ES2353378T3 - Composiciones que comprenden extractos orgánicos de geum japonicum var. thunb y el uso de las mismas. - Google Patents

Abstract

Una composición farmacéutica para uso en el tratamiento de enfermedades asociadas con el corazón isquémico y el infarto de miocardio en un sujeto por estimulación de la angiogénesis y la miogénesis tempranas en el corazón isquémico y el infarto de miocardio, que comprende una cantidad eficaz de un extracto de Geum japonicum var. thunb en un disolvente orgánico y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Description

Campo de la invención

La invención se refiere a un uso del extracto de Geum japonicum var. thunb (EGJ), en particular a un uso de un EGJ orgánico en el tratamiento de enfermedades isquémicas en seres humanos o animales, incluyendo la cardiopatía isquémica y la isquemia de los miembros y de enfermedades asociadas con un miocardio dañado. Antecedentes de la invención

Geum japonicum var. thunb es una planta que crece, por lo general, en las provincias de Jiangsu, Jiangxi, Guizhou y Yunan, en China. El género Geum consta de 65 especies de hierbas y subarbustos rizomatosos con hojas lobuladas simples o pinnadas y flores regulares, como G. borisii, G. chiloense, G. coccineum, G. macrophyllum, G. montanum, G. reptans, G. rivale, G. triflorum, G. urbanum, G. japonicum, etc. Geum japonicum thunb es una hierba perenne y una planta con flores de la familia de las Rosaceae. El extracto acuoso de la planta completa de Geum japonicum thunb ha sido usado como diurético en la medicina tradicional china, Perry, L. M., en Medical Plants of East and Southeast Asia, MIT Press, Cambridge, Mass., EE. UU., pág. 343 (1980). Se sabe que las plantas de la especie Geum son ricas en taninos. A partir de Geum japonicum se han aislado varios taninos hidrolizables, como gemina A, B, C, D, E y F, Dong, H., Chen, S. X., Kini,

R. M. y Xu, H. X., J. Nat. Products 61: 1356-60 (1998). Además de taninos, también se han aislado algunos triterpenoides, incluyendo ácido 2-hidroxioleanólico, ácido 2-hidroxiursólico, ácido 2,19-dihidroxiursólico, 28-O-Dglucopiranósido de ácido 2,3,19,23-tetrahidroxiurs-12-en-28oico, Xu, H. X., Zeng, F. Q., Wang, M. y Sim, K. Y., J. Nat. Products 59: 643-5 (1996).

Sin embargo, no se ha desvelado ninguna información sobre el uso de un EGJ en el tratamiento de enfermedades

isquémicas y del miocardio dañado. Las enfermedades isquémicas, como la cardiopatía coronaria, siguen siendo la principal causa de muerte en el mundo occidental, como en América y en las regiones desarrolladas de Asia, como Hong Kong, y empiezan a serlo ahora también en China, American Heart Association, 2001 Heart and Stroke Statistical Update, Dallas, Texas, EE. UU.: American Heart Association, 2000, 1

32. Actualmente, las estrategias terapéuticas disponibles para estas enfermedades solamente pueden aliviar los síntomas y, desafortunadamente, incluso con todos los avances recientes, la cura de estos tipos de enfermedades isquémicas y del miocardio dañado es difícil debido a la falta de un procedimiento para el crecimiento de nuevos vasos en un estadio temprano en el miocardio isquémico y a la incapacidad de regenerar los cardiomiocitos, Uchida, Y., Yanagisawa-Miwa, A., Nakamura, F., Yamada, K., Tomaru, T, Kimura, K. y Morita, T., Am. Heart J. 130: 1182-1188 (1995); Lazarous, D. F., Scheinowitz, M., Shou, M., Epstein, S. E. y col., Circulation 91: 145-153 (1995); Pu, L. Q., Sniderman,

A. D., Brassard, R., Lachapelle, K. J., Graham, A. M., Lisbona, R. y Symes, J. F., Circulation 88: 208-215 (1993). Según estudios anteriores en modelos animales de isquemia tanto aguda como crónica o en ensayos clínicos, la angiogénesis por medio de factores de crecimiento como VEGF, aFGF, bFGF o PDGF requiere tiempo (del orden de 3 a 9 semanas) y es limitada, (8 a 15) Risau, W., Nature 386: 671674 (1997); Folkman, J., N. Engl. J. Med. 333: 1757-1763 (1995); Ware, J. A., Angiogenesis and Cardiovascular Disease

(J.A. Ware y M. Simons, eds., Oxford University Press, Nueva York, Oxford, 30-59 (1999); Ware, J. A. y Simons, M., Nat. Med. 3: 158:164 (1997); Arras, M., Ito, W. D., Scholz, D., Winkler, B., Schaper, J. y Schaper, W., J. Clin. Invest.

101: 40-50 (1998); Banai, S., Jaklitsch, M. T., Casscells, W., Shou, M, Shrivastav, S., Correa, R., Epstein, S. E. y Unger, E. F., Circ. Res. 69: 76-85 (1991); Arras, M., Mollnau, H., Strasser, R., Ito, W. D., Schaper, J. y Schaper, W., Nat. Biotechnol. 16: 159-162 (1998); Kurz, H.,

Wilting, J., Sandau, K. y Christ, B., Microvasc. Res. 55: 92-102 (1998), mientras que la necrosis del miocardio debida a una oclusión coronaria tiene lugar muy rápidamente (en horas), (Unger, E. F., Shou, M., Sheffield, C. D., Hodge, E., Jaye, M. y Epstein, S. E., Am. J. Physiol. 264: H15671574 (1993); Unger, E. F., Banai, S., Shou, M., Jaklitsch, M., Hodge, E., Correa, R., Jaye, M. y Epstein, S. E., Cardiovasc. Res. 27: 785-791 (1993); Schlaudraff, K., Schumacher, B., von Specht, B. U., Seitelberger, R., Schlosser, V. y Fasol, R., Eur. J. Cardiothorac. Surg. 7: 637-643 (1993). Por lo tanto, la angiogénesis temprana de carácter terapéutico y la cardiomiogénesis pueden constituir la estrategia alternativa de mayor utilidad, la cual, de tener éxito, puede convertirse en la principal opción de tratamiento en muchas enfermedades isquémicas y en caso de un miocardio dañado.

Hasta ahora, no existe un producto similar disponible en el mercado mundial que sea capaz de inducir una angiogénesis temprana en el corazón y la regeneración del miocardio es una novedad total. Según estudios anteriores en modelos animales de isquemia tanto aguda como crónica o en ensayos clínicos, algunos factores de crecimiento, como VEGF, aFGF, bFGF o PDGF podrían aumentar la angiogénesis en un cierto grado, pero se requiere tiempo (del orden de semanas), mientras que la necrosis miocárdica debido a una oclusión coronaria se produce muy rápidamente (en cuestión de horas). Por lo tanto, la inducción de una angiogénesis temprana se ha convertido en un objetivo importante para reducir el tamaño del infarto en el corazón y salvar el tejido afectado. Además, a pesar de todos los avances recientes en las ciencias y los campos de investigación, no existe ningún procedimiento ni ningún fármaco que pueda usarse para regenerar los miocitos cardíacos.

En estudios recientes, los inventores han identificado un extracto de una hierba medicinal china, Geum japonicum var. thunb, que mostró un efecto potente en la estimulación del crecimiento temprano de nuevos vasos (< 48 h) y en la

regeneración de los cardiomiocitos en un modelo de infarto de miocardio agudo en conejos. En comparación con el período de semanas de la angiogénesis que se produce de manera natural y de la angiogénesis mediante el uso de factores de crecimiento, la angiogénesis inducida por el EGJ en el miocardio necesita menos de 48 horas. Por lo tanto, esta característica única de una angiogénesis temprana inducida por el EGJ es muy útil para el desarrollo de una nueva estrategia para el tratamiento efectivo de enfermedades isquémicas, especialmente importante para la reducción del tamaño del infarto y el salvamento de los miocitos cardíacos afectados mientras se produce el infarto de corazón, como se demuestra en nuestros experimentos con animales.

El concepto de una angiogénesis terapéutica por aumento del proceso natural de revascularización para el tratamiento de enfermedades vasculares isquémicas es una idea muy atractiva. Nos ofrece la oportunidad de conseguir una revascularización más completa en pacientes con enfermedades relacionadas con la isquemia, como la cardiopatía coronaria

o el infarto de corazón. Para el caso de la cardiopatía isquémica, en la actualidad, además de mediante la prevención, los bloqueos en las arterias coronarias solamente pueden remediarse por cirugía o angioplastia. No existe ninguna medicina eficaz que pueda estimular el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos (angiogénesis) en un estadio temprano. Además, después de un infarto de miocardio, el miocardio es incapaz de regenerar nuevos cardiomiocitos para sustituir a las células musculares perdidas. Por otra parte, el tejido de cicatrización que sustituye al miocardio necrótico causa un deterioro de la actividad cardíaca. Por lo tanto, es evidente que se necesita una estrategia de revascularización alternativa para tratar la isquemia y estimular la sustitución de las células del músculo cardíaco dañadas o perdidas. La angiogénesis terapéutica y la cardiomiogénesis serían la estrategia alternativa más útil, que puede convertirse en la principal opción de tratamiento de muchas enfermedades

isquémicas, incluyendo la cardiopatía coronaria y la isquemia de los miembros, y del miocardio dañado. Incluso puede ser capaz de sustituir algunas de las modalidades de tratamiento actuales por una estrategia menos invasiva, pero mucho más eficaz, en caso de que pueda conseguirse una angiogénesis temprana.

La invención es para cumplir el propósito de hacer crecer nuevos vasos sanguíneos en un estadio temprano y regenerar los miocitos cardíacos en un miocardio infartado para sustituir al miocardio dañado mediante el uso del EGJ. El EGJ puede administrarse por inyección local en el miocardio, directamente a las partes distales de un vaso ocluido en el corazón o miembros isquémicos. También puede desarrollarse potencialmente para una administración por vía oral (comprimidos) o por inyección en la corriente sanguínea

o los músculos en los pacientes que no soporten una inyección local en el miocardio y para los que se haya comprobado que no padecen ninguna formación neoplásica ni tumores.

La presente invención se refiere a un extracto orgánico, en particular a un extracto metanólico de Geum japonicum var. thunb que estimula la angiogénesis temprana y la regeneración miocárdica en el corazón isquémico y en el infarto de miocardio y, por lo tanto, es útil en el tratamiento de enfermedades isquémicas, como la cardiopatía isquémica, incluyendo la cardiopatía coronaria, el infarto de corazón, los miembros isquémicos, el miocardio dañado y la cicatrización de tejidos. Resumen de la invención

La primera realización de la presente invención es una composición farmacéutica para usar en el tratamiento de enfermedades asociadas con el corazón isquémico y el infarto de miocardio en un sujeto mediante estimulación de la angiogénesis y la miogénesis tempranas en el corazón isquémico y el infarto de miocardio, que comprende una cantidad eficaz de un extracto de Geum japonicum var. thunb en un disolvente orgánico y un vehículo farmacéuticamente

aceptable.

Las realizaciones preferidas de la composición farmacéutica se mencionan en las reivindicaciones subordinadas 2 a 5.

Otra realización es el uso de un extracto de Geum japonicum var. thunb en un disolvente orgánico para la preparación de un producto farmacéutico para el tratamiento de enfermedades asociadas con el corazón isquémico y el infarto de miocardio mediante estimulación de la angiogénesis y la miogénesis tempranas en el corazón isquémico y el infarto de miocardio.

Las realizaciones preferidas se mencionan en las reivindicaciones 7 y 8.

Breve descripción de la invención

La fig. 1 muestra que un EGJ según la invención aumenta la proliferación de células HVEC en cultivo a distintas dosis.

La fig. 2 muestra el tamaño de la región de infarto en el corazón de un conejo después de su tratamiento con un EGJ según la invención.

La fig. 3 muestra que se forman nuevos vasos sanguíneos llenos de células sanguíneas en la región de infarto en un conejo, después de su tratamiento con un EGJ según la invención.

La fig. 4 muestra que los cardiomiocitos teñidos con el antígeno nuclear de proliferación celular (PCNA) en la región de infarto se han regenerado nuevamente y que, en particular, los grupos de células teñidas con PCNA en la zona central del infarto son más significativos después del tratamiento con el EGJ según la invención.

Descripción detallada de la invención

En el procedimiento de preparación de un extracto de la planta Geum japonicum, var. thunb mediante un disolvente orgánico se usa preferentemente la planta seca. En este caso, la planta se desmenuza en polvo.

La abreviatura “EGJ” usada en la invención, sin

indicación específica, significa un extracto de la planta Geum japonicum var. thunb mediante un disolvente orgánico descrito a continuación.

Los disolventes orgánicos usados en el procedimiento de la invención se encuentran en estado líquido a 25° y pueden seleccionarse del grupo que consta de hidrocarburos alifáticos o hidrocarburos aromáticos, cetonas (aldehídos), ácidos carboxílicos, ésteres y éteres, que están sin sustituir o sustituidos con uno o más sustituyentes, o una mezcla de los mismos.

El término “hidrocarburo(s) alifático(s)” usado en este documento significa un alcano, un alqueno, un alquino y un hidrocarburo alicíclico y, en general, incluye de 4 a 20 carbonos.

El término “sustituyente(s)” se selecciona del grupo que consta de halógeno, hidroxi, alquilo, alquenilo, alquinilo, alcoxilo, alquiltio, alquenoxilo, alqueniltio, alquinoxilo y alquiniltio. De los sustituyentes, se prefieren alquilo inferior, alquenilo inferior, alquinilo inferior, alcoxilo inferior, alquiltio inferior, alquenoxilo inferior, alqueniltio inferior, alquinoxilo inferior y alquiniltio inferior. El número de sustituyentes puede ser de 1 a 3.

El término “alquilo” se refiere a un hidrocarburo alifático saturado, que incluye grupos de cadena lineal y de cadena ramificada. Preferentemente, el grupo alquilo tiene de 1 a 20 átomos de carbono (siempre que se use un intervalo numérico; por ejemplo, se usa “1-20” en este documento, significa que el grupo a que se hace referencia, en este caso el grupo alquilo, puede constar de 1 átomo de carbono, 2 átomos de carbono, 3 átomos de carbono, etc., hasta 20 átomos de carbono, inclusive).

Los términos “alquilo inferior, alquenilo inferior, alquinilo inferior, alcoxilo inferior, alquiltio inferior, alquenoxilo inferior, alqueniltio inferior, alquinoxilo inferior o alquiniltio inferior” usados en la invención contienen de 1 a 6 carbonos.

Entre los hidrocarburos aromáticos sustituidos se prefieren aquellos sustituidos por cloro y alquilos inferiores como clorobenceno, tolueno y xileno.

Entre los disolventes de la invención se prefieren alcoholes, éteres, cetonas, ácidos carboxílicos y ésteres de los mismos que contienen de 2 a 18 átomos de carbono. De estos disolventes se prefieren alcoholes de alquilo inferior, con mayor preferencia alcoholes C1-4 y con la máxima preferencia, metanol.

La etapa de remojo puede realizarse a temperaturas entre 10° y 100°. Depende del punto de ebullición del disolvente que se use. En general, la etapa puede realizarse a una temperatura entre 10° y el punto de ebullición del disolvente. Preferentemente, esta etapa se lleva a cabo a temperatura ambiente.

En la composición farmacéutica de la invención, el término “cantidad eficaz” o “cantidad terapéuticamente eficaz” es obvio para el experto en la técnica. Esta depende de la edad, el peso y el estado del sujeto que se trata y del modo de administración. En general, el extracto en la composición varía desde el 0,01% al 99,99%, preferentemente del 1% al 99%, con mayor preferencia del 10% al 90% y, con la máxima preferencia, del 30% al 70% en peso.

Un “paciente” o “sujeto” como se usa en este documento significa un ser humano o un animal. En general, implica un animal o un ser humano. El animal puede ser un animal doméstico o un animal de caza, como vacas, caballos, cerdos, ciervos, conejos, perros y otros, que sufran las enfermedades mencionadas en este documento.

Un “principio activo” mencionado en la invención significa un EGJ obtenido mediante un disolvente orgánico descrito en la presente invención.

Un “vehículo” o “vehículo farmacéuticamente aceptable” usado en este documento significa un componente o un ingrediente que es aceptable en el sentido de que es compatible con otros ingredientes de la composición farmacéutica como se describe en este documento y no

demasiado perjudicial para el paciente al que se administra la composición, incluyendo todos y cada uno de los disolventes, diluyentes u otro vehículo líquido, dispersantes o agentes de suspensión, tensioactivos, agentes isotónicos, espesantes o emulsionantes, conservantes, aglutinantes sólidos, lubricantes y similares, según sean adecuados para la forma de dosificación particular deseada. Dado que el principio activo de la composición de la invención es liposoluble, cuando las composiciones se forman como formulaciones líquidas el principio activo se disuelve primeramente en estos vehículos, incluyendo un alcohol C2-12 como etanol, n-propanol, i-propanol, n-butanol y alcohol bencílico, glicerol, propilenglicol, N,N-dimetilacetamida, DMSO, aceite de oliva, aceite de semillas de algodón, aceite de cacahuete, aceite de semillas de amapola, aceite de sésamo, aceite de soja y otros aceites vegetales y después, si es necesario, se prepara según las formulaciones deseadas. El vehículo puede comprender también un sólido seleccionado entre aquellos que se usan convencionalmente en la técnica de la formulación farmacéutica, como gelatina, lactosa, estearato de magnesio, talco, carbonato de calcio, carbonato de magnesio, almidón (almidón de maíz y almidón de patata) y aquellos bien conocidos en la técnica anterior.

La composición farmacéutica puede comprender también uno o más componentes usados típicamente en la técnica de la formulación farmacéutica, como tensioactivos, propulsores, saborizantes, conservantes, tampones, cargas, aglutinantes, desintegrantes, lubricantes y similares, que pueden ser determinados por aquellos expertos en la técnica según las formulaciones que han de preparase.

Las composiciones farmacéuticas usadas en la presente invención incluyen formulaciones sistémicas y tópicas y entre esas se prefieren las formulaciones que son adecuadas para la administración por inhalación o por vía oral, rectal, vaginal, intracavitaria, intraorgánica, tópica, incluyendo bucal, sublingual, dérmica e intraocular, parenteral, incluyendo subcutánea, intradérmica,

intramuscular, intravenosa e intraarticular y transdérmica.

Las composiciones pueden presentarse en formas de dosificación unitaria o de múltiples unidades, así como a granel y pueden prepararse por cualquiera de los procedimientos bien conocidos en la técnica de farmacia. Todos los procedimientos incluyen la etapa de poner el principio activo, el EGJ, en asociación con un vehículo que constituye uno o más ingredientes accesorios. Generalmente, las formulaciones se preparan por asociación uniforme e íntima del principio activo con un vehículo líquido, un vehículo sólido finamente dividido o ambos y después, si es necesario, se da al producto la forma de las formulaciones deseadas.

Las composiciones adecuadas para la administración por vía oral pueden presentarse en unidades discretas, como cápsulas, sellos, pastillas para chupar o comprimidos, en que cada uno contiene una cantidad predeterminada del principio activo; como polvo o gránulos; como disolución o suspensión en un líquido acuoso; o como emulsión de aceite en agua o de agua en aceite. Una composición para la administración por vía oral puede incluir opcionalmente recubrimientos entéricos conocidos en la técnica para evitar la degradación de las composiciones en el estómago y conseguir la liberación del principio activo en el intestino delgado. Las composiciones adecuadas para la administración por vía bucal incluyen pastillas para chupar que comprenden el principio activo en una base con sabor, usualmente sacarosa y goma de acacia o tragacanto; y pastillas que comprenden el principio activo en una base inerte como gelatina y glicerina o sacarosa y goma de acacia.

Las composiciones adecuadas para la administración por vía parenteral comprenden disoluciones estériles para inyección, acuosas y no acuosas, del principio activo, cuyas preparaciones son preferentemente isotónicas con la sangre del receptor al que se destinan. Estas preparaciones pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostáticos y solutos que hacen que la composición sea isotónica con la sangre del

receptor al que se destinan. Las suspensiones estériles acuosas y no acuosas pueden contener agentes de suspensión y espesantes. Las composiciones pueden presentarse en envases de dosis unitaria o multidosis, como ampollas y viales sellados y pueden almacenarse en un vehículo líquido estéril, como disolución salina o agua para inyección, inmediatamente antes de su uso. Las disoluciones y suspensiones para inyección extemporánea pueden prepararse a partir de polvos, gránulos o comprimidos estériles.

Preferentemente, las composiciones según la invención adecuadas para la administración por vía tópica sobre la piel toman la forma de una pomada, crema, loción, pasta, gel, espray, aerosol o aceite. Las composiciones adecuadas para la administración por vía transdérmica pueden presentarse como parches discretos adaptados para permanecer en contacto íntimo con la epidermis del receptor por un espacio de tiempo prolongado. Las composiciones adecuadas para la administración por vía transdérmica pueden administrarse también por iontoforesis y típicamente toman la forma de una disolución acuosa del principio activo, opcionalmente tamponada.

Preferentemente, el principio activo se formula en una forma de dosificación unitaria para facilitar la administración y la uniformidad de dosificación. La “forma de dosificación unitaria” como se usa en este documento se refiere a una unidad físicamente discreta de la composición farmacéutica apropiada para el paciente que se ha de tratar. Cada dosis deberá contener la cantidad de principio activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado, bien como tal o en asociación con el vehículo farmacéutico seleccionado. Típicamente, el principio activo se administrará en unidades de dosificación que contienen desde aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 500 mg en peso en la composición, siendo preferido un intervalo de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 100 mg.

El principio activo de la invención puede administrarse en niveles de dosificación de aproximadamente 0,001 a

aproximadamente 120 mg/kg de peso corporal del sujeto por día y, preferentemente, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 30 mg/kg de peso corporal del sujeto por día, una o más veces al día, para obtener el efecto terapéutico deseado.

A modo de ejemplo, una dosis adecuada para la administración oral sería del orden de 30 mg/kg de peso corporal por día, mientras que una dosis típica para la administración por vía intravenosa sería del orden de 1 a 10 mg/kg de peso corporal por día.

La composición farmacéutica según la invención puede usarse para tratar las enfermedades asociadas con la isquemia, como la cardiopatía isquémica. Para el tratamiento de cardiopatías, se recomienda el uso de una inyección local con disoluciones, de modo que la concentración local del fármaco sea alta y este funcione mejor y de manera más eficaz. Sin embargo, si el paciente sufre simultáneamente un tumor o neoplasma maligno, no se recomienda la inyección sistémica ni la administración por vía oral y la inyección local sería un medio más seguro.

En el procedimiento para la preparación de una composición farmacéutica con un EGJ para tratar enfermedades asociadas con la isquemia, el daño de tejidos y la cicatrización de tejidos, se mezcla una cantidad eficaz de EGJ con uno o más de los vehículos indicados anteriormente. El contenido de EGJ en la composición farmacéutica es normalmente del 0,01% al 99,99% en peso. Preferentemente, el contenido del EGJ en la composición es del 1 al 99% en peso. Ejemplos

Durante el curso del cribado de reactivos angiogénicos de la medicina china, se ha identificado el extracto metanólico de Geum japonicum var. thunb que mostró potentes efectos duales en la estimulación del crecimiento temprano (menos de 48 horas) de nuevos vasos sanguíneos en músculos cardíacos isquémicos y en músculos cardíacos infartados y en la estimulación de la regeneración miocárdica en el infarto de miocardio.

Ejemplo 1

Se redujo a polvo 1 kg de plantas completas secas de Geum japonicum var. thunb, recogidas en la provincia de Guizhou en China. Después, el polvo de las plantas se puso en remojo en metanol (8 l) a temperatura ambiente durante 2 a 3 horas. Los productos resultantes se filtraron y el filtrado se evaporó a sequedad en vacío (50°C) para dar lugar a un polvo (50 g).

Un análisis por cromatografía y RMN mostró que el EGJ contiene principalmente taninos, triterpenos, incluyendo ácido 2α,19α-dihidroxi-3-oxo-12-ursen-28-oico, ácido ursólico, ácido epimólico, ácido maslínico, ácido euscáfico, ácido torméntico, 28--D-glucósido de ácido torméntico, etc.

Ejemplo 2

Polvo del EGJ obtenido en el ejemplo 1 0,4 g

Disolución de DMSO al 5% en agua 100 ml

El polvo de EGJ se disolvió en 100 ml de una disolución de DMSO al 5% en agua para obtener una disolución de trabajo.

Ejemplo 3

EGJ del ejemplo 1 0,1 g

Almidón de maíz 0,5 g

Lactosa 1,87 g

Estearato de magnesio 0,03 g

El polvo del EGJ del ejemplo 1, el almidón de maíz y la lactosa se mezclaron uniformemente. A la mezcla se añadió una pequeña cantidad de agua. El material resultante se filtró y se secó. Se añadió estearato de magnesio a la mezcla y se mezcló uniformemente. El producto resultante se redujo a pastillas mediante una peletizadora. Cada pastilla pesa 250 mg y comprende 10 mg de principio activo.

Ejemplo 4

EGJ del ejemplo 1 80 mg

Cloruro de sodio 8 mg

EDTA 1 mg

Tampón de fosfato de sodio (pH 6,5) 10 mg

Éter de polietilenglicol 10 mg

Agua destilada añadida hasta 2 ml

Todos los componentes se disolvieron en agua destilada y después se añadió agua destilada a la mezcla hasta un volumen de 2 ml. La disolución resultante se filtró con un filtro estéril para formular una inhalación nasal. Experimento 1

Se analizó una disolución de EGJ en DMSO al 5% (ejemplo 2) en cuanto a sus actividades angiogénicas y miogénicas específicas para estimular la proliferación de células endoteliales vasculares humanas (HVEC) y células miogénicas (C2C12), como se muestra en la fig. 1. En la fig. 1, los números de referencia 1, 2 y 3 indican, respectivamente, diferentes placas de cultivo en las mismas condiciones. Se muestra que el EGJ pudo aumentar significativamente la proliferación de las células HVEC en cultivo de manera dependiente de la dosis, en comparación con el control de DMSO al 5%. También se demostró, según los experimentos de los inventores con animales, que esta disolución de ECG mostró potentes efectos duales tanto sobre la angiogénesis como sobre la miogénesis en el miocardio infartado. Para la determinación cromatográfica, el EGJ se solubilizó en un disolvente y se aplicó en una columna de Sephadex LH-20 equilibrada con metanol al 10% y eluída con un gradiente de H2O-metanol (cantidad creciente de metanol). Se eluyeron 12 fracciones, que se analizaron en cuanto a sus actividades duales en el aumento de la proliferación de los cultivos de células HVEC y C2C12. Este extracto metanólico (EGJ) con las actividades duales específicas se analizó más detenidamente en experimentos posteriores in vivo. Para determinar las identidades de los compuestos contenidos en la fracción activa se usó RMN. Experimento 2

Este EGJ disuelto en DMSO al 5% se investigó posteriormente en un modelo de infarto de corazón en conejo para analizar sus efectos en los músculos cardíacos. La razón de la elección del conejo como modelo de infarto de corazón es que los conejos tienen arterias terminales sin

conexiones arteriolares, de modo que una oclusión coronaria aguda podía conducir rápidamente a un infarto transmural. Se ligaron la arteria circunfleja izquierda (ACI) o la arteria descendente anterior izquierda (ADAI), respectivamente, de los animales experimentales. Directamente después de la ligadura se administró una única inyección de EGJ (una disolución saturada de EGJ en DMSO al 5%, 0,5 ml) o una disolución de control (DMSO al 5%) en los extremos distales de las arterias ligadas, respectivamente. Los animales se sacrificaron en los días 4 ó 7 después de la ligación y los corazones se extirparon para estudios histológicos.

La fig. 2 muestra que el tamaño de la región del infarto fue 3 a 5 veces inferior en los animales tratados con EGJ (a), como indican las flechas azules, en comparación con el control (b). En la fig. 3 se mostró la presencia de numerosos vasos sanguíneos de nueva formación llenos de células sanguíneas en segmentos de miocardio infartado (a y c), como indican las flechas azules, en los animales tratados con EGJ. Por el contrario, en el control se observaron muchos menos vasos (b y d).

En el día 7 se encontraron numerosos cardiomiocitos recientemente regenerados con núcleos teñidos con PCNA alrededor de los bordes del infarto, con algunos de ellos organizados en grupos dentro de la región del infarto de los corazones tratados con el EGJ y también se encontraron numerosos vasos, indicados por flechas negras, como se muestra en la fig. 4, (b). Por el contrario, solamente se encontraron algunos cardiomiocitos nuevamente regenerados y teñidos con PCNA a lo largo de los bordes del infarto y no se encontraron cardiomiocitos recientemente regenerados agrupados centralmente en el corazón de control, estando la región del infarto fundamentalmente ocupada por fibroblastos, como se muestra en la fig. 4, (a). Las secciones se tiñeron después inmunohistoquímicamente con anticuerpos monoclonales contra la cadena pesada de miosina (MF20) para confirmar que los núcleos teñidos con PCNA correspondían a cardiomiocitos. En la fig. 4, (c) se muestra

a mayor aumento la región rodeada por las flechas azules en

(b) y, en (d), algunos cardiomiocitos nuevamente regenerados se encontraron también alrededor de los bordes del infarto en corazones tratados con EGJ, como se indica con las

5 flechas azules.

Mediante el uso de la tinción inmunohistoquímica con anticuerpos monoclonales contra PCNA, solamente pudieron teñirse los núcleos de células nuevamente regeneradas. Mediante el procedimiento de tinción inmunohistoquímica

10 contra MF20 solamente pudieron teñirse cardiomiocitos. La combinación de estos dos procedimientos de tinción inmunohistoquímica y el análisis morfológico permitió la identificación fiable de los cardiomiocitos nuevamente regenerados. Los núcleos de cardiomiocitos intactos no

15 dañados alrededor de la región del infarto no se tiñeron con PCNA, pero el citoplasma se tiñó con MF20 (células teñidas en marrón).

Claims (8)

1.

Una composición farmacéutica para uso en el tratamiento de enfermedades asociadas con el corazón isquémico y el infarto de miocardio en un sujeto por estimulación de la angiogénesis y la miogénesis tempranas en el corazón isquémico y el infarto de miocardio, que comprende una cantidad eficaz de un extracto de Geum japonicum var. thunb en un disolvente orgánico y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

2.

La composición farmacéutica según la reivindicación 1, en que dicha composición comprende dicho extracto en una proporción del 0,1% al 99,99% en peso.

3.

La composición farmacéutica según la reivindicación 1, en que dicho sujeto es un ser humano.

4.

La composición farmacéutica según la reivindicación 1, en que dicho disolvente orgánico se selecciona del grupo que consta de alcoholes de alquilo inferior que comprenden 1 a 6 átomos de carbono.

5.

La composición farmacéutica según la reivindicación 4, en que dicho disolvente orgánico es metanol.

6.

Uso de un extracto de Geum japonicum var. thunb en un disolvente orgánico para la preparación de un producto farmacéutico para el tratamiento de enfermedades asociadas con el corazón isquémico y el infarto de miocardio por estimulación de la angiogénesis y la miogénesis tempranas en el corazón isquémico y el infarto de miocardio.

7.

El uso de la reivindicación 6, en que dichas enfermedades son aquellas asociadas con el daño miocárdico.

8.

El uso de la reivindicación 6, en que dichas

enfermedades son aquellas asociadas con el daño o pérdida de los miocitos cardíacos.