KR20180083083A - 천연 복합 항비만 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은, 죽엽 및 모과의 추출 복합물을 유효성분으로 함유하는, 비만의 예방, 치료, 개선용 약학조성물 및 건강식품 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 의하면 부작용이 거의 없고 항비만 효과가 뛰어나기 때문의 비만의 예방, 개선 및 치료용 약학조성물 및 건강식품으로 유용하게 이용될 수 있는 바, 기존의 천연 항비만제를 뛰어넘는 새로운 치료제 및 치료법을 제공할 수 있다.
Description
본 발명은, 죽엽과 모과의 추출 복합물을 유효성분으로 함유하는, 비만의 예방, 치료, 개선용 약학조성물 및 건강식품 조성물에 관한 것이다.
비만(Obesity)은 전 세계적으로 가장 흔한 영양장애 중의 하나로써, 소모하는 열량에 비해 과다한 열량을 섭취함으로써 여분의 열량이 체내에 지방의 형태로 축적되어지는 현상을 말한다. 즉, 열량의 섭취와 소비의 불균형으로 발생하는 대사성 질환으로서, 과열량으로 인해 지방 조직이 비정상적으로 증가된 상태를 의미한다.
비만은 유전적 영향, 서구화되는 식생활에 의한 환경적인 영향, 스트레스에 의한 심리적인 영향 등 다양한 원인에 의해 유발되어지는 것으로 생각되고 있으나 아직 그 정확한 원인이나 기작에 관해서는 명확히 정립된 바가 없는 실정이다.
비만이 발생하여 그 상태가 지속되면 고혈압, 혈중 콜레스테롤 상승, 당뇨병, 신장 질환, 뇌졸증, 동맥경화증, 지방간, 관절염, 암, 수면, 무호흡증 등의 다양한 질환을 유발할 수 있다.
또한, 비만은 지방전구세포(preadipocyte)의 분화 및 지방생성(adipogenesis) 과정에 의하여 지방세포(adipocyte)의 세포 내 중성지방(triglyceride, TG)의 축적으로 발생하며 이러한 지방생성 기전을 조절하는 것이 비만 억제의 효과적인 치료방법으로 알려져 있다.
현재까지는 비만을 치료하는 방법 중 완전한 방법은 없으며 이러한 방법을 중단하였을 때 다시 체중이 증가되는 요요현상이 나타나거나 식이제한에 의한 영양불균형, 면역력 저하에 의한 감염 등 여러 가지 부작용이 나타나고 있다. 특히 약물요법의 경우, 우울증, 불면증, 소화장애 등 그 부작용이 다양하게 보고되고 있다. 따라서, 이러한 전통적인 방법 이외에 체중감소를 촉진하는 효과적이며 안전한 방법을 개발하려는 연구가 지속되고 있다.
한편, 종래 모과 추출물을 이용하거나, 죽엽과 황금 복합 추출물을 이용한 항비만 조성물이 개시된 바 있으나, 모과 추출물과 죽엽 추출물의 복합물을 이용한 항비만 조성물은 알려진 바 없다.
모과의 경우 당질을 13.4∼20.7% 정도 함유하고 있으며 당질 중 당분은 10~13%로서 당을 많이 포함하고 있어 모과 단일 추출물의 농도가 높아질 경우 추출물의 점도가 높아지게 된다. 이렇게 추출물의 점도가 높아지게 되면 제형 및 제제화가 어려울 뿐만 아니라 이러한 문제를 해결하기 위해 부형제가 과다하게 첨가되어 효과 용량을 섭취하기 위해서는 제형화된 물질을 많이 먹어야 하는 불편함이 발생한다는 문제가 있다.
또한, 죽엽의 경우 맛이 너무 써서 이를 식품 등의 제품으로 만들기 어려운 문제가 있다.
이에, 본 발명자들은, 안전하고도 부작용 없이 항비만 효과가 뛰어난 천연 약물을 개발하기 위해 예의 연구한 결과, 죽엽과 모과의 추출 복합물이 우수한 항비만 효과가 있을 뿐만 아니라, 단독 추출물이 갖는 문제를 해결할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은, 죽엽과 모과의 추출 복합물을 유효성분으로 함유하는 비만의 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은, 죽엽과 모과의 추출 복합물을 유효성분으로 함유하는 비만의 예방 또는 개선용 건강식품 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 죽엽과 모과의 추출 복합물을 유효성분으로 함유하는, 비만의 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은, 죽엽과 모과의 추출 복합물을 유효성분으로 함유하는, 비만의 예방 또는 개선용 건강식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은, 죽엽과 모과의 추출 복합물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 비만의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
또한, 본 발명은, 죽엽과 모과의 추출 복합물의 항비만 용도를 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 추출은 물, C1 내지 C4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매를 사용하여 수행된 것임을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 저급알코올은 에탄올인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 추출 복합물은 죽엽 추출물과 모과 추출물을 1: 0.1 내지 10의 중량비로 혼합한 것임을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 중량비는 1: 1인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 죽엽과 모과의 추출 복합물은 부작용이 거의 없고 항비만 효과가 뛰어나기 때문의 비만의 예방, 개선 및 치료용 약학조성물 및 건강식품으로 유용하게 이용될 수 있는 바, 본 발명에 의하면 기존의 천연 항비만제를 뛰어넘는 새로운 치료제 및 치료법을 제공할 수 있다.
또한, 모과와 죽엽을 조합할 경우, 모과로 인해 죽엽의 쓴 맛을 감소시킬 수 있으며, 모과와 죽엽 단일 추출물의 효과 농도보다 낮은 농도에서 비만 개선 효과를 나타내므로, 단일 추출물과 비교하여 효과농도에서의 당의 농도가 낮아 제제 및 제형화가 어려웠던 문제를 해결할 수 있다.
또한, 일반적으로 추출 복합물이 단일 추출물과 동일한 효능을 보이기 위해서는 각각 동량의 추출물을 사용하여야 하지만, 본 발명에서는 각 추출물의 효능 용량의 1/2만을 섭취하여도 단일 추출물을 섭취하는 경우와 동일한 효과를 나타낼 수 있다.
도 1은, 3T3-L1 지방세포에서 죽엽+모과 30% 에탄올 추출복합물과 죽엽+모과 열수 추출복합물의 세포독성평가를 MTT assay로 수행한 결과이다.
도 2는, 3T3-L1 지방세포에서 죽엽+모과 30% 에탄올 추출복합물과 죽엽+모과 열수 추출복합물을 농도별로 처리한 후 렙틴(leptin) 농도를 측정한 결과이다.
도 3은, 3T3-L1 지방세포에서 죽엽+모과 30% 에탄올 추출복합물과 죽엽+모과 열수 추출복합물을 농도별로 처리한 후 글리세롤 생산량을 측정한 결과이다.
도 4는, 3T3-L1 지방세포에서 죽엽+모과 30% 에탄올 추출복합물과 죽엽+모과 열수 추출복합물을 농도별로 처리한 후 triglyceride 농도를 측정한 결과이다.
도 5 및 6은, C57BL/6J 마우스의 ND(normal diet) 및 HD(high fat diet)군에게 죽엽+모과 열수 추출복합물을 경구 투여한 후 체중 변화를 관찰한 결과이다.
도 7은, C57BL/6J 마우스의 ND(normal diet)군 및 HD(high fat diet)군에게 죽엽+모과 열수 추출복합물을 경구 투여한 후 부고환 지방(EAT) 무게 변화를 관찰한 결과이다.
도 8은, C57BL/6J 마우스의 ND(normal diet)군 및 HD(high fat diet)군에게 죽엽+모과 열수 추출복합물을 경구 투여한 후 갈색지방(BAT) 무게 변화를 관찰한 결과이다.
도 9는, C57BL/6J 마우스의 ND(normal diet)군 및 HD(high fat diet)군에게 죽엽+모과 열수 추출복합물을 경구 투여한 후, 내장 지방세포의 크기를 관찰하기 위하여 내장지방의 H&E(hemaoxylin & eosin)염색을 수행한 결과이다.
도 10A는, C57BL/6J 마우스의 ND(normal diet)군 및 HD(high fat diet)군에게 죽엽+모과 열수 추출복합물을 경구 투여한 후, 내장 지방세포의 크기를 측정한 결과이며, 도 10B는, 내장 지방세포의 면적을 측정한 결과이다.
도 11은, C57BL/6J 마우스의 ND(normal diet)군 및 HD(high fat diet)군에게 죽엽+모과 열수 추출복합물을 경구 투여한 후, 갈색 지방세포의 크기를 관찰하기 위하여 갈색지방의 H&E(hemaoxylin & eosin)염색을 수행한 결과이다.
도 12A는, C57BL/6J 마우스의 ND(normal diet)군 및 HD(high fat diet)군에게 죽엽+모과 열수 추출복합물을 경구 투여한 후, 갈색 지방세포의 크기를 측정한 결과이며, 도 12B는, 갈색 지방세포의 면적을 측정한 결과이다.
도 13은, C57BL/6J 마우스의 ND(normal diet)군 및 HD(high fat diet)군에게 죽엽+모과 열수 추출복합물을 경구 투여한 후, 부고환 지방세포의 크기를 관찰하기 위하여 부고환 지방의 H&E(hemaoxylin & eosin)염색을 수행한 결과이다.
도 14A는, C57BL/6J 마우스의 ND(normal diet)군 및 HD(high fat diet)군에게 죽엽+모과 열수 추출복합물을 경구 투여한 후, 부고환 지방세포의 크기를 측정한 결과이며, 도 14B는, 부고환 지방세포의 면적을 측정한 결과이다.
도 2는, 3T3-L1 지방세포에서 죽엽+모과 30% 에탄올 추출복합물과 죽엽+모과 열수 추출복합물을 농도별로 처리한 후 렙틴(leptin) 농도를 측정한 결과이다.
도 3은, 3T3-L1 지방세포에서 죽엽+모과 30% 에탄올 추출복합물과 죽엽+모과 열수 추출복합물을 농도별로 처리한 후 글리세롤 생산량을 측정한 결과이다.
도 4는, 3T3-L1 지방세포에서 죽엽+모과 30% 에탄올 추출복합물과 죽엽+모과 열수 추출복합물을 농도별로 처리한 후 triglyceride 농도를 측정한 결과이다.
도 5 및 6은, C57BL/6J 마우스의 ND(normal diet) 및 HD(high fat diet)군에게 죽엽+모과 열수 추출복합물을 경구 투여한 후 체중 변화를 관찰한 결과이다.
도 7은, C57BL/6J 마우스의 ND(normal diet)군 및 HD(high fat diet)군에게 죽엽+모과 열수 추출복합물을 경구 투여한 후 부고환 지방(EAT) 무게 변화를 관찰한 결과이다.
도 8은, C57BL/6J 마우스의 ND(normal diet)군 및 HD(high fat diet)군에게 죽엽+모과 열수 추출복합물을 경구 투여한 후 갈색지방(BAT) 무게 변화를 관찰한 결과이다.
도 9는, C57BL/6J 마우스의 ND(normal diet)군 및 HD(high fat diet)군에게 죽엽+모과 열수 추출복합물을 경구 투여한 후, 내장 지방세포의 크기를 관찰하기 위하여 내장지방의 H&E(hemaoxylin & eosin)염색을 수행한 결과이다.
도 10A는, C57BL/6J 마우스의 ND(normal diet)군 및 HD(high fat diet)군에게 죽엽+모과 열수 추출복합물을 경구 투여한 후, 내장 지방세포의 크기를 측정한 결과이며, 도 10B는, 내장 지방세포의 면적을 측정한 결과이다.
도 11은, C57BL/6J 마우스의 ND(normal diet)군 및 HD(high fat diet)군에게 죽엽+모과 열수 추출복합물을 경구 투여한 후, 갈색 지방세포의 크기를 관찰하기 위하여 갈색지방의 H&E(hemaoxylin & eosin)염색을 수행한 결과이다.
도 12A는, C57BL/6J 마우스의 ND(normal diet)군 및 HD(high fat diet)군에게 죽엽+모과 열수 추출복합물을 경구 투여한 후, 갈색 지방세포의 크기를 측정한 결과이며, 도 12B는, 갈색 지방세포의 면적을 측정한 결과이다.
도 13은, C57BL/6J 마우스의 ND(normal diet)군 및 HD(high fat diet)군에게 죽엽+모과 열수 추출복합물을 경구 투여한 후, 부고환 지방세포의 크기를 관찰하기 위하여 부고환 지방의 H&E(hemaoxylin & eosin)염색을 수행한 결과이다.
도 14A는, C57BL/6J 마우스의 ND(normal diet)군 및 HD(high fat diet)군에게 죽엽+모과 열수 추출복합물을 경구 투여한 후, 부고환 지방세포의 크기를 측정한 결과이며, 도 14B는, 부고환 지방세포의 면적을 측정한 결과이다.
본 발명의 죽엽과 모과의 추출 복합물은 하기와 같이 제조될 수 있다.
죽엽 및 모과를 물로 세척하여 음건 후, 각각 마쇄하여 상기 생약재료 중량의 약 1 내지 20배, 바람직하게는 약 2내지 10배에 달하는 부피의 물, C1 내지 C4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 30% 에탄올로 0 내지 120℃ 온도에서 약 1시간 내지 1일 동안, 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출, 초음파 추출 또는 초임계 추출 등의 추출방법으로 추출한 후, 추출액을 냉각 후에 여과하고 여과액을 동결 건조하여 본 발명의 추출복합물을 얻을 수 있다.
상기 추출 복합물은, 죽엽 추출물 및 모과 추출물을 1 : 0.1 내지 10의 중량비로 혼합하는 것이 바람직하고, 1 : 1의 중량비로 각 단독 추출물을 혼합하는 것이 가장 바람직하다.
본 발명의 약학 조성물은 기존 치료 활성 성분, 기타 보조제, 약제학적으로 허용가능한 담체 등의 성분을 추가로 포함할 수 있다. 상기 약제학적으로 허용가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 및 에탄올 등을 포함한다.
본 발명에서 "개체"란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 쥐(rat), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다. 또한 본 발명에서 "약제학적 유효량"은 투여되는 질환 종류 및 중증도, 환자의 연령 및 성별, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정되며 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최대 효과를 얻을 수 있는 양으로, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 조성물은 목적 조직에 도달할 수 있는 한 투여방법에는 제한이 없다. 예를 들면, 경구 투여, 동맥 주사, 정맥 주사, 경피 주사, 비강 내 투여, 경기관지 투여 또는 근육 내 투여 등이 포함된다. 일일 투여량은 약 0.0001 내지 100mg/kg이고, 바람직하게는 0.001 내지 10mg/kg이며, 하루 일회 내지 수회 나누어 투여하는 것이 바람직하다.
본 발명의 조성물은 비만의 예방 및 개선을 위한 약제, 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있으며, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료 형태로 사용할 수 있다.
본 발명에서 "죽엽(竹葉)"이란, 대나무과의 왕대, 맹종죽, 솜대, 조릿대 등의 잎사귀를 의미하는데, 한방에서는 열을 내리고 번조(煩躁)를 제거하며 진액(津液)을 생성하고 이뇨(利尿)하는 효능을 나타낸다고 알려져 있다.
"모과(木瓜)"는 중국이 원산지로서 장미과(Rosaceae) 목과속(Chaenomelis Lindl.)에 속하며 낙엽관목 또는 소교목이다. 한방에서는 모과가 비위를 조화시키며 습을 제거하는 약물로 인식되어 급성 위장병, 각기병, 근육통, 관절염, 신경통에 효험있는 약재로 처방되고 있다. 또한 진해, 거담, 폐렴, 기관지염 등에도 효과가 있는 것으로 알려져 있다.
본 발명에서 "비만"이란, 일반적으로 체내에 지방조직이 과다한 상태이거나 또는 신체비만지수(체질량지수, Body mass index: 체중(kg)을 신장(m)의 제곱으로 나눈 값)가 25 이상인 경우를 의미한다. 비만 증상이 발생한 개체에서는 통상적으로 혈장으로부터 지방세포로 유입된 지방산과 포도당이 에스테르화하여 주로 중성지방의 형태로 축적된다.
본 발명에서는, 항비만효능 탐색을 위하여 비만 세포모델인 3T3-L1 지방세포를 분화시킨 후 죽엽+모과 추출복합물을 처리하여 세포생존율, Triglyceride content, Leptin production, Glycerol release 등을 측정하여 그 효과를 살펴보았다. 또한, 동물모델인 C57BL/6J mice에 일반식이(ND)와 고지방식이(HD)를 공급하면서 죽엽+모과 추출복합물을 8주 동안 경구투여 시킨 후 체중, 혈중지질 및 지방조직의 변화를 통한 항비만효능을 규명하였다.
그 결과, 죽엽+모과 추출복합물은 3T3-L1 지방세포에서 지질축적을 감소시키고 글리세롤 분비를 증가시켰으며, 지방세포의 분화와 합성을 억제함을 확인하였다. 또한 8주간 죽엽+모과 추출복합물을 경구투여한 C57BL/6J mice에서는 유의한 체중 감소효과가 나타났다. 이러한 체중 감소효과는 죽엽+모과 추출복합물 투여에 의한 지방조직 무게, 지방세포의 크기와 면적이 감소된 것에 기인하는 것으로 나타났으며, 체지방 감소에 의하여 혈중 지질농도도 유의하게 개선되었음을 확인할 수 있었다.
따라서, 본 발명의 죽엽+모과 추출복합물은, 비만의 예방과 치료에 있어서 유용하게 이용될 수 있으며, 현재 체지방감소 건강기능식품으로 사용되고 있는 가르시니아캄보지아 추출물(HCA)의 효능과 유의적 차이가 없었는 바, 새로운 체지방감소 건강기능식품의 후보로 제시될 수 있을 것이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[
실시예
]
실시예
1 : 실험방법
1-1. 추출 복합물의 제조
본 실험에 사용한 천연재료들은 ㈜동양허브에서 구입하여 정선한 것을 사용하였다. 먼저 죽엽과 모과를 각각 음건 및 분쇄한 후, 죽엽 50g 및 모과 50g 각각을 30% 에탄올 1ℓ에 넣고 약탕기를 이용해 열수 추출물을 얻은 후 동결건조하였다. 동결건조한 시료 100mg을 1ml의 30% 에탄올에 넣고 녹인 후 0.2um 필터로 불순물을 제거한 후 시료로 사용하였다.
체중이 60kg인 성인이 복용하는 추출복합물(죽엽 추출물 및 모과 추출물을 1:1의 중량비로 혼합)을 1000mg, 3000mg로 정하고, 이를 마우스에 적용하기 위해 하기 공식을 이용하여 사료를 제조하였다.
HED (mg/kg)=Animal dose (mg/kg) X Animal Km/Human Km
1-2. 세포배양
American Type Culture Collection(Rockville, MD, USA)에서 지방세포(adipocyte)인 3T3-L1 세포주를 구입하여, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 10% Fetal Bovine Serum (FBS; Invitrogen, USA)이 함유된 DMEM (Invitrogen, USA) 배지를 사용하여 배양하였다. 오염 방지를 위해 항생제로 100unit/ml 페니실린, 100ug/ml 스트렙토마이신 (Gibco/BRL, USA)을 첨가하고, 트립신-EDTA (Gibco/BRL, USA)를 처리하여 계대 배양하였다. 배지는 2-3일 마다 교환하여 주었다.
추출복합물을 처리하기 위해, 배양하고 있는 3T3-L1 세포주를 1×105/well의 개수로 24-well 플레이트(Corning, USA)에 옮겨주고, 다음날 저녁에 FBS가 들어있지 않은 배지로 16시간 이상 교체해준 후 처리하였다.
1-3. 실험동물
4주령의 C57BL/6J 계열 수컷 mice를 (주)중앙실험동물(Central Lab-Animal Inc. Seoul, Korea)에서 구입하여 1주간 총 칼로리의 10%가 지방인 일반식이로 적응시킨 후 실험에 사용하였다.
1-4. 마우스 동물모델
실험군
정상식이군과 정상식이 시료군을 제외한 모든 군은 비만 유도를 위하여 총 칼로리의 60%가 지방인 고지방식이를 공급하였으며, 정상식이군과 정상식이 시료군은 총 칼로리의 10%가 지방인 일반식이를 총 8주 동안 자유 급식하였다.
실험군은 정상식이군(normal diet, ND), 고지방 식이군(high fat diet, HD), 양성대조군(HCA), 정상식이군에 죽엽+모과 열수 추출복합물을 투여한 시료군(ND+JMW), 고지방 식이에 죽엽+모과 열수 추출복합물을 2배 농도로 각각 투여한 시료효능군(HD+JMW200, HD+JMW400) 으로 총 6개 군으로 분류하였고 각 군마다 10마리씩 난괴법으로 나누어 실험하였다.
1주간의 적응 후 1주에서 8주까지 8주간의 시료 추출물의 항비만 효과를 확인하기 위해서 실험물질은 증류수에 용해하여 양성대조군은 300 mg/kg BW/day, 정상식이 시료군은 400 mg/kg BW/day, 고지방식이 시료효능군은 200 mg/kg BW/day와 400 mg/kg BW/day의 농도로 1일 1회 경구투여 하였으며 정상식이군과 고지방식이군에는 증류수를 투여하였다. 이때, ND, HD의 식이조성은 하기 표 1에 나타내었다.
[표 1]
1-5. 통계
모든 측정값은 평균값 표준편차(mean±S.D.)로 표시하였고, 각 실험군 간의 통계학적 분석은 window용 SPSS Program의 one-way ANOVA로 검정하여 p값이 0.05 이하인 경우에 유의한 것으로 인정하였다.
실시예
2.
in vitro
세포실험
2-1.
MTT
assay (독성실험)
3T3-L1 adipocytes에서 죽엽+모과 30% 에탄올 추출복합물과 죽엽+모과 열수 추출복합물의 세포독성평가를 공지의 MTT assay로 수행하였다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 세포만 배양한 경우의 생존율을 100%를 기준으로 했을 때, 죽엽+모과 30% 에탄올 추출복합물 농도 50, 100, 200, 400, 800, 1000 μg/mL에서 각각 99.84%, 99.15%, 98.44%, 98.57%, 94.50%, 88.10%로 측정되었다. 따라서 50~400 μg/mL의 농도에서는 유의성이 없었으며 세포독성이 없는 것으로 평가되었다. 또한, 죽엽+모과 열수 추출복합물에서는 농도 50, 100, 200, 400, 800, 1000 μg/mL에서 각각 99.70%, 98.54%, 99.34%, 98.48%, 95.74%, 91.55%로 측정되었다. 즉, 죽엽+모과 열수 추출복합물은 50~400 μg/mL의 농도에서는 유의성이 없었으며 세포독성이 없는 것으로 평가되었다.
도 1에서, Con은 adipocytes, JME은 Quinces and Bamboo leaves 30% ethanol extract, JMW은 Quinces and Bamboo leaves water extract를 의미한다.
이러한 세포독성 결과에 따라 이후의 실험에서는 세포독성이 나타나지 않는 농도범위 (0~400 μg/mL)에서 죽엽+모과 추출복합물의 항비만 효과를 검증하였다.
2-2.
Leptin
production 분석
Leptin은 지방세포의 비만 유전자에 의해 생성되는 호르몬으로 지방 세포내 지방축적량이 높을수록 leptin의 분비량이 증가하여 혈중 leptin 농도는 체지방량을 나타내는 지표로 비만연구에 많이 사용되고 있다. 분화가 안된 pre-adipocytes의 leptin 생산량은 0.027±0.01 ng/mL, 분화된 adipocytes의 leptin 생산량은 0.50±0.01 ng/mL이며, 양성대조군인 HCA(hydroxy citric acid) 100 μg/mL농도에서 leptin 생산량은 0.39±0.01 ng/mL이다.
3T3-L1 adipocytes에 죽엽+모과 30% 에탄올 추출복합물과 열수 추출복합물을 각각의 농도별로 (50, 100 μg/mL) 처리하여 ELISA kit을 이용하여 leptin 농도를 측정한 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 죽엽+모과 30% 에탄올 추출복합물과 죽엽+모과 열수 추출복합물을 처리한 adipocytes에서의 leptin 생산량은 50, 100 μg/mL 농도에서 각각 0.42±0.03, 0.35±0.01 ng/mL과 0.37±0.03, 0.35±0.01 ng/mL로 유의적 (p<0.05) 으로 감소하였다. 또한, 죽엽+모과 30% 에탄올 추출복합물 100 μg/mL 농도와 죽엽+모과 열수 추출복합물 50, 100 μg/mL 농도에서는 HCA 100 μg/mL보다 유의적으로 leptin 생산량이 낮았다.
도 2에서, Pre는 Preadipocytes, C는 adipocytes, JME은 Quinces and Bamboo leaves 30% ethanol extract, JMW은 Quinces and Bamboo leaves water extract를 의미한다.
2-3. Glycerol release 분석
3T3-L1 adipocytes에 죽엽+모과 30% 에탄올 추출복합물과 죽엽+모과 열수 추출복합물을 각각의 농도별로 (50, 100 μg/mL) 처리하여 glycerol 생산량을 측정하였다. 분화가 안된 pre-adipocytes의 glycerol 생산량은 2.46±1.34 μg/mL, 분화가 된 adipocytes의 glycerol 생산량은 18.10±2.28 μg/mL이고, 양성대조군 HCA 100 μg/mL의 glycerol 생산량은 32.09±1.23 μg/mL이다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 죽엽+모과 30% 에탄올 추출복합물과 죽엽+모과 열수 추출복합물을 처리한 adipocytes에서의 glycerol 생산량은 50, 100 μg/mL에서 각각 30.34±1.97, 32.17±1.04 μg/mL와 33.09±0.63, 36.61±0.38 μg/mL로 유의적 (p<0.05) 으로 증가하였고, 죽엽+모과 열수 추출복합물 50, 100 μg/mL 농도에서는 HCA 100 μg/mL보다 유의적으로 glycerol 생산량이 높았다.
도 3에서, Pre는 Preadipocytes, C는 adipocytes, JME은 Quinces and Bamboo leaves 30% ethanol extract, JMW은 Quinces and Bamboo leaves water extract를 의미한다.
이러한 결과는, 죽엽+모과 추출복합물이 효과적으로 지방세포에 저장되어 있던 중성지방을 유리 지방산과 glycerol로 분해시켜 세포 밖으로 방출시킴을 의미하는 것이다.
2-4.
Triglyceride
content 분석
3T3-L1 adipocytes에 죽엽+모과 30% 에탄올 추출복합물과 죽엽+모과 열수 추출복합물을 각각의 농도별로 (50, 100 μg/mL) 처리하여 triglyceride 농도를 측정하였다. 분화가 안된 preadipocytes의 triglyceride 함량은 2.14±1.65 μg/mg protein, 분화된 adipocytes의 triglyceride 함량은 126.2±1.25 μg/mg protein이고, 양성대조군 HCA 100 μg/mL에서의 triglyceride 함량은 98.01±1.24 μg/mg protein이다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 죽엽+모과 30% 에탄올 추출복합물과 죽엽+모과 열수 추출복합물을 50, 100 μg/mL 농도로 처리한 adipocytes에서 triglyceride 함량은 각각 106.91±1.44, 96.75±1.52 μg/mg protein과 104.39±2.98, 86.60±1.46 μg/mg protein로 유의적 (p<0.05) 으로 감소하는 것을 볼 수 있었다. 또한, 죽엽+모과 30% 에탄올 추출복합물 100 μg/mL 농도에서의 triglyceride 함량은 HCA 100 μg/mL의 triglyceride 함량과 유의적인 차이가 없었고, 죽엽+모과 열수 추출복합물 100 μg/mL 농도에서는 HCA 100 μg/mL의 triglyceride 함량보다 유의적으로 감소하였다.
도 4에서, Pre는 Preadipocytes, C는 adipocytes, JME은 Quinces and Bamboo leaves 30% ethanol extract, JMW은 Quinces and Bamboo leaves water extract를 의미한다.
이러한 결과는, 죽엽+모과 추출복합물이 효과적으로 중성지방 함량을 감소시킴을 의미하는 것이다.
실시예
3.
in
vivo
동물실험
3-1. 체중 증가량,
식이섭취량
,
식이효율
분석
실험동물을 일주일간 적응시킨 후, 8주 동안 C57BL/6J mice에게 죽엽+모과 열수 추출복합물을 경구 투여하여 체중 변화량을 관찰하였다.
그 결과, 도 5 및 6에 나타낸 바와 같이, ND(normal diet)군은 5.03g, ND+JMW400군은 (JMW 400 mg/kg BW/day 경구투여한 군) 4.03g으로 ND군에 비해 ND+JMW400군이 낮은 수치였지만 유의적인 차이는 없었다.
이에 반하여, HD(high fat diet)군의 체중변화량은 20.07g, HD+JMW200군은 (JMW 200 mg/kg BW/day 경구투여한 군) 11.88g, HD+JMW400군은 (JMW 400 mg/kg BW/day 경구투여한 군) 12.14g, 양성 대조군인 HD+HCA군은 12.83g으로, HD군에 비해 HD+JMW200군, HD+JMW400군이 낮은 수치로 유의적인 차이가 있었으며, HD+HCA군과는 비슷한 값을 나타내었다.
이러한 결과를 통해, 죽엽+모과 열수 추출복합물의 섭취는 체중 증가를 억제하는 효과가 있음을 알 수 있었으며, JMW 투여량에 따른 유의적 차이는 없었다.
또한, 하기 표 2에 나타낸 바와 같이, 식이섭취량(Food intake)은 ND군은 4.37g, ND+JMW400군은 3.89g, HD군은 4.16g, HD+JMW200군은 3.59g, HD+JMW400군은 3.80g, HD+HCA군은 3.79g으로 ND군의 식이섭취량이 가장 많았으며, HD+JMW200군의 섭취량이 제일 적어 유의적인 차이를 보였다. 식이효율(FER, Food efficiency ratio)을 계산한 결과 ND군은 1.15, ND+JMW400군은 1.04, HD군은 4.82, HD+JMW200군은 3.31, HD+JMW400군은 3.19, HD+HCA군은 3.39로 HD군에 비해 HD+JMW200군, HD+JMW400군, HD+HCA군이 낮은 수치로 유의적인 차이가 있었다.
[표 2]
3-2. 지방조직 무게 분석
죽엽+모과 열수 추출복합물을 처리한 실험동물의 지방조직 무게를 측정하여 하기 표 3에 나타내었다.
[표 3]
그 결과, 부고환 지방(EAT, epididylmal adipose tissue)의 무게는 ND+JMW400군에서 0.30g으로 정상식이군인 ND군의 0.53g보다 낮은 수치로 유의적 차이가 있었고, HD+JMW200군과 HD+JMW400군은 각각 1.40g, 1.44g으로 비만대조군인 HD군의 2.69g보다 낮은 수치로 유의적 차이가 있었다. HD+JMW200군과 HD+JMW400군 사이의 유의적 차이는 없었으나 두군 다 양성대조군인 HD+HCA군의 1.70g 보다 유의적으로 낮았다 (도 7 참조).
뒷목 부분의 갈색지방(BAT, brown adipose tissue) 무게 분석 결과, ND+JMW400군에서 0.06g으로 정상식이군인 ND군의 0.08g보다 낮은 수치로 유의적 차이가 있었고, HD+JMW200군과 HD+JMW400군은 각각 0.10g, 0.10g로 비만대조군인 HD군의 0.18g보다 낮은 수치로 HD+JMW200군, HD+JMW400군과 HD군과는 유의적 차이가 있었다 (도 8 참조).
이러한 결과를 통하여, 죽엽+모과 열수 추출복합물을 경구투여했을 때, 부고환지방과 갈색지방의 무게를 감소시키는데 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
3-3. 혈중 지질 분석
죽엽+모과 열수 추출복합물을 처리한 실험동물에서 혈중 지질양(중성지방, 콜레스테롤)을 측정하여 하기 표 4에 나타내었다.
[표 4]
혈중 중성지방(Triglyceride)의 경우, ND군은 129.33 mg/dL 농도이며, ND+JMW400군은 121.01 mg/dL이었다. HD군은 200.03 mg/dL로 높게 나타났으며, HD+JMW200군, HD+JMW400군은 각각 170.43 mg/dL, 165.08 mg/dL으로 유의적으로 감소하였다. HD+HCA군은 174.08 mg/dL로 HD+JMW200, HD+JMW400군과 유의적인 차이를 나타내지 않았다.
혈중 총 콜레스테롤의 경우, ND군은 159.08 mg/dL 농도였으며, ND+JMW400군은 149.77 mg/dL으로 유의적인 차이는 없었다. 반면 HD군은 260.55 mg/dL로 높게 나타났으며, HD+JMW200군, HD+JMW400군은 각각 240.88 mg/dL, 237.25 mg/dL으로 유의적으로 감소하였으며, HD+HCA군은 241.53 mg/dL로 HD+JMW200군, HD+JMW400군과 유의적인 차이를 나타내지 않았다.
LDL-콜레스테롤의 경우, 정상식이군인 ND군이 71.15 mg/dL 농도이며, ND+JMW400은 41.94 mg/dL으로 ND군에 비해 유의적으로 낮았다. 비만대조군 HD는 182.84 mg/dL로 가장 높은 농도를 보였고, HD+JMW200군이 128.32 mg/dL, HD+JMW400군이 124.82 mg/dL으로 HD군에 비해 두군 모두 유의적으로 낮게 나타났다. 양성대조군은 131.06 mg/dL로 HD+JMW200군, HD+JMW400군과 유의적 차이를 나타내지 않았다.
HDL-콜레스테롤의 경우, ND군이 62.06 mg/dL 농도이며, ND+JMW400은 83.63 mg/dL으로 ND군에 비해 유의적으로 높았다. HD군은 37.70 mg/dl로 가장 낮게 나타났으며, HD+JMW200, 400군이 각각 78.48 mg/dL, 79.41 mg/dL로 유의적으로 증가하였으며, HD+HCA군은 75.66 mg/dl로 JMW200, 400군과 유의적인 차이를 나타내지 않았다.
따라서, JMW 경구투여로 인하여, 혈중 중성지방 농도를 비롯하여 총 콜레스테롤, LDL-콜레스테롤의 농도가 감소되었고, HDL-콜레스테롤 농도는 증가시켜 비만모델인 C57BL/6J mice의 혈중 지질 대사가 개선됨을 알 수 있었다.
3-4. 지방조직과 지방세포 분석
지방조직의 분석은 한국의과학연구소에 의뢰하여 이루어졌다. 지방세포 측정은 400배로 관찰하였으며, 동일성을 위하여 모든 지방을 400배로 20곳을 지정하여 관찰하였다. 세포 크기는 지름을 나타낸 것이고 면적은 nm²을 나타낸 것이고 image pro plus 를 사용하여 면적을 구했다.
구체적으로, 측정방법은 먼저 적출한 지방조직을 formalin solution에 24시간 이상 고정하고 흐르는 물에 수세하여 포르말린을 제거하였다. 충분히 세척한 지방조직은 Thermo Tissue Processor를 이용하여 파라핀을 침투시키고 Thermo Embedding center에서 포매 시켜 만든 파라핀 블록을 Microtome을 이용하여 4μm으로 자른 후 슬라이드 위에 부착하여 건조하였다. 지방조직이 부착된 슬라이드를 xylene을 이용하여 파라핀을 제거한 후 hematoxylin and eosin (H&E) 으로 염색하고 광학 현미경을 통해 400배 배율로 조직학적 변화를 관찰하였다.
① 내장 지방세포의 크기와 면적
지방구의 크기를 관찰하기 위하여 동물을 해부한 후 내장지방의 H&E(hemaoxylin & eosin)염색을 수행하였다. 그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, 실험동물의 내장 지방세포의 크기는 8주 동안 60% high fat diet를 공급한 군들이 normal diet를 공급한 군에 비해 육안으로 커진 상태를 확인하였고, 비만이 유도되었음을 확인할 수 있었다.
또한, 도 10(A)에 나타낸 바와 같이, 내장 지방세포의 크기는 정상식이군인 ND군이 368.0 nm였고, ND+JMW400군이 354.5 nm로 유의적으로 차이가 없었다. 비만대조군인 HD군은 610.3 nm로 내장 지방세포의 크기가 가장 컸고, HD+JMW200, 400군은 각각 463.7 nm, 458.9 nm로 비만군보다 유의적으로 감소했다. 양성대조군인 HD+HCA군은 530.4 nm로 HD+JMW200, 400군보다 유의적으로 컸다.
또한, 도 10(B)에 나타낸 바와 같이, 내장 지방세포의 면적은 정상식이군인 ND군이 109,724.3 nm²였고, ND+JMW400군이 100,836.0 nm²로 유의적 차이는 없었다. 비만대조군인 HD군은 302,347.1 nm²로 내장 지방 세포 면적이 가장 넓었고, HD+JMW200, 400군은 각각 172,173.9 nm², 171,082.8 nm²로 비만대조군보다 유의적으로 감소하였다. 각 시료군 간의 유의적 차이는 없었으며 양성대조군인 HD+HCA군은 228,3943.9 nm²로 HD+JMW200, 400군보다 유의적으로 넓었다.
따라서, 죽엽+모과 추출복합물을 섭취한 군은 내장 지방세포의 크기와 면적을 감소시키는 효과가 있음을 알 수 있었다.
② 갈색 지방세포의 크기와 면적
지방구의 크기를 관찰하기 위하여 동물을 해부한 후 갈색지방의 H&E (hemaoxylin & eosin)염색을 수행하였다. 그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, 실험동물의 갈색 지방세포의 크기는 8주 동안 60% high fat diet를 공급한 군들이 normal diet를 공급한 군에 비해 육안으로 커진 상태를 확인하였고, 비만이 유도되었음을 확인할 수 있었다.
또한, 도 12(A)에 나타낸 바와 같이, 갈색 지방세포의 크기는 정상식이군인 ND군이 155.8 nm였고, ND+JMW400군이 125.5 nm로 유의적으로 그 크기가 감소하였다. 비만대조군인 HD군은 238.2 nm로 크기가 가장 컸고, HD+JMW200, 400군은 각각 138.0 nm, 153.0 nm로 비만대조군보다 유의적으로 감소하였다. 시료첨가군 간의 유의적의 차이는 없었으며, 양성대조군인 HD+HCA군의 크기는 167.7 nm로 HD+JMW200, 400군보다 유의적으로 컸다.
또한, 도 12(B)에 나타낸 바와 같이, 갈색 지방세포의 면적은 정상식이군인 ND군이 19,218.4 nm²였고, ND+JMW400군이 12,594.4 nm²로 유의적으로 감소하였다. 비만대조군인 HD군은 45,019.5 nm²로 갈색 지방세포의 면적이 가장 넓었고, HD+JMW200, 400군은 각각 24,362.4 nm², 26,814.9 nm²로 비만대조군보다 유의적으로 감소하였다. 양성대조군인 HD+HCA군은 27,355.8 nm²로 HD+JMW200, 400군과 유의적인 차이가 없었다.
따라서, 죽엽+모과 추출복합물을 섭취한 군은 갈색 지방세포의 크기와 면적을 감소시키는 효과가 있음을 알 수 있었다.
③ 부고환 지방세포의 크기와 면적
지방구의 크기를 관찰하기 위하여 동물을 해부한 후 부고환 지방세포의 H&E (hemaoxylin & eosin)염색을 수행하였다. 그 결과, 도 13에 나타낸 바와 같이, 실험동물의 부고환 지방세포의 크기는 8주 동안 60% high fat diet를 공급한 군들이 normal diet를 공급한 군에 비해 육안으로 커진 상태를 확인하였고, 비만이 유도되었음을 확인할 수 있었다.
또한, 도 14(A)에 나타낸 바와 같이, 부고환 지방세포의 크기는 정상식이군인 ND군이 498.2 nm였고, ND+JMW400군이 443.2 nm로 유의적으로 감소하였다. 비만대조군인 HD군은 919.3 nm로 크기가 가장 컸고, HD+JMW200, 400군은 각각 679.9 nm, 689.5 nm로 비만군보다 유의적으로 감소하였다. 양성대조군인 HD+HCA군의 크기는 675.6 nm로 HD+JMW200, 400군과 유의적 차이는 없었다.
또한, 도 14(B)에 나타낸 바와 같이, 부고환 지방세포의 면적은 정상식이군인 ND군이 193,683.3 nm²였고, ND+JMW400군이 157,907.5 nm²로 유의적인 차이는 없었다. 비만대조군인 HD군은 678,649.1 nm²로 부고환 지방세포의 면적이 가장 넓었으며, HD+JMW200, 400군은 각각 408,477.2 nm², 416,554.2 nm²로 비만대조군보다 유의적으로 감소하였다. 양성대조군인 HD+HCA군은 377,630.7 nm²로 HD+JMW200, 400군과 유의적인 차이가 없었다.
따라서, 죽엽+모과 추출복합물을 섭취한 군은 부고환 지방세포의 크기와 면적을 감소시키는 효과가 있음을 알 수 있었다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
Claims (10)
- 죽엽 및 모과의 추출 복합물을 유효성분으로 함유하는, 비만의 예방 또는 치료용 약학조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 추출은 물, C1 내지 C4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매를 사용하여 수행된 것임을 특징으로 하는, 비만의 예방 또는 치료용 약학조성물.
- 제 2 항에 있어서, 상기 저급알코올은 에탄올인 것을 특징으로 하는, 비만의 예방 또는 치료용 약학조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 추출 복합물은 죽엽 추출물과 모과 추출물을 1 : 0.1 내지 10의 중량비로 혼합한 것임을 특징으로 하는, 비만의 예방 또는 치료용 약학조성물.
- 제 4 항에 있어서, 상기 중량비는 1: 1인 것을 특징으로 하는, 비만의 예방 또는 치료용 약학조성물.
- 죽엽 및 모과의 추출 복합물을 유효성분으로 함유하는, 비만의 예방 또는 개선용 건강식품 조성물.
- 제 6 항에 있어서, 상기 추출은 물, C1 내지 C4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매를 사용하여 수행된 것임을 특징으로 하는, 비만의 예방 또는 개선용 건강식품 조성물.
- 제 7 항에 있어서, 상기 저급알코올은 에탄올인 것을 특징으로 하는, 비만의 예방 또는 개선용 건강식품 조성물.
- 제 6 항에 있어서, 상기 추출 복합물은 죽엽 추출물과 모과 추출물을 1: 0.1 내지 10의 중량비로 혼합한 것임을 특징으로 하는, 비만의 예방 또는 개선용 건강식품 조성물.
- 제 9 항에 있어서, 상기 중량비는 1: 1인 것을 특징으로 하는, 비만의 예방 또는 개선용 건강식품 조성물.
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