CN106153761B - 同时检测无籽刺梨果实中3种黄酮类成分的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种同时检测无籽刺梨果实中3种黄酮类成分的方法，该方法是先取待检无籽刺梨果实干燥粉末，以甲醇或含水甲醇提取，减压旋干滤液，加入超纯水，用水饱和正丁醇按照醇水比4:1萃取两次，再用乙酸乙酯萃取两次，合并滤液，减压旋干并定容后制备出供试品溶液，然后选择芦丁、槲皮素、山奈酚为对照品，制备对照品溶液；分别将对照品溶液和供试品溶液在同一色谱条件下的高效液相色谱仪中进行进样分析，根据外标法监测无籽刺梨中上述3种成分即可。本发明首次在同一色谱条件下检测了上述无籽刺梨果实中主要黄酮类成分，共指认了3个具体化合物，可更全面跟准确地用于无籽刺梨果实黄酮类活性成分的深入研究。

Description

同时检测无籽刺梨果实中3种黄酮类成分的方法

技术领域

本发明涉及一种黄酮类成分的检测方法，尤其是无籽刺梨果实中3种黄酮类成分的检测方法。

背景技术

无籽刺梨(Rosa sterilis S.D.Shi)属蔷薇科蔷薇属多年生攀援类果树，为贵州特有种，是一种药食同源的植物，2015年被国家林业局授权为植物新品种，其生态价值与经济价值对于喀斯特石漠化地区具有重要意义。其生态价值主要体现在石漠化治理、水土保持和生态修复等方面，药用和保健价值主要体现在无籽刺梨医药和保健产品逐步上市，市场前景较好。

已有研究表明，无籽刺梨生物活性成分中黄酮类物质含量最高。黄酮类物质是小分子化合物，广泛存是许多中草药的有用成分，有较好的抗氧化性和清除自由基的能力。国内外已有研究表明某些黄酮类化合物既是药理因子，又是重要的营养因子，为一种新发现的营养素，不同分子结构的黄酮可作用于身体不同器官，对人体具有重要的生理保健功效。然而，就目前研究现状而言，关于无籽刺梨质量控制的报道很少，采用HPLC法测定其中某类成分的研究更少，已有研究中测定的成分较为单一，如单独测定无籽刺梨果实中芦丁、没食子酸。尚未见使用HPLC同时测定无籽刺梨中3类以上成分的报道。

发明内容

本发明的目的是为进一步加深无籽刺梨活性成分的深入研究，采用HPLC法建立无籽刺梨的多指标含量测定方法，同时测定芦丁、槲皮素和山奈酚3种黄酮类成分的含量，以弥补现有技术的不足，加深对无籽刺梨黄酮类物质成分的了解及其含量测定，为其合理利用提供科学依据。

本发明的技术方案如下：

本发明提供同时检测无籽刺梨果实中芦丁、槲皮素和山奈酚的方法，它包括如下操作步骤：

（1）取待检无籽刺梨果实干燥粉末，以甲醇或含水甲醇提取，减压旋干滤液，加入10ml超纯水，分别水饱和正丁醇萃取两次（醇水比4:1），10ml乙酸乙酯萃取两次，合并滤液，减压旋干并定容至10ml，为制备供试品溶液；

（2）选择芦丁、槲皮素、山奈酚为对照品，制备对照品溶液；

（3）分别将对照品、供试品溶液在同一色谱条件下的高效液相色谱仪中进行进样分析，根据外标法监测无籽刺梨中上述3种成分即可，色谱条件如下：

色谱柱：十八烷基键合硅胶为填料；

检测波长：360nm；

流速：0.6-1.0ml/min；

流动相：流动相为A：乙腈，B：0.05-0.4%磷酸水溶液；

梯度洗脱程序： 0-5min，90-87%B；5-10min，87%B；10-15min，87%-85%B；15-20min，85%-84%B；20-32min，84%-82%B；32-35min，82%-80%B；35-40min，80%-78%B；40-55min，78%-75%B；55-70min，75%-70%B；70-80min，70%-60%B；80-90min，60%-35%B；90-95min，35%-20%B；95-105min，20%-10%B；105-110min，10%-5%B；110-115min，5%-10%B；115-120min，10%-20%B；120-130min，20%-90%B；130-150min，90%B。

本发明需要指出，由于无籽刺梨中糖、酸等含量较高，待提取液制备完全后，应尽可能的将其中大极性物质最大可能去除，以保持谱图基线平稳和各未知物良好的分离，同时还需保证前处理方法的回收率达标。因此在HPLC法分析过程中，实现无籽刺梨提取液中各物质基线分离和目标物含量测定是难点。本发明所建立的方法可同时分离测定芦丁、槲皮素和山奈酚3种成分。目前公开的刺梨色谱条件均不能实现同时对本发明中的3种成分进行含量测定。

进一步地，步骤（1）中，在以甲醇或含水甲醇提取时，提取溶剂甲醇浓度为50-100%v/v，优选为100%v/v，在采用100%v/v浓度时提取效果远高于采用50%v/v浓度。

更进一步地，步骤（1）中，在以甲醇或含水甲醇提取时，提取方法选自回流、超声以及超声加回流3种之一。

进一步地，色谱条件中，流速为0.7ml/min。

进一步地，色谱条件中，磷酸水溶液浓度为0.1%。

进一步地，色谱条件中，色谱柱尺寸为4.6mm×250mm，5μm。

更进一步地，色谱条件中，色谱柱柱温为30℃±2℃。

本发明检测方法中，出峰数量较多，分离度良好，基线平稳，能够对无籽刺梨果实中主要黄酮类成分进行有效检测，为其深入研究提供可靠检测手段。本发明首次在同一色谱条件下检测了上述无籽刺梨果实中主要黄酮类成分，共指认了3个具体化合物，可更全面跟准确地用于无籽刺梨果实黄酮类活性成分的深入研究。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1：

本发明检测方法包括如下步骤：

（1）取待检无籽刺梨果实干燥粉末，以甲醇或含水甲醇提取，减压旋干滤液，加入10ml超纯水，分别水饱和正丁醇萃取两次（醇水比4:1，体积比），10ml乙酸乙酯萃取两次，合并滤液，减压旋干并定容至10ml，为制备供试品溶液；

（2）选择芦丁、槲皮素、山奈酚为对照品，制备对照品溶液；

（3）分别将对照品、供试品溶液在同一色谱条件下的高效液相色谱仪中进行进样分析，根据外标法监测无籽刺梨中上述3种成分即可，色谱条件如下：

色谱柱：十八烷基键合硅胶为填料；

检测波长：360nm；

流速：0.7ml/min；

流动相：流动相为A：乙腈，B：0.1%磷酸水溶液；梯度洗脱程序： 0-5min，90-87%B；5-10min，87%B；10-15min，87%-85%B；15-20min，85%-84%B；20-32min，84%-82%B；32-35min，82%-80%B；35-40min，80%-78%B；40-55min，78%-75%B；55-70min，75%-70%B；70-80min，70%-60%B；80-90min，60%-35%B；90-95min，35%-20%B；95-105min，20%-10%B；105-110min，10%-5%B；110-115min，5%-10%B；115-120min，10%-20%B；120-130min，20%-90%B；130-150min，90%B。

本实施例所用无籽刺梨粉末是指无籽刺梨果实部分。

试验例2：方法学考查

1 材料

岛津LC-20A高效液相色谱仪（包括二元梯度泵，自动进样器，柱温箱，紫外检测器，LC solution色谱工作站），电子分析天平，超纯水机。

芦丁、槲皮素和山奈酚对照品均购于成都曼斯特生物科技有限公司（供含量测定用，纯度≥98%）。乙腈、甲醇、正丁醇和乙酸乙酯（色谱纯，科密欧），水为超纯水，其余试剂为分析纯。

2方法与结果

2.1色谱条件安捷伦C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相为A：乙腈，B：0.1％磷酸水溶液，梯度洗脱程序：0-5min，90-87％B；5-10min，87％B；10-15min，87％-85％B；15-20min，85％-84％B；20-32min，84％-82％B；32-35min，82％-80％B；35-40min，80％-78％B；40-55min，78％-75％B；55-70min，75％-70％B；70-80min，70％-60％B；80-90min，60％-35％B；90-95min，35％-20％B；95-105min，20％-10％B；105-110min，10％-5％B；110-115min，5％-10％B；115-120min，10％-20％B；120-130min，20％-90％B；130-150min，90％B；体积流量0.7ml/min,；柱温：30℃；进样量10μl；检测波长：360nm。按照上述色谱条件进行测定，各成分分离度良好。

2.2 对照品溶液的制备

称取减压干燥至恒重的对照品适量，加入甲醇配制成没每1ml含芦丁1.05mg、槲皮素0.64mg、山奈酚1mg的单标，分别取110μl、5μl、2μl定容至1.5ml制备混合对照品溶液A。混合对照品溶液A中芦丁、槲皮素和山奈酚的含量分别为0.1155mg、0.0032mg、0.002mg。

2.3 供试品溶液制备

去无籽刺梨粉末约1g，精密称定，精密加入100%甲醇25ml称定重量，超声提取30min，冷却后补重，摇匀，静止，过滤，收集残渣，再次加入25ml100%甲醇，重复上述提取步骤，合并滤液并减压蒸发至几无甲醇；加入10ml超纯水，40ml水饱和正丁醇萃取两次，再加入10ml乙酸乙酯萃取两次，合并滤液，减压蒸发至1ml左右，用甲醇溶解并定容至10ml，即得。

2.4线性关系的考察

分别精密吸取混合对照品A溶液2μl、4μl、8μl、10μl、20μl进样，以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，分别绘制标准曲线，计算得各对照品的回归方程和线性范围(表1)。

表1对照品的线性关系和范围

2.5 精密度试验

精密吸取供试溶液10μl，连续进样6次，记录色谱峰面积。结果芦丁、槲皮素和山奈酚峰面积的RSD分别为1.102%、0.991%、1.110%。表明仪器精密度良好。

2.6 重复性试验

取同一份样品（JC）粉末6份，按2.3项下方法平行制备供试品溶液，按2.1项色谱条件进样分析，记录色谱峰面积。结果芦丁、槲皮素和山奈酚RSD分别为1.51%、2.01%、1.78%。表明方法的重复性好。

2.7 稳定性试验

取同一份供试品溶液（JC），分别在0、2、4、8、16、48h进样6次，记录色谱峰面积。结果芦槲皮素和山奈酚峰面积的RSD分别为1.102%、0.991%、1.110%。表明供试样品溶液48h内稳定性良好。

2.8 加样回收率试验

取已知含量的JC样品粉末约0.5g平行6份，精密称定。分别依次加入100%甲醇配置的芦丁、槲皮素和山奈酚对照品350μl、15μl、2μl，按供试品溶液制备方法制备。精密吸取加样回收溶液10μl，注入液相色谱仪测定其含量。根据公式，加样回收率（%）=（A-B）/C*100(A为实测量，B为样品中被测物质量，C为加入对照品量），分别计算各成分加样回收率，结果见表2。

2.9 样品的含量测定取无籽刺梨果实粉末，按2.3项下方法制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液10μl，注入液相色谱已进行测定。采用外标法计算无籽刺梨果实中3种黄酮类成分的含量，结果见表3。

3 讨论

本研究建立了以HPLC法同时测定无籽刺梨果实中3种黄酮类成分含量的方法，这3种成分分别为芦丁、槲皮素和山奈酚，该方法能够较为准确、稳定的测定无籽刺梨果实中主要黄酮类成分的含量。

3.1 测定波长的确定

分别对3个被测成分进行200-500nm全波长扫描，结果显示芦丁的最大吸收波长为268nm，槲皮素最大吸收波长为359nm，山奈酚最大吸收波长为360nm。为兼顾3个成分的最大吸收，试验过程中对已有文献记载的黄酮类物质较好吸收波长分别做了测试，分别为254、265、280、360nm，最终确定360nm为检测波长。

3.2 供试品提取方法的考查

分别考察了不同提取方式、不同体积比甲醇、酸水解处理、不同料液比和不同提取时间。最终确定以1.0g粉末加入100%甲醇25ml作提取剂提取两次，并使用水饱和正丁醇和乙酸乙酯进行萃取，作为供试品溶液的制备方法。

3.2.1 提取方式的考察

精密称取JC无籽刺梨粉末约1.0g，3份，以100%甲醇30ml作提取剂，各以超声30min2次、回流30min次以及超声30min加2mol/L Hcl回流30min作为提取方法，按2.3项下方法制备供试品溶液，精密吸取10μl供试品溶剂注入高效液相色谱仪，色谱条件同2.1，结果如表4所示。

结果可知，超声提取的成分色谱峰面积普遍较大，超声加酸解回流的方式对槲皮素含量影响较大，故选取超声提取方式。

3.2.2 甲醇体积比考察

精密称取JC无籽刺梨粉末1.0g，6份，分别加入50%、60%、70%、80%、90%、100%v/v甲醇30ml作为提取溶剂，按2.3项下方法制备供试品溶液，精密吸取10μl供试品溶液注入高效液相色谱仪，色谱条件同2.1，结果如表5所示。

结果可知，100%甲醇提取的各成分色谱峰面积较大，谱图基线较平，故选取100%甲醇作为提取溶剂。

3.2.3 料液比考察

精密称取JC无籽刺梨果实粉末1.0g，4份，分别加入100%甲醇25ml、30ml、40ml和50ml作为提取溶剂，按2.3项下方法制备供试品溶液，精密吸取10μl供试品溶液注入高效液相色谱仪，色谱条件同2.1，结果如表6所示。

结果可知，料液比为1:25的提取效率较高。

3.2.4 提取时间考察

精密称取JC无籽刺梨果实粉末1.0g，4份，以100%甲醇30ml作为提取溶剂，分别超声提取30min、60min、90min、120min各两次，按2.3项下方法制备供试品溶液，精密吸取10μl供试品溶液注入高效液相色谱仪，色谱条件同2.1，结果如表7所示。

结果表明，超声30min提取2次时3种黄酮类成分的峰面积较大，且不再随提取时间延长而增大，故确定提取时间为30min，提取2次。

最终确定以1.0g无籽刺梨果实粉末加入100%甲醇25ml，超声30min，提取2次，分别使用水饱和正丁醇和乙酸乙酯萃各取2次，作为供试品溶液的制备方法。

3.3 色谱条件考察

对色谱系统（甲醇-水、乙腈-水）、酸种类（磷酸、甲酸）、酸水浓度、流动相梯度、柱温及流速分别进行了考察。由于样品中大极性物质较多，使供试样品提取物全部达到基线分离是本研究的难点。选用甲醇-水为流动相时，系统压力较大，故初步选择乙腈-水为流动相；分别以0.1%的磷酸和甲酸作为流动相B，使用磷酸的峰形和分离度较好；分别以0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%磷酸水溶液作为流动相B，0.1%磷酸水溶液可以达到较好的分离；在增大或降低流动相中有机相比例进行反复的条件筛选，最终选定的色谱条件能较为理想的分离样品提取物，且基线较平；考察了柱温为25℃、30℃、40℃使的分离效果，确定30℃可以较好的分离；分别考察了流速为0.6ml/min、0.7ml/min、0.8ml/min、0.9ml/min、1.0ml/min，在0.7ml/min流速下分离较好。

最终确定的色谱条件为：

色谱柱：十八烷基键合硅胶为填料

检测波长：360nm

体积流量：0.7ml/min

柱温：30℃

进样量：10μl

流动相：流动相为A：乙腈，B：0.1%磷酸水溶液；梯度洗脱程序： 0-5min，90-87%B；5-10min，87%B；10-15min，87%-85%B；15-20min，85%-84%B；20-32min，84%-82%B；32-35min，82%-80%B；35-40min，80%-78%B；40-55min，78%-75%B；55-70min，75%-70%B；70-80min，70%-60%B；80-90min，60%-35%B；90-95min，35%-20%B；95-105min，20%-10%B；105-110min，10%-5%B；110-115min，5%-10%B；115-120min，10%-20%B；120-130min，20%-90%B；130-150min，90%B。

当然，以上只是本发明的具体应用范例，本发明还有其他的实施方式，凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明所要求的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种同时检测无籽刺梨果实中3种黄酮类成分的方法，包括同时检测无籽刺梨果实中芦丁、槲皮素和山奈酚的方法，其特征在于该方法包括如下步骤：

步骤（1）取待检无籽刺梨果实干燥粉末，以甲醇或含水甲醇提取，减压旋干滤液，加入超纯水，用水饱和正丁醇按照醇水比4:1萃取两次，再用乙酸乙酯萃取两次，合并滤液，减压旋干并定容后制备出供试品溶液；

步骤（2）选择芦丁、槲皮素、山奈酚为对照品，用100%甲醇制备对照品溶液；

步骤（3）分别将对照品溶液和供试品溶液在同一色谱条件下的高效液相色谱仪中进行进样分析，根据外标法监测无籽刺梨中上述3种成分即可；高效液相色谱仪中的色谱条件如下：

色谱柱：十八烷基键合硅胶为填料；

检测波长：360nm；

流速：0.6-1.0ml/min；

流动相：流动相为A：乙腈，B：0.05-0.4%磷酸水溶液；

梯度洗脱程序： 0-5min，90-87%B；5-10min，87%B；10-15min，87%-85%B；15-20min，85%-84%B；20-32min，84%-82%B；32-35min，82%-80%B；35-40min，80%-78%B；40-55min，78%-75%B；55-70min，75%-70%B；70-80min，70%-60%B；80-90min，60%-35%B；90-95min，35%-20%B；95-105min，20%-10%B；105-110min，10%-5%B；110-115min，5%-10%B；115-120min，10%-20%B；120-130min，20%-90%B；130-150min，90%B。

2.根据权利要求1所述的同时检测无籽刺梨果实中3种黄酮类成分的方法，其特征在于：步骤（1）中，所述以甲醇或含水甲醇提取中提取溶剂甲醇浓度为50-100%v/v。

3.根据权利要求1所述的同时检测无籽刺梨果实中3种黄酮类成分的方法，其特征在于：步骤（1）中，所述以甲醇或含水甲醇提取中提取方法采用回流、超声以及超声加回流3种之一。

4.根据权利要求1所述的同时检测无籽刺梨果实中3种黄酮类成分的方法，其特征在于：色谱条件中，流速为0.7ml/min。

5.根据权利要求1所述的同时检测无籽刺梨果实中3种黄酮类成分的方法，其特征在于：色谱条件中，磷酸水溶液浓度为0.1%。

6.根据权利要求1所述的同时检测无籽刺梨果实中3种黄酮类成分的方法，其特征在于：色谱条件中，色谱柱尺寸为4.6mm×250mm，5μm。

7.根据权利要求1所述的同时检测无籽刺梨果实中3种黄酮类成分的方法，其特征在于：色谱条件中，色谱柱柱温为30℃±2℃。