CN103822977B

CN103822977B - 一种测定化妆品中甘草七种功效成分的方法

Info

Publication number: CN103822977B
Application number: CN201310483268.0A
Authority: CN
Inventors: 陆军; 王嘉仡; 佟晓波; 庞燕军
Original assignee: LIAONING PROVINCE INSTITUTE FOR FOOD AND DRUG CONTROL
Current assignee: LIAONING PROVINCE INSTITUTE FOR FOOD AND DRUG CONTROL
Priority date: 2013-10-15
Filing date: 2013-10-15
Publication date: 2015-07-29
Anticipated expiration: 2033-10-15
Also published as: CN103822977A

Abstract

本发明涉及一种测定化妆品中甘草七种功效成分的方法。向待测样品中加入60%_80%甲醇，反复超声提取并离心，合并离心上清液，至旋转蒸发瓶中，旋转蒸发至不超过定容体积，转移至刻度管中以甲醇定容，滤膜过滤，滤液进行液相色谱测定。采用二极管阵列检测器，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂柱，在190_400nm进行检测，以乙腈-磷酸溶液为流动相，梯度洗脱，收集七种功效成分别为甘草苷、异甘草苷、甘草素、甘草酸二钾（甘草酸）、甘草查尔酮A、光甘草定、甘草次酸；本发明分辨率高、灵敏度高、选择性好，时间短，样品处理方法简单，适宜化妆品中甘草七种功效成分微量分析，填补了化妆品中甘草七种功效成分测定的空白。

Description

一种测定化妆品中甘草七种功效成分的方法

技术领域

本发明涉及同时测定甘草七种功效成分的方法，特别是一种测定化妆品中甘草七种活性成分的方法。

背景技术

近几年，天然植物甘草作为功效成分，被广泛用于各类化妆品中，起着美白、防晒、抗炎、调节皮脂、生发护发等多种功效作用。天然植物类化妆品的增长远超过普通化妆品，2008年～2010年增长58％，其中，增长最快的是含中草药成分的化妆品，国际品牌化妆品也开始介入中药领域，目前已经出现了一些添加中草药(如金银花、野菊花、人参、甘草、首乌和生姜)的化妆品。

甘草为豆科多年生草本植物，是临床上应用最广的传统中药之一，也是一种很好的化妆品添加剂。甘草主要含有三大类活性成分：黄酮类(甘草苷、异甘草苷、甘草素、甘草查尔酮A、光甘草定等)，三萜类(主要成分甘草酸、甘草次酸，甘草酸二钾液相色谱检测的成分为甘草酸)，以及多糖类。

据研究显示，甘草生物活性成分既能美白防晒，又有抗炎等功效。甘草苷、异甘草苷、甘草素、甘草查尔酮A具有抗炎、抗变态反应、免疫调节的功能。光甘草定能深入皮肤内部，有效抑制黑色素生成过程中多种酶的活性，具有美白功效；光甘草定对紫外光和可见光均能强烈吸收，具有防晒功效；光甘草定还具有防止皮肤粗糙、抗炎、抗菌功效。光甘草定是目前疗效好、功效全面的美白成分，被世界化妆品界誉为“美白黄金”，是目前国际上高档美白化妆品的主要功效成分。甘草酸二钾和甘草次酸在化妆品中有广泛的配伍性，可用于膏、霜、水、乳液、奶类和蜜类等所有化妆品，可用于防晒、美白、止痒、调节皮脂、生发护发等，可以起到类似于肾上腺皮脂激素的作用，而又没有任何副作用，

目前关于甘草黄酮类、三萜类、多糖类检测方法：分光光度法、毛细管电泳法、薄层扫描法、高效液相色谱法、超临界流体色谱法等。分光光度法操作简单，但样品未经分离纯化，误差大。毛细管电泳法、薄层扫描法速度快，选择高，但更适用定性分析。超临界流体色谱法在国际上发展很快，但在我国还处于探索阶段，因此，高效液相色谱法仍为甘草功效成分的主流分析方法。现有的资料和文献，关于高效液相色谱法检测甘草功效成分，仅局限于药品制剂的分析检测，多集中在甘草苷、异甘草苷、甘草素、异甘草素的检测。甘草检验标准，只有药典2010年版一部中甘草，测定甘草苷和甘草酸两个成分，而用这个方法不能同时分析测定上述甘草七种功效成分。在化妆品领域，迄今为止，对甘草功效成分的测定尚属空白，也没有相关的检测标准出台，而甘草功效成分在化妆品中应用越来越多，添加的限量，安全的范围，检验的标准，都值得我们越来越多的关注。

发明内容

本发明目的是提供一种测定化妆品中甘草七种功效成分的方法。

为实现上述目的本发明采用技术方案为：

一种测定化妆品中甘草七种功效成分的方法，

将待测化妆品样品的甲醇提取液上样进行液相色谱测定，同时定性和/或定量对待测化妆品样品中的七种功效成分中的一种或二种以上进行确定；

七种功效成分别为甘草苷、异甘草苷、甘草素、甘草酸二钾(甘草酸)、甘草查尔酮A、光甘草定、甘草次酸。

向0.5-2.0g待测样品中加入浓度为60％-80％(v/v)的甲醇，反复超声提取并离心，合并离心上清液，至旋转蒸发瓶中，旋转蒸发至不超过定容体积，转移至刻度管中加甲醇定容，经0.45μm滤膜过滤，滤液进行液相色谱测定。采用二极管阵列检测器，以十八烷基硅烷键合硅胶作为填充剂柱，在190-400nm进行检测，以乙腈-磷酸溶液为流动相，梯度洗脱，流速0.8-1.2mL/min，收集5.0-7.4min的组分即为甘草苷；收集9.1-11.7min的组分即为异甘草苷；收集11.3-14.3min的组分即为甘草素；收集15.6-17.9min的组分即为甘草酸二钾(甘草酸)；收集20.5-23.4min的组分即为甘草查尔酮A；收集21.9-25.0min的组分即为光甘草定；收集27.5-31.1min的组分即为甘草次酸；

其中，待测样品与甲醇按质量体积比为1:10-40(g/ml)；流动相采用22-80％乙腈(v/v)—78-20％的0.01-0.07％磷酸溶液(v/v)。

所述具体梯度洗脱为，35min内完成检测，0→4min：乙腈22％(v/v)，0.05％磷酸78％(v/v)；4→27min：乙腈22％(v/v)→80％(v/v)，0.05％磷酸78％(v/v)→20％(v/v)；27→35min乙腈80％(v/v)→22％(v/v)，0.05％磷酸20％(v/v)→78％(v/v)。

所述加入60％-80％(v/v)甲醇，反复超声提取并离心，合并上清液，旋转蒸发至不超过定容体积，转移至刻度管中以甲醇定容，经0.45μm滤膜过滤，待用。

所述待测样品为化妆品中的膏、霜、水剂、乳液、面膜或浴液。

所述以面膜为待测样品时，取样时挤压面膜取其液体，而后向待测样品中加入60％-80％(v/v)甲醇。

所述超声提取时间为30-50min，温度40℃；而后以5000-8000r/min离心，离心时间10-20min。

采用紫外检测器或二极管阵列检测器，采用C18柱，C18柱以十八烷基硅烷键合硅胶作为填充剂柱，在237nm进行检测，以体积比乙腈：0.01％-0.07％磷酸溶液为流动相，梯度洗脱，温度25-40℃，进样体积为2-10μL，流速0.8-1.2mL/min，收集5.0-7.4min的组分即为甘草苷；收集9.1-11.7min的组分即为异甘草苷；收集11.3-14.3min的组分即为甘草素；收集15.6-17.9min的组分即为甘草酸二钾；收集20.5-23.4min的组分即为甘草查尔酮A；收集21.9-25.0min的组分即为光甘草定；收集27.5-31.1min的组分即为甘草次酸；

或，采用紫外检测器或二极管阵列检测器，采用C8柱，C8柱以辛烷基硅烷键合硅胶作为填充剂柱，在237nm进行检测，以体积比乙腈：0.01％-0.07％磷酸溶液为流动相，梯度洗脱，温度25-40℃，进样体积为2-10μL，流速0.8-1.2mL/min，收集7.3-10.0min的组分即为甘草苷；收集10.3-13.2min的组分即为异甘草苷；收集13.6-16.9min的组分即为甘草素；收集15.8-18.5min的组分即为甘草酸二钾；收集22.1-25.2min的组分即为甘草查尔酮A；收集23.5-26.8min的组分即为光甘草定；收集28.0-32.0min的组分即为甘草次酸。

所述采用十八烷基硅烷键合硅胶为C18柱的填充剂，C18柱规格为4.6mm*250mm，5μm，并且柱温25-40℃，进样体积为2-10uL。所述使用二极管阵列检测器在190-400nm进行检测，甘草苷在230nm吸收最大，异甘草苷在220nm-365nm都有吸收，甘草素在225nm吸收最大、甘草酸二钾(甘草酸)在245nm吸收最大，甘草查尔酮A在230nm-400nm都有吸收，光甘草定在230nm吸收最大，甘草次酸在250nm吸收最大，综合考虑选择最佳检测波长237nm。

所述样品根据其保留时间和光谱进行定性分析，利用外标法根据其峰面积进行定量分析。

所述样品根据其保留时间和光谱进行定性分析，利用外标法根据其峰面积进行定量分析；

采用C18柱，温度25℃，流速1.0mL/min时，当已腈体积含量为26.4％-29.1％，0.05％磷酸溶液体积含量为73.6％-70.9％，收集对应的5.945min组分即为甘草苷；当已腈体积含量为37.3％-38.8％，0.05％磷酸溶液体积含量为62.7％-61.2％，收集对应的10.235min组分为异甘草苷；当已腈体积含量为43.5％-45.0％，0.05％磷酸溶液体积含量为56.5％-55.0％，收集对应的12.650min组分为甘草素；当已腈体积含量为53.1％-54.3％，0.05％磷酸溶液体积含量为46.9％-45.7％，收集对应的16.535min组分为甘草酸二钾(甘草酸)；当已腈体积含量为66.4％-67.7％，0.05％磷酸溶液体积含量为33.6％-32.3％，收集对应的21.737min组分为甘草查尔酮A；当已腈体积含量为70.2％-71.4％，0.05％磷酸溶液体积含量为29.8％-28.6％，收集对应的23.223min组分为光甘草定；当已腈体积含量为66.4％-62.2％，0.05％磷酸溶液体积含量为33.6％-37.8％，收集对应的29.031min组分为甘草次酸；

或，采用C8柱,温度25℃，流速1.0mL/min时,当已腈体积含量为32.5％-34.1％，0.05％磷酸溶液体积含量为67.5％-65.9％，收集对应的8.412min组分即为甘草苷；当已腈体积含量为40.9％-41.8％，0.05％磷酸溶液体积含量为59.1％-58.2％，收集对应的11.633min组分为异甘草苷；当已腈体积含量为49.7％-50.7％，0.05％磷酸溶液体积含量为50.3％-49.3％，收集对应的15.129min组分为甘草素；当已腈体积含量为54.6％-55.5％，0.05％磷酸溶液体积含量为45.4％-44.5％，收集对应的17.052min组分为甘草酸二钾(甘草酸)；当已腈体积含量为70.8％-72.2％，0.05％磷酸溶液体积含量为29.2％-27.8％，收集对应的23.515min组分为甘草查尔酮A；当已腈体积含量为74.6％-75.6％，0.05％磷酸溶液体积含量为25.4％-24.4％，收集对应的25.032min组分为光甘草定；当已腈体积含量为60.1％-57.2％，0.05％磷酸溶液体积含量为39.9％-42.8％，收集对应的29.796min组分为甘草次酸。

本发明所具有的优点：

本发明测定方法七种化合物分离度远远大于1.5，峰型尖锐，峰宽窄，因而分辨率高；通过选择合适的色谱柱，合适的流动相，改变流动相配比方式，采用合适的梯度洗脱条件，因而灵敏度高；时间短，样品处理方法简单，同时检测甘草中多种功效成分，对功效成分进行精确的定性和定量分析。本发明填补了化妆品中甘草七种功效成分甘草苷、异甘草苷、甘草素、甘草酸二钾、甘草查尔酮A、光甘草定、甘草次酸测定的空白，为化妆品的市场监督检验和标准制定提供有利的技术支持。

采用本发明高效液相色谱测定化妆品中甘草七种功效成分甘草苷、异甘草苷、甘草素、甘草酸二钾、甘草查尔酮A、光甘草定、甘草次酸，其检出限为0.6ng-1.0ng，平均回收率为92.5％-102.7％，日内精密度RSD RSD 0.1％-1.8％，日间精密度(稳定性)RSD0.3％-2.0％。

附图说明

图1为本发明实施例提供的甘草七种标准溶液的高效液相色谱图。(按照具体实施方式中3.色谱条件进行测定的色谱图)，其中1.甘草苷 2.为异甘草苷 3.甘草素 4.甘草酸二钾(甘草酸) 5.甘草查尔酮A 6.光甘草定 7.甘草次酸。

图2为本发明实施例1提供的样品中含有甘草酸二钾(甘草酸)的色谱图，其中1为甘草酸二钾(甘草酸)。

图3为本发明实施例2提供的样品中含有甘草次酸的色谱图，其中1为甘草次酸。

图4为本发明实施例3提供的样品中同时含有甘草酸二钾(甘草酸)和光甘草定的色谱图，其中1.甘草酸二钾(甘草酸)2.光甘草定。

图5为本发明实施例4提供的样品中含有光甘草定的色谱图，其中1为光甘草定。

图6为实施例5七种混合标准溶液在Inspire C8柱的色谱图，其中1.甘草苷 2.为异甘草苷 3.甘草素 4.甘草酸二钾(甘草酸) 5.甘草查尔酮A 6.光甘草定 7.甘草次酸。

图7为实施例6七种混合标准溶液在Discovery RP Amide C16的色谱图。

图8为实施例7七种混合标准溶液在流动相为0.5％(v/v)甲酸的色谱图其中1.甘草苷 2.为异甘草苷 3.甘草素 4.甘草酸二钾(甘草酸) 5.甘草查尔酮A 6.光甘草定 7.甘草次酸。

图9为实施例8七种混合标准溶液在流动相为0.5％(v/v)乙酸的色谱图其中1.甘草苷 2.为异甘草苷 3.甘草素 4.甘草酸二钾(甘草酸) 5.甘草查尔酮A 6.光甘草定 7.甘草次酸。

图10为实施例9七种混合标准溶液在流动相为0.02mol/L磷酸氢二铵的色谱图其中1.甘草苷 2.为异甘草苷 3.甘草素 4.甘草酸二钾(甘草酸) 5.甘草查尔酮A 6.光甘草定 7.甘草次酸。

图11为实施例10七种混合标准溶液在流动相为0.01％(v/v)磷酸的色谱图其中1.甘草苷 2.为异甘草苷 3.甘草素 4.甘草酸二钾(甘草酸) 5.甘草查尔酮A 6.光甘草定 7.甘草次酸。

图12为实施例11七种混合标准溶液在流动相为0.03％(v/v)磷酸的色谱图其中1.甘草苷 2.为异甘草苷 3.甘草素 4.甘草酸二钾(甘草酸) 5.甘草查尔酮A 6.光甘草定 7.甘草次酸。

图13为实施例12七种混合标准溶液在流动相为0.07％(v/v)磷酸的色谱图其中1.甘草苷 2.为异甘草苷 3.甘草素 4.甘草酸二钾(甘草酸) 5.甘草查尔酮A 6.光甘草定 7.甘草次酸。

图14为实施例13七种混合标准溶液在柱温为30℃的色谱图其中1.甘草苷 2.为异甘草苷 3.甘草素 4.甘草酸二钾(甘草酸) 5.甘草查尔酮A 6.光甘草定 7.甘草次酸。

图15为实施例14七种混合标准溶液在柱温为40℃的色谱图其中1.甘草苷 2.为异甘草苷 3.甘草素 4.甘草酸二钾(甘草酸) 5.甘草查尔酮A 6.光甘草定 7.甘草次酸。

图16为实施例15七种混合标准溶液在流速为0.8mL/min的色谱图其中1.甘草苷 2.为异甘草苷 3.甘草素 4.甘草酸二钾(甘草酸)5.甘草查尔酮A 6.光甘草定 7.甘草次酸。

图17为实施例16七种混合标准溶液在流速为1.2mL/min的色谱图其中1.甘草苷 2.为异甘草苷 3.甘草素 4.甘草酸二钾(甘草酸)5.甘草查尔酮A 6.光甘草定 7.甘草次酸。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明：

1.仪器

Agilent Technologies 1260型高效液相色谱系统，配G4212B-1260DAD二极管阵列检测器；超声机AS3210A，天津奥特赛恩斯仪器有限公司；高速台式离心机GT10-1，北京时代北利离心机有限公司；旋转蒸发器RE-52A，上海亚荣生化仪器厂；HANNAHI2221 Calibration cheek PH/ORP Meter。

2.试剂

乙腈，色谱纯，批号：13010291，TEDIA；磷酸，分析纯AR，批号：T20091109，国药集团化学试剂有限公司；纯净水：娃哈哈饮用纯净水；

对照品甘草苷，批号：111610—201106，含量93.7％，中国食品药品研究院；异甘草苷，批号：EKKS1071，含量≥98.0％，EKEAR；甘草素，批号：00012290—820，Chroma DEX；甘草酸二钾，批号：WP27E—HC，TCI；甘草查尔酮A，批号：BCBJ5290V，含量96.0％，SIGMA；光甘草定，批号：070K1056V，含量≥98.0％，SIGMA；甘草次酸，批号：110723—200612，中国药品生物制品检定所。

3.色谱条件

色谱柱：ODS—2HYPERSIL 250mm×4.6mm，5μm，批号11879；

检测器：G4212B-1260DAD(二极管阵列检测器)，G1314F-1260VWD紫外检测器。

检测波长：237nm。

流动相：采用乙腈-0.05％磷酸溶液梯度洗脱，35min内完成检测，0→4min：乙腈22％(v/v)，0.05％磷酸78％(v/v)；4→27min：乙腈22％(v/v)→80％(v/v)，0.05％磷酸(v/v)78％(v/v)→20％(v/v)；27→35min乙腈80％(v/v)→22％(v/v)，0.05％磷酸20％(v/v)→78％(v/v)。

流速：1.0mL/min

柱温：25℃

进样量：10uL

4.标准品储备液配制

精密称取0.0100g甘草苷、异甘草苷、甘草素、甘草酸二钾、甘草查尔酮A、光甘草定、甘草次酸标准品分别置于10mL容量瓶中，加甲醇溶解，并用甲醇定容，摇匀，配制成浓度为1mg/mL的标准液作为储备液，于4℃冰箱中存放备用。

5.标准工作液及线性回归方程

用甲醇将甘草苷、异甘草苷、甘草素、甘草酸二钾、甘草查尔酮A、光甘草定、甘草次酸储备液稀释成如表1的标准浓度系列，按3.色谱条件进行高效液相色谱定性定量分析，得到线性回归方程及相关系数(以峰面积Y为纵坐标，浓度X为横坐标)。

表1 七种化合物的标准液浓度、线性方程及相关系数

6.混合标准溶液配制

取上述甘草苷标准储备液浓度0.05mL、异甘草苷标准储备液浓度0.16mL、甘草素标准储备液浓度0.14mL、甘草酸二钾标准储备液浓度0.1mL、甘草查尔酮A标准储备液浓度0.05mL、光甘草定标准储备液浓度0.1mL、甘草次酸标准储备液浓度0.1mL、甲醇溶剂0.4mL置于液相进样瓶中，作为混合标准溶液，按3.色谱条件进行高效液相色谱分析。结果显示:当已腈体积含量为26.4％-29.1％，0.05％磷酸溶液体积含量为73.6％-70.9％，收集5.945min的组分即为甘草苷；当已腈体积含量为37.3％-38.8％，0.05％磷酸溶液体积含量为62.7％-61.2％，收集10.235min的组分即为异甘草苷；当已腈体积含量为43.5％-45.0％，0.05％磷酸溶液体积含量为56.5％-55.0％，收集12.650min的组分即为甘草素；当已腈体积含量为53.1％-54.3％，0.05％磷酸溶液体积含量为46.9％-45.7％，收集16.535min的组分即为甘草酸二钾(甘草酸)；当已腈体积含量为66.4％-67.7％，0.05％磷酸溶液体积含量为33.6％-32.3％，收集21.737min的组分即为甘草查尔酮A；当已腈体积含量为70.2％-71.4％，0.05％磷酸溶液体积含量为29.8％-28.6％，收集23.223min的组分即为光甘草定；当已腈体积含量为66.4％-62.2％，0.05％磷酸溶液体积含量为33.6％-37.8％，收集29.031min的组分即为甘草次酸，见图1。

本发明以国家抽检样品和委托检验样品70批次各种剂型美白化妆品作为样品进行检测。

实施例1

待处理样品为化妆品中的面膜(样品编号为HC20120259)：挤压面膜取其液体，准确称取液体两份平行样，每份0.8g(精确到0.01g)于15mL刻度离心管中，加70％甲醇至12mL，超声提取45min，温度40℃，5000r/min离心15分钟，转移提取液于旋转蒸发瓶中，再往15mL刻度离心管中加70％甲醇至12mL，超声提取30min，温度40℃，5000r/min离心15分钟，合并两次提取液，旋转蒸发至2～5mL，转移至10mL刻度管中，用甲醇定容，经0.45μm滤膜过滤，滤液按照3.色谱条件进行定性定量分析，结果检出甘草酸(甘草酸二钾)，收集16.445min的组分即为甘草酸(甘草酸二钾)，见图2。

样品含量计算：

X---样品浓度μg/mL，V---定容体积mL，A---样品称样量g

实施例1面膜检出甘草酸二钾(甘草酸)，峰面积代入5.标准工作液及线性回归方程之甘草酸二钾(甘草酸)回归方程得到浓度，代入含量公式，计算出面膜甘草酸含量900mg/kg。

实施例2

待处理样品为化妆品中的精华霜(样品编号为HC20120366)：准确称取精华霜样品两份平行样，每份1.0g(精确到0.01g)于50mL刻度离心管中，加70％甲醇至30mL，超声提取45min，温度40℃，5000r/min离心15分钟，转移提取液于旋转蒸发瓶中，再往50mL刻度离心管中加70％甲醇至30mL，超声提取30min，温度40℃，5000r/min离心15分钟，合并两次提取液，旋转蒸发至2～5mL，转移至10mL刻度管中，用甲醇定容，经0.45μm滤膜过滤，滤液按照3.色谱条件进行定性定量分析，结果检出甘草次酸，收集28.936min的组分即为甘草次酸，见图3。

实施例2精华霜检出甘草次酸，峰面积代入5.标准工作液及线性回归方程之甘草次酸回归方程得到浓度，代入样品含量计算公式，计算出精华霜甘草次酸含量500mg/kg。

实施例3

待处理样品为化妆品中的精华乳(样品编号为HC20120363)：准确称取精华乳样品两份平行样，每份0.7g(精确到0.01g)于50mL刻度离心管中，加70％甲醇至20mL，超声提取45min，温度40℃，5000r/min离心15分钟，转移提取液于旋转蒸发瓶中，再往50mL刻度离心管中加70％甲醇至20mL，超声提取30min，温度40℃，5000r/min离心15分钟，合并两次提取液，旋转蒸发至2～5mL，转移至10mL刻度管中，用甲醇定容，经0.45μm滤膜过滤，滤液按照3.色谱条件进行定性定量分析，结果检出甘草酸二钾(甘草酸)和光甘草定，收集16.457min的组分即为甘草酸二钾(甘草酸)，收集23.257min的组分即为光甘草定，见图4。

实施例3精华乳检出甘草酸二钾(甘草酸)和光甘草定，峰面积分别代入5.标准工作液及线性回归方程之甘草酸二钾(甘草酸)和光甘草定回归方程得到浓度，分别代入样品含量计算公式，计算出精华乳中甘草酸二钾(甘草酸)含量1200mg/kg，光甘草定含量350mg/kg。

实施例4

待处理样品为化妆品中的精华露(样品编号为HW20130025)：准确称取精华乳样品两份平行样，每份1.2g(精确到0.01g)于50mL刻度离心管中，加70％甲醇至40mL，超声提取45min，温度40℃，5000r/min离心15分钟，转移提取液于旋转蒸发瓶中，再往50mL刻度离心管中加70％甲醇至40mL，超声提取30min，温度40℃，5000r/min离心15分钟，合并两次提取液，旋转蒸发至2～5mL，转移至10mL刻度管中，用甲醇定容，经0.45μm滤膜过滤，滤液按照3.色谱条件进行定性定量分析，结果检出光甘草定，收集23.258min的组分即为光甘草定，见图5。

实施例4精华露检出光甘草定，峰面积代入5.标准工作液及线性回归方程之光甘草定回归方程得到浓度，代入样品含量计算公式，计算出精华露中光甘草定含量450mg/kg。

本发明方法回收率、精密度、稳定性、检出限的测定

取不含甘草苷、异甘草苷、甘草素、甘草酸二钾、甘草查尔酮A、光甘草定、甘草次酸的七种化合物样品，分别添加七种化合物的低点浓度和高点浓度标准溶液，每个添加水平取2个平行样，计算低点回收率为92.5％-102.7％，高点回收率为93.2％-101.4％(见表2)；每个平行样连续测定6次，得到日内精密度RSD0.1％-1.8％(见表3)；连续测定3天，得到日间精密度(稳定性)RSD0.3％-2.0％(见表4)。逐级稀释七种化合物的标准溶液加入到空白样品中，当信噪比(S/N)为3时，得到检出限为0.6-1.0ng(见表5)。由此可知本发明有较好的回收率、精密度、稳定性和检出限，适合实际样品的分析。

表2.甘草七种化合物回收率

表3.甘草七种化合物日内精密度RSD

表4.甘草七种化合物日间精密度(稳定性)RSD

表5.甘草七种化合物检出限

由上述可见本发明准确、高效、灵敏度高，样品处理方法简便，适用于化妆品中甘草七种功效成分甘草苷、异甘草苷、甘草素、甘草酸二钾(甘草酸)、甘草查尔酮A、光甘草定、甘草次酸的定性和定量分析。

采用与实施例1相同条件的检测条件(只是待测化妆品样品不同)，在运用本发明检测的70批次各种剂型美白化妆品中，检出甘草酸二钾(甘草酸)26个批次，占37％，检出甘草次酸3个批次，占4％，检出光甘草定7个批次占10％。，随着甘草功效成分被越来越多地应用到化妆品中，那么，加强化妆品功效性监管，建立药妆法规，建立甘草功效成分检测标准，已迫在眉睫，本发明以理论分析和大量实验，找到了一种利用高效液相色谱同时测定化妆品中甘草七种功效成分甘草苷、异甘草苷、甘草素、甘草酸二钾、甘草查尔酮A、光甘草定、甘草次酸的方法，填补了化妆品中甘草七种功效成分分析空白，是非常值得推广的方法。

实施例5

采用上述1-6的条件进行检测，与其中3.色谱条件不同之处在于采用的色谱柱：Inspire C8(辛烷基硅烷键合硅胶为C8的填充剂柱)，C8柱规格为：250mm×4.6mm，5μm。

混合标准溶液检测结果如图6所示：证明C8柱的检测效果也很好，用此C8柱可以。

实施例6

采用上述1-6的条件进行检测，与其中3.色谱条件不同之处在于采用的色谱柱：Discovery RP Amide C16，250mm×4.6mm，5μm。

混合标准溶液检测结果如图7所示：峰型不对称，分辨率低，少一个峰，用此C16柱不适合。

实施例7

采用上述1-6的条件进行检测，采用的色谱柱：C18ODS—2HYPERSIL，250mm×4.6mm，5μm。

与其中3.色谱条件不同之处在于：流动相体积浓度0.5％(v/v)甲酸代替0.05％(v/v)磷酸，其它条件：与上述3色谱条件一致；

混合标准溶液检测结果如图8所示：七种目标化合物检出，但甲酸有吸收，基线噪音大，随着梯度洗脱基线严重漂移，流动相甲酸不适合应用。

实施例8

与其中3.色谱条件不同之处在于：流动相体积浓度0.5％(v/v)乙酸代替0.05％(v/v)磷酸，其它条件：与上述3色谱条件一致；

混合标准溶液检测结果如图9所示：七种目标化合物检出，但乙酸有吸收，基线噪音大，随着梯度洗脱基线漂移，流动相乙酸不适合应用。

实施例9

与其中3.色谱条件不同之处在于：流动相0.02mol/L磷酸氢二铵(PH＝8.0)代替0.05％(v/v)磷酸，其它条件：与上述3色谱条件一致；

混合标准溶液检测结果如图10所示：目标化合物峰型脱尾，七种化合物没有完全检出，磷酸氢二铵流动相不适合应用。

实施例10

与其中3.色谱条件不同之处在于：流动相0.01％(v/v)磷酸代替0.05％(v/v)磷酸，其它条件：与上述3.色谱条件一致；

混合标准溶液检测结果如图11所示：七种目标化合物全部检出，而且分辨率高，灵敏度高，0.01％(v/v)磷酸流动相适合应用。

实施例11

与其中3.色谱条件不同之处在于：流动相0.03％(v/v)磷酸代替0.05％(v/v)磷酸，其它条件：与上述3.色谱条件一致；

混合标准溶液检测结果如图12所示：七种目标化合物全部检出，而且分辨率高，灵敏度高，0.03％(v/v)磷酸流动相适合应用。

实施例12

与其中3.色谱条件不同之处在于：流动相0.07％(v/v)磷酸代替0.05％(v/v)磷酸，其它条件：与上述3.色谱条件一致；

混合标准溶液检测结果如图13所示：七种目标化合物全部检出，而且分辨率高，灵敏度高，0.07％(v/v)磷酸流动相适合应用。

实施例13

与其中3.色谱条件不同之处在于：柱温30℃代替25℃，其它条件：与上述3.色谱条件一致；

混合标准溶液检测结果如图14所示：七种目标化合物全部检出，而且分辨率高，灵敏度高，柱温30℃适合应用。

实施例14

与其中3.色谱条件不同之处在于：柱温40℃代替25℃，其它条件：与上述3.色谱条件一致；

混合标准溶液检测结果如图15所示：七种目标化合物全部检出，而且分辨率高，灵敏度高，柱温40℃适合应用。

实施例15

与其中3.色谱条件不同之处在于：0.8mL/min流速代替1.0mL/min流速，其它条件：与上述3.色谱条件一致；

混合标准溶液检测结果如图16所示：七种目标化合物全部检出，而且分辨率高，灵敏度高，0.8mL/min流速适合应用。

实施例16

与其中3.色谱条件不同之处在于：1.2mL/min流速代替1.0mL/min流速，其它条件：与上述3.色谱条件一致；

混合标准溶液检测结果如图17所示：七种目标化合物全部检出，而且分辨率高，灵敏度高，1.2mL/min流速适合应用。

Claims

1.一种测定化妆品中甘草七种功效成分的方法，其特征在于：

七种功效成分别为甘草苷、异甘草苷、甘草素、甘草酸二钾、甘草查尔酮A、光甘草定、甘草次酸；

进行液相色谱测定时，采用C18柱或C8柱，使用紫外检测器或二极管阵列检测器在237进行检测，采用乙腈-磷酸溶液流动相，梯度洗脱；

具体梯度洗脱体积比为：0→4min：乙腈22％，0.05％磷酸78％；4→27min：乙腈22％→80％，0.05％磷酸78％→20％；27→35min乙腈80％→22％，0.05％磷酸20％→78％；

其中，待测样品与甲醇按质量体积比为1:10-40g/ml；流动相采用体积比为22-80％乙腈：78-20％的浓度为0.01-0.07％磷酸溶液；

2.按权利要求1所述的测定化妆品中甘草七种功效成分的方法，其特性在于：具体为，

将待测化妆品样品的甲醇提取液上样进行液相色谱测定，采用甘草七种功效成分标准品的甲醇溶液作为参比上样进行液相色谱测定，定性确定待测化妆品样品是否含有甘草七种功效成分中的一种或二种以上，或者定量确定待测化妆品样品甘草七种功效成分中的一种或二种以上的含量；

所述样品分析采用外标法，根据其保留时间及光谱进行定性分析，根据其峰面积进行定量分析。

3.按权利要求1或2所述的测定化妆品中甘草七种功效成分的方法，其特性在于：

向待测样品中加入浓度体积比为60％-80％的甲醇，反复超声提取并离心，合并离心上清液，至旋转蒸发瓶中，旋转蒸发至不超过定容体积，转移至刻度管中以甲醇定容，经0.45μm滤膜过滤，滤液进行液相色谱测定。

4.按权利要求3所述的测定化妆品中甘草七种功效成分的方法，其特性在于：所述待测样品为化妆品中的膏、霜、水剂、乳液、面膜或浴液；

所述以面膜为待测样品时，取样时挤压面膜取其液体，而后向面膜挤压的液体中加入体积比为60％-80％甲醇。

5.按权利要求3所述的测定化妆品中甘草七种功效成分的方法，其特征在于：所述超声提取时间为30-50min，温度40℃；而后以5000-8000r/min离心，离心时间10-20min。

6.按权利要求3所述的测定化妆品中甘草七种功效成分的方法，其特征在于：

所述滤液进行液相色谱测定，所述采用十八烷基硅烷键合硅胶为C18柱的填充剂，C18柱规格为4.6mm*250mm，5μm；或采用辛烷基硅烷键合硅胶为C8柱的填充剂，C8柱规格为4.6mm*250mm，5μm。

7.按权利要求1或2所述的测定化妆品中甘草七种功效成分的方法，其特征在于：所述使用紫外检测器或二极管阵列检测器在237nm进行检测。

8.按权利要求1、2或6所述的测定化妆品中甘草七种功效成分的方法，其特征在于：所述样品根据其保留时间和光谱进行定性分析，利用外标法根据其峰面积进行定量分析；

采用C18柱，温度25℃，流速1.0mL/min时，当乙腈体积含量为26.4％-29.1％，0.05％磷酸溶液体积含量为73.6％-70.9％，收集5.945min组分即为甘草苷；当乙腈体积含量为37.3％-38.8％，0.05％磷酸溶液体积含量为62.7％-61.2％，收集10.235min组分为异甘草苷；当乙腈体积含量为43.5％-45.0％，0.05％磷酸溶液体积含量为56.5％-55.0％，收集12.650min组分为甘草素；当乙腈体积含量为53.1％-54.3％，0.05％磷酸溶液体积含量为46.9％-45.7％，收集16.535min组分为甘草酸二钾；当乙腈体积含量为66.4％-67.7％，0.05％磷酸溶液体积含量为33.6％-32.3％，收集21.737min组分为甘草查尔酮A；当乙腈体积含量为70.2％-71.4％，0.05％磷酸溶液体积含量为29.8％-28.6％，收集23.223min组分为光甘草定；当乙腈体积含量为66.4％-62.2％，0.05％磷酸溶液体积含量为33.6％-37.8％，收集29.031min组分为甘草次酸；

或，采用C8柱,温度25℃，流速1.0mL/min时,当乙腈体积含量为32.5％-34.1％，0.05％磷酸溶液体积含量为67.5％-65.9％，收集8.412min组分即为甘草苷；当乙腈体积含量为40.9％-41.8％，0.05％磷酸溶液体积含量为59.1％-58.2％，收集11.633min组分为异甘草苷；当乙腈体积含量为49.7％-50.7％，0.05％磷酸溶液体积含量为50.3％-49.3％，收集15.129min组分为甘草素；当乙腈体积含量为54.6％-55.5％，0.05％磷酸溶液体积含量为45.4％-44.5％，收集17.052min组分为甘草酸二钾；当乙腈体积含量为70.8％-72.2％，0.05％磷酸溶液体积含量为29.2％-27.8％，收集23.515min组分为甘草查尔酮A；当乙腈体积含量为74.6％-75.6％，0.05％磷酸溶液体积含量为25.4％-24.4％，收集25.032min组分为光甘草定；当乙腈体积含量为60.1％-57.2％，0.05％磷酸溶液体积含量为39.9％-42.8％，收集29.796min组分为甘草次酸。