CN1258371C - 包括大根草有机提取物的组合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了大根草(Geum Japonicum thunb var.)的有机提取物(EGJ)，以及包含所述大根草有机提取物的药用组合物。已经鉴定有机EGJ表现出有效的双重作用，即刺激缺血性心肌和心梗心肌中新血管的早期生长(少于48个小时)，以及引发心肌梗塞的心肌再生，因此所述有机EGJ可用于治疗人类或者动物的缺血性疾病，包括缺血性心脏病和缺血性四肢，以及与心肌损伤相关的疾病。

Description

包括大根草有机提取物的组合物及其应用

发明领域

本发明涉及大根草(Geum Japonicum thunb var.)提取物(EGJ)的应用，特别是应用EGJ有机提取物治疗人和动物的缺血性疾病，包括缺血性心脏病和缺血性四肢，以及与心肌损伤相关的疾病。

发明背景

大根草(Geum Japonicum thunb var.)是一种广泛生长于中国江苏省，江西省，贵州省和云南省的植物。水杨梅属(Geum)是一个包含65个根茎草本植物或小灌木种的属，叶简单或者羽状浅裂，花整齐，所述属包括诸如G.Borisii，G.chiloense，G.coccineum，G.macrophyllum，G.montanum，G.reptans，G.rivale，G.triflorum，G.urbanum和G.japonicum等。大根草(Geum japonicum thunb.)是一种蔷薇科(Rosaceae)的多年生草本和开花植物。大根草全植物水浸提物被用作传统中药里的利尿剂(Perry，L.M.的，东亚和东南亚的药用植物，MIT Press，Cambridge，Mass.，343页(1980))。已知水杨梅属植物富含单宁。已从Geum japonicum中分离出几种可水解的单宁，例如水杨酸素(gemin)A，B，C，D，E和F(Dong，H.，Chen，S.X.，Kini，R.M.，和Xu，H.X.，J.Nat.Products.61，1356-60(1998))。除了单宁外，已分离出几种三萜化合物，包括2-羟基齐墩果酸(2-hydroxyoleanolicacid)，2-羟基熊果酸(2-hydroxyursolic acid)，2，19-二羟基熊果酸(2-dihydroxyursolic acid)，2，3，19，23-四羟基熊果-12烯-28酸-28-O-D-吡喃葡萄糖苷(Xu，H.X.，Zeng，F.Q.，Wan，M.，和sim，K.Y.，J.Nat.Products，59，643-5(1996))。

然而还没有公开关于EGJ用于治疗缺血性疾病和心肌损伤的信息。缺血性疾病，例如冠心病仍然是西方世界诸如美国，以及亚洲发达地区诸如香港的首要死因，而现在也成为中国的首要死因(AmericanHeart Asseciation，2001心脏和中风统计更新，Dallas，Texas：AmericanHeart Asseciation，2000，1-32)。目前可行的治疗方法只能缓解症状，而且不幸的是即使有所有目前的进展，因为缺乏在缺血心肌的早期阶段生长功能性新血管的方法，以及不能再生心肌细胞，所以缺血性疾病和心肌损伤的治疗仍然是困难的(Uchida，Y.，Yanagisawa-Miwa，A.，Nakamura，F.，Yamada，K.，Tomaru，T.，kimura，K.，和Morita，T.，AmHeart J.130：1182-1188(1995)；Lazarous，D.F.，Scheinowitz，M.，Shou，M.，Epstein，S.E.，等人，Circulation 91：145-152(1995)；Pu，L.Q.，Sniderman，A.D.，Brassard，R.，Lachapelle，K.J.，Graham，A.M.，Lisbona，R.，andsymes，J.F.，Circulation 88：208-215(1993)。根据从前对于急慢性缺血性动物模型或者临床试验的研究，通过使用诸如VEGF，aFGF，bFGF，或者PDGF的生长因子诱导血管发生需要时间(需要3-9周)并且是受到限制的，(8-15)(Risau，W.，Nature 386：671-674(1997)；Folkman，J.，N.Engl.J.Med.333：1757-1763(1995)；Ware.J.A.，Angiogenesis and Cardiovascular Disease(J.A.Ware和M.Simons编辑)，Oxford University Press，New York，Oxford，30-59(1999)；Ware，J.’A.，和Simons，M.，Nat.Med.3：158-164(1997)；Arras，M.，Ito，W.D.，Scholz，D.，Winkler，B.，Schaper，J.，和Schaper，W.，J.Clin.Invest.101：40-50(1998)；Banai，S.，Jaklitsch，M.T.，Casscells，W.，Shou，M.，Shrivastav，S.，Correa，R.，Epstein，S.E.和Unger，E.F.，Circ.Res.69，76-85(1991)；Arras，M.，Mollnau，H.，Strasser，R.，Ito，W.D.，Schaper，J.，和Schaper，W.，Nat.Biotechnol.16：159-162(1998)；Kurz，H.，Wilting，J.，Sandau，K.，和Christ，B.，Microvasc.Res.55：92，102(1998))，而由冠状动脉堵塞导致的心肌坏死的发生却很快(几小时)(Unger，E F.，Shou，M.，Sheffield，C.D.，Hodge，E.，Jaye，M.，& Epstein，S.E.，Am.J.Physiol.264：H1567-1574(1993)；Unger，E.F.，Banai，S.，Shou，M.，Jaklitsch，M.，Hodge，E.，Correa，R.，Jaye，M.，& Epstein，S.E.，Cardiovasc.Res.27：785-791(1993)；和Schlaudraff，K.，Schumacher，B.，von Specht，B.U.，Seitelberger，R.，Schlosser，V.，& Fasol，R.，Eur.J.Cardiothorac.Surg.7：637-643(1993))。因此，治疗性的早期血管发生和心肌发生可以提供最为有效的替代治疗策略，如果能够成功的话，这将成为许多缺血性疾病和心肌损伤的主要治疗选择。

至今为止，世界市场上没有能够诱导心脏早期血管发生和使得再生完全新的心肌的任何类似产品。根据从前对于急慢性缺血性动物模型或者临床试验的研究，一些生长因子诸如VEGF，aFGF，bFGF或者PDGF能够在一定水平上促进血管发生，但是它需要时间(需要几周)，而由于冠状动脉堵塞造成的心肌坏死的发生非常迅速(在几小时内)。因此诱导早期血管发生成为缩小心脏梗塞灶面积和挽救染病组织的重要目标。而且，即使在科学和研究领域的所有最新进展中，也没有可用于心肌细胞再生的方法和任何药物。

在我们最近的研究中，我们鉴定到一种中草药-大根草的提取物在兔急性心肌梗塞模型中显示出刺激新血管早期生长(＜48小时)和心肌细胞再生的有效作用。相比较天然发生的血管发生和使用生长因子诱导的血管发生的几周时间，EGJ诱导的心肌中的血管发生只需要少于48小时的时间。因此如我们的动物试验所显示的，EGJ诱导的早期血管发生的这一独特特征对于开发出有效治疗缺血性疾病的新策略是非常有用的，特别是当心脏梗死发生时对于缩小梗塞灶面积，挽救染病的心肌细胞是非常重要的。

通过改善自然发生的血管再生过程来治疗缺血性血管疾病的治疗性血管发生的概念是非常有吸引力的想法。它使我们有机会使患缺血性相关疾病，诸如冠心病或者心肌梗塞的病人实现更完全的血管再生。对于缺血性心脏病而言，目前除了预防外，通过手术或者血管成形术，冠状动脉阻塞只能被缓解。目前没有有效的药物可以促进早期新血管的生长(血管发生)。而且，心肌梗塞发生后，心肌不能再生新的心肌细胞来取代损失的心肌细胞。而且取代坏死心肌的瘢痕组织还能导致心脏功能的损伤。因此，显然需要一种可选择的血管再生方法来治疗缺血性疾病和促进损坏的或者损失的心肌细胞的取代。治疗性的血管发生和心肌发生将是非常最有用的可选择的治疗策略，所述策略可能会成为治疗许多缺血性疾病，包括冠心病和缺血性四肢，以及损伤的心肌的主要的治疗选择。如果能够实现早期血管发生，可以用更具损伤性但更有效的治疗策略替代许多当前的治疗模式。

本发明的目的就是通过使用EGJ实现在梗塞心肌中早期阶段生长新血管和再生心肌细胞取代损伤的心肌。可以通过局部心肌注射将EGJ直接施用到缺血性心脏或者四肢的血管堵塞的末梢部分。对于不能够承受局部心肌注射并且证实没有赘生物形成或者肿瘤的病人，还可以开发口服给药(片剂)或者注射用药的制剂到病人的血液或者肌肉中。

本发明涉及大根草的有机提取物，尤其是甲醇提取物，所述提取物刺激缺血性心脏和心肌梗死的早期血管生成和心肌再生，因此可用于治疗缺血性疾病，诸如包括冠心病，心脏梗塞的缺血性心脏病，缺血性四肢，心肌损伤和组织修复。

发明概述

本发明的一个目的是提供一种包含有机EGJ的药用组合物，用于治疗病人与局部缺血，组织损伤和组织修复相关的疾病。本发明的药用组合物包含有效量的EGJ和药用载体。

本发明的另一个目的是提供有机EGJ制造药用组合物的应用，所述组合物用于治疗包括人类在内的受试者与局部缺血，组织损伤和组织修复相关的疾病，所述的应用包含将有效量的所述有机EGJ与药用载体或者其它的治疗剂，诸如用于治疗骨骼缺陷和疾病的骨骼形态发生蛋白混合。

本发明的另一目的是提供用有机溶剂制备大根草提取物的方法，所述提取物用于治疗受试者与局部缺血，组织损伤和组织修复有关的疾病。所述方法包含将所述植株破碎成碎片；将所述碎片用有机溶剂浸泡；过滤生成物；蒸发过滤物到干燥。

本发明的另一目的是提供用于治疗受试者与局部缺血，组织损伤和组织修复相关疾病的方法，所述包括给受试者施用有效治疗量的所述有机EGJ。

发明附图

图1显示了本发明的EGJ在培养物中不同剂量下促进HVEC的增殖。

图2显示了根据本发明用EGJ处理后的兔心脏梗塞灶面积的大小。

图3显示了根据本发明用EGJ处理后的兔心脏梗塞灶中形成充满血细胞的新血管。

图4显示了根据本发明用EGJ处理后的心脏梗塞灶中PCNA-染色阳性的心肌细胞是新再生的心肌细胞，尤其是梗塞灶的中心区域PCNA染色阳性的细胞群最为明显。

发明详述

在用有机溶剂从大根草植株制备抽提物的过程中，优选使用干燥的植株。在此情况下，植株优选破碎成粉末。

本发明中使用的缩写词“EGJ”，如果没有特别指出，是指大根草植株的如下所述有机溶剂的抽提物。

本发明的方法中使用的有机溶剂在25℃时为液态，可以选自脂肪族烃或者芳香族烃，酮(醛)，羧酸，酯和醚，它们没有被取代或者被一个或者多个取代基取代，或者其混合物。

本发明使用的术语“脂肪族烃”指的是烷烃，烯烃，炔烃和脂环族烃，通常包括4-20个碳。

术语“取代基”选自卤素，羟基，烷基，烯基，炔基，烷氧基，烷基硫代，链烯氧基，烯基硫代，炔氧基，炔基硫代。这些取代基中，优选低级烷基，低级烯基，低级炔基，低级烷氧基，低级烷基硫代，低级链烯氧基，低级烯基硫代，低级炔基氧基，低基炔基硫代。取代基数可以从1到3。

术语“烷基”指的是包括直链和支链基团的饱和脂肪族烃。优选地，烷基基团具有1到20个碳原子(任何时候的数值范围；例如此处使用的“1-20”，是指提到的基团，这里指的是烷基，可能含有1个碳原子，2个碳原子，3个碳原子，等等，直到包括20个碳原子)。

本发明使用的术语“低级烷基，低级烯基，低级炔基，低级烷氧基，低级烷基硫代，低级链烯氧基，低级烯基硫代，低级炔基氧基，低基炔基硫代”中包含1-6个碳原子。

在被取代的芳香族烃中，优选被氯和低级烷基诸如氯苯，甲苯和二甲苯取代。

在本发明的溶剂中，优选含有2-18个碳原子的醇，醚，酮，羧酸及其酯。这些溶剂中，优选低级烷基醇，更优选含1-4个碳原子的醇，最优选甲醇。

本发明的浸泡步骤可以在10-100℃温度下进行。这依赖于所使用溶剂的沸点。通常该步骤可以在10℃和该溶剂的沸点之间的温度下进行。优选地，该步骤在10-80℃温度下或常温下进行。

本发明的药物组合物中，术语“有效含量”或者“有效治疗量”对于本领域的技术人员是显而易见的。它依赖于受试者的年龄，体重，健康状态以及给药方式。通常，组合物中的提取物的重量百分比为从0.01％到99.99％，优选从1％到99％，更优选从10％到90％，而最优选从30％到70％。

此处使用的“病人”或者“受试者”是指人或者动物。通常，是指动物或者人。动物可以是家养或者野生动物，诸如牛，马，猪，鹿，兔，狗和其它患有此处提到的疾病的动物。

本发明提到的“活性成分”是指本发明中公开的有机溶剂的EGJ。

此处使用的“载体”或者“药用载体”是指一种组分或者成分，可接受意指它与此处公开的药物组合物的其它成分相容，且不会对组合物所施用的病患产生过度毒害，所述组合物包括任何和所有溶剂，稀释剂，和其它液体载体，分散和悬浮助剂，表面活性剂，等渗剂，增稠或乳化剂，防腐剂，固体粘合剂，润滑剂等等，并与所需的特定的剂型相匹配。因为本发明组合物的活性组分是脂溶性的，所以当组合物形成液体制剂时，活性组分首先溶解于包括如下组分的载体：2-12个碳原子的醇，诸如乙醇，正丙醇，异丙醇，正丁醇，和苯甲醇，甘油，丙二醇，N，N-二甲基乙酰胺，二甲基亚砜(DMSO)，橄榄油，棉子油，花生油，罂粟子油，芝麻油，大豆油和其它植物油，然后如果需要，配制成所需制剂。载体还可以包括选自通常用于药物制剂工艺的固体，诸如白明胶，乳糖，硬脂酸镁，滑石粉，碳酸钙，碳酸镁，淀粉(玉米淀粉和马铃薯淀粉)，以及其它在现有技术中公知的固体。

药物组合物还可以包含一种或者多种通常用于药物制剂工艺的成分，诸如表面活性剂，促进剂，调味剂，防腐剂，缓冲剂，填充剂，粘合剂，分解质，润滑剂，等，本领域的技术人员可以根据制备的制剂来确定。

本发明使用的药物组合物包括全身和局部制剂，其中优选的制剂适于吸入，口服，直肠，阴道，腔内，器官内，局部包括口腔，舌下，dernal，眼内，肠胃外，包括皮下，皮内，肌内，静脉内，关节内和透皮肤给药。

组合物可以以单个或者多单位剂量形式或者以散装形式存在，并且可以以制药工艺中广为人知的方法制备。所有方法包括将活性组分EGJ和组成一种或者多种附加成分的载体结合到一起的步骤。制剂通常通过将活性组合物与液体载体，细分的固体载体或者与二者均一而紧密地结合而制备，然后如果需要，将产物制成想要的剂型。

适于口服给药的组合物可以以分散单位，诸如胶囊，cachets，锭剂，或者片剂的形式存在，每一单位包含预定量的活性成分；以粉状或者颗粒的形式存在；或者以水溶液中的溶液或者悬浮液的形式存在；或者以水包油和油包水乳液的形式存在。口服给药的组合物优选包含本领域中公知的微囊涂料以防止组合物在胃中降解并提供活性成分在小肠中释放。适于口腔给药的组合物包括在香味基体中含有活性组分的锭剂，香味基体通常是蔗糖和阿拉伯树胶或者黄芪胶；或者在惰性基体诸如凝胶和甘油或者蔗糖和阿拉伯树胶中包含活性成分的软锭剂。

适于肠胃外给药的组合物包含活性组分无菌水相和非水相注射溶液，所述制备物优选与预定的接受者血液等渗。这些制备物可以包含抗氧化剂，缓冲剂，抑菌剂和使组合物与预定接受者血液等渗的溶质。水溶液和非水溶液的无菌悬浮液可以包含悬浮剂和增稠剂。所述组合物可以存在于单位剂量或者多单位剂量的容器中，如安瓿和小瓶的中，并且在使用前贮存在诸如盐水或者水等无菌液体载体中。可以从无菌粉末，颗粒和片剂制成临时的注射溶液和悬浮液。

根据本发明的适于皮肤局部施用的组合物优选采用油膏，乳油膏，洗剂，乳膏，凝胶，喷雾剂，气雾剂或者油的形式。

适于透皮肤给药的组合物可以采用离散小块的形式，从而和接受者的表皮亲密接触较长的时间。适于透皮肤给药的组合物还可以通过离子电渗疗法进行递送，通常采用活性成分的任选缓冲水溶液的形式。

活性组分优选配制成易于给药的剂量单位的形式以易于给药和均一剂量的形式。此处使用“剂量单位形式”指的是对治疗的病人合适的药物组合物的物理离散单位。每一剂量应当含有经计算的一定量的活性成分以产生所需要的治疗效果，所述活性成分单独使用或者与选定的药物载体结合。典型地，组合物活性成分以剂量单位的形式给药，所述剂量单位含有从约0.1mg到约500mg重量的组合物，优选从约1mg到约100mg。

本发明的活性成分可以以每天每kg接受者体重约从0.001到约120mg的剂量水平给药，优选每天每kg接受者体重从约0.01到大约30mg，每天一次或者数次，以获得所要的治疗效果。

通过实例，口服给药的合适剂量应当规定为每天每kg体重30mg，而静脉内给药的典型剂量应当规定为每天每kg体重1-10mg。

本发明的药物组合物用于治疗与缺血诸如缺血性心脏病和肢体缺血，器官损坏诸如软组织和硬组织损伤，手术刀口和要求新血管生成的组织愈合诸如大腿骨头(颈部)骨折或者低位1/3胫骨骨折相关的疾病。

为治疗骨骼肌肉损伤，皮肤损伤，手术刀口和其它的软组织损伤，优选局部给药的制剂。然而，对于治疗诸如烧伤的外部给药来说，乳膏，乳油或者粉剂是优先选择的剂型。为治疗心脏疾病，建议使用溶液进行局部注射，因此药物的局部浓度会很高而作用效果更好并且更有效。然而如果病人同时患有良性或恶性肿瘤，推荐不要采用全身注射或者口服给药，而局部注射是更为安全的途径。

根据本发明利用EGJ制备药物组合物治疗与缺血，组织损伤和组织愈合相关的疾病的过程中，将有效量的EGJ与一种或多种如上所述的载体混合。在所述药物组合物中，EGJ的重量百分比通常为从0.01％到99.99％。优选地，组合物中EGJ的重量百分比为从1-99％。

实施例

在从中药中筛选血管生成剂的过程中，大根草的甲醇提取物显示出刺激缺血性心肌和梗塞心肌中新血管早期生长(少于48小时)，和引发心肌梗塞中心肌再生的双重功效。

实施例1

从中国广东省收集的1kg的干燥大根草全植株被磨成粉状。然后将粉末在室温下浸泡于甲醇(8L)中2-3小时。将获得的产物进行过滤，滤液真空(50℃)蒸发到干燥得到粉末(50g)。

通过色谱和NMR分析显示EGJ主要含有丹宁，三萜化合物，包括2-α，19-α-二羟基-3-氧-12-ursen-28-oic acid，熊果酸，epimolic acid，maslinic acid，euscaphic acid，tormentic acid，tormentic acid的28-β-D-葡萄糖苷等。

实施例2

从实施例1中获得的EGJ粉末              0.4g

5％的DMSO水溶液                       100ml

EGJ粉末溶解于100ml5％DMSO水溶液中以得到工作溶液。

实施例3

实施例1的EGJ              0.1g

玉米淀粉                  0.5g

乳糖                      1.87g

硬脂酸镁                  0.03g

实施例1的EGJ，玉米淀粉，乳糖均一混合。向混合物加入少量水。过滤得到的物质并干燥。向混合物中加入硬脂酸镁并均一混合。使用造粒机将合成物制成小球。每个小球重250mg，并含有10mg的活性成分。

实施例4

实施例1的EGJ                       80mg

氯化钠                             8mg

EDTA                               1mg

磷酸钠缓冲液(pH6.5)                10mg

聚乙二醇醚                         10mg

蒸馏水                             加到2ml

所有组分溶解于蒸馏水中，然后向混合物中加入蒸馏水到2ml。用无菌过滤器过滤获得的溶液以制成鼻吸入剂。

实验1

如图1所示，使用EGJ的5％DMSO溶液(实施例2)进行刺激培养的人血管内皮细胞(HVEC)和肌肉细胞(C2C12增殖)实验以检测其特异性血管生成和肌肉生成活性。在图1中，参照数字1，2，和3分别显示了相同培养条件下的不同培养平板。比较5％DMSO对照，EGJ能够明显以剂量依赖性的方式促进培养物中HVEC的增殖。根据我们的动物实验证明，EGJ溶液显示出对于梗塞心肌的血管生成和肌肉生成的有效的双重效果。在色谱检测中，将EGJ溶解于溶剂中，并加样于10％甲醇平衡的Sephadex LH-20柱上，用梯度水-甲醇(增加甲醇的量)洗脱。洗脱得到12个小部分，并检测它们促进培养的HVEC和C2C12细胞增殖的双重活性。具有特异性双重活性的甲醇提取物(EGJ)进一步用于随后的体内实验。使用NMR测定活性部分中含有的化合物的同一性。

实验2

这种EGJ的5％DMSO溶液进一步应用于兔心脏梗塞模型以研究对于心肌的效果。选择兔子作为心脏梗塞模型的原因是兔子具有不与小动脉连接的末端动脉，因此急性冠状动脉堵塞能够导致快速的透膜梗塞。分别结扎实验动物的左回旋支(LCX)或者左前降支动脉(LAD)。连接后立即分别对结扎动脉的末梢端单独注射EGJ(0.5ml的EGJ的5％DMSO的饱和溶液)或者对照溶液(5％DMSO)。结扎后第4天或者第7天处死动物取出心脏用于组织研究。

图2显示，如蓝色箭头所示的EGJ处理的动物(a)梗塞灶面积比对照(b)小3-5倍。

图3显示，如蓝色箭头所示的EGJ处理的动物(a & c)梗塞灶切片中观察到许多充满血液细胞的新形成血管。相比较下，对照(b & d)中观察到更少的血管。

图4(b)显示出在第7天EGJ处理的心脏围绕梗塞灶边缘有大量带有PCNA染色阳性的细胞核的新的再生心肌细胞，其中一些组织成为细胞簇，同时如黑色箭头所示有大量血管存在。相比之下，如图4(a)所示，围绕梗塞灶边缘只有很少的PCNA染色阳性的新的再生心肌细胞，对照心脏中没有中央成簇的新的再生心肌细胞，而主要是成纤维细胞存在于梗塞灶中。切片进一步使用单克隆肌球蛋白重链(MF20)抗体进行组织化学染色以证明PCNA染色阳性的核是心肌细胞。图4中，(c)是(b)中蓝色箭头围绕区域的高倍视野，而在(d)中，如蓝色箭头所示，许多新的再生心肌细胞也存在于EGJ处理心脏中围绕梗塞灶的边缘。

使用抗PCNA的单克隆抗体进行免疫组织化学染色时，只有新的再生细胞核染色呈阳性。使用抗MF20的免疫组织化学染色方法，只有心肌细胞染色呈阳性。将这些双重免疫组织化学染色方法和形态学分析相结合，新的再生心肌细胞能够被很可靠地鉴别出来。围绕梗塞灶的完整未损伤心肌细胞的细胞核的PCNA染色呈阴性，而细胞质的MF20染色呈阳性(褐染的细胞)。

尽管本发明以一定的优选实施方案来描述和例证，但是其它实施方案对于本领域技术人员而言也是显而易见的。因此，本发明不限于所描述和例证的特定实施方案，只要不脱离本发明的精神可以对其进行修正和改变，附加权利要求限定了本发明的全部范围。

Claims (16)

1.一种用于治疗受试者与缺血，组织损伤和组织愈合相关的疾病的药物组合物，所述组合物包含有效量的大根草的含1-6个碳原子烷基醇的提取物EGJ，以及一种药用载体。

2.根据权利要求1的药物组合物，其中所述组合物包含从0.01％到99.99％重量的所述提取物。

3.根据权利要求1的药物组合物，其中所述受试者为人类。

4.根据权利要求1的药物组合物，其中所述烷基醇含1-4个碳原子。

5.根据权利要求4的药物组合物，其中所述烷基醇是甲醇。

6.根据权利要求1-5任一项的药物组合物，其中所述疾病包括与缺血性心脏病，缺血性四肢，软组织或者硬组织损伤，手术刀口，大腿骨头颈部骨折或者低位1/3胫骨骨折相关的疾病。

7.通过有机溶剂从大根草植物制备提取物的方法，所述方法包含如下步骤：

i)将所述植物破碎成碎片；

ii)用含1-6个碳原子烷基醇浸泡所述碎片；

iii)过滤步骤ii)获得的产物；和

iv)将过滤物蒸发至干。

8.根据权利要求7的方法，其中所述植物在破碎前是干燥的。

9.根据权利要求7或8的方法，其中所述步骤ii)在10到80℃之间的温度下进行。

10.根据权利要求7的方法，其中所述步骤ii)是在常温下进行的。

11.EGJ在制备用于治疗与缺血，组织损伤和组织愈合相关疾病的药物组合物中的应用，所述组织愈合需要重构血液供应的早期血管再生。

12.根据权利要求11的应用，其中所述疾病包括冠心病和心肌梗塞。

13.根据权利要求11的应用，其中所述疾病是与心肌损伤相关的疾病。

14.根据权利要求11的应用，其中所述疾病是与心肌细胞损伤或者丧失相关的疾病。

15.根据权利要求11的应用，其中所述疾病是与包括软组织和硬组织愈合的组织愈合相关的疾病，所述的组织愈合需要重构血液供应。

16.根据权利要求11的应用，其中所述疾病包含与缺血性四肢相关的疾病。

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