을 가짐을 보였다.

콜라겐의 미 정맥 주사를 사용한 치사 실험에서, 혈소판 응집을 방지하는 작용을 갖는 티모사포닌 AIII 및 혈관 확장 작용을 갖는 티모사포닌 BII는 모두 모델 마우스의 생존 시간을 현저하게 연장하고 모델 마우스의 생존율을 증가시킬 수 있었으나, 상기 마우스 꼬리 절단 실험은 이들 두 화합물을 마우스에게 단독으로 투여했을 때 미 정맥 출혈 시간이 연장되고 출혈 부피가 증가함을 보였다. 이러는 동안, 상기 티모사포닌 AIII 및 BII의 3:1 조합이 또한, 미 정맥 출혈 시간이 연장되고 출혈 부피가 현저하게 감소하였지만, 이들을 단독으로 투여한 경우와 동일한 혈전증 방지 활성을 가졌으며; 상기 티모사포닌들의 다른 조합의 미 정맥 출혈 시간 및 출혈 부피도 감소하였지만, 이들의 혈전방지 활성도 또한 현저하게 감소하였음을 발견하였다. 상기 실험들은 혈전 응집의 적절하게 강한 억제 활성 및 적합한 혈관 확장 활성이 생체 내에서 최상의 혈전방지 효과를 유발할 수 있음을 나타내었다.

따라서, 상기 실험들에서 중요한 발견들 중 하나는 AIII의 비율이 큰 티모사포닌들의 조합이 생체 내에서 최상의 혈전방지 효과를 유발할 수 있고 비교적 적은 출혈 부작용을 가질 수 있다는 것이다. 따라서, 다양한 투여형의 약제들이 개발되었으며, 이를 다양한 종류의 뇌혈관 질병의 치료에 사용할 수 있고, 이는 안전성 및 높은 효율성의 목적을 실현할 수 있다.

실시예 2: 혈소판 응집에 대한 본 발명의 약학 조성물의 시험관 내 억제 효과의 연구

I. 물질 및 방법

1. 실험 물질

체중 280 내지 320 g의 수컷 위스타 래트, 체중 2 내지 2.5 ㎏의 암컷 큰 귀 토끼, 체중 5 내지 7 ㎏의 수컷 마카크 모두 군사의학과학원의 동물 사육 센서에 의해 제공되었다. 인간 혈소판은 베이징 혈액 센터에 의해 제공되었다. 본 발명의 약학 조성물은 실시예 15에 인용된 방법에 따라 제조된 백색 분말이었다. 아데노신 다이포스페이트(ADP), 아라키돈산(AA), 다이메틸 설폭사이드(DMSO)는 시그마 캄파니의 제품이었고; 리스토세틴 및 아드레날린을 바이오풀 캄파니(Biopool Company)로부터 구입하였다.

2. 실험 방법

2.1 채혈

수컷 위스타 래트를 2% 펜토바르비탈 나트륨(30 내지 40 ㎎/㎏)의 복강 내 주사에 의해 마취시키고, 혈액 샘플을 심장으로부터 채혈하고; 혈액 샘플을 암컷 큰 귀 토끼의 귀 동맥으로부터 조용한 상태에서 채혈하고, 이어서 3.8% 나트륨 시트레이트(부피 비: 1:9)로 즉시 응고방지시켰다.

2.2 혈소판의 제조

상기 채혈한 샘플을 800 rpm 하에 실온에서 10 분간 원심분리시키고, 상부 혈소판 풍부 혈장 층을 취하고, 3000 rpm 하에 실온에서 20 분간 원심분리시키고, 상부 혈소판 결핍 혈장 층을 취하였다. F-820 혈구계를 사용하여 카운팅을 수행하고 PRP를 3.0 x 10¹¹/L의 농도를 갖도록 PPP로 조절하였다.

2.3 최대 혈소판 응집 속도의 측정

크로노로그 혈소판 응집 분석기 시험: 혈소판 현탁액을 3.0 x 10¹¹/L의 농도를 갖도록 혈장으로 조절하고, 상기 혈소판 응집 분석기를 켜고, PPP를 블랭크 대조군으로서 사용하여 투과율을 100%로 조절하였다. 혈소판 현탁액 450 ㎕를 취하고, 교반 막대로 교반하고 37 ℃에서 3 분간 예열하고, 다양한 종류의 유도제(50 ㎕): ADP 제(최종 농도: 20 μM), AA(최종 농도: 80 μM), 리스토세틴(최종 농도: 1.2 ㎎/㎖), 아드레날린(최종 농도: 10 μM)를 별도로 가하고, 이어서 5 분 다이어그램을 기록하고, 1 분, 3 분 및 5 분째의 응집 속도 및 최대 응집 속도를 판독하였다.

II. 실험 결과

1. 래트에서 ADP에 의해 유발된 혈소판 응집의 시험관 내 억제에 대한 본 발명의 약학 조성물의 효과

래트의 혈소판 샘플에 상이한 농도의 본 발명의 약학 조성물을 미리 가하고, 2 분간 배양하고, 응집 유도제로서 ADP를 가하고, 상이한 시점에서 혈소판 응집 속도를 탐지하였다. 결과를 표 5에 나타내었으며, 여기에서 본 발명의 약학 조성물 10 ㎍/㎖은 래트 혈소판의 응집을 현저하게 억제할 수 있었으며, 상기 억제 효과는 본 발명의 약학 조성물의 용량 증가에 따라 현저하게 증가하였고, 본 발명의 약학 조성물은 50 ㎍/㎖ 수준에서 래트 혈소판의 응집을 완전하게 억제할 수 있다. 이는 래트 혈소판 응집의 억제를 위한 본 발명의 약학 조성물의 IC₅₀ 값이 26.92±4.75 ㎍/㎖인 통계 처리에 의해 계산되었다.

래트(n=8)의 혈소판 응집에 대한 본 발명의 약학 조성물의 억제 효과
그룹	혈소판 응집 속도 (%)
그룹	1분	3분	5분	최대
ADP 20 μM	22.4±2.83	39.0±1.77	43.9±2.42	43.9±2.42
ADP 20 μM + 본 발명의 약학 조성물 10 ㎍/mL	19.6±5.32	35.6±3.50	37.5±3.82	38.13±3.04**
ADP 20 μM + 본 발명의 약학 조성물 20 ㎍/mL	16.0±4.44	30.6±5.32	27.5±8.75	31.38±6.74**
ADP 20 μM + 본 발명의 약학 조성물 30 ㎍/mL	9.8±5.78	19.0±9.47	14.4±12.32	20.75±8.78**
ADP 20 μM + 본 발명의 약학 조성물 40 ㎍/mL	7.3±5.50	14.0±10.28	10.8±8.63	15.25±8.83**
ADP 20 μM + 본 발명의 약학 조성물 50 ㎍/mL	0.4±0.74	0.1±0.93	0	1.0±1.85**
주: ADP 그룹에 대한 최대 응집 속도 비교: ^P<0.05, ^*P<0.01

2. 토끼에서 시험관 내 혈소판 응집에 대한 본 발명의 약학 조성물의 억제 효과

토끼는 혈전방지 약물의 연구에 통상적인 동물들 중 하나이다. 실험에서, 토끼 혈소판 응집에 대한 상이한 용량의 본 발명의 약학 조성물의 억제 효과를 관찰하였다. 결과를 표 6에 나타내었으며, 여기에서 10 ㎍/㎖의 본 발명의 약학 조성물은 ADP-유발된 토끼 혈소판 응집의 최대 속도를 23%까지 억제할 수 있고, 상기 억제 효과는 본 발명의 약학 조성물의 용량의 증가에 따라 현저하게 증가하였으며, 본 발명의 약학 조성물은 60 ㎍/㎖ 수준에서 래트 혈소판 응집의 최대 속도를 80%까지 억제할 수 있었다. 이는 래트 혈소판 응집의 억제를 위한 본 발명의 약학 조성물의 IC₅₀ 값이 16.1±2.1 ㎍/㎖인 통계 처리에 의해 계산되었다.

토끼(n=3)의 혈소판 응집에 대한 본 발명의 약학 조성물의 억제 효과
그룹	혈소판 응집 속도 (%)
그룹	1분	3분	5분	최대
ADP 20 μM	16.7±2.08	32.0±2.65	35.7±4.73	35.7±4.73
ADP 20 μM + 본 발명의 약학 조성물 10 ㎍/mL	18.0±5.20	26.5±4.50	26.7±3.79	27.3±3.51**
ADP 20 μM + 본 발명의 약학 조성물 20 ㎍/mL	10.5±4.09	14.7±3.51	14.2±3.75	15.2±3.33**
ADP 20 μM + 본 발명의 약학 조성물 30 ㎍/mL	9.0±4.24	10.4±4.74	9.5±0.36	11.0±4.24**
ADP 20 μM + 본 발명의 약학 조성물 40 ㎍/mL	7.3±1.77	7.5±2.12	7.0±4.24	9.0±1.41**
ADP 20 μM + 본 발명의 약학 조성물 60 ㎍/mL	0.4±0.74	5.0±1.41	3.8±3.89	6.8±0.35**
주: ADP 그룹에 대한 최대 응집 속도 비교: ^P<0.05, ^*P<0.01

3. 시험관 내 마카크 혈소판 응집에 대한 본 발명의 약학 조성물의 억제 효과

마카크는 인간에 가장 가까운 유전자 배경을 가졌다. 마카크 혈소판 응집에 대한 본 발명의 약학 조성물의 억제 효과를 관찰하였다. 실험에서 50 ㎍/㎖의 본 발명의 약학 조성물이 ADP-유발된 마카크 혈소판 응집의 최대 속도를 13%까지 억제할 수 있고, 상기 억제 효과는 본 발명의 약학 조성물의 용량의 증가에 따라 현저하게 증가하였으며, 본 발명의 약학 조성물은 150 ㎍/㎖에서 마카크 혈소판 응집의 최대 속도를 90%까지 억제할 수 있음을 발견하였다. 이는 마카크 혈소판 응집의 억제를 위한 본 발명의 약학 조성물의 IC₅₀ 값이 79.16±5.31 ㎍/㎖인 통계 처리에 의해 계산되었다. 마카크 혈소판 응집의 억제를 위한 본 발명의 약학 조성물의 IC₅₀ 값이 토끼 및 래트의 경우보다 현저하게 더 높았음을 알 수 있다.

마카크(n=5)의 혈소판 응집에 대한 본 발명의 약학 조성물의 억제 효과
그룹	혈소판 응집 속도 (%)
그룹	1분	3분	5분	최대
ADP 20 μM	34.8±1.94	54±5.02	58.2±5.84	58.2±5.84
ADP 20 μM + 본 발명의 약학 조성물 50 ㎍/mL	26.6±1.74	40.4±2.24	45±3.46	45±3.46**
ADP 20 μM + 본 발명의 약학 조성물 75 ㎍/mL	15±4.20	29.4±5.35	32.8±5.31	32.8±5.31**
ADP 20 μM + 본 발명의 약학 조성물 100 ㎍/mL	11.6±4.41	20.6±4.76	23.6±3.72	23.6±3.72**
ADP 20 μM + 본 발명의 약학 조성물 125 ㎍/mL	4.5±1.12	9.8±1.79	12.5±2.06	12.5±2.06**
ADP 20 μM + 본 발명의 약학 조성물 150 ㎍/mL	0	4±2.94	7.3±2.36	7.3±2.36**
주: ADP 그룹에 대한 최대 응집 속도 비교: ^P<0.05, ^*P<0.01

4. 상이한 유도제들에 의해 유발된 인간 혈소판 응집에 대한 본 발명의 약학 조성물의 시험관 내 억제 효과의 비교

건강한 인간으로부터의 신선한 혈소판에 상이한 농도의 본 발명의 약학 조성물을 가하고, 이어서 다양한 종류의 유도제로 혈소판 응집을 유도하였으며, 결과를 표 8 내지 11에 나타낸다. 실험에서 ADP(20 μM), 아라키돈산(80 μM), 리스토세틴(1.2 ㎎/㎖) 및 아드레날린(10 μM)이 모두 인간 혈소판 응집을 유발하였으며, 응집 속도는 모두 50% 이상임을 발견하였다. 20 내지 25 ㎍/㎖의 본 발명의 약학 조성물이 상기 유도제들 모두에 의해 유발된 혈소판 응집을 억제할 수 있었고, 상기 억제 효과는 본 발명의 약학 조성물의 용량의 증가에 따라 현저하게 증가하였으며, 본 발명의 약학 조성물은 150 내지 300 ㎍/㎖에서 상기 유도제들에 의해 유발된 인간 혈소판 응집을 완전히 억제할 수 있었다. 상이한 유도제들에 의해 유발된 인간 혈소판 응집을 억제하기 위한 본 발명의 약학 조성물의 IC₅₀ 값을 표 12에 나타내었다.

상기 실험은 상이한 출처로부터의 혈소판들이 본 발명의 약학 조성물에 대해 상이한 감도를 갖지만, 상기 약학 조성물은 높은 용량 수준에서 ADP, 아라키돈산, 리스토세틴 및 아드레날린에 의해 유발된 인간 혈소판 응집을 완전하게 억제함을 보였으며, 이는 본 발명의 약학 조성물이 잠재적으로 임상용 가치를 가짐을 암시한다.

ADP(n=5)에 의해 유발된 인간 혈소판 응집에 대한 본 발명의 약학 조성물의 효과
그룹	혈소판 응집 속도 (%)
그룹	1분	2분	3분	5분
ADP 20 μM	23.5±3.87	34.50±1.73	42.75±2.75	51.25±9.07
ADP 20 μM + 본 발명의 약학 조성물 12.5 ㎍/mL	23.25±2.22	33.00±2.16	42.25±5.91	50.75±9.11
ADP 20 μM + 본 발명의 약학 조성물 25 ㎍/mL	23.75±4.92	32.25±4.11	41.75±6.55	46.75±9.84**
ADP 20 μM + 본 발명의 약학 조성물 50 ㎍/mL	21.00±2.58	30.00±4.55	36.75±6.90	40.75±8.42**
ADP 20 μM + 본 발명의 약학 조성물 100 ㎍/mL	10.50±1.73	17.00±0.82	20.50±1.29	24.00±4.32**
ADP 20 μM + 본 발명의 약학 조성물 200 ㎍/mL	0.25±0.50	0.50±1.00	0.75±1.50	1.50±1.91**
주: ADP 그룹에 대한 최대 응집 속도 비교: ^P<0.05, ^*P<0.01

AA(n=5)에 의해 유발된 인간 혈소판 응집에 대한 본 발명의 약학 조성물의 효과
그룹	최대 응집 속도 (%)
	1분	2분	3분	5분
AA 80 μM	39.00±9.50	53.03±7.30	62.00±5.50	67.75±2.25
AA 80 μM + 본 발명의 약학 조성물 25 ㎍/mL	18.00±3.50	38.13±2.83	49.50±10.50	63.25±3.75
AA 80 μM + 본 발명의 약학 조성물 50 ㎍/mL	16.25±4.75	42.25±3.75	54.75±2.96	61.25±3.25*
AA 80 μM + 본 발명의 약학 조성물 100 ㎍/mL	11.00±7.00	29.15±6.24	37.75±3.38	43.75±3.25**
AA 80 μM + 본 발명의 약학 조성물 200 ㎍/mL	7.50±1.25	18.27±1.85	28.75±10.63	33.00±9.50**
AA 80 μM + 본 발명의 약학 조성물 300 ㎍/mL	0	0	0	0**
주: AA 그룹에 대한 5 분 최대 응집 속도 비교: ^P<0.05, ^*P<0.01

리스토세틴(n=5)에 의해 유발된 인간 혈소판 응집에 대한 본 발명의 약학 조성물의 효과
그룹	최대 응집 속도 (%)
	1분	2분	3분	5분
리스토세틴 1.2 mg/mL	38.67±4.62	54.33±6.35	60.67±5.13	64.67±4.04
리스토세틴 1.2 mg/mL + 본 발명의 약학 조성물 25 ㎍/mL	32.33±2.52	51.67±5.86	57.67±6.66	63.00±3.61
리스토세틴 1.2 mg/mL + 본 발명의 약학 조성물 50 ㎍/mL	30.67±6.43	49.33±7.23	53.00±7.00	58.33±2.89*
리스토세틴 1.2 mg/mL + 본 발명의 약학 조성물 100 ㎍/mL	23.33±1.15	43.00±6.08	49.00±7.21	54.00±2.65*
리스토세틴 1.2m g/mL + 본 발명의 약학 조성물 200 ㎍/mL	2.00±2.00	6.67±3.06	12.33±1.15	24.67±4.16**
리스토세틴 1.2 mg/mL + 본 발명의 약학 조성물 400 ㎍/mL	0	0	0.33±0.58	0.33±0.58**
주: 리스토세틴 그룹에 대한 최대 응집 속도 비교: ^P<0.05, ^*P<0.01

아드레날린(n=5)에 의해 유발된 인간 혈소판 응집에 대한 본 발명의 약학 조성물의 효과
그룹	최대 응집 속도 (%)
그룹	1분	2분	3분	5분
Adrenalin 10 μM	13.67±3.87	44.33±1.53	50.67±1.53	55.67±1.15
Adrenalin + 본 발명의 약학 조성물 25 ㎍/mL	17.33±2.08	41.33±9.07	49.33±5.13	55.33±0.58
Adrenalin + 본 발명의 약학 조성물 50 ㎍/mL	9.67±2.52	21.33±3.51	35.00±5.57	43.33±4.04*
Adrenalin + 본 발명의 약학 조성물 75 ㎍/mL	9.67±2.52	19.00±1.73	31.67±3.51	35.33±1.15**
Adrenalin + 본 발명의 약학 조성물 100 ㎍/mL	1.33±0.58	2.67±0.58	3.33±0.58	4.33±2.08**
Adrenalin + 본 발명의 약학 조성물 150 ㎍/mL	0.33±0.58	0.33±0.58	0.67±0.58	1.33±0.58**
주: 아드레날린 그룹에 대한 최대 응집 속도 비교: ^P<0.05, ^*P<0.01

상이한 유도제들에 의해 유발된 인간 혈소판 응집에 대한 본 발명의 약학 조성물의 IC₅₀ 값
	ADP	아라키돈산	리스토세틴	아드레날린
IC50 (㎍/mL)	81.28±3.64	131.92±16.75	147.54±9.34	89.42±5.74

실시예 3: 혈전증에 대한 본 발명의 약학 조성물의 생체 내 투여의 억제 효과에 대한 연구

I. 물질 및 방법

1. 실험 물질

체중 280 내지 320 g의 수컷 위스타 래트가 군사의학과학원의 동물 사육 센터에 의해 제공되었다. 티모사포닌 BII 및 AIII의 조성물은 실시예 5에 인용된 제조 방법에 의해 수득하였다. 헤파린은 시그마 캄파니로부터 구입하였다. 생리 식염수를 베이징 슈앙헤 제약 회사(Beijing Shuanghe Pharmaceutical Group Ltd)로부터 구입하였다. 아스피린은 쉬지아주앙 제약 회사의 오우이 파마슈티칼 캄파니로부터 구입하였다. 출혈 시간 및 응고 시간(PT, TT 및 APTT)용 키트를 샹하이 타이양 바이오테크놀로지 캄파니(Shanghai Taiyang Biotechnology Company)로부터 구입하였다.

2. 실험 방법

2.1 동물 배치

위스타 래트를 5 개의 그룹, 즉 블랭크 대조용 그룹, 아스피린 40 ㎎/㎏ 그룹, 본 발명의 약학 조성물 10 ㎎/㎏, 20 ㎎/㎏, 및 40 ㎎/㎏ 그룹으로 무작위 분류하고, 상기 그룹의 동물들에게 하루에 한 번 7일간 연속적인 위 투여를 수행하였으며, 용량 부피는 10 ㎖/㎏이었고, 실험을 7일째 투여 1 시간 후에 수행하였으며, 블랭크 대조군에게 동일한 부피의 증류수를 투여하였다.

2.2 래트에서 동맥-정맥 우회로 혈전증의 실험

참고문헌의 방법을 약간 개선시켰다. 래트를 2% 펜토바르비탈 나트륨 용액 (30 내지 40 ㎎/㎏)의 복강 내 주사에 의해 마취시키고, 뒤로 누운 자세로 고정하고, 우측 총경동맥 및 좌측 바깥 경정맥을 분리시키고, 폴리에틸렌관의 세 부분을 연결하고, 그의 한쪽 단부를 상기 우측 총경동맥에 삽입하고 그의 다른 단부를 상기 좌측 바깥 경정맥에 삽입하며, 상기 폴리에틸렌관을 상기 두 단부에서 25 u/㎖ 헤파린(생리식염수를 사용하여 새로 제조한 것)으로 충전하였으며, 상기 중간 부분의 길이는 10 ㎝이었고, 길이 8 ㎝의 7^# 봉합사(칭량한 것)를, 생리 식염수가 충전된 상기 관(주의: 기포가 없도록 해야 한다)에 넣어, 동맥-정맥 우회로를 설치하였다. 상기 관을 20 분 후에 해체하고, 혈전을 꺼내어, 습윤 여과지 상에 바르고, 잔류 혈액은 제거하고, 양피지 상에 놓고 칭량하여 그의 습윤 중량을 획득하였다. 이어서, 상기를 건조 오븐에 넣고 60 ℃에서 1 시간 동안 항량 건조시키고, 냉각시키고 칭량하여 상기 혈전의 건조 중량을 획득하였다.

2.3 PRP 및 PPP의 제조

상기 7일째 투여 1 시간 후에 위스타 수컷 래트를 펜토바르비탈 나트륨(30 내지 40 ㎎/㎏)의 복강 내 주사에 의해 마취시키고, 혈액 샘플을 심장으로부터 채혈하고, 3.8% 나트륨 시트레이트(부피 비: 1:9)로 응고 방지시켰다. 원심분리를 800 rpm 하에 실온에서 10 분간 수행하여 상부 혈소판 풍부 혈장(PRP) 층을 취하고, 원심분리를 3000 rpm 하 실온에서 20 분간 수행하여 상부 혈소판 결핍 혈장(PPP) 층을 취하였다. F-820 혈구계를 사용하여 카운팅을 수행하고 PRP를 3.0 x 10¹¹/L의 농도를 갖도록 PPP로 조절하였다.

2.4 최대 혈소판 응집 속도의 측정

크로노로그 혈소판 응집 분석기 시험: 혈소판 현탁액을 3.0 x 10¹¹/L의 농도를 갖도록 혈장으로 조절하고, 상기 혈소판 응집 분석기를 켜고, PPP를 블랭크 대조군으로서 사용하여 투과율을 100%로 조절하였다. 혈소판 현탁액 450 ㎕를 취하고, 교반 막대로 교반하고 37 ℃에서 3 분간 예열하고, 유도제(50 ㎕) ADP 제(최종 농도: 20 μM)를 별도로 가하고, 이어서 5 분 다이어그램을 기록하고, 1 분, 3 분 및 5 분째의 응집 속도 및 최대 응집 속도를 판독하였다.

2.5 출혈 시간 및 응고 시간의 측정

혈액 샘플을 모으고, 혈장을 분리시키고, 상기 과정을 키트의 명세서에 따라 수행하였다.

II. 실험 결과

1. 래트 동맥-정맥 우회술 혈전에 대한 본 발명의 약학 조성물의 위 투여 효과

본 발명의 약학 조성물을 위 투여에 사용하였으며, 상기 투여 용량은 하루에 한 번, 40, 20 및 10 ㎎/㎏이었고, 아스피린 40 ㎎/㎏이 양성 대조군이었으며, 동맥-정맥 우회술 혈전증 실험을 상기 투여 후 7일째에 수행하였다. 결과는, 본 발명의 큰 용량 및 중간 용량 그룹이 상기 대조용 그룹에 비해 현저하게 감소된 혈전 건조 중량 및 습윤 중량을 제공하였으며, 이때 상기 큰 용량 그룹의 감소가 가장 현저하였고, 작은 용량 그룹은 상기 대조용 그룹의 경우보다 적은 혈전 중량을 제공하였지만 현저한 차이는 없었다. 상기 아스피린 양성 대조용 그룹은 상기 큰 용량 그룹의 경우보다 약간 더 높은 혈전 건조 및 습윤 중량을 제공하였으며, 상기 대조용 그룹과 현저한 차이가 있었다. 이러한 결과는 본 발명의 약학 조성물이 생체 내에서 혈전증의 억제 효과를 가짐을 암시하였다.

래트에서 경동맥-정맥 우회술 혈전증에 대한 위 투여에 의한 본 발명의 약학 조성물의 효과
그룹	수	혈전 중량 (mg)
그룹	수	습윤 중량	건조 중량
대조용 그룹	11	117.1±38.3	35.9±8.4
본 발명의 약학 조성물 40 ug/mL	9	64.3±22.6**	24.4±6.3**
본 발명의 약학 조성물 20 ug/mL	8	70.3±12.7*	26.6±8.1*
본 발명의 약학 조성물 10 ug/mL	8	88.6±17.2	29.5±5.4
아스피린 그룹	11	79.7±19.0*	26.7±6.4*
주: 대조용 그룹과 비교 시: ^*P<0.01, ^P<0.05

2. 래트의 혈소판 응집 속도 및 출혈/응고 시간에 대한 위 투여에 의한 본 발명의 약학 조성물의 효과

본 발명의 약학 조성물의 투여 방법 및 동물 배치 방법은 상기 세 번째 부분의 경우와 동일하였으며, 혈액 샘플을 투여 후 7일째에 래트의 심장으로부터 채혈하였고, 동일한 배치의 ADP-유발된 혈소판 응집 및 출혈/응고 시간(PT, TT 및 APTT)을 측정하였다. 결과는 본 발명의 약학 조성물의 3 개 용량 그룹이 모두 대조용 그룹보다 낮은 혈소판 응집 속도를 제공하고, 특정한 용량 효과를 가짐을 나타내었다. 아스피린 그룹은 대조용 그룹보다 낮은 혈소판 응집 속도를 제공하였으나, 현저한 차이는 없었다. 본 발명의 약학 조성물로 처리된 그룹들은 PT, TT 및 APTT의 태양에서 대조용 그룹에 비해 통계학적 유의수준을 갖지 못했으며; 아스피린 그룹은 대조용 그룹에 비해 현저하게 연장된 APTT를 가졌으나, 다른 2 개의 지수에 있어서 대조용 그룹에 비해 현저한 차이가 없었다. 상기 결과는 본 발명의 약학 조성물의 생체 내 투여가 혈소판 응집을 억제하고, 혈전증을 방지할 수 있지만, 혈액 응고 시간에는 영향을 미치지 않음을 나타내었다.

래트의 ADP-유발된 혈소판 응집에 대한 위 투여에 의한 본 발명의 약학 조성물의 효과
	대조용 그룹	AIII 및 BII의 조성물, 40 ug/mL	AIII 및 BII의 조성물, 20 ug/mL	본 발명의 약학 조성물, 10 ug/mL	아스피린 그룹
혈소판 최대 응집 속도	54.9±5.8	43.3±7.6**	48.3±5.1*	49.9±4.6	49.1±4.8
주: 대조용 그룹과 비교 시: ^*P<0.01, ^P<0.05

래트 혈액 응고 매개변수 APTT, PT 및 TT에 대한 경구 투여에 의한 본 발명의 약학 조성물의 효과
그룹	n	응고 시간 (s)
		APTT	PT	TT
정상 대조용 그룹 본 발명 약학 조성물 40 mg/kg 본 발명 약학 조성물 20 mg/kg 본 발명 약학 조성물 10 mg/kg 아스피린 그룹	8 8 8 8 8	24.84±1.45 24.91±1.46 24.53±1.07 24.47±1.67 17.50±2.37*	17.74±1.55 16.85±1.11 17.15±1.15 16.91±0.76 16.49±2.08	28.37±0.90 27.34±1.58 28.20±1.84 27.65±2.32 28.98±0.97
주: 대조용 그룹과 비교 시: ^*P<0.05

실시예 4: 대뇌 허혈 래트의 운동 및 감각 기능에 대한 본 발명의 약학 조성물의 효과

허혈성 뇌혈관 질병(주로 뇌 혈전증이라 칭함)에 대한 최선의 치료 시간 창은 발병 후 6 시간 이내이며, 긍정적인 요법은 손상을 최저 한계로 줄일 수 있다. 그러나, 대부분의 대뇌 허혈 환자들은 수면 상태와 같은 휴식 상태에서 발병하며, 운송 및 영상 진단은 종종 치료의 지연을 유발하고 반신불수 및 실어증과 같은 후속의 잔재를 유발한다. 따라서, 뇌의 아급성 단계 및 초기 회복 단계 동안의 치료 및 중재가 특히 중요하다. 실험에서, 중뇌 동맥 폐색(MCAO) 모델을, 뇌 기능 허혈 손상 래트의 운동 기능에 대한 본 발명의 약학 조성물의 효과를 연구하기 위해 사용하였으며, 따라서 임상에서 본 발명의 약학 조성물의 합리적인 적용을 위한 실험 기준이 제공되었다.

I. 물질 및 방법

1. 실험 동물

체중 280 내지 300 g의 수컷 SD 래트를 베이징 웨이통리후아 실험 동물 기술 회사(Beijing Weitonglihua Experimental Animals Technology Co., Ltd., 증서 번호.: SCXK (京) 2002-2003)에 의해 제공받았다.

2. 실험제

본 발명의 약학 조성물을 실시예 6의 방법에 따라 제조하였다.

3. 실험 방법

3.1 래트 중뇌 동맥 폐색 재관류 모델의 제조

래트를 10% 클로랄 하이드레이트의 복강 내 주사에 의해 마취시키고, 반듯이 뉘여 고정하고, 피부를 통상적으로 소독하고, 앞 목을 절단하고, 분리시켜 우측 총경동맥, 내부 경동맥 및 외부 경동맥을 노출시키고, 예비용 봉합사로 상기 외부 경동맥과 총 경동맥을 결찰하고, 상기 내부 경동맥의 원위 단부를 동맥 클립으로 고정시키고, 상기 외부 경동맥과 내부 경동맥의 분기점을 절개하고, 공 모양으로 둥근 단부를 갖는 매끈한 나일론 봉합사(직경 0.25 ㎜, 단부 직경 0.27 ㎜, 상기 단부로부터 18 ㎜ 위치에 표시함)를 상기 절개부에 삽입하고, 저항이 느껴지면 멈추고, 허혈 시간을 기록하였으며, 상기 삽입 깊이는 중뇌 동맥 폐색에 의해 유발된 뇌 허혈을 성취하기 위해 약 18 ㎜이었다. 이어서 상기 절개부를 결찰하고, 상기 나일론 봉합사를 고정시키고, 근육과 피부를 층마다 봉합하고 소독하였다. 2 시간 후에, 상기 나일론 봉합사를 그의 단부가 상기 절개부에 가까워질 때까지 잡아당겨 재관류를 이행한다. 모의 그룹의 래트는 단지 우측 총경동맥을 노출하고 분리시켰다. 상기 대뇌 허혈 및 재관류 중 실내 온도는 23 ℃에서 유지되었으며 상기 래트는 통상적인 방법에 의해 우리에서 사육되었다.

3.2 모델 성공의 판단

제아 롱가(Zea Longa) 5등급 득점 방법(그의 참고문헌을 제공해 주시오)에 따라, 상기 래트를 완전히 진정된 후에 채점하였으며, 상기 득점 기준은 하기와 같았다: 겉보기에 신경학적 증상이 없음, 득점 0; 좌측 앞발을 완전하게 뻗을 수 없음, 득점 1; 좌측으로 돈다, 득점 2; 걷는 동안 좌측으로 넘어진다, 득점 3; 혼자서 걸을 수 없다, 득점 4. 1 내지 3 점을 득점한 래트를 후속 시험을 위해 선택하였다.

3.3 동물 배치 및 투여

1 내지 3 점을 득점한 신경 증상을 갖는 래트들을 5 개의 그룹으로 분류하였다: 모델 그룹; 본 발명의 약학 조성물 15 ㎎/㎏(낮은), 30 ㎎/㎏(중간), 60 ㎎/㎏(높은)을 투여한 그룹; 안궁후황환(Angong Niuhuang Wan)(그의 제조사 및 배치 번호를 제공해 주시오) 400 ㎎/㎏을 양성 대조군으로서 사용하였다. 모의 그룹 및 상기 모델 그룹에게 동량의 0.5% CMC 용액을 투여하였다. 상기 실행 후 3 내지 4일째로부터, 래트들에게 하루에 한 번 위 투여하였다.

3.4 사지 운동 및 감각 기능의 탐지

3.4.1 들보 걷기 시험

들보 걷기 시험[Feeney DM et al, Science, 1982, 217: 855-857]을 운동의 협조 및 통합 결여를 평가하기 위해 사용하였다. 폭 2.0 ㎝, 길이 120 ㎝ 및 두께 1 ㎝의 들보를 지면으로부터 80 ㎝ 공기 중에 수평으로 매달고, 상기 들보의 한쪽 끝을 암 상자(길이 25 ㎝, 폭 22 ㎝, 높이 18 ㎝)에 연결하고, 상기 래트를 소음으로 자극하여 상기 들보를 지나 상기 암 상자로 들어가게 하였다. 득점 기준: 래트가 상기 들보 위에 머무를 수 없다, 득점 0; 래트가 상기 들보 위에 머무를 수는 있으나 움직일 수 없다, 득점 1; 래트가 지나가려 하나, 상기 들보로부터 떨어짐, 득점 2; 래트가 상기 들보 위를 걷지만 그의 손상된 뒷다리의 떨어짐 회수가 50%를 초과함, 득점 3; 상기 회수가 1을 초과하지만, 50% 미만임, 득점 4; 오직 한번 만 떨어짐, 득점 5; 원활하게 지나감, 득점 6. 상기 래트를 허혈 전 2일 동안 상기 들보를 원활하게 지나가는 방법을 익히도록 훈련하였다. 상기 래트를 허혈 후 각각 3, 7, 10 및 14일째에 시험하였다.

3.4.2 촉각 자극 시험

몸 감각 및 소 근육 실행 기능을 평가하였다(상기와 같은 방법의 참고문헌을 제공해 주시오). 동일한 면적(0.7 ㎝ x 0.7 ㎝)의 의료용 테이프를 각 앞다리 팔의 내면에 붙이고 촉각 자극으로서 제거하여 테이프 노출 잠복기를 기록하였다. 상기 래트를 상기 실행 전에, 하루에 한 번 2일간 상기 래트가 20 초 이내에 테이프 노출 동작을 완료할 수 있도록 훈련하였다. 상기 시험을 허혈 후 3, 7, 10 및 14일째에 수행하였다.

3.5 물질 수집

시험 후, 상기 래트를 10% 클로랄 하이드레이트(0.35 g/㎏)의 복강 내 주사에 의해 마취시키고, 좌심실 캐뉼러를 가하고, 37° 생리식염수 및 예냉된 4% 파라폼알데하이드 포스페이트 완충액(pH 7.2)으로 관류시켰으며, 상기 래트가 경직된 후에, 상기 래트를 참수하고 그의 뇌를 꺼내어, 4% 폼알데하이드 용액에 침지하고 24 시간 동안 고정하고, 통상적인 방법으로 물을 제거하고, 파라핀 왁스에 매몰하고, 2.2 ㎜ 내지 1.7 ㎜의 전방 두개 천문으로부터의 조직 블록을 취하고, 그의 관상 부위를 연속적으로 절단하였으며, 상기 뇌 조각은 3 ㎛의 두께를 가졌다.

3.6 조직병리학적 및 면역조직화학적 염색

HE 염색 및 면역조직화학적 염색(Sp 2-단계 방법)을 각 그룹의 5 개의 사례에 대해 수행하였다. 200x 광학 현미경 하에서, 3 개의 고정된 시야를 상기 각 조각 상의 경색 영역 주위에서 선택하고 빛을 비추고, 상기 상을 소프트웨어, 이미지-프로-플러스(Image-Pro Plus)(v.5.1, Silver Spring, Maryland, USA)를 사용하여 분석하여 피질의 운동 및 감각 영역 중 신경 세포의 형태학적 구조를 관찰하고, 200x 시야(HP), 즉 n/200 HP에서 상기 신경 세포를 카운트하였으며; 경색 영역 주위의 뇌 조직 중 VEGF 양성 세포(세포질은 갈색 입자로 보였다)의 적분 광학 밀도(IOD) 및 미세혈관 밀도(MVD)를 문헌[Weidner N. et al, N Engl J Med, 1991, 324: 1-8.]의 방법에 따라 측정하였고, 임의의 갈색 염색 내피 세포 또는 내피-세포 덩어리는 단일의 가산 미세혈관으로 간주되었으며, 혈관 관강은 구조를 미세혈관의 수(㎡당 면적)를 계산하기 위한 미세혈관으로서 한정할 필요가 없었고, 상기 3 개 시야의 평균을 시험 결과로서 사용하였다.

3.7 통계 방법

윈도우용으로 적합한 SPSS 13.0 통계 소프트웨어를 데이터 통계 및 분석에 사용하였으며, 이때 상기 네이터는

±s로 나타내었고, 그룹 들간의 비교를 1원 분산 분석에 의해 수행하였다.

II. 시험 결과

1. 대뇌 허혈 재관류 래트의 운동 및 감각 기능에 대한 본 발명의 약학 조성물의 효과

1.1 대뇌 허혈 재관류 래트의 들보 걷기 능력에 대한 본 발명 약학 조성물의 효과

표 16에서, 모의 실행 그룹 래트의 들보 걷기 능력은 변하지 않은 반면, 허혈증 그룹 래트의 들보 걷기 능력은 현저하게 감소하였고, 관찰 기간 내에 정상 수준으로 회복되지 않음을 알 수 있었다. 실행 후 14일째에, 본 발명의 약학 조성물 30 ㎎/㎏, 60 ㎎/㎏, 및 안궁후황환을 투여한 그룹들은 모델 그룹에 비해, 래트 걷기 능력의 개선된 회복, P<0.05, P<0.01을 제공하였다.

대뇌 허혈 재관류 래트의 들보 걷기 능력에 대한 본 발명의 약학 조성물의 효과( ±s)
그룹	n	용량 (mg/kg)	들보 걷기 점수
			3일	7일	10일	14일
모의 실행	10	-	5.60±0.49	6.00±0	6.00±0	6.00±0
모델	10	-	1.20±0.6	1.30±0.46	2.10±0.54	3.60±0.66＃
본 발명의 조성물 (낮은)	10	15	1.00±0.45	1.30±0.46	1.90±0.70	3.90±0.83
본 발명의 조성물 (중간)	11	30	1.00±0.63	1.20±0.75	2.30±0.46	4.27±0.64*
본 발명의 조성물 (높은)	11	60	1.00±0.60	1.30±0.45	2.30±0.62	4.64±0.77**
안궁후황환	11	400	1.09±0.51	1.40±0.64	2.50±0.50	4.30±0.45*
주: 모델 그룹과 비교 시, P<0.05, *P<0.01; 모의 실행 그룹과 비교 시, #P<0.01

1.3 대뇌 허혈 재관류 래트에서 촉각 자극 반응에 대한 본 발명의 약학 조성물의 효과

허혈증 그룹 래트의 허혈성 맞은편 앞다리의 촉각 감도 및 소 근육 실행 능력이 현저하게 약화되었고, 이는 관찰 기간 중에 점진적으로 회복되었지만, 14일 후에 여전히 정상 그룹의 경우보다 현저하게 작았다. 상기 모델 그룹에 비해, 본 발명의 약학 조성물 30 ㎎/㎏, 60 ㎎/㎏을 투여한 그룹의 테이프 노출 잠복기가 현저하게 단축되었다, P<0.05.

대뇌 허혈 재관류 래트의 촉각 자극에 대한 본 발명의 약학 조성물의 효과( ±s)
그룹	n	용량 (mg/kg)	촉각 자극 잠복기 (s)
			3일	7일	10일	14일
모의 실행	10	-	18.80±3.06	19.30±3.80	18.40±2.37	16.10±2.26
모델	10	-	335.20±36.17	259.90±28.58	146.20±12.39	71.70±9.22#
본 발명의 조성물 (낮은)	10	15	317.70±37.05	251.90±16.07	135.40±19.59	73.00±13.75
본 발명의 조성물 (중간)	11	30	328.55±39.56	245.64±15.71	142.09±16.21	60.82±9.97*
본 발명의 조성물 (높은)	11	60	340.09±31.61	231.09±32.71	137.64±11.36	60.18±8.92*
안궁후황환	11	400	307.09±38.34	232.64±38.51	145.00±19.68	67.09±7.67
주: 모델 그룹과 비교 시, P<0.05, *P<0.01; 모의 실행 그룹과 비교 시, #P<0.01

2. 대뇌 허혈 재관류 래트의 피질 운동 및 감각 영역 중 신경 손상에 대한 본 발명의 조성물의 효과

상기 모델 그룹 래트의 피질 운동 및 감각 영역 및 신선조체에서, 다수의 신경 세포가 변성되고 사멸하였으며, 무질서하게 배열되어, 세포막 및 핵의 불분명한 윤곽 프로파일, 핵 응축, 세포체 수축, 신경세포 밀도 감소, 겉보기 신경세포 누락, 체 모양 간충직의 보다 많은 상실에 이르게 되었다. 상기 모델 그룹에 비해, 본 발명의 약학 조성물 30 ㎎/㎏, 60 ㎎/㎏, 및 안궁후황환을 투여한 그룹들은 현저하게 증가된 신경세포 수, 보다 적은 변성 및 괴사 조직 영역, 및 광 한계를 나타내었다.

대뇌 허혈 재관류 래트의 피질 운동 및 감각 영역 중의 신경세포 수에 대한 본 발명의 약학 조성물의 효과( ±s)
그룹	n	용량 (mg/kg)	n/200xHP
모의 실행	10	-	91.6±8.2
모델	10	-	12.7±4.8#
본 발명의 조성물 (낮은)	10	15	22.8±6.7
본 발명의 조성물 (중간)	11	30	32.2±11.7^**
본 발명의 조성물 (높은)	11	60	47.2±8.4^**
안궁후황환	11	400	39.6±9.8^**
주: 모델 그룹과 비교 시, P<0.05, *P<0.01; 모의 실행 그룹과 비교 시, #P<0.01

3. 대뇌 허혈 재관류 래트의 혈관형성 및 VEGF 발현에 대한 본 발명의 조성물의 영향

모의 실행 그룹의 래트에서, 소량의 갈색 미세혈관 및 VEGF-양성 신경세포 및 내피세포를 그들의 피질 및 선조체에서 볼 수 있었으며; 대뇌 허혈 그룹의 래트에서, 다수의 신경세포를 피질 및 선조체 경색 부근의 영역에서 볼 수 있었고, 아교 세포 및 내피 세포 모두는 VEGF-양성이었으며, 산재하거나 군집한 CD34-양성 세포 및 이에 의해 형성된 미세혈관이 경색 부위의 영역에 분포되었고 경색 중심을 향해 연장되었다. 상기 모델 그룹에 비해, 본 발명의 약학 조성물 30 ㎎/㎏, 60 ㎎/㎏, 및 안궁후황환을 투여한 그룹들은 현저하게 증가된 VEGF 발현, 현저하게 증가된 수의 미세혈관을 나타내었다; P<0.05, P<0.01.

대뇌 허혈 재관류 래트의 혈관형성에 대한 본 발명의 약학 조성물의 효과( ±s)
그룹	n	용량 (mg/kg)	MVD(n/mm²)
모의 실행	5	-	214.8±26.8
모델	5	-	359.6±14.5#
본 발명의 조성물 (낮은)	5	15	352.1±37.5
본 발명의 조성물 (중간)	5	30	409.5±28.9^*
본 발명의 조성물 (높은)	5	60	440.4±19.4^**
안궁후황환	5	400	424.5±34.2^**
주: 모델 그룹과 비교 시, P<0.05, *P<0.01; 모의 실행 그룹과 비교 시, #P<0.01

대뇌 허혈 재관류 래트의 VEGF 발현에 대한 본 발명의 약학 조성물의 효과( ±s)
그룹	n	용량 (mg/kg)	IOD
모의 실행	5	-	70.0±5.4
모델	5	-	172.4±22.8#
본 발명의 조성물 (낮은)	5	15	196.1±26.2
본 발명의 조성물 (중간)	5	30	224.9±26.8^*
본 발명의 조성물 (높은)	5	60	229.9±22.9^**
안궁후황환	5	400	262.2±27.8^**
주: 모델 그룹과 비교 시, P<0.05, *P<0.01; 모의 실행 그룹과 비교 시, #P<0.01

III. 논의

래트의 병소 뇌 조직 허혈 재관류 후에, 생성되는 손상은 피질 운동 및 감각 영역 및 신선조체 중의 다량의 신경세포의 변성 및 괴사, 사지 운동 및 감각 기능장애, 운동 협조 및 균형 능력의 현저한 감소에 이르게 하며, 따라서 이는 허혈 조직에 대한 혈액 공급을 확립하기 위해 신경 기능의 회복에 중요한 단계이다. 이 연구에서, 본 발명의 조성물(30 ㎎/㎏, 60 ㎎/㎏)을 허혈 후 아급성기(3일째에서부터 내지 14일째까지) 동안 투여하였으며, 따라서 래트의 운동 및 감각 기능이 현저하게 개선되었다. 상기 모델 그룹에 비해, 래트의 들보 걷기 능력이 개선되었고, 테이프 노출 잠복기가 단축되었으며, 피질 운동 및 감각 영역 중 신경세포의 손상이 개선되었고, 경색 부근 영역의 VEGF 발현 및 미세혈관 수가 증가하였다, P<0.05, P<0.01. 요컨대, 본 발명의 조성물은 대뇌 허혈 래트에서 운동 및 감각 기능의 회복을 촉진할 수 있으며, 그의 가능한 기전은 뇌 VEGF의 발현 및 미세혈관의 신생을 유발시키는 것이다.

실시예 5: 본 발명 약학 조성물의 제조

지모의 신선한 뿌리줄기 3 ㎏을 얇은 조각으로 절단하고, 8 L의 70% 에탄올을 가하고 1 시간 동안 침지시키고, 환류 하에서 추출하고, 여과하고, 잔사에 6 L의 70% 에탄올을 가하고 환류 하에서 2 회 추출하였다. 상기 수득된 추출액들을 합하고, 에탄올 회수를 수행하고, 감압 하에서 10 L로 농축시켰다. 예비 처리된 거대다공성 흡착성 수지 SP825(Mitsubishi Company of Japan)를 컬럼(4 L)에 로딩하고, 물로 균형을 맞추고, 상기 농축된 용액을 여과하고, 상기 여액을 크로마토그래피 컬럼 상에 로딩하고, 4 BV(컬럼 부피의 4 배)의 물 및 4 BV의 20% 에탄올로 용출시켜 불순물을 제거하고, 이어서 4BV의 70% 에탄올 및 3 BV의 95% 에탄올로 용출시키고, 상기 용출액의 70% 부분에 대해 에탄올 회수를 수행하고, 1000 ㎖로 농축시키고, 동결 건조시켜 81 g의 1차 총 사포닌을 수득하였다. 지모의 신선한 뿌리줄기 9 ㎏을 얇은 조각으로 절단하고, 자연 발효를 위해 72 시간 동안 37 ℃ 수욕으로 가온하면서 24 L의 물을 가하였다. 여과 후에, 상기 여액을 버리고, 잔사를 1 시간 동안 환류 하에서 18 L의 메탄올로 추출하고, 여과하고, 상기 잔사를 동일한 방식으로 환류 하에서 18 L의 메탄올로 2 회 추출하였다. 모든 메탄올 추출액들을 합하고, 부분 용매 회수를 수행하여 침전물을 수득하였으며, 상기 침전물을 건조시키고 칭량하여 212 g의 조 AIII 샘플을 수득하였다. HPLC-ELSD 방법의 측정은 상기 1차 총 사포닌 중의 티모사포닌 BII 함량이 58.7%이고, 상기 조 AIII 샘플 중의 티모사포닌 AIII 함량이 55.4%임을 보였다. 80 g의 상기 1차 총 사포닌 및 20 g의 상기 조 AIII을 균일하게 혼합하여 본 발명의 약학 조성물을 수득하였다. HPLC-ELSD 외부 표준 2 점 방법을 별도로 사용하여 측정한 바와 같은 상기 티모사포닌 AIII 및 BII의 함량은 40.9% 및 16.1%이고, 자외선 분광광도측정에 의해 측정한 바와 같은 총 티모사포닌은 82.7%이었다.

실시예 6: 본 발명 약학 조성물의 제조

한약 지모를 달인 조각 6 ㎏을 적합하게 분쇄하고, 48 L의 물을 가하고 1 시간 동안 침지시키고, 1 시간 동안 가열하여 달이고, 여과하고; 상기 잔사에 36 L의 물을 가하여 2 회 달이고, 여과하였다. 상기 여액들을 합하고, 감압 하에서 30 L로 농축시키고, 원심분리시켜 예비용 상등액을 수득하였다. 예비 처리된 거대다공성 흡착성 수지 SP700(Mitsubishi Company of Japan)를 컬럼(18 L)에 로딩하고, 물로 균형을 맞추었다. 상기 예비용 상등액을 상기 균형된 SP700 수지 컬럼 상에 로딩하고, 물로 균형을 맞추었다. 상기 농축된 추출액을 여과하고, 상기 여액을 로딩하고, 물로 세척하여 불순물을 제거하고, 이어서 4 BV의 25% 에탄올, 4 BV의 90% 에탄올 순으로 용출시켰다. 상기 용출액의 90% 부분에 에탄올 회수를 수행하고, 5000 ㎖로 농축시켰다. 상기 중 1000 ㎖을 취하여 동결 건조시켜 78 g의 1차 총 사포닌을 수득하였다. 나머지 4000 ㎖을 물을 가하여 15000 ㎖로 희석하고, 이어서 20 ㎖의 β-글루코시다제를 가하고, 균일하게 혼합하고 열 보존 및 전환을 위해서 24 시간 동안 50 ℃ 수욕에 넣었다. 상기 전환된 용액을 원심분리시켜 상등액 및 침전물을 수득하고, 상기 침전물을 10 시간 동안 건조 오븐에서 80 ℃에 두어 건조시켜 213 g의 2차 총 사포닌을 수득하고, 이를 분말 형태로 분쇄하였다. 상기 1차 총 사포닌 및 2차 총 사포닌 중의 티모사포닌 BII 및 AIII의 함량은 HPLC-ELSD 방법에 의해 52.6% 및 66.3%인 것으로 별도로 측정되었다. 상기 1차 총 사포닌 75 g 및 상기 2차 총 사포닌 180 g을 균일하게 혼합하여 본 발명의 약학 조성물을 수득하였다. HPLC-ELSD 외부 표준 2 점 방법을 별도로 사용하여 측정한 바와 같은 상기 티모사포닌 AIII 및 BII의 함량은 47.1% 및 15.6%이고, 자외선 분광광도측정에 의해 측정한 바와 같은 총 티모사포닌은 88.5%이었다.

실시예 7: 본 발명 약학 조성물의 제조

섬유 뿌리 지모 8 ㎏을 절단하고, 48 L의 65% 에탄올을 가하고 1 시간 동안 침지시키고, 1 시간 동안 환류 하에서 추출하고, 여과하고; 상기 잔사에 48 L의 60% 에탄올을 가하고, 환류 하에서 2 회 추출하고, 여과하였다. 상기 여액들을 합하고, 20 L로 에탄올의 진공 회수를 수행하고, 에탄올을 가하여 30%의 농도에 도달하였으며, 이를 예비용으로 두었다. 예비 처리된 거대다공성 흡착성 수지 SP700(Mitsubishi Company of Japan)를 컬럼(10 L)에 로딩하고, 30% 에탄올로 균형을 맞추었다. 상기 예비 추출액을 원심분리하고, 생성된 상등액을 상기 균형된 수지 컬럼 상에 로딩하고, 4 BV의 30% 에탄올, 4 BV의 90% 에탄올 순으로 용출시켰다. 상기 90% 에탄올 부분을 수거하고, 에탄올 회수를 수행하고, 4000 ㎖로 농축시켰다. 상기 중 2000 ㎖을 취하여 동결 건조시켜 165 g의 1차 총 사포닌을 수득하였다. 나머지 2000 ㎖을 물을 가하여 3200 ㎖로 희석하고, 이어서 30 ㎖의 펙티나제(NCB-PE40)를 가하고, 균일하게 혼합하고 열 보존 및 전환을 위해서 12 시간 동안 50 ℃ 수욕에 넣었다. 상기 전환된 용액을 원심분리시켜 상등액 및 침전물을 수득하고, 상기 침전물을 6 시간 동안 건조 오븐에서 80 ℃에 두어 건조시켜 119 g의 2차 총 사포닌을 수득하였다. 상기 1차 총 사포닌 중의 티모사포닌 BII 및 AIII의 함량은 HPLC-ELSD 방법에 의해 19.2% 및 32.6%인 것으로 측정되었고, 상기 2차 총 사포닌 중의 티모사포닌 AIII의 양은 61.3%이었다. 상기 1차 총 사포닌 100 g 및 상기 2차 총 사포닌 100 g을 균일하게 혼합하여 본 발명의 약학 조성물을 수득하였다. HPLC-ELSD 외부 표준 2 점 방법을 별도로 사용하여 측정한 바와 같은 상기 티모사포닌 AIII 및 BII의 함량은 47.2% 및 9.7%이고, 자외선 분광광도측정에 의해 측정한 바와 같은 총 티모사포닌은 79.4%이었다.

실시예 8: 본 발명 약학 조성물의 제조

한약재 지모를 달인 조각 6 ㎏을 적합하게 분쇄하고, 48 L의 30% 에탄올을 가하고 1 시간 동안 침지시키고, 1 시간 동안 환류 하에서 추출하고, 여과하고; 상기 잔사에 36 L의 30% 에탄올을 가하고 동일한 방식으로 환류 하에서 2 회 추출하였다. 상기 에탄올 추출액들을 예비용으로 합하였다. 예비 처리된 거대다공성 흡착성 수지 SP825(Mitsubishi Company of Japan)를 컬럼(18 L)에 로딩하고, 30% 에탄올로 균형을 맞추었다. 상기 예비용 상등액을 상기 균형된 SP825 수지 컬럼 상에 로딩하고, 4BV의 30% 에탄올로 세척하여 불순물을 제거하고, 이어서 4 BV의 50% 에탄올 및 3 BV의 80% 에탄올 순으로 용출시키고, 상기 컬럼을 3 BV의 95% 에탄올을 사용하여 재생시켰다. 상기 50% 및 80% 에탄올의 용출 용액들을 수거하고, 별도로 에탄올 회수를 수행하고, 진공 농축시켰다. 상기 50% 에탄올 농축물을 동결 건조시켜 113 g의 조 BII를 수득하고, 상기 80% 에탄올 농축물을 건조시켜 221 g의 조 AIII을 수득하였다. HPLC-ELSD 방법에 의해 측정된 바와 같이 상기 조 BII 및 조 AIII 중의 티모사포닌 BII 및 AIII의 함량은 61.2% 및 55.9%이었다. 상기 조 BII 110 g 및 상기 조 AIII 180 g을 균일하게 혼합하여 본 발명의 약학 조성물을 수득하였다. HPLC-ELSD 외부 표준 2 점 방법을 별도로 사용하여 측정한 바와 같은 상기 티모사포닌 AIII 및 BII의 함량은 32.4% 및 26.2%이고, 자외선 분광광도측정에 의해 측정한 바와 같은 총 티모사포닌은 83.3%이었다.

실시예 9: 본 발명 약학 조성물의 제조

한약재 지모를 달인 조각 6 ㎏을 적합하게 분쇄하고, 48 L의 물을 가하고 1 시간 동안 침지시키고, 1 시간 동안 가열하여 달이고, 여과하고; 상기 잔사에 36 L의 물을 가하여 동일한 방식으로 2 회 달였다. 상기 추출액들을 합하고, 감압 하에서 30 L로 농축시키고, 에탄올을 가하여 30%의 농도에 도달시키고, 균일하게 진탕하고 밤새 정치시키고, 원심분리시켜 예비용 상등액을 수득하였다. 예비 처리된 거대다공성 흡착성 수지 HP20(Mitsubishi Company of Japan)을 컬럼(18 L)에 로딩하고, 30% 에탄올로 균형을 맞추었다. 상기 예비용 상등액을 상기 균형된 HP20 수지 컬럼 상에 로딩하고, 4 BV의 30% 에탄올로 세척하여 불순물을 제거하고, 이어서 4 BV의 50% 에탄올 및 4 BV의 80% 에탄올 순으로 용출시키고, 상기 컬럼을 3 BV의 95% 에탄올을 사용하여 최종적으로 재생시켰다. 상기 50% 및 80% 에탄올 용출액들을 수거하였다. 상기 80% 에탄올 농축물을 건조시켜 125 g의 조 AIII을 수득하였다. 상기 50% 에탄올 부분에 에탄올 회수를 수행하고, 4000 ㎖로 농축시켰다. 상기 50% 에탄올 농축물 1500 ㎖을 취하고 동결 건조시켜 153 g의 조 BII를 수득하였다. 상기 용액의 나머지 2500 ㎖을 물을 가하여 7000 ㎖로 희석하고, 이어서 40 ㎖의 복합 과일 펄프 효소(NCB-PE200)를 가하고, 균일하게 혼합하고 전환을 위해 120 rpm 하에서 36 시간 동안 50 ℃ 진탕기에 넣었다. 상기 전환된 용액을 원심분리시켜 침전물을 수득하고, 상기 침전물을 6 시간 동안 건조 오븐에서 80 ℃에 두어 건조시켜 183 g의 2차 총 사포닌을 수득하였다. HPLC-ELSD 방법을 사용하여 측정함으로써, 상기 조 BII 중의 티모사포닌 BII의 양은 53.2%이고, 상기 조 AIII 중의 티모사포닌 AIII 및 2 차 총 사포닌의 함량은 57.1% 및 64.3%이었다. 상기 조 BII 50 g, 상기 조 AIII 120 및 상기 2차 총 사포닌 180 g을 균일하게 혼합하여 본 발명의 약학 조성물을 수득하였다. HPLC-ELSD 외부 표준 2 점 방법을 별도로 사용하여 측정한 바와 같은 상기 티모사포닌 AIII 및 BII의 함량은 52.7% 및 7.8%%이고, 자외선 분광광도측정에 의해 측정한 바와 같은 총 티모사포닌은 85.8%이었다.

실시예 10: 본 발명 약학 조성물의 제조

한약재 지모를 달인 조각 6 ㎏을 적합하게 분쇄하고, 48 L의 50% 에탄올을 가하고 1 시간 동안 침지시키고, 1 시간 동안 환류 하에서 추출하고, 여과하고; 상기 잔사에 36 L의 50% 에탄올을 가하고 동일한 방식으로 환류 하에서 2 회 추출하였다. 상기 추출액들을 합하고, 감압 하에서 6 L로 농축시키고, 추출을 위해 수-포화된 n-부탄올을 3 회 가하고, 모든 n-부탄올 층들을 합하고, 농축시켜 551 g의 1차 총 사포닌을 수득하였다. 500 g의 상기 1차 총 사포닌을 물 10000 ㎖에 용해시키고, 110 ㎖의 셀룰라제(AE80)를 가하고, 균일하게 혼합하고 전환을 위해 120 rpm 하에 50 ℃ 진탕기에서 36 시간 동안 두었다. 상기 전환된 용액을 원심분리시켜 침전물을 수득하고, 상기 침전물을 6 시간 동안 건조 오븐에서 80 ℃에 두어 건조시켜 283 g의 2차 총 사포닌을 수득하였다. HPLC-ELSD 방법을 사용하여 측정함으로써, 상기 조 BII 중의 티모사포닌 BII의 양은 44.1%이고, 상기 2차 총 사포닌 중의 티모사포닌 AIII의 양은 62.3%이었다. 상기 1차 총 사포닌 50 g, 및 상기 2차 총 사포닌 280 g을 균일하게 혼합하여 본 발명의 약학 조성물을 수득하였다. HPLC-ELSD 외부 표준 2 점 방법을 별도로 사용하여 측정한 바와 같은 상기 티모사포닌 AIII 및 BII의 함량은 53.7% 및 6.9%이고, 자외선 분광광도측정에 의해 측정한 바와 같은 총 티모사포닌은 86.1%이었다.

실시예 11: 본 발명 약학 조성물의 제조

지모의 신선한 뿌리줄기 6 ㎏을 얇은 조각으로 절단하고, 8 L의 70% 에탄올을 가하고 2 시간 동안 침지시키고, 가열 환류 하에서 1 시간 동안 추출하고, 여과하고, 상기 잔사에 6 L의 70% 에탄올을 가하고 환류 하에서 동일한 방식으로 2 회 추출하였다. 상기 추출액들을 합하고, 에탄올 회수를 수행하고, 감압 하에서 10 L로 농축시켰다. 예비 처리된 거대다공성 흡착성 수지 SP700(Mitsubishi Company of Japan)을 컬럼(6 L)에 로딩하고, 20% 에탄올로 균형을 맞추고, 상기 농축된 용액을 20%에 도달하도록 에탄올을 가하고, 여과하고, 상기 여액을 크로마토그래피 컬럼 상에 로딩하고, 4 BV의 20% 에탄올, 4 BV의 80% 에탄올 및 3 BV의 95% 에탄올 순으로 용출시키고, 상기 80% 에탄올에 대해 에탄올 회수를 수행하고, 2000 ㎖의 작은 부피로 농축시켰다. 이 중 500 ㎖을 취하고 동결 건조시켜 56 g의 1차 총 사포닌을 수득하였다. 나머지 1500 ㎖을 7000 ㎖로 희석하고, 200 ㎖의 유화액을 가하고, 균일하게 혼합하고 전환을 위해 120 rpm 하에 37 ℃ 진탕기에 24 시간 동안 넣었다. 상기 전환된 용액을 원심분리시켜 상등액 및 침전물을 수득하고, 상기 침전물을 건조 오븐에서 80 ℃에 두어 건조시켜 105 g의 2차 총 사포닌을 수득하였다. HPLC-ELSD 방법을 사용하여 측정함으로써, 상기 1차 총 사포닌 중의 티모사포닌 BII의 양은 43.3%이고, 상기 2차 총 사포닌 중의 티모사포닌 AIII의 양은 55.6%이었다. 상기 1차 총 사포닌 50 g, 및 상기 2차 총 사포닌 100 g을 균일하게 혼합하여 본 발명의 약학 조성물을 수득하였다. HPLC-ELSD 외부 표준 2 점 방법을 별도로 사용하여 측정한 바와 같은 상기 티모사포닌 AIII 및 BII의 함량은 37.5% 및 14.7%이고, 자외선 분광광도측정에 의해 측정한 바와 같은 총 티모사포닌은 73.5%이었다.

실시예 12: 본 발명 약학 조성물의 제조

지모의 신선한 뿌리줄기 6 ㎏을 얇은 조각으로 절단하고, 8 L의 60% 에탄올을 가하고 2 시간 동안 침지시키고, 초음파 진동자를 사용하여 초음파 하에서 0.5 시간 동안 추출하고, 여과하고, 잔사에 6 L의 60% 에탄올을 가하고 초음파 하에서 동일한 방식으로 2 회 추출하고 여과하였다. 상기 추출액들을 합하고, 감압 하에서 10 L로 농축시키고, 예비용으로 20%에 도달하도록 아세톤을 가하였다. 예비 처리된 거대다공성 흡착성 수지 AB-8(Tianjin Nankai Chemical Factory)을 컬럼(6 L)에 로딩하고, 20% 아세톤으로 균형을 맞추고, 상기 예비용의 20% 아세톤 용액을 상기 컬럼 상에 로딩하고, 4 BV의 20% 아세톤, 4 BV의 80% 아세톤 순으로 용출시키고, 상기 80% 아세톤 부분을 수거하고, 아세톤 회수를 수행하고, 2000 ㎖로 농축시켰다. 이 중 500 ㎖을 동결 건조시켜 43 g의 1차 총 사포닌을 수득하였다. 나머지 1500 ㎖을 7000 ㎖로 희석하고, 200 ㎖의 유화액을 가하고, 균일하게 혼합하고 열 보존 및 전환을 위해 37 ℃ 수욕 중에 24 시간 동안 넣었다. 상기 전환된 용액을 원심분리시켜 상등액 및 침전물을 수득하고, 상기 침전물을 건조 오븐에서 80 ℃에 6 시간 동안 두어 건조시켜 94 g의 2차 총 사포닌을 수득하였다. HPLC-ELSD 방법을 사용하여 측정함으로써, 상기 1차 총 사포닌 및 2차 총 사포닌 중의 티모사포닌 BII 및 AIII의 함량은 각각 54.1% 및 62.3%이었다. 상기 1차 총 사포닌 43 g, 및 상기 2차 총 사포닌 90 g을 균일하게 혼합하여 본 발명의 약학 조성물을 수득하였다. 상기 티모사포닌 AIII 및 BII 및 총 티모사포닌의 함량을 HPLC-ELSD 외부 표준 2 점 방법 및 자외선 분광광도측정을 사용하여 별도로 측정하였으며, 이때 BII는 17.3%이고, AIII은 42.7%이고 총 사포닌은 83.4%이었다.

실시예 13: 본 발명 약학 조성물의 제조

지모의 신선한 뿌리줄기 9 ㎏을 얇은 조각으로 절단하고, 24 L의 40% 아세톤을 가하고 2 시간 동안 침지시키고, 초음파 진동자를 사용하여 초음파 하에서 0.5 시간 동안 추출하고, 여과하고, 잔사에 18 L의 40% 아세톤을 가하고 초음파 하에서 동일한 방식으로 2 회 추출하였다. 상기 추출액들을 합하고, 아세톤 회수를 수행하고, 감압 하에서 10 L로 농축시켰다. 예비 처리된 거대다공성 흡착성 수지 D-101(Tianjin Insecticide Factory)을 컬럼(12 L)에 로딩하고, 물로 균형을 맞추었다. 상기 농축된 추출액을 컬럼 상에 로딩하고, 4 BV의 물, 4 BV의 15% 아세톤, 4 BV의 70% 아세톤 순으로 용출시키고, 상기 70% 아세톤 부분을 수거하고, 용매 회수를 수행하고, 3000 ㎖로 농축시켰다. 이 중 500 ㎖을 동결 건조시켜 46 g의 1차 총 사포닌을 수득하였다. 나머지 2500 ㎖을 11000 ㎖로 희석하고, 54 ㎖의 β-글루카나제(NCB-10)를 가하고, 균일하게 혼합하고 열 보존 및 전환을 위해 50 ℃ 수욕에 20 시간 동안 넣었다. 상기 전환된 용액을 원심분리시켜 상등액 및 침전물을 수득하고, 상기 침전물을 건조 오븐에서 80 ℃에 두어 건조시켜 163 g의 2차 총 사포닌을 수득하였다. HPLC-ELSD 방법을 사용하여 측정함으로써, 상기 1차 총 사포닌 중의 티모사포닌 BII의 양은 56.2%이고, 상기 2차 총 사포닌 중의 티모사포닌 AIII의 양은 63.5%이었다. 상기 1차 총 사포닌 40 g, 및 상기 2차 총 사포닌 160 g을 균일하게 혼합하여 본 발명의 약학 조성물을 수득하였다. HPLC-ELSD 외부 표준 2 점 방법을 별도로 사용하여 측정한 바와 같은 상기 티모사포닌 AIII 및 BII의 함량은 51.3% 및 11.2%이고, 자외선 분광광도측정에 의해 측정한 바와 같은 총 티모사포닌은 87.5%이었다.

실시예 14: 본 발명 약학 조성물의 제조

지모의 섬유 뿌리 12 ㎏을 절단하고, 48 L의 물을 가하고 1 시간 동안 침지시키고, 초음파 진동자를 사용하여 초음파 하에서 0.5 시간 동안 추출하고, 여과하고; 상기 잔사에 36 L의 물을 가하고 초음파 하에서 동일한 방식으로 2 회 추출하고, 여과하였다. 상기 여액들을 합하고, 감압 하에서 20 L로 농축시키고, 30%의 농도에 도달하도록 에탄올을 가하고, 예비용으로 두었다. 예비 처리된 거대다공성 흡착성 수지 D-101(Tianjin Insecticide Factory)을 컬럼(8 L)에 로딩하고, 30% 에탄올로 균형을 맞추었다. 상기 예비용 추출액을 원심분리하고, 생성된 상등액을 균형된 컬럼에 로딩하고, 4 BV의 30% 에탄올, 3 BV의 80% 에탄올 및 3 BV의 95% 에탄올 순으로 용출시키고, 상기 80% 에탄올 부분을 수거하고, 2000 ㎖로 농축시켰다. 이 중 400 ㎖을 동결 건조시켜 21 g의 1차 총 사포닌을 수득하였다. 나머지 1600 ㎖에 아스퍼질러스 니거 배양액 2000 ㎖을 가하고, 균일하게 혼합하고 열 보존 및 전환을 위해 37 ℃ 수욕에 20 시간 동안 넣었다. 상기 전환된 용액을 원심분리시켜 상등액 및 침전물을 수득하고, 상기 침전물을 건조 오븐에서 80 ℃에 두어 건조시켜 63 g의 2차 총 사포닌을 수득하였다. HPLC-ELSD 방법을 사용하여 측정함으로써, 상기 1차 총 사포닌 중의 티모사포닌 BII의 양은 44.3%이고, 상기 2차 총 사포닌 중의 티모사포닌 AIII의 양은 52.3%이었다. 상기 1차 총 사포닌 20 g, 및 상기 2차 총 사포닌 60 g을 균일하게 혼합하여 본 발명의 약학 조성물을 수득하였다. HPLC-ELSD 외부 표준 2 점 방법을 별도로 사용하여 측정한 바와 같은 상기 티모사포닌 AIII 및 BII의 함량은 39.5% 및 11.2%이고, 자외선 분광광도측정에 의해 측정한 바와 같은 총 티모사포닌은 71.8%이었다.

실시예 15: 본 발명 약학 조성물의 제조

한약재 지모를 달인 조각 6 ㎏을 적합하게 분쇄하고, 48 L의 물을 가하고 1 시간 동안 침지시키고, 1 시간 동안 가열하여 달이고, 여과하고; 상기 잔사에 물을 가하고 동일한 방식으로 2 회 달였다. 상기 추출액들을 합하고, 감압 하에서 30 L로 농축시키고, 35%의 농도에 도달하도록 에탄올을 가하고, 균일하게 혼합하고 밤새 정치시키고, 원심분리시켜 예비용 상등액 및 침전물을 수득하고, 이를 건조시켜 보관하였다. 예비 처리된 거대다공성 흡착성 수지 HP20(Mitsubishi Company of Japan)을 컬럼(18 L)에 로딩하고, 35% 에탄올로 균형을 맞추었다. 상기 예비용 상등액을 균형된 HP20 수지 컬럼 상에 로딩하고, 4 BV의 35% 에탄올로 세척하여 불순물을 제거하고, 이어서 4 BV의 85% 에탄올로 용출시키고, 상기 컬럼을 3 BV의 95% 에탄올을 사용하여 최종적으로 재생시켰다. 상기 85% 에탄올 용출액을 수거하고, 에탄올 회수를 수행하고, 3000 ㎖로 농축시켰다. 이 중 600 ㎖을 동결 건조시켜 52 g의 1차 총 사포닌을 수득하였다. 나머지 2400 ㎖의 용액을 아세테이트 완충액(pH = 4) 1000 ㎖을 가하여 희석하고, 균일하게 혼합하고 전환을 위해 120 rpm 하에 37 ℃ 진탕기에 24 시간 동안 넣었다. 상기 전환된 용액을 원심분리시켜 상등액 및 침전물을 수득하고, 상기 침전물을 건조 오븐에서 80 ℃에 두어 건조시켜 166 g의 2차 총 사포닌을 수득하였다. HPLC-ELSD 방법을 사용하여 측정함으로써, 상기 1차 총 사포닌 중의 티모사포닌 BII의 양은 50.2%이고, 상기 2차 총 사포닌 중의 티모사포닌 AIII의 양은 57.1%이었다. 상기 1차 총 사포닌 40 g, 및 상기 2차 총 사포닌 165 g을 균일하게 혼합하여 본 발명의 약학 조성물을 수득하였다. HPLC-ELSD 외부 표준 2 점 방법을 별도로 사용하여 측정한 바와 같은 상기 티모사포닌 AIII 및 BII의 함량은 46.1% 및 10.4%이고, 자외선 분광광도측정에 의해 측정한 바와 같은 총 티모사포닌은 81.5%이었다.

실시예 16: 본 발명 약학 조성물의 제조

한약재 지모를 달인 조각 6 ㎏을 적합하게 분쇄하고, 48 L의 물을 가하고 1 시간 동안 침지시키고, 1 시간 동안 가열하여 달이고, 여과하고; 상기 잔사에 물을 가하고 동일한 방식으로 2 회 달였다. 상기 추출액들을 합하고, 감압 하에서 30 L로 농축시키고, 15%의 농도에 도달하도록 아세톤을 가하고, 균일하게 혼합하고 밤새 정치시키고, 원심분리시켜 예비용 상등액을 수득하였다. 예비 처리된 거대다공성 흡착성 수지 SP825(Mitsubishi Company of Japan)을 컬럼(18 L)에 로딩하고, 15% 아세톤으로 균형을 맞추었다. 상기 예비용 상등액을 균형된 SP825 수지 컬럼 상에 로딩하고, 4 BV의 15% 아세톤으로 세척하여 불순물을 제거하고, 이어서 4 BV의 70% 아세톤으로 용출시켰다. 상기 70% 아세톤 용출액을 수거하고, 용매 회수를 수행하고, 5000 ㎖로 농축시켰다. 상기 농축된 용액 1500 ㎖을 동결 건조시켜 87 g의 조 BII를 수득하였다. 나머지 3500 ㎖의 용액에 황산을 가하여 pH를 2 내지 3으로 조절하고, 균일하게 혼합하고 2 시간 동안 가수분해 및 전환시켰다. 상기 전환된 용액을 원심분리시켜 상등액 및 침전물을 수득하고, 상기 침전물을 건조 오븐에서 80 ℃에 두어 건조시켜 113 g의 2차 총 사포닌을 수득하였다. HPLC-ELSD 방법을 사용하여 측정함으로써, 상기 1차 총 사포닌 중의 티모사포닌 BII의 양은 55.6%이고, 상기 2차 총 사포닌 중의 티모사포닌 AIII의 양은 46.3%이었다. 상기 1차 총 사포닌 및 상기 2차 총 사포닌을 균일하게 혼합하여 본 발명의 약학 조성물을 수득하였다. HPLC-ELSD 외부 표준 2 점 방법을 별도로 사용하여 측정한 바와 같은 상기 티모사포닌 AIII 및 BII의 함량은 26.7% 및 24.3%이고, 자외선 분광광도측정에 의해 측정한 바와 같은 총 티모사포닌은 73.7%이었다.

실시예 17: 본 발명 약학 조성물의 제조

한약재 지모를 달인 조각 2 ㎏을 적합하게 분쇄하고, 16 L의 50% 에탄올을 가하고 1 시간 동안 침지시키고, 1 시간 동안 환류 하에서 추출하고, 여과하고; 상기 잔사에 12 L의 50% 에탄올을 가하고 동일한 방식으로 2 회 추출하였다. 상기 에탄올 추출액들을 합하고, 에탄올 회수를 수행하고, 감압 하에서 10 L로 농축시켜 예비용 상등액을 수득하였다. 예비 처리된 거대다공성 흡착성 수지 SP700(Mitsubishi Company of Japan)을 컬럼(8 L)에 로딩하고, 물로 균형을 맞추었다. 상기 예비용 상등액을 균형된 SP700 수지 컬럼 상에 로딩하고, 4 BV의 물 및 이어서 4 BV의 30% 에탄올로 세척하여 불순물을 제거하고, 이어서 3 BV의 50% 에탄올로 용출시켰다. 상기 50% 에탄올 용출액을 수거하고, 에탄올 회수를 수행하고, 감압 하에서 1500 ㎖로 농축시켰다. 상기 농축액을 C18 컬럼 크로마토그래피에 반복해서 통과시키고, 일정한 비율의 55% 메탄올로 용출시켜 최종적으로 32 g의 BII(면적 퍼센트 방법의 함량은 95%를 초과한다)를 수득하였다. 지모의 신선한 뿌리줄기 24 ㎏을 얇은 조각으로 절단하고, 48 L의 물을 가하고, 열 보존 및 천연 발효를 위해 37 ℃ 수욕에 72 시간 동안 넣었다. 여과 후에, 상기 여액은 버리고, 잔사를 환류 하에서 48 L의 메탄올로 1 시간 동안 추출하고, 여과하고, 상기 잔사를 동일한 방식으로 환류 하에서 48 L의 메탄올로 2 회 추가로 추출하였다. 상기 메탄올 추출액들을 합하고, 부분 용매 회수를 수행하여 침전물을 수득하고, 상기 침전물을 메탄올로 반복해서 재결정화하여 181 g의 순수한 AIII 생성물(면적 퍼센트 방법의 함량은 95%를 초과한다)을 수득하였다(또는 상기 메탄올 추출액을 실리카 컬럼에 로딩하고, 클로로폼-메탄올-물 시스템으로 용출시켜 AIII의 순수한 생성물을 수득하였다). 20 g의 BII 및 180 g의 AIII을 균일하게 혼합하여 본 발명의 약학 조성물을 수득하였다. HPLC-ELSD 외부 표준 2 점 방법을 별도로 사용하여 측정한 바와 같은 상기 티모사포닌 AIII 및 BII의 함량은 83.7% 및 9.2%이고, 자외선 분광광도측정에 의해 측정한 바와 같은 총 티모사포닌은 99.4%이었다.

실시예 18: 본 발명 약학 조성물의 제조

한약재 지모를 달인 조각 6 ㎏을 적합하게 분쇄하고, 48 L의 40% 에탄올을 가하고 1 시간 동안 침지시키고, 1 시간 동안 가열하여 환류시키고, 여과하고; 상기 잔사에 36 L의 40% 에탄올을 가하고 동일한 방식으로 2 회 환류시켰다. 상기 추출액들을 합하고, 6 L에 도달하도록 진공 에탄올 회수를 수행하고, 이어서 20%에 도달하도록 에탄올을 가하고, 균일하게 혼합하고 밤새 정치시키고, 원심분리시켜 예비용 상등액을 수득하였다. 예비 처리된 거대다공성 흡착성 수지 SP700(Mitsubishi Company of Japan)을 컬럼(8 L)에 로딩하고, 20%로 균형을 맞추었다. 상기 예비용 상등액을 균형된 SP700 수지 컬럼 상에 로딩하고, 4 BV의 20% 에탄올로 세척하여 불순물을 제거하고, 이어서 3 BV의 90% 에탄올로 용출시켰다. 상기 90% 에탄올 용출액을 수거하고, 에탄올 회수를 수행하고, 1500 ㎖로 농축시키고, 동결 건조시켜 498 g의 샘플을 수득하였으며, 이는 본 발명의 약학 조성물을 나타내었다. HPLC-ELSD 방법을 사용하여 측정된 바와 같은 상기 중 티모사포닌 AIII 및 BII의 함량은 25.3% 및 12.5%이고, 자외선 분광광도측정에 의해 측정한 바와 같은 총 티모사포닌은 56.4%이었다.

실시예 19: 본 발명 약학 조성물의 제조

한약재 지모를 달인 조각 6 ㎏을 적합하게 분쇄하고, 48 L의 40% 에탄올을 가하고 1 시간 동안 침지시키고, 1 시간 동안 가열하여 환류시키고, 여과하고; 상기 잔사에 36 L의 40% 에탄올을 가하고 동일한 방식으로 2 회 환류시켰다. 상기 추출액들을 합하고, 6 L에 도달하도록 진공 에탄올 회수를 수행하고, 이어서 25%에 도달하도록 에탄올을 가하고, 진탕에 의해 균일하게 혼합하고 밤새 정치시키고, 원심분리시켜 예비용 상등액을 수득하였다. 예비 처리된 거대다공성 흡착성 수지 SP700(Mitsubishi Company of Japan)을 컬럼(8 L)에 로딩하고, 20%로 균형을 맞추었다. 상기 예비용 상등액을 균형된 SP700 수지 컬럼 상에 로딩하고, 4 BV의 25% 에탄올로 세척하여 불순물을 제거하고, 이어서 3 BV의 50% 에탄올 및 85% 에탄올로 용출시켰다. 상기 50% 및 85% 에탄올 용출액을 수거하고, 에탄올 회수를 수행하고, 진공 농축시키고, 별도로 동결 건조시켜 153 g의 1차 총 사포닌 및 316 g의 2차 총 사포닌을 수득하였다. 150 g의 1차 총 사포닌 및 300 g의 2차 총 사포닌을 균일하게 혼합하여 본 발명의 약학 조성물을 수득하였다. HPLC-ELSD 방법을 사용하여 측정된 바와 같은 상기 중 티모사포닌 AIII 및 BII의 함량은 27.6% 및 13.5%이고, 자외선 분광광도측정에 의해 측정한 바와 같은 총 티모사포닌은 60.3%이었다.

Claims

유효량의 티모사포닌 AIII 및 티모사포닌 BII, 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는, 협심증, 심근 경색, 뇌졸중, 뇌혈전증, 뇌경색, 폐 색전증, 당뇨병, 및 혈관염으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 혈전성 질병의 예방 또는 치료를 위한 약학 조성물로서, 상기 티모사포닌 AIII 대 티모사포닌 BII의 중량비가 2:1 내지 5:1 임을 특징으로 하는 약학 조성물.
유효량의 티모사포닌 AIII 및 티모사포닌 BII를 포함하고, 상기 티모사포닌 AIII 및 티모사포닌 BII가 약학 조성물 중에 티모사포닌의 추출물로서 사용되는, 협심증, 심근 경색, 뇌졸중, 뇌혈전증, 뇌경색, 폐 색전증, 당뇨병, 및 혈관염으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 혈전성 질병의 예방 또는 치료를 위한 약학 조성물로서, 상기 티모사포닌 AIII 대 티모사포닌 BII의 중량비가 2:1 내지 5:1 임을 특징으로 하는 약학 조성물.
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제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 티모사포닌 AIII 대 티모사포닌 BII의 중량비가 3:1인 약학 조성물.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
캡슐, 정제, 과립 또는 주사의 형태로 제형화된 약학 조성물.
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제 1 항 또는 제 2 항에 따른 약학 조성물의 제조 방법으로서,
40 내지 70%의 C₁-C₄ 알콜 또는 40 내지 70%의 아세톤으로 지모(Rhizome anemarrhenae)의 달임 부분, 신선한 뿌리줄기 또는 섬유 뿌리를 추출하고, 생성된 추출액을 여과하여 여과액을 수득하고, 상기 여과액을 수거 및 원심분리하여 상등액을 수득하고, 이어서 상기 상등액을 거대다공성 흡착성 수지 컬럼에 로딩하고, 물, 20 내지 90% C₁-C₄ 알콜 및 10 내지 80% 아세톤으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 용매로 구배 용출시키고, 50 내지 90% C₁-C₄ 알콜 성분 또는 35 내지 80% 아세톤 성분을 수거하여 지모의 1차 총 사포닌을 수득하는 단계;
상기 성분들에 β-글루카나제, β-글루코시다제, 펙티나제, 셀룰라제, 에멀신, 및 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger) 또는 미생물로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 효소를 첨가하여 혼합용액을 제조하고, 상기 혼합용액을 원심분리시켜 지모의 2차 총 사포닌을 수득하는 단계; 및
상기 지모의 1차 총 사포닌 및 2차 총 사포닌을 혼합하여 본 발명의 약학 조성물을 수득하는 단계
를 포함하는 방법.
제 12 항에 있어서,
40 내지 70%의 에탄올로 지모의 달임 부분, 신선한 뿌리줄기 또는 섬유 뿌리를 추출하고, 생성된 추출액을 여과하여 여과액을 수득하고, 상기 여과액을 수거하고, 감압 하에서 원심분리하고, 이어서 90 내지 100% 에탄올을 첨가하고, 원심분리하여 상등액을 수득하고, 이어서 상기 상등액을 거대다공성 흡착성 수지 컬럼에 로딩하고, 20 내지 95% 에탄올 구배로 용출시키고, 50 내지 90% 에탄올 성분을 수거하여 지모의 1차 총 사포닌을 수득하는 단계;
상기 성분들에 β-글루카나제, β-글루코시다제, 펙티나제, 셀룰라제, 에멀신, 및 아스퍼질러스 니거 또는 미생물로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 효소를 첨가하여 혼합용액을 제조하고, 상기 혼합용액을 원심분리시켜 지모의 2차 총 사포닌을 수득하는 단계; 및
상기 지모의 1차 총 사포닌 및 2차 총 사포닌을 혼합하여 본 발명의 약학 조성물을 수득하는 단계
를 포함하는 방법.