CN116019795A - 莱菔素用于制备抗衰老药物的用途 - Google Patents

莱菔素用于制备抗衰老药物的用途 Download PDF

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CN116019795A CN202310006034.0A CN202310006034A CN116019795A CN 116019795 A CN116019795 A CN 116019795A CN 202310006034 A CN202310006034 A CN 202310006034A CN 116019795 A CN116019795 A CN 116019795A
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袁其朋
张博
郭扬
韩永志
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Abstract

本发明属于生物医药技术领域，涉及莱菔素或其组合物用于制备靶向清除或修复动物机体组织微环境中衰老或损伤细胞的药物的用途。本发明安全、有效地将莱菔素或其组合物用于人体或动物机体抗衰老，可用于预防和治疗与组织细胞损伤有关的疾病，具有疗效确切、不良反应少、病人服药顺应性好等优点。

Description

莱菔素用于制备抗衰老药物的用途
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及莱菔素或其组合物用于制备靶向清除或修复动物机体组织微环境中衰老或损伤细胞的药物的用途。
背景技术
随着全球人口的增加和寿命的延长，老龄化正成为最重要的公共健康问题之一。众所周知，衰老是许多人类疾病的主要危险因素，如癌症、特发性帕金森病、I型和II型糖尿病、心血管疾病和代谢综合征。衰老是一个不可避免的过程，其特征是机体功能能力的进行性损害。衰老与许多器官和系统的形态和生理变化有关，包括免疫系统。越来越多的证据表明氧化应激在衰老过程中起着至关重要的作用。衰老是不可避免地，延缓衰老及预防衰老相关疾病已成为人类面临的重大难题。
细胞衰老往往伴随着细胞永久性的增殖停滞和多种表型的变化。这些变化包括大量生物活性分子的释放，这些分子统称为衰老相关分泌表型(senescence-associatedsecretory phenotype,SASP)。研究表明，衰老和SASP会因细胞和机体代谢状态发生变化，而细胞和机体的衰老状态反过来又驱动了代谢功能障碍相关的表型。衰老细胞和全身代谢之间的相互作用是动态的。衰老细胞会破坏多种组织的代谢稳态，而这些变化反过来又会促进衰老，形成恶性循环，从而导致各种代谢疾病的发生。
近年来研究发现，除SASP之外，衰老细胞的表型还具有显著的可变性、异质性和可塑性。例如，对于大部分衰老细胞来说，生长停滞是由细胞周期蛋白依赖性激酶与细胞周期抑制因子p16INK4a和p21CIP1(由CDKN2A和CDKN1A基因编码)启动和/或强制执行的。同样，其他常用的衰老标志物，例如衰老相关的β-半乳糖苷酶(senescence-associatedβ-galactosidase，SA-β-gal)阳性率的升高，核纤层蛋白lamin B1的表达降低，以及核蛋白HMGB1的分泌和重新定位，也可能只适应于绝大多数而不是全部的衰老细胞。因此，评估特定刺激诱导衰老反应的能力以及评估体内组织中衰老细胞的比例需要使用多种标记物。
莱菔(Raphanus sativus L.)又名萝卜、罗服，属于十字花科，早在《诗经》中就有关于莱菔的记载，其在我国具有悠久的种植历史。萝卜是莱菔素(Sulforaphene，SFE)的重要来源之一，富含多种活性成分，生物碱，芥子硫苷，异硫氰酸酯和黄酮类等。干燥的萝卜种子又称为莱菔子，中药莱菔子在我国已有1400多年用药历史。研究发现，莱菔子提取物富含的活性成分中SFE和莱菔硫烷(Sulforaphane，SFA)的含量较高，其中莱菔素是萝卜籽中主要的异硫氰酸酯类化合物，是一种从莱菔子当中提取出来的天然产物，具有抗菌，抗肿瘤，抗氧化等活性。
发明内容
本发明的目的是提供莱菔素或其组合物用于制备靶向清除或修复动物机体组织微环境中衰老或损伤细胞的药物的用途，以能够安全、有效地将莱菔素或其组合物用于人体或动物机体抗衰老。
为实现此目的，在基础的实施方案中，本发明提供莱菔素或其组合物用于制备靶向清除或修复动物机体组织微环境中衰老或损伤细胞的药物的用途。
在一种优选的实施方案中，本发明提供莱菔素或其组合物用于制备靶向清除或修复动物机体组织微环境中衰老或损伤细胞的药物的用途，其中所述的组合物选自药品、保健品、食品或化妆品。
在一种优选的实施方案中，本发明提供莱菔素或其组合物用于制备靶向清除或修复动物机体组织微环境中衰老或损伤细胞的药物的用途，其中所述的药品为药物制剂，选自片剂、颗粒剂、冲剂、软胶丸、粉剂、软胶囊、口服液、滴丸剂、软膏剂、乳液或注射液(优选软胶囊)。
在一种优选的实施方案中，本发明提供莱菔素或其组合物用于制备靶向清除或修复动物机体组织微环境中衰老或损伤细胞的药物的用途，其中所述的组合物包含植物提取物，所述的植物选自孢子甘蓝、花椰菜、白菜、无头甘蓝、羽衣甘蓝、绿色椰菜芽、芥菜、萝卜、西兰花、辣根中的一种或多种(优选萝卜、西兰花、芥菜、辣根中的一种或多种)。
在一种优选的实施方案中，本发明提供莱菔素或其组合物用于制备靶向清除或修复动物机体组织微环境中衰老或损伤细胞的药物的用途，其中所述的组合物包含辅料。
在一种优选的实施方案中，本发明提供莱菔素或其组合物用于制备靶向清除或修复动物机体组织微环境中衰老或损伤细胞的药物的用途，其中所述的莱菔素或其组合物单独使用或与其他药物联合使用(其他药物例如：NMN、二甲双胍、白藜芦醇、雷帕霉素、α-酮戊二酸、阿卡波糖、达沙替尼、槲皮素、姜黄素、虾青素、熊果苷)。
在一种优选的实施方案中，本发明提供莱菔素或其组合物用于制备靶向清除或修复动物机体组织微环境中衰老或损伤细胞的药物的用途，其中所述的莱菔素在细胞中的用量为0.625-5μM。
在一种优选的实施方案中，本发明提供莱菔素或其组合物用于制备靶向清除或修复动物机体组织微环境中衰老或损伤细胞的药物的用途，其中所述的莱菔素在动物机体中的有效量为10-50mg/kg b.w.。
本发明的有益效果在于，本发明安全、有效地将莱菔素或其组合物用于人体或动物机体抗衰老，可用于预防和治疗与组织细胞损伤有关的疾病，具有疗效确切、不良反应少、病人服药顺应性好等优点。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
(1)本发明发现莱菔素新的医药用途，开拓了一个新的应用领域；
(2)莱菔素作为抗衰老剂可用于食品、药品、药物、化妆品中，能够满足有抗衰老人群的需求；
(3)莱菔素可以通过激素、细胞因子和各种信号传递等调节和各种信号传递等调节和控制机体衰老过程中的代谢网络，具有明显的抗衰老效果，同时具有明显的抗氧化、降血脂、增强机体免疫力等药用保健功能，预示着很好的医用前景；
(4)莱菔素具有稳定体系、不易吸湿解潮的特点，货架期较长；
(5)同时，经过细胞和动物实验发现莱菔素具有显著的抗衰老作用，可用于制备治疗或预防延缓衰老的药物或功能性产品，本发明为寻找延缓衰老的药物或功能性产品提供了新的来源。
抗衰老药物难于成功研发的一个很重要的原因是没有一个完整且创新的理论较好地解释衰老现象和作用机制。基于目前的研究证明，衰老组织微环境的形成和SASP的释放有很大关系。与年轻组织微环境相比，SASP增多和免疫因子的减少会导致机体变得越来越不稳定，SASP一方面可通过多种转录因子和信号通路改变组织微环境，进一步导致衰老恶化；另一方面可通过旁分泌和内分泌方式不断扩大和持续衰老信号，促进组织衰老。因此，如果能够有效的改善组织衰老微环境、阻断SASP介导的衰老信号传递，就可有效抑制衰老的发生。
附图说明
图1为莱菔素对人正常皮肤细胞活性的影响。
图2为二甲双胍对人正常皮肤细胞活性的影响。
图3为过氧化氢对人正常皮肤细胞活性的影响。
图4为莱菔素对氧化损伤皮肤细胞活性的影响。
图5为莱菔素对氧化损伤皮肤细胞凋亡的影响。
图6为莱菔素对氧化损伤皮肤细胞凋亡蛋白酶活性的影响。
图7为莱菔素对氧化损伤皮肤细胞凋亡蛋白及抗凋亡蛋白的影响。
图8为莱菔素对氧化损伤皮肤细胞周期的影响。
图9为莱菔素对氧化损伤皮肤细胞ATP含量的影响。
图10为莱菔素对氧化损伤皮肤细胞内ROS的影响。
图11为莱菔素对氧化损伤皮肤细胞β-半乳糖苷酶活性的影响。
图12为过氧化氢对正常皮肤细胞活性的影响。
图13为莱菔素对D-半乳糖诱导皮肤细胞氧化损伤的影响。
图14为莱菔素对D-半乳糖诱导皮肤细胞凋亡的影响。
图15为莱菔素对D-半乳糖诱导皮肤细胞凋亡蛋白酶活性的影响。
图16为莱菔素对D-半乳糖诱导皮肤细胞凋亡蛋白的影响。
图17为莱菔素对D-半乳糖诱导氧化损伤皮肤细胞周期的影响。
图18为莱菔素对D-半乳糖诱导氧化损伤皮肤细胞ATP含量的影响。
图19为莱菔素对D-半乳糖诱导氧化损伤皮肤细胞内ROS的影响。
图20为莱菔素对D-半乳糖诱导氧化损伤皮肤细胞β-半乳糖苷酶活性的影响。
图21为莱菔素对复制衰老性细胞内ROS的影响。
图22为莱菔素对复制衰老性细胞内β-半乳糖苷酶活性的影响。
图23为莱菔素可有效清除博来霉素诱导的衰老细胞。
图24为莱菔素对黑腹果蝇寿命的影响。
图25为莱菔素对D-半乳糖衰老模型小鼠各组织H&E染色的影响。
图26为莱菔素对D-半乳糖衰老模型小鼠肝功酶活力的影响。
图27为莱菔素对D-半乳糖衰老模型小鼠血脂指标的影响。
图28为莱菔素对D-半乳糖衰老模型小鼠肝组织和肾组织氧化水平指标的影响。
图29为莱菔素对D-半乳糖衰老模型小鼠肝组织和肾组织抗氧化水平指标的影响。
图30为莱菔素对D-半乳糖衰老模型小鼠肝组织和肾组织促炎指标的影响。
图31为莱菔素对D-半乳糖衰老模型小鼠肾组织中抗氧化蛋白表达的影响。
图32为莱菔素对D-半乳糖衰老模型小鼠肾组织中炎症相关蛋白表达的影响。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明的具体实施方式作出进一步的说明。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法和技术，通常按照所属领域的常规条件或按照制造厂商所建议的条件进行。下述实验方法所用的试剂，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到。
莱菔素
莱菔素的英文名称为Sulforaphene；分子式为C6H9NOS2。化学结构式如下式(Ⅰ)：
在本发明中，所述的“莱菔素”可以是纯净形式存在的式(Ⅰ)所示的化合物，或纯度大于95％的式(Ⅰ)所示的化合物。
现有技术中，所示的式(Ⅰ)所示的化合物一般通过实验室制备液相所得，因此其成品是本领域技术人员易于获得的。
本发明的具体实施例中，使用的为莱菔素的单体化合物，例如一个实施例中，在细胞实验中，通过摩尔质量给出了一系列给药方案。
本发明中，也运用了小鼠作为实验动物，从小鼠的给药剂量换算为适用于人类的给药剂量是本领域人员易于作出的，例如可根据人和动物间按体表面积折算等效剂量：例如：人的临床剂量为×mg/kg，换算成大鼠的剂量(6.3×mg/kg)，这也就是说，按单位体重的剂量来算，大鼠的等效剂量相当于人的6.3倍。依次类推，可以算出小鼠、豚鼠等其他动物剂量与人的比值。小鼠的剂量(9.1×mg/kg)、豚鼠的剂量(5.42×mg/kg)、兔的剂量(3.27×mg/kg)、猫的剂量(2.73×mg/kg)、猴的剂量(1.05×mg/kg)、狗的剂量(1.87×mg/kg)。
必要的时候，莱菔素还可以与其他活性成分或药物联合给药，额外抗衰老成分可选：NMN、二甲双胍、白藜芦醇、雷帕霉素、α-酮戊二酸、阿卡波糖、达沙替尼、槲皮素、姜黄素、虾青素、熊果苷。
在一些实施例中，所述药物可以通过下述方式给予：口服、吸入、舌下、直肠、透皮、阴道粘膜、透黏膜、局部或肠道给药；注射给药，如眼内注射、肌肉注射、皮下注射、髓内注射、腹腔内、静脉注射、以及鞘内、原位、关节炎、肝内、病灶内、颅内、鼻腔给药或其他药物递送方式。
本发明通过CCK-8法和β-半乳糖苷酶染色法测得正常组、模型组、莱菔素给药组、二甲双胍阳性药组及单独给药，观察皮肤细胞的细胞活性和细胞衰老情况。细胞活性结果显示，与正常组相比，模型组细胞活性水平显著降低，莱菔素给药组细胞活性显著提高。本发明能够改善经H2O2或D-gal处理后皮肤细胞的活性；细胞衰老情况结果显示，与正常组相比，模型组衰老细胞明显增高，与模型组相比，莱菔素给药组或阳性药组衰老细胞明显降低，说明，莱菔素可有效预防皮肤细胞的衰老。
具体的，本发明通过细胞流式技术、WB法及激光共聚焦成像，说明莱菔素可有效降低细胞凋亡水平、减少细胞内ROS水平，进而降低细胞氧化应激。
具体的，本发明通过果蝇实验发现莱菔素可有效延长果蝇寿命。
具体的，本发明通过莱菔素对D-半乳糖诱导小鼠抗衰老作用研究发现，通过体重、器官指数、H&E染色法，发现经过莱菔素治疗后体重及器官指数有所提高，对各器官无毒副作用。这提示，本发明所述的莱菔素具有延缓衰老的作用。
具体的，所述莱菔素具有降低肝功酶的作用。
具体的，所述莱菔素具有降低血脂水平的作用。
具体的，所述莱菔素具有降低氧化产物(ROS、MDA和4-HNE)水平和升高抗氧化(指标如：T-AOC和SOD、CAT)水平。
本发明通过测定正常组、模型组、莱菔素给药组及阳性药组衰老小鼠肝、肾组织的SASP因子，发现，本发明的莱菔素可显著降低衰老小鼠中SASP因子(IL-1β，IL-6，IFN-γ和TNF-α；CXCL10，MCP-1和MMP-3)的水平。
在实施例中，所述的细胞包括：自然衰老细胞或损伤细胞，较佳地为组织微环境中的损伤细胞，更佳地为氧化剂或化学试剂诱导后的损伤细胞。
在本文使用的术语“预防”是指当用于疾病或病症时，与未给予化合物或药物的受试者相比，所述化合物或药物能降低体内的医学病症症状的频率或推迟其发病。
在本文中使用的术语“治疗”是指减轻、缓解或改善疾病或病症的症状，改善潜在的代谢引起的症状，抑制疾病或症状，例如阻止疾病或病症的发展、缓解疾病或病症、引起疾病或病症的消退、缓解疾病或病症引起的病况、或阻止疾病或病症的症状。
在本文中使用的术语“有效量”是指给予的药物或化合物的足够量(例如，剂量)时，其将在一定程度上减轻被治疗的疾病或病症的一种或多种症状。结果可以是缩小和/或减轻病症或疾病原因或任意其他期望的生物系统的改变。例如，用于治疗用途的“有效量”是提供以使疾病或病症的临床症状显著减轻、而不产生过度的毒副作用的化合物或药物的量。
如本文中使用的术语“剂量”是指每千克(kg)哺乳动物体重的活性物质的重量(例如，毫克(mg)、克(g))。
术语“方法”是指用于完成给定任务的方式、手段、技术或操作，包括(但不限于)药理学、生物学、生物化学和医学领域的从业者已知的那些方式、手段、技术和操作或容易从已知的方式、手段、技术和操作中开发的那些方式、手段、技术和操作。
如本文所使用的衰老清除剂是“选择性地”(优先地或在较大程度上)破坏、杀死、去除或促进选择性破坏衰老细胞的药剂。换言之，与破坏或杀死非衰老细胞的能力相比，衰老清除剂以在生物学上、临床上或统计学上显著的方式破坏或杀死衰老细胞。使用衰老清除剂的量和持续时间足以选择性地杀死实施例中的衰老细胞，在某些实施方案中，本文所述的衰老清除剂以诱导(引发、处罚、激活、促进)和导致衰老细胞死亡的方式改变了至少一种信号传导途径。
另外，治疗和预防的对象并不限定于人，可以为除人以外的哺乳动物(例如小鼠、大鼠、狗、猫)，此外，也可以为牛、马、羊等家畜，猴子、黑猩猩、大猩猩等灵长类等，特别优选为人。
具体的，所述药物的剂型包括片剂、颗粒剂、冲剂、软胶丸、粉剂、软胶囊、口服液、滴丸剂、软膏剂、乳液或注射液，较佳地为软胶囊。
具体的，所述化妆品的剂型包括霜剂、乳剂、面膜剂等。
具体的，所述功能性产品的剂型包括茶剂、饮料、糖浆、饼干类、糖果类或糕点类。
具体的，所述药物或功能性产品还包括药学上可接受的辅料，例如环糊精。
具体的，莱菔素可以被制成药品、保健品或食品的形式。
实施例1：不同种类异硫氰酸酯类化合物对正常皮肤细胞的影响
本发明选用21种不同种类的异硫氰酸酯类化合物，其中包括异硫氰酸丙烯酯、异硫氰酸苄酯、异硫氰酸苯乙酯、异硫氰酸3-甲硫基代丙酯、异硫氰酸甲酯、异硫氰酸乙酯、异硫氰酸异丁酯、异硫氰酸异戊酯、异硫氰酸异丙酯、异硫氰酸3-丁烯酯、异硫氰酸2-丁酯、异硫氰酸戊酯、异硫氰酸3-戊烯酯、异硫氰酸4-丁酯、异硫氰酸4-戊烯酯、异硫氰酸5-己烯酯、异硫氰酸己酯、异硫氰酸5-戊酯、异硫氰酸6-己酯、莱菔素和莱菔硫烷来观察对正常皮肤细胞的作用，从而选取最优的抗衰老成分。
实验方法：人包皮成纤维(Human foreskin fibroblast，HFF)细胞和人永生化角质形成细胞(human immortalized keratinocytes，HaCaT)两株细胞接种于96孔板，每孔的体系为100μL，在检测孔周边每孔放置250μL的PBS溶液，待细胞贴壁后，将制备得到的纯度为95％的莱菔素，用细胞级的DMSO溶解后，过0.22μm滤膜除菌，用含血清的DMEM培养基进行稀释，使最终浓度分别为0.2μM、0.4μM、0.8μM、1.0μM、1.2μM、2.4μM、4.8μM、9.6μM和19.2μM。在细胞按8×10^3密度接种至96孔板培养24h后，换成含不同异硫氰酸酯类化合物浓度的培养液培养细胞24h，空白孔加入培养基。次日，取出96孔板，加入10μL CCK-8溶液，培养箱中孵育3-4h后，终止培养，整个操作过程需避光操作。检测不同浓度的异硫氰酸酯类化合物对细胞活性的影响。利用酶标仪进行检测，在波长450nm处每孔的吸光度值，记录吸光度绘制细胞生长曲线用来计算细胞活性进而计算细胞存活率(％)。每个不同的浓度进行三次重复。
细胞存活率计算公式(2)如下所示：
细胞存活率(％)＝(A加药-A空白)/(A未加药-A空白)×100％式(2)
实验结果：除莱菔素和莱菔硫烷外，其他异硫氰酸酯类化合物不能促进细胞的增殖，且对细胞活性还有一定的抑制作用。相对比莱菔硫烷的增殖率达到120.01±4.46％，而莱菔素的增殖率为150.01±7.46％。所以在后期实验，选取了莱菔素作为主要的研究对象。
实施例2：莱菔素对过氧化氢引起皮肤细胞损伤的保护作用
1、莱菔素对正常皮肤成纤维细胞的影响
实验方法：见上述实施例1(不同种类异硫氰酸酯类化合物对正常皮肤细胞的影响所述方法)
实验结果：结果如图1所示：当莱菔素浓度范围为1.25～5μM时，HFF细胞的活性呈增长趋势，在5μM时细胞活性最大为141.24±7.26％(P<0.001)然而当莱菔素剂量为10μM时细胞活性下降为81.61±8.48％；当莱菔素浓度范围为0.625～2.5μM时，HaCaT细胞的活性呈增长趋势，在2.5μM时细胞活性最大为130.01±6.46％(P<0.001)。然而当莱菔素剂量为5μM时细胞活性下降为106.74±15.50％。因此，综合细胞活性的检测，结果表明在一定浓度范围内莱菔素对人正常皮肤细胞HFF及HaCaT无细胞毒性，可安全地用于研究其对细胞的保护作用。
2、二甲双胍对人正常皮肤细胞的影响
实验方法：将纯度为98％的二甲双胍，用细胞级的DMSO溶解后，过0.22μm滤膜除菌，用含血清的DMEM培养基进行稀释，使二甲双胍最终浓度分别为0.2mM、0.4mM、0.8mM、1mM、2mM、4mM、6mM、8mM和10mM。在细胞按8×10^3密度接种至96孔板培养24h后，换成含不同二甲双胍浓度的培养液培养细胞24h。用CCK-8法来检测二甲双胍对人正常皮肤细胞HFF及HaCaT活性的影响。
实验结果：如图2所示，当二甲双胍浓度为2mM时，HFF及HaCaT细胞的活性最大，然而当二甲双胍浓度为4mM时细胞活性下降，因此选择2mM进行后续实验。
3、H2O2诱导氧化损伤皮肤细胞模型构建
实验方法：如上述检测细胞活性方法一致，次日，取出96孔板，除空白孔外每孔采用H2O2处理细胞3h后，加入10μL CCK-8溶液，培养箱中孵育3-4h后，终止培养，整个操作过程需避光操作。利用酶标仪进行检测，在波长450nm处每孔的吸光度值，记录吸光度绘制细胞生长曲线用来计算细胞活性进而计算细胞存活率(％)。每个不同的浓度进行三次重复。
实验结果：如图3所示，终浓度为50、100、200、300、400、500μM的H2O2处理组与对照组相比，细胞存活率随着H2O2浓度的升高逐渐降低，并呈浓度依赖性。其中100μM浓度组的细胞存活率分别为68.64±1.55％、66.37±4.11％。文献报道体外药物模拟氧化损伤的细胞模型，其损伤程度通常控制在细胞存活率下降30％～50％。因此，选择100μM的H2O2处理3h作为构建皮肤细胞氧化损伤模型的适宜条件。
4、莱菔素对氧化损伤皮肤细胞活性的影响
实验方法：见上述实施例1的相应部分(不同种类异硫氰酸酯类化合物对正常皮肤细胞的影响所述方法)。
实验结果：本研究用不同浓度的莱菔素(1.25μM、2.5μM和5μM；0.625μM、1.25μM和2.5μM)预处理HFF及HaCaT细胞24h，以二甲双胍作为阳性对照，观察其对氧化损伤皮肤细胞模型的保护作用。首先采用CCK-8法检测不同浓度莱菔素对氧化损伤皮肤细胞活性的影响。
如图4所示：氧化损伤模型组的皮肤细胞活性与正常对照组相比明显下降；而与模型对照组相比，莱菔素预处理组的细胞活性显著升高(P<0.05，P<0.01，P<0.001)，并呈浓度依赖性。5μM(HFF细胞)和2.5μM(HaCaT细胞)的莱菔素预处理组与其它浓度组相比皮肤细胞活性最高。单独添加莱菔素及二甲双胍都有效的促进了细胞增殖。综合以上结果说明，莱菔素可有效预防氧化损伤，免受氧化物的攻击。
5、莱菔素对氧化损伤皮肤细胞凋亡的影响
实验方法：本发明采用Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(碧云天生物技术有限公司)，具体操作步骤见说明书。
实验结果：采用Annexin V/PI染色检测不同浓度莱菔素对氧化损伤皮肤成纤维细胞(HFF)凋亡的影响。如图5-1所示：氧化损伤模型组的皮肤成纤维细胞凋亡率为16.60±1.40％，与正常对照组相比显著升高(P<0.001)，而与模型对照组相比，莱菔素预处理组的细胞凋亡率随莱菔素浓度的升高而逐渐降低。其中5μM的莱菔素预处理组与其它浓度组相比皮肤成纤维细胞凋亡率最低，能够将氧化损伤的纤维细胞凋亡率降低到7.84±1.75％。单独添加莱菔素组的细胞凋亡率5.70±1.33％；2mM的二甲双胍阳性对照组的细胞凋亡率为10.81±0.96％，相比莱菔素预处理组降低较少，都能有效的降低氧化损伤皮肤成纤维细胞的凋亡。单独添加二甲双胍时，细胞凋亡率为8.21±0.41％。
继续检测不同浓度莱菔素对氧化损伤皮肤细胞(HaCaT)凋亡的影响。结果如图5-2所示，氧化损伤模型组的皮肤细胞凋亡率为18.11±0.98％，与正常对照组相比显著升高(P<0.001)，而与模型对照组相比，莱菔素预处理组的细胞凋亡率随莱菔素浓度的升高而逐渐降低。其中2.5μM的莱菔素预处理组与其它浓度组相比皮肤细胞凋亡率最低，能够将氧化损伤的皮肤细胞凋亡率降低到8.78±0.39％。单独添加莱菔素组的细胞凋亡率5.34±1.10％；2mM的二甲双胍阳性对照组的细胞凋亡率为10.45±1.27％，相比莱菔素预处理组降低较少，都能有效的降低氧化损伤皮肤细胞的凋亡。单独添加二甲双胍时，细胞凋亡率为5.53±0.82％。
6、莱菔素对氧化损伤皮肤细胞凋亡蛋白酶活性的影响
实验方法：本发明采用Caspase 3/9活性检测试剂盒(碧云天生物技术有限公司)，具体操作步骤见说明书。
实验结果：本实验采用碧云天试剂盒对氧化损伤皮肤成纤维细胞(HFF)中Caspase-3和Caspase-9的活性进行检测。结果如图6-1所示，氧化损伤模型组细胞的Caspase-3和Caspase-9活性表达水平相较于正常对照组显著升高(P<0.001)，而莱菔素预处理组细胞的两种蛋白的活性表达水平逐渐降低，呈现浓度依赖性。其中5μM的莱菔素预处理组，相较氧化损伤模型组的活性表达分别降低至1.23±0.02％和1.21±0.06％，具有显著性差异(P<0.001；P<0.01)。二甲双胍阳性药处理组相对于氧化损伤模型组的活性表达分别降低至1.27±0.23％和1.25±0.04％，具有显著性差异(P<0.001；P<0.01)。综合分析，莱菔素和二甲双胍都可有效降低氧化损伤皮肤成纤维细胞中Caspase-3和Caspase-9两种蛋白的活性。
随后，对氧化损伤角质层细胞(HaCaT)中Caspase-3和Caspase-9的活性进行检测。结果如图6-2所示，氧化损伤模型组细胞的Caspase-3和Caspase-9活性表达水平相较于正常对照组显著升高(P<0.001)，而莱菔素预处理组细胞的两种蛋白的活性表达水平逐渐降低，呈现浓度依赖性。其中2.5μM的莱菔素预处理组，相较氧化损伤模型组的活性表达分别降低至1.38±0.09％和1.19±0.10％，具有显著性差异(P<0.01)。二甲双胍阳性药处理组相对于氧化损伤模型组的活性表达分别降低至1.32±0.09％和1.25±0.02％，具有显著性差异(P<0.01；P<0.001)。综合分析，莱菔素和二甲双胍都可有效降低氧化损伤皮肤细胞中Caspase-3和Caspase-9两种蛋白的活性。
7、莱菔素对氧化损伤皮肤细胞凋亡蛋白的影响
实验方法：细胞总蛋白提取：吸去6孔板中的培养液，用PBS缓冲液冲洗一遍，加入胰酶。收集细胞于离心管中，4000r/min离心5min，弃上清液，重复以上操作两次，尽量吸净上清液；随后加入RIPA裂解液和PMSF溶液，混匀，用移液枪轻轻吹打5min，在冰上静置30min；每管样本放在冰上超声波破碎，超声5sec，间隔20sec，重复5次，使细胞充分裂解，超声结束后置于冰上30min；4℃离心，12000r/min，5min，取上清液；采用BCA法测定总蛋白含量，加入5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，98℃下金属浴5min，瞬时离心后分装，并置于-80℃保存。
小鼠肾脏总蛋白提取：从-80℃冰箱取出组织(0.1g)置于冰上，在离心管中加入研磨珠(6-8颗)、RIPA缓冲液(400μL)；采用组织破碎仪提取总蛋白，然后处理条件为2-3档，10sec一次，待组织破碎后，冰上静置30min，4500r/min离心10min，取上清液。BCA法测定蛋白浓度，其余步骤按上述操作。
SDS-PAGE电泳
配胶与上样：根据实验需要，根据说明书步骤，配制分离胶和浓缩胶。将配好的胶固定在电泳槽中，加满1×电泳缓冲液。从-80℃取出样品置于冰上，上样前将样品于金属浴中98℃，5min。将凝胶上的梳子轻轻拔出后依次加入适量的蛋白样品，左右两边各加入Marker 3μL和5μL，用16SDS-PAGE蛋白上样缓冲液补齐到每孔15μL。盖上盖子，接通电源，电泳时间一般40min，调节恒压为80V，待电泳跑到分离胶部分可调节恒压为120V，时间为100min。当蛋白缓冲液到电泳槽最底端时停止电泳。
转膜：取下电泳后的凝胶，将玻璃板撬开，取出凝胶，将浓缩胶轻轻刮去，去掉多余的分离胶。将配制的1×转膜缓冲液，4℃冰箱冷却备用。根据目的蛋白的位置裁剪胶，将其浸泡1×转膜缓冲液中，根据凝胶大小，剪出一张PVDF膜，随后将PVDF膜浸过甲醇中，5min左右，将滤纸在转膜前20min放入1×转膜缓冲液中待用。将滤纸、凝胶和PVDF膜依次放在转膜仪里，注意操作过程中滤纸、凝胶和膜之间不要有气泡，否则会影响转膜效果。接通电源，100mA恒流转膜，转膜时间1.5h左右。
封闭：转膜结束后将PVDF膜放在封闭液，室温下水平摇床封闭1h。
抗体结合免疫反应：封闭结束后，将PVDF膜取出，用1×TBST缓冲液漂洗5min。将PVDF膜放置在盛有一抗封闭液的孵育盒中，4℃孵育过夜。次日，PVDF膜用1×TBST缓冲液漂洗三次，每次15min。随后将漂洗的PVDF膜放入二抗稀释液中，室温下孵育1.5h后，用1×TBST缓冲液漂洗三次，每次15min，漂洗的过程均在室温条件下进行。
蛋白条带检测：将A和B两种试剂在保鲜膜上等体积混合；1min后，将膜蛋白面朝下与此混合液充分接触；1min后，将膜移至另一保鲜膜上，去尽残液，包好，放入X-光片夹中。在暗室中，将1×显影液和定影液分别到入塑料盘中；在红灯下取出X－光片，用切纸刀剪裁适当大小(比膜的长和宽均需大1cm)；打开X-光片夹，把X－光片放在膜上，一旦放上，便不能移动，关上X-光片夹，开始计时；根据信号的强弱适当调整曝光时间，一般为1min或5min，也可选择不同时间多次压片，以达最佳效果；曝光完成后，打开X-光片夹，取出X-光片，迅速浸入显影液中显影，待出现明显条带后，即刻终止显影。用Image软件分析目标带的分子量和净光密度值。
实验结果：本发明采用Western Blot法分析凋亡相关蛋白的表达水平，其中包括Caspase-9、Cleaved caspase-9、Caspase-3、Cleaved caspase-3、Bcl-2、Bax及Bcl-xl，用来分析莱菔素对氧化损伤皮肤细胞的保护作用。结果如图7-1及7-2所示。与对照组相比经过H2O2处理后会导致胞质中Caspase-9和Cleaved caspase-9的积累(P<0.001，P<0.001)。而莱菔素预处理后蛋白表达水平逐渐下降，其中高剂量组(5μM和2.5μM莱菔素)有明显地缓解(P<0.001，P<0.001)。随后检测Caspase-3和Cleaved caspase-3的蛋白表达水平，结果发现，与对照组相比，经H2O2处理后显著增加了皮肤细胞中Cleaved caspase-3蛋白的活化(P<0.001，P<0.001)。莱菔素预处理后显著下调Cleaved caspase-3的蛋白表达水平。同时，检测Bcl-2家族成员中Bax、Bcl-2的表达情况，莱菔素预处理组细胞的Bax与Bcl-2比值相较氧化损伤模型组显著降低(P<0.001，P<0.001)，并呈浓度依赖性。综上所述，莱菔素可抑制H2O2诱导的ROS生成，减少凋亡前因子释放，降低Caspase-9、Cleaved caspase-9、Caspase-3和Cleaved caspase-3蛋白表达水平，降低Bax/Bcl-2，增加Bcl-xl蛋白水平，进而稳定线粒体膜电位。从而抑制细胞凋亡的发生并通过抑制凋亡信号通路保护细胞免受细胞毒性。
8、莱菔素对氧化损伤皮肤细胞周期的影响
实验方法：本发明采用的周期试剂盒为凯基生物(KGA512)。主要步骤：1).用适当的方法诱导细胞凋亡，同时设立阴性对照组，并收集细胞；2).用PBS洗涤细胞一次(离心2000rpm，5min)收集并调整细胞浓度为1×10^6/ml，取1ml单细胞悬液；3).制备的单细胞悬液离心后，去除上清，在细胞中加入体积分数为70％冷乙醇500ul固定(2小时至过夜)，4℃保存，染色前用PBS洗去固定液；(如需要，细胞悬液用200目筛网过滤一次)；4).加100μLRNaseA37℃水浴30min；5).再加入400μLPI染色混匀，4℃避光30min；6).上机检测，记录激发波长488nm处红色荧光。
实验结果：衰老细胞同样拥有一些共同特点，主要表现在细胞增殖抑制、细胞周期阻滞、β-半乳糖苷酶活性增高等细胞功能的一系列变化。细胞周期蛋白(eyelin)E和周期蛋白依赖性激酶(CDK)2的复合物CyclinE-CDK2为细胞从G1期进入S期的关键激酶复合物，在细胞从G1期进入S期过程中起着至关重要的作用。利用流式细胞术检测氧化损伤对皮肤细胞周期的影响(左：HFF细胞；右：HaCaT细胞)。结果如图8所示，细胞暴露在氧化剂H2O2后，纤维细胞中G1期细胞百分比显著降低，而S期的比例较大(P<0.001)。而与模型对照组相比，莱菔素预处理组的细胞S期，随莱菔素浓度的升高而逐渐降低。同时，阳性药物二甲双胍组也有效降低S期比例。
9、莱菔素对氧化损伤皮肤细胞ATP含量的影响
实验方法：本发明采用碧云天生物技术公司生产的ATP检测试剂盒，具体操作步骤见说明书。
氧化应激可破坏氧化还原稳态，触发异常线粒体ROS信号，诱发线粒体功能障碍。功能失调的线粒体表现为线粒体膜电位丧失，ATP生成不足，细胞色素c释放到细胞质中。线粒体是ATP合成的主要场所，ATP是由线粒体膜内的三羧酸循环(TCA)和氧化磷酸化(OXPHOS)产生。中枢神经系统的能量代谢非常高，以维持各种神经元活动所需的高三磷酸腺苷(ATP)，而这些能量主要由线粒体电子传递链(ETC)产生。ETC活性受损是产生更多自由电子的主要来源，这些电子产生氧自由基。多项证据表明，线粒体在衰老过程中发挥重要作用。线粒体是细胞内活性氧(ROS)产生的主要部位，也是ATP的主要来源。
实验结果：为明确莱菔素对细胞能量代谢的影响，用不同浓度的莱菔素(1.25μM、2.5μM和5μM；0.625μM、1.25μM和2.5μM)预处理HFF及HaCaT细胞24h。随后，在氧化损伤组加入诱导剂，检测对氧化损伤皮肤细胞中ATP水平的变化，结果如图9所示，氧化损伤模型组的皮肤细胞活性与正常对照组相比明显下降(P<0.001)；莱菔素组以剂量依赖的方式增加ATP水平(P<0.001)。二甲双胍阳性药物组也不同程度的缓解了氧化损伤皮肤细胞中ATP的水平(P<0.001)。为了进一步解释莱菔素是否调控ATP水平，本发明人用莱菔素(5μM和2.5μM)处理皮肤细胞，然后使用化学发光仪检测ATP的表达水平。可以提高皮肤细胞中ATP的表达水平。
10、莱菔素对氧化损伤皮肤细胞内ROS的影响
实验方法：将细胞接种于6孔板中，按照上述操作步骤，在37℃、5％ CO2条件下培养。将DCFH-DA探针加到无血清的培养基中，按照1:1000比例稀释DCFH-DA(终浓度为10μM)。去除检测孔中的培养液后，加入适当体积并已经稀释好的DCFH-DA溶液，加入的体积以能充分盖住细胞为宜，37℃避光孵育30-60min。随后在荧光显微镜下用于分析拍照。
实验结果：为了探讨莱菔素对氧化损伤皮肤细胞的保护作用，本发明用不同浓度莱菔预处理细胞24h后，采用DCFH-DA荧光探针测定细胞内ROS水平。结果如图10所示，与对照组相比，H2O2处理的皮肤细胞内ROS的绿色荧光强度明显增强。然而，当用不同浓度的莱菔素预处理后，细胞内ROS水平显著下降，以剂量依赖的方式。5μM(HFF，上)和2.5μM(HaCaT，下)的莱菔素显示出最高的ROS清除活性，阳性药组能够恢复到正常水平，单独添加莱菔素不会造成细胞内ROS升高。结果表明，莱菔素能够抑制H2O2诱导的细胞内ROS的产生，减少细胞内氧化应激的产生，保护皮肤细胞免受损伤。
11、莱菔素对氧化损伤皮肤细胞β-半乳糖苷酶活性的影响
实验方法：本发明采用碧云天生物技术公司生产的细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒(C0602)，具体操作步骤见说明书。
实验结果：本发明采用β-半乳糖苷酶染色鉴定衰老，SA-β-Gal染色如图11所示，与对照组相比，H2O2处理的皮肤细胞内SA-β-Gal阳性细胞数明显增多，然而，当用不同浓度的莱菔素预处理后，细胞内ROS水平显著下降，以剂量依赖的方式。阳性药组能够恢复到正常水平。
实施例3：莱菔素对D-半乳糖引起皮肤细胞损伤的保护作用
1、D-半乳糖诱导氧化损伤皮肤细胞模型构建
D-半乳糖是体内正常的还原糖。在正常水平下，通常由半乳糖-1-磷酸尿苷转移酶和半乳糖激酶转化为葡萄糖。D-半乳糖可在正常浓度下代谢。但在高水平时，它可以在半乳糖氧化酶的催化下转化为醛糖和过氧化氢，从而产生超氧阴离子和氧衍生自由基(OFR)，损害大分子和细胞。高剂量的D-半乳糖可引起晚期糖基化终末产物(AGEs)的积累，导致渗透应激、活性氧的产生，进而导致生物体组织中的氧化应激和细胞衰老。
实验方法：见实施例1的相应部分(不同种类异硫氰酸酯类化合物对正常皮肤细胞的影响所述方法)。
实验结果：本研究以人正常纤维细胞HFF及HaCaT为基础，构建D-gal诱导的HFF及HaCaT皮肤细胞氧化损伤模型。采用CCK-8法检测不同浓度的D-半乳糖作用于HFF细胞24h和48h后，对HFF细胞活性的影响。如图12-1所示，终浓度为10、20、30、40、50和60mg/mL的D-半乳糖处理组与对照组相比，细胞存活率随着D-gal浓度的升高逐渐降低，并呈浓度依赖性。处理24h后，50mg/mL的D-半乳糖处理组可以降低细胞活性。为了进一步诱导氧化应激，在48h后，采用CCK-8法检测不同浓度的D-半乳糖处理后细胞的存活率，50mg/mL的D-gal细胞存活率为51.16±2.63％。因此，选择50mg/mL的D-半乳糖处理48h作为构建皮肤细胞氧化损伤模型的适宜条件。
随后，构建D-半乳糖诱导的HaCaT皮肤角质层细胞氧化损伤模型。采用CCK-8法检测不同浓度的D-半乳糖作用于HaCaT细胞24h和48h后，对HaCaT细胞活性的影响。如图12-2所示，终浓度为10、20、30、40、50和60mg/mL的D-半乳糖处理组与对照组相比，细胞存活率随着D-gal浓度的升高逐渐降低，并呈浓度依赖性。处理24h后，40mg/mL的D-半乳糖处理组可以降低细胞活性。为了进一步诱导氧化应激，在48h后，采用CCK-8法检测不同浓度的D-半乳糖处理后细胞的存活率，40mg/mL的D-半乳糖细胞存活率为50.46±2.71％。因此，选择40mg/mL的D-半乳糖处理48h作为构建皮肤细胞氧化损伤模型的适宜条件。
2、莱菔素对D-半乳糖诱导皮肤细胞氧化损伤的影响
实验方法：见实施例1的相应部分(不同种类异硫氰酸酯类化合物对正常皮肤细胞的影响所述方法)。
实验结果：建立D-半乳糖致体外培养的人皮肤细胞(HFF及HaCaT)损伤模型，为研究皮肤衰老等提供实验依据。本研究用不同浓度的莱菔素(1.25μM、2.5μM和5μM；0.625μM、1.25μM和2.5μM)预处理，随后加入不同浓度的D-半乳糖。以二甲双胍作为阳性对照，观察其对氧化损伤皮肤细胞模型的保护作用。首先采用CCK-8法检测不同浓度莱菔素对氧化损伤皮肤细胞活性的影响。如图13所示：氧化损伤模型组的皮肤细胞活性与正常对照组相比明显下降；而与模型对照组相比，莱菔素预处理组的细胞活性显著升高(P<0.05，P<0.001)，并呈浓度依赖性。5μM(HFF细胞)和2.5μM(HaCaT细胞)的莱菔素预处理组与其它浓度组相比皮肤细胞活性最高。单独添加莱菔素及二甲双胍都有效的促进了细胞增殖。
3、莱菔素对D-半乳糖诱导皮肤细胞凋亡的影响
实验方法：见实施例2的相应部分(5、莱菔素对氧化损伤皮肤细胞凋亡的影响所述方法)。
实验结果：采用Annexin V/PI染色检测不同浓度莱菔素对氧化损伤皮肤成纤维细胞(HFF)凋亡的影响。如图14-1所示：氧化损伤模型组的皮肤成纤维细胞凋亡率为22.57±1.04％，与正常对照组相比显著升高(P<0.001)，而与模型对照组相比，莱菔素预处理组的细胞凋亡率随莱菔素浓度的升高而逐渐降低。其中5μM的莱菔素预处理组与其它浓度组相比皮肤成纤维细胞凋亡率最低，能够将氧化损伤的纤维细胞凋亡率降低到9.84±0.97％。单独添加莱菔素组的细胞凋亡率5.47±1.32％；2mM的二甲双胍阳性对照组的细胞凋亡率为15.15±1.97％，相比莱菔素预处理组降低较少，都能有效的降低氧化损伤皮肤成纤维细胞的凋亡。单独添加二甲双胍时，细胞凋亡率为7.53±0.69％。
继续检测不同浓度莱菔素对氧化损伤皮肤角质层细胞(HaCaT)凋亡的影响。如图14-2所示：氧化损伤模型组的皮肤细胞凋亡率为29.69±1.45％，与正常对照组相比显著升高(P<0.001)，而与模型对照组相比，莱菔素预处理组的细胞凋亡率随莱菔素浓度的升高而逐渐降低。其中2.5μM的莱菔素预处理组与其它浓度组相比皮肤细胞凋亡率最低，能够将氧化损伤的皮肤细胞凋亡率降低到10.69±1.54％。单独添加莱菔素组的细胞凋亡率5.33±0.31％；2mM的二甲双胍阳性对照组的细胞凋亡率为11.90±0.85％，相比莱菔素预处理组降低较少，都能有效的降低氧化损伤皮肤细胞的凋亡。单独添加二甲双胍时，细胞凋亡率为6.74±0.36％。
4、莱菔素对D-半乳糖诱导皮肤细胞凋亡蛋白酶活性的影响
实验方法：见实施例2的相应部分(6、莱菔素对氧化损伤皮肤细胞凋亡蛋白酶活性的影响所述方法)。
实验结果：本实验采用碧云天试剂盒对D-半乳糖诱导氧化损伤皮肤成纤维细胞(HFF)中Caspase-3和Caspase-9的活性进行检测。结果如图15-1所示，氧化损伤模型组细胞的Caspase-3和Caspase-9活性表达水平相较于正常对照组显著升高(P<0.001)，而莱菔素预处理组细胞的两种蛋白的活性表达水平逐渐降低，呈现浓度依赖性。其中5μM的莱菔素预处理组，相较氧化损伤模型组的活性表达分别降低至1.06±0.18％和0.92±0.52％，具有显著性差异(P<0.001)。二甲双胍阳性药处理组相对于氧化损伤模型组的活性表达分别降低至1.04±0.23％和0.91±0.11％，具有显著性差异(P<0.001)。综合分析，莱菔素和二甲双胍都可有效降低氧化损伤皮肤成纤维细胞中Caspase-3和Caspase-9两种蛋白的活性。
随后，对D-半乳糖诱导氧化损伤角质层细胞(HaCaT)中Caspase-3和Caspase-9的活性进行检测。结果如图15-2所示，氧化损伤模型组细胞的Caspase-3和Caspase-9活性表达水平相较于正常对照组显著升高(P<0.001)，而莱菔素预处理组细胞的两种蛋白的活性表达水平逐渐降低，呈现浓度依赖性。其中2.5μM的莱菔素预处理组，相较氧化损伤模型组的活性表达分别降低至1.56±0.10％和1.86±0.11％，具有显著性差异(P<0.05，P<0.001)。二甲双胍阳性药处理组相对于氧化损伤模型组的活性表达分别降低至1.40±0.16％和1.99±0.13％，具有显著性差异(P<0.01；P<0.001)。综合分析，莱菔素和二甲双胍都可有效降低D-半乳糖诱导氧化损伤皮肤细胞中Caspase-3和Caspase-9两种蛋白的活性。
5、莱菔素对D-gal诱导皮肤细胞凋亡蛋白的影响
实验方法：见实施例2的相应部分(7、莱菔素对氧化损伤皮肤细胞凋亡蛋白的影响所述方法)。
实验结果：本发明采用Western Blot法分析凋亡相关蛋白的表达水平，其中包括Caspase-9、Cleaved caspase-9、Caspase-3、Cleaved caspase-3、Bcl-2、Bax及Bcl-xl，用来分析莱菔素对氧化损伤皮肤细胞的保护作用。结果如图16-1及16-2所示。与对照组相比经过D-gal处理后会导致胞质中Caspase-9和Cleaved caspase-9的积累(P<0.001，P<0.001)。而莱菔素预处理后蛋白表达水平逐渐下降，其中高剂量组(5μM和2.5μM莱菔素)有明显地缓解(P<0.001，P<0.001)。随后检测Caspase-3和Cleaved caspase-3的蛋白表达水平，结果发现，与对照组相比，经D-半乳糖处理后显著增加了皮肤细胞中Cleaved caspase-3蛋白的活化(P<0.001，P<0.001)。莱菔素预处理后显著下调Cleaved caspase-3的蛋白表达水平。同时，检测Bcl-2家族成员中Bax、Bcl-2的表达情况，莱菔素预处理组细胞的Bax与Bcl-2比值相较氧化损伤模型组显著降低(P<0.001，P<0.001)，并呈浓度依赖性。综上所述，莱菔素可抑制D-半乳糖诱导的ROS生成，减少凋亡前因子释放，降低Caspase-9、Cleavedcaspase-9、Caspase-3和Cleaved caspase-3蛋白表达水平，降低Bax/Bcl-2，增加Bcl-xl蛋白水平，进而稳定线粒体膜电位。从而抑制细胞凋亡的发生并通过抑制凋亡信号通路保护细胞免受细胞毒性。
6、莱菔素对D-半乳糖诱导氧化损伤皮肤细胞周期的影响
实验方法：见实施例2的相应部分(8、莱菔素对氧化损伤皮肤细胞周期的影响所述方法)。
实验结果：细胞周期是细胞生命活动的基本过程，细胞在周期时相的变迁中进入增殖，分化，衰老和死亡等生理状态。细胞周期运转是十分有序的，沿着G1期→S期→G2期→M期的顺序进行。衰老阻滞主要发生在细胞周期的G1期，有别于G0阻滞(G0-arrested)的休眠细胞。利用流式细胞术检测D-gal诱导氧化损伤对皮肤细胞周期的影响(左：HFF细胞；右：HaCaT细胞)。结果如图17所示，细胞暴露在氧化剂D-半乳糖后，纤维细胞中G1期细胞百分比显著增多(P<0.001)，而S期的比例较小。而与模型对照组相比，莱菔素预处理组的细胞G1期随莱菔素浓度的升高而逐渐降低。同时，阳性药物二甲双胍组也有效降低G1期比例。
7、莱菔素对D-半乳糖诱导氧化损伤皮肤细胞ATP含量的影响
实验方法：见实施例2的相应部分(9、莱菔素对氧化损伤皮肤细胞ATP含量的影响所述方法)。
实验结果：线粒体作为细胞的能源中心，在产生ATP的同时也产生氧自由基，提高细胞的氧化应激水平，从而在细胞衰老中发挥重要作用。为探究莱菔素对细胞能量代谢的影响，用不同浓度的莱菔素(1.25μM、2.5μM和5μM；0.625μM、1.25μM和2.5μM)预处理HFF及HaCaT细胞24h。随后，在氧化损伤组加入诱导剂，检测对D-半乳糖诱导氧化损伤皮肤细胞中ATP水平的变化，结果如图18所示，氧化损伤模型组的皮肤细胞活性与正常对照组相比明显下降(P<0.001)；莱菔素组以剂量依赖的方式增加ATP水平(P<0.05，P<0.01，P<0.001)。二甲双胍阳性药物组也不同程度的缓解了氧化损伤皮肤成纤维细胞中ATP的水平(P<0.001)。
8、莱菔素对D-半乳糖诱导氧化损伤皮肤细胞内ROS的影响
实验方法：见实施例2的相应部分(10、莱菔素对氧化损伤皮肤细胞内ROS的影响所述方法)。
实验结果：为了探讨莱菔素对D-半乳糖诱导氧化损伤皮肤细胞的保护作用，本发明用不同浓度莱菔预处理细胞24h后，采用DCFH-DA荧光探针测定细胞内ROS水平。结果如图19所示，与对照组相比，D-半乳糖处理的皮肤细胞内ROS的绿色荧光强度明显增强。然而，当用不同浓度的莱菔素预处理后，细胞内ROS水平显著下降，以剂量依赖的方式。5μM(HFF，上)和2.5μM(HaCaT，下)的莱菔素显示出最高的ROS清除活性，阳性药组能够恢复到正常水平，单独添加莱菔素不会造成细胞内ROS升高。结果表明，莱菔素能够抑制D-半乳糖诱导的细胞内ROS的产生，减少细胞内氧化应激的产生，保护皮肤细胞免受损伤。
9、莱菔素对D-半乳糖诱导氧化损伤皮肤细胞β-半乳糖苷酶活性的影响
实验方法：见实施例2的相应部分(11、莱菔素对氧化损伤皮肤细胞β-半乳糖苷酶活性的影响所述方法)。
实验结果：本发明采用β-半乳糖苷酶染色鉴定衰老，SA-β-Gal染色如图20所示，与对照组相比，D-半乳糖处理的皮肤细胞内SA-β-Gal阳性细胞数明显增多，然而，当用不同浓度的莱菔素预处理后，细胞内ROS水平显著下降，以剂量依赖的方式。阳性药组能够恢复到正常水平。
实施例4：莱菔素对复制性衰老引起细胞损伤的保护作用
1、莱菔素对复制衰老性细胞内ROS的影响
实验方法：见实施例2的相应部分(10、莱菔素对氧化损伤皮肤细胞内ROS的影响所述方法)。
实验结果：结果如图21所示，与对照组(第10代细胞)相比，复制性衰老细胞(第29代)内ROS的绿色荧光强度明显增强。然而，当用5μM(HFF，上)和2.5μM(HaCaT，下)莱菔素随着细胞不断进行传代后，细胞内ROS水平显著下降。5μM和2.5μM的莱菔素显示出最高的ROS清除活性，阳性药组基本能够恢复到正常水平，单独添加莱菔素不会造成细胞内ROS升高。结果表明，莱菔素能够抑制复制性衰老细胞内ROS的产生，减少细胞内氧化应激的产生，保护皮肤细胞免受损伤。
2、莱菔素对复制衰老性细胞内β-半乳糖苷酶活性的影响
实验方法：见实施例2的相应部分(11、莱菔素对氧化损伤皮肤细胞β-半乳糖苷酶活性的影响所述方法)。
实验结果：结果如图22所示，与对照组(第10代细胞)相比，复制性衰老细胞(第29代)内SA-β-Gal阳性细胞数明显增多，然而，当用5μM(HFF，上)和2.5μM(HaCaT，下)莱菔素随着细胞不断进行传代后，细胞内SA-β-Gal水平显著下降。阳性药组能够恢复到正常水平。
实施例5：莱菔素有效清除衰老细胞
莱菔素可有效清除博来霉素诱导的衰老细胞
实验方法：见实施例1的相应部分(不同种类异硫氰酸酯类化合物对正常皮肤细胞的影响所述方法)。
实验结果：采用Annexin V/PI染色检测浓度莱菔素对博来霉素氧化损伤皮肤成纤维细胞(HFF)和角质层细胞(HaCaT)凋亡的影响。结果如图23所示，用50μg/m L的博来霉素处理细胞24h建立细胞衰老模型。在显微镜下可观察到细胞凋亡情况，说明造模成功。随后，加入5μM(HFF，左)莱菔素可以使细胞的凋亡率从20.06±0.97％增加到59.46±1.97％(P<0.001)；2.5μM(HaCaT，右)莱菔素可以使细胞的凋亡率从10.61±0.27％增加到30.57±1.17％(P<0.001)。说明莱菔素可有效清除衰老细胞。
实施例6：莱菔素延长果蝇寿命
莱菔素对黑腹果蝇寿命的影响
实验方法：选取未交配的野生型黑腹果蝇，随机分成5组，每组300只，其中1组为对照组，另外4组为试验组。果蝇食物的配制按照之前实验室方法进行。随后，配制不同浓度的莱菔素，对照组采用3％蔗糖水+0.5％ DMSO；实验组分别为3％蔗糖水+5μg/mL莱菔素、3％蔗糖水+10μg/mL莱菔素、3％蔗糖水+15μg/mL莱菔素、3％蔗糖水+20μg/mL莱菔素。喂药时，将果蝇放置空管中，管中含不同浓度药的滤纸片，滴加体积为200μL，使其充分浸透入食物表面，待6h结束后，再将果蝇转移至对应的含食物的管中。饲养在温度为25±1℃、湿度为65％的环境中，交替12h的光、暗恒温恒湿培养箱内培养，每2d更换新鲜培养基并记录果蝇死亡状况，直至全部死亡。
实验结果：结果如图24所示，莱菔素可以有效延长雄性果蝇的整体寿命(延长10天)，其平均寿命也显著提高，说明莱菔素是一种含有抗衰老成分的天然产物，具有显著的抗衰老作用。
实施例7：莱菔素对D-半乳糖诱导衰老小鼠的免疫调节作用
1、莱菔素对D-半乳糖衰老模型小鼠体重的影响
D-半乳糖处理的小鼠模型用于衰老研究，因为D-半乳糖诱导行为损伤、ROS产生、降低抗氧化酶活性和免疫反应，与正常衰老过程类似。D-半乳糖致衰老小鼠体内自由基水平升高，抗氧化酶活性下降。目前，应用最多的是D-半乳糖所致的亚急性衰老模型，它可引起心、肝、肾、脑等重要器官的代谢异常，类似人类自然衰老时的表现。
实验方法：将购买的5-6周龄的C57BL/6J小鼠适应一周喂养后，随机分为6组，具体分组如下：
组I(GroupⅠ)：正常对照组，给予生理盐水。
组II(GroupⅡ)：模型组，实验开始前两周采用皮下注射的方式，连续注射D-半乳糖，剂量为(300mg/kg b.w.)；第3-6周时，D-半乳糖剂量为(500mg/kg b.w.)；最后两周更换D-半乳糖剂量(800mg/kg b.w.)，以此建立衰老小鼠模型。
组III(GroupⅢ)：莱菔素低剂量组，在给予D-半乳糖2h后，灌胃服用莱菔素(10mg/kg b.w.,56d)。
组IV(GroupⅣ)：莱菔素中剂量组，在给予D-半乳糖2h后，灌胃服用莱菔素(30mg/kg b.w.,56d)。
组V(GroupⅤ)：莱菔素高剂量组，在给予D-半乳糖2h后，灌胃服用莱菔素(50mg/kgb.w.,56d)。
组VI(GroupⅥ)：NMN阳性药对照组，在给予D-半乳糖2h后，灌胃服用NMN(100mg/kgb.w.,56d)。
分别使用生理盐水、莱菔素和NMN进行干预，实验结束后对D-半乳糖诱导衰老小鼠的模型进行评价。体重及各器官重量采用天平等仪器。
实验结果：在连续注射D-半乳糖56天时，同时进行体重变化测量。实验结束后，观察莱菔素对D-半乳糖所致小鼠各项衰老指标的对抗作用，以期探讨莱菔素的抗衰老作用机制。结果如表1所示，末次称量体重后，模型组体重相对于正常组有所下降(P<0.05)，给予莱菔素和NMN处理后，体重有所上升，其中低剂量莱菔素增长较明显，其他剂量莱菔素组和NMN有所增长。
表1莱菔素对D-半乳糖诱导衰老模型小鼠体重的影响
2、莱菔素对D-半乳糖衰老模型小鼠器官指数的影响
实验方法：采用天平等仪器进行称重。
实验结果：本发明通过D-半乳糖诱导的动物衰老模型，结果如表2所示，模型组小鼠肝脏、脾脏、肾脏、心脏指数均比正常组显著降低(P<0.001，P<0.05，P<0.01，P<0.01)，给予莱菔素和NMN后，除脾脏升高不明显外，肝脏、肾脏和心脏都有不同程度的升高，表明莱菔素能拮抗D-半乳糖诱导的衰老模型小鼠肝脏、脾脏、肾脏、心脏重量的增龄性下降，对肝脏、肾脏和心脏器官的衰老过程有明显的延缓作用。
表2莱菔素对D-半乳糖诱导衰老模型小鼠器官指数的影响
3、莱菔素对D-半乳糖衰老模型小鼠各组织H&E染色的影响
实验方法：将剪好的各组织固定于4％多聚甲醛24h以上。将组织从固定液取出放于脱水盒内后置于脱水机内依次梯度酒精进行脱水。将浸好蜡的组织于包埋机内进行包埋，切片。依次将切片放入二甲苯-无水乙醇-95％酒精-90％酒精-80％酒精-70％酒精-蒸馏水洗。切片放入苏木素中染3-8min，自来水洗后用1％的盐酸酒精分化，自来水冲洗，0.6％氨水返蓝，流水冲洗。随后将切片放入伊红染液中染色1-3min，酒精进行梯度洗脱，用中性树胶封片，显微镜镜检，图像采集、图像处理及分析。
实验结果：结果如图25所示，对肝脏进行H&E染色，空白组小鼠肝细胞和肝血窦周围呈放射状排列，肝细胞及肝小叶结构清晰、排列整齐，肝索呈辐射状排列，肝窦正常，细胞核周边间隙均匀；模型组小鼠肝脏组织结构混乱，细胞核排列不整齐，核质界限不清；阳性对照组肝细胞体积较模型组增大，细胞界限较明显，核亦增大；与模型组比较，莱菔素不同剂量组可在不同程度上改善衰老小鼠的肝组织病理损伤。
对脾脏进行H&E染色，衰老模型对照组小鼠脾脏细胞形态不规则，排列不整齐，界限糊，细胞间隙大，滤泡数量减少，形态萎缩；莱菔素高剂量组和阳性对照组NMN小鼠脾脏细胞形态规则正常，排列整齐，细胞间隙小滤泡数量丰富，形态饱满。脾脏是人体最大的免疫器官，含有大量的淋巴细胞和巨噬细胞，是机体细胞免疫和体液免疫的中心，自由基攻击机体蛋白质和脂质，发生炎性反应，使脾脏结构受到破坏，影响人体免疫和造血功能。组织形态学观察发现，衰老模型对照组小鼠脾脏组织出现纤维化反应，滤泡萎缩减少提示淋巴细胞增殖活性降低，存在衰老状态，比较高剂量组小鼠脾脏说明莱菔素和NMN具有缓解细胞损伤、刺激淋巴细胞增殖和抗体生成的作用。
对心脏进行H&E染色，可以观察到对照组心肌结构和细胞形态大小正常，D-gal损伤模型组小鼠心肌纤维排列紊乱，心肌纤维直径增大，胞质染色不均，心肌纤维肿胀，部分心肌纤维断裂和坏死。经莱菔素干预后的小鼠心肌组织损伤减轻，可显著改善不正常的心肌细胞排列和细胞大小，说明莱菔素可以抵抗D-半乳糖引起的心肌损伤。
4、莱菔素对D-半乳糖衰老模型小鼠肝功酶活力的影响
实验方法：采用南京建成公司生产的试剂盒，具体操作步骤见说明书。
实验结果：血清中肝功酶活力检测结果如图26所示：与正常组相比，模型组血清中肝功酶活性水平显著上升(P<0.01，P<0.001)。表明肝细胞受损，细胞内的肝功酶释放入血，导致血清中的肝功酶活性显著升高。与模型组相比，给予莱菔素处理后肝功酶活力逐渐下降，AST的变化在中剂量(30mg/kg b.w.)和高剂量组(50mg/kg b.w.)无明显差异，阳性给药组降低最为明显(P<0.001)。ALT的变化在高剂量组(50mg/kg b.w.)和阳性给药组降低最为明显(P<0.001)。表明莱菔素和NMN可显著抑制D-半乳糖对肝细胞的损伤，对D-半乳糖诱导的衰老模型小鼠具有显著的保护作用。综合以上数据表明：莱菔素和NMN均对D-半乳糖诱导的衰老模型小鼠的肝功酶具有显著的保护作用。
5、莱菔素对D-半乳糖衰老模型小鼠血脂指标的影响
实验方法：采用南京建成公司生产的试剂盒，具体操作步骤见说明书。
实验结果：对D-半乳糖诱导衰老模型小鼠的血脂指标进行评价。结果如图27所示，连续给药56d后，与对照组比较，模型组小鼠TC、TG、LDL-C含量升高，差异具有统计学意义(P<0.05，P<0.001，P<0.001)；HDL-C含量降低，差异具有统计学意义(P<0.05)，以上结果说明D-半乳糖诱导的衰老模型小鼠血脂水平会升高。与模型组比较，莱菔素和NMN组可降低小鼠的TC、TG、LDL-C水平，且差异均具有统计学意义(P<0.05，P<0.01，P<0.001)；与模型组比较，低剂量和中剂量莱菔素组无明显差异，高莱菔素和NMN都能升高小鼠的HDL-C水平，差异具有统计学意义(P<0.05)。
6、莱菔素对D-半乳糖衰老模型小鼠肝组织和肾组织氧化水平指标的影响
实验方法：采用南京建成公司和上海酶联生产的试剂盒，具体操作步骤见说明书。
实验结果：本发明通过检D-半乳糖诱导衰老小鼠肝组织和肾组织中氧化相关指标ROS、MDA和4-HNE的变化探究莱菔素对衰老小鼠肝组织和肾组织的保护作用。结果如图28所示：与正常组相比，模型组ROS水平和氧化产物MDA、4-HNE水平显著增加(P<0.01，P<0.001)。与模型组相比，莱菔素处理组和阳性药NMN组小鼠肝组织和肾组织中ROS和MDA、4-HNE水平逐渐下降。阳性药物组与正常组水平相当。
7、莱菔素对D-半乳糖衰老模型小鼠肝组织和肾组织抗氧化水平指标的影响实验方法：采用南京建成公司生产的试剂盒，具体操作步骤见说明书。
实验结果：本发明通过检测小鼠肝组织和肾组织抗氧化酶系统相关指标的表达情况探究莱菔素对D-半乳糖衰老模型小鼠抗氧化系统的影响。结果如图29所示，模型组小鼠肝和肾组织的T-AOC水平和SOD、CAT酶活性相较正常对照组显著下降(P<0.05，P<0.01，P<0.001)。在莱菔素处理组肝组织和肾组织细胞内的T-AOC水平和SOD、CAT酶活性相较模型组逐渐上升，有所缓解；其中阳性对照NMN组皆相较模型组显著升高(P<0.01)。结果表明莱菔素组可缓解D-半乳糖诱导的抗氧化系统的消耗，对衰老小鼠具有抗氧化保护作用。NMN组相关指标与正常组相当。
8、莱菔素对D-半乳糖衰老模型小鼠肝组织和肾组织促炎指标的影响
实验方法：采用上海酶联公司生产的试剂盒，具体操作步骤见说明书。
实验结果：结果如图30所示：与正常组相比，过量D-半乳糖可导致肝/肾组织中LPS的激增，进一步诱导促炎细胞因子如：IL-1β，IL-6，IFN-γ和TNF-α的释放。与模型组相比，莱菔素处理组中相关指标有所降低，高剂量组(50mg/kg b.w.)相对明显。阳性药物组NMN抗炎促炎介质的表达与正常组相当。结果表明莱菔素可通过抑制肝/肾组织中促炎相关介质的释放发挥对D-半乳糖诱导的衰老小鼠肝/肾组织炎症的保护作用。
随后，对D-半乳糖衰老模型小鼠肝和肾组织趋化因子和基质基础蛋白酶进行检测，D-半乳糖衰老组的趋化因子和基质基础蛋白酶表达显著上升(P<0.01，P<0.001)。D-半乳糖衰老组相比，NMN组和莱菔素组的趋化因子和基质基础蛋白酶表达水平有所下降。结果表明，莱菔素通过抑制趋化因子和基质基础蛋白酶的表达发挥对D-半乳糖诱导衰老小鼠肝和肾损伤的保护作用。
9、莱菔素对D-半乳糖衰老模型小鼠肾组织中抗氧化蛋白表达的影响实验方法：见实施例2的相应部分(7、莱菔素对氧化损伤皮肤细胞凋亡蛋白的影响所述方法)。
实验结果：本发明采用Western Blot检测Nrf2及其下游蛋白(HO-1、NQO1和GCLM)的表达，探究莱菔素对衰老小鼠肾脏的抗氧化护机制。结果如图31所示，与正常组相比，模型组Nrf2的蛋白表达水平明显下降(P<0.001)，而与莱菔素和阳性药NMN治疗组相比，Nrf2表达水平逐渐升高，尤其是高剂量组(50mg/kg b.w.)改善明显(P<0.001)。Nrf2可以激活其下游的抗氧化蛋白，包括NQO1和GCLM，它们清除自由基，保护小鼠免受氧化损伤。随后对下游蛋白HO-1、NQO1和GCLM进行检测，与对照组相比，D-半乳糖处理组HO-1、NQO1和GCLM的表达水平降低(P<0.001)，然而莱菔素治疗组肾细胞的HO-1、NQO1和GCLM蛋白表达水平较氧化损伤模型组显著升高(P<0.001；P<0.001；P<0.001)。结果表明莱菔素通过上调Nrf2-ARE信号依赖的抗氧化防御来保护小鼠肾脏免受氧化损伤。
10、莱菔素对D-半乳糖衰老模型小鼠肾组织中炎症相关蛋白表达的影响实验方法：见实施例2的相应部分(7、莱菔素对氧化损伤皮肤细胞凋亡蛋白的影响所述方法)。
实验结果：本发明采用Western Blot检测炎症相关蛋白TLR4及其下游相关蛋白MyD88、p-IκBα、p-NF-κB和IL-6的表达情况，分析莱菔素对D-半乳糖衰老模型小鼠肾组织中炎症相关蛋白表达的影响。结果如图32所示，除了IL-6以外，其他指标蛋白模型组中肝组织炎症相关蛋白表达水平与正常组相比均显著上调(P<0.001)，莱菔素治疗组这些蛋白的表达水平与模型组相比逐渐降低。其中50mg/kg的莱菔素治疗组，相较模型组的蛋白表达下降最为显著。阳性药物NMN组的蛋白表达与正常组相当。综合以上结果提示：D-半乳糖可诱导小鼠肾脏内炎症相关蛋白表达的增加，进而导致炎症的发生。莱菔素能够有效抑制肾脏中促炎相关蛋白的表达，进而减少促炎相关细胞因子的释放，从而抑制肾脏中炎症的发生，对衰老小鼠发挥保护作用，50mg/kg b.w.的莱菔素为治疗衰老的有效量。
11、统计学分析
采用GraphPad Prism 5.0软件对数据进行多组间方差分析和T检验，实验数据用平均数±标准差(Mean±S.D.)表示，显著性差异以P<0.05为标准。
实施例8：莱菔素在受试人群中的作用
采用随机、平行对照、双盲临床实验方法，将160名入组人员随机分为对照组1、对照组2、实验组和安慰剂组，每组40人。要求入组人员常规饮食，每人每天上午需要称量体重，并按剂量服用研究人员提供的抗衰老产品，连续服用3个月。入选年龄在50-75岁之间，无任何潜在疾病。
其中，对照组1服用的抗衰老产品为购自艾里克NMN，用量为每天两次(一次两粒)，早饭之后或者是午饭之后服用，可根据自身情况。对照组2的抗衰老产品为Swisse斯维诗的葡萄籽胶囊，即葡萄籽提取物，每天2粒，午饭后服用或随餐服用。实验组的抗衰老产品为本发明所提到的莱菔素，早饭后服用，每天一次服用4粒。安慰剂组为组合物片剂等量的淀粉片，同意的为早饭后服用，每天一次服用4粒。
采用交叉设计方法，通过受试者服用抗衰老产品前后进行检测结果对照。样本及体测采集点分别为入组后服用前记为0期、服用3个月记为1期、3个月后停止服用记为2期。对比受试者的血常规、肝功酶、血脂等进行评估其是否可以延缓机体衰老。
实验结果：实验结果如表3所示，以下指标均发生了明显变化，分别为血小板体积分布宽度、平均血小板体积、谷草转氨酶、谷丙转氨酶、总胆固醇和甘油三酯。也就是说莱菔素可以使机体指标发生变化，具有一定的抗衰老价值。
表3莱菔素对受试人群的影响
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若对本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其同等技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。上述实施例或实施方式只是对本发明的举例说明，本发明也可以以其它的特定方式或其它的特定形式实施，而不偏离本发明的要旨或本质特征。因此，描述的实施方式从任何方面来看均应视为说明性而非限定性的。本发明的范围应由附加的权利要求说明，任何与权利要求的意图和范围等效的变化也应包含在本发明的范围内。

Claims (8)

1.莱菔素或其组合物用于制备靶向清除或修复动物机体组织微环境中衰老或损伤细胞的药物的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的组合物选自药品、保健品、食品或化妆品。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述的药品为药物制剂，选自片剂、颗粒剂、冲剂、软胶丸、粉剂、软胶囊、口服液、滴丸剂、软膏剂、乳液或注射液。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的组合物包含植物提取物，所述的植物选自孢子甘蓝、花椰菜、白菜、无头甘蓝、羽衣甘蓝、绿色椰菜芽、芥菜、萝卜、西兰花、辣根中的一种或多种。
5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的组合物包含辅料。
6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的莱菔素或其组合物单独使用或与其他药物联合使用。
7.根据权利要求1-6之一所述的用途，其特征在于：所述的莱菔素在细胞中的用量为0.625-5μM。
8.根据权利要求1-6之一所述的用途，其特征在于：所述的莱菔素在动物机体中的有效量为10-50mg/kg b.w.。
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