ES2292883T3

ES2292883T3 - Uso de hederagenina 3-o-alfa-l-ramnopiranosil-(1->2)-(beta-d-glucopiranosil-(1->4)-alfa-l-arabinopiranosido o un extracto de pulsatillae radix que lo contiene como agente terapeutico para tumores solidos.

Info

Publication number: ES2292883T3
Application number: ES03015114T
Authority: ES
Inventors: Song-Bae Kim; Byung-Zun Ahn; Yong Kim
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2002-07-22
Filing date: 2003-07-03
Publication date: 2008-03-16
Anticipated expiration: 2023-07-03
Also published as: US7682638B2; KR100568607B1; US8075923B2; EP1388542B1; AU2003208120B2; US20050239718A1; CA2435524A1; US20100152124A1; AU2003208120A1; DE60316389D1; ATE373670T1; TWI280881B; RU2325178C2; EP1388542A1; KR20040009172A; CA2435524C; MXPA03006473A; US20040082528A1; RU2003122817A; CN1494910A

Abstract

El uso de un extracto de Pulsatillae radix que contiene hederagenina 3-O-alfa-L-ramnopìranosil(1-->2)-[beta-D-glucopiranosil(1-->4)]-alfa-L-arabinopiranósido para la fabricación de un medicamento para tratar tumores sólidos.

Description

Uso de hederagenina 3-O-\alpha-L-ramnopiranosil-(1\rightarrow2)-[\beta-D-glucopiranosil-(1\rightarrow4)]-\alpha-L-arabinopiranósido o un extracto de Pulsatillae radix que lo contiene como agente terapéutico para tumores sólidos.

Campo técnico

Esta invención se refiere al uso de la hederagenina 3-O-\alpha-L-ramnopiranosil(1\rightarrow2)-[\beta-D-glucopiranosil(1\rightarrow4)]-\alpha-L-arabinopiranósido representada por la fórmula I siguiente:

1

o un extracto de Pulsatillae radix que contiene la misma como un agente terapéutico para tumores sólidos.

Antecedentes de la técnica

Pulsatillae radix es la raíz seca de especies de Pulsatilla que pertenecen a la familia Ranunculaceae (Ki Hwan Bae, Korean Medicinal Herbs, 1999). Según la medicina china, la Pulsatillae radix tiene el efecto de eliminar calor de la sangre y detoxificarla. Se ha usado también como un agente antiinflamatorio, astringente, hemostático y antidiarreico, y para el tratamiento de la hematoquecia, malaria, hemorragias nasales, y hemorragias dentales. Su flor se denomina Pulsatillae Flos, y se usa para el tratamiento de la malaria y de la viruela. Su hoja se denomina Pulsatillae Folium, y se usa para el tratamiento del dolor de cintura, edema o dolor de corazón. Además, se ha descrito que un extracto obtenido por cocción de Pulsatillae radix tiene un efecto antibacteriano contra la disentería amebiana, y un efecto pesticida contra Trichonomas.

La Pulsatillae radix contiene alrededor del 9% de saponinas, y hasta ahora se han aislado de la misma tales ingredientes como derivados de la protoanemonina, anemonina, ranunculina, hederagenina, ácido betulínico, y ácido oleanólico y sus glicósidos que están representados por la fórmula (II) siguiente:

2

Los ingredientes anteriores no han sido aún estudiados en gran detalle en cuanto a sus efectos farmacológicos, pero se ha descrito que la protoanemonina posee mitotoxicidad (Vonderbank, F., Pharmazie 5, 210, 1950). Li, et al. (Li, R. Z., et al., Yao Hsueh Hsueh Pao. 28, 326 31, 1993) también describieron que la ranunculina posee citotoxicidad contra células KB, por inhibición de la ADN polimerasa.

La hederagenina 3-O-\alpha-L-ramnopiranosil(1\rightarrow2)-[\beta-D-glucopiranosil(1\rightarrow4)]-\alpha-L-arabinopiranósido se aisló de la Pulsatilla cerna y P. koreana por Shimizu, et al. (Chem. Pharm. Bull., 26, 1666, 1978); de P. chinensis por Yoshihiro, et al. (J. Nat. Pro., 62, 1279, 1999); y de Serjania salzmanniana Schlecht por Ekabo, et al. (J. Nat. Pro., 59, 431, 1996). Kang et al., (Arch. Pharm. Res., 12 (1), 42-47, 1989) la aislaron también de P. coreana, y reconfirmaron su estructura. Yoshihiro, et al., describieron en la publicación anterior que derivados de la hederagenina y el ácido oleanólico mostraron citotoxicidad contra células humanas de leucemia HL-60. Describieron que la hederagenina 3-O-\alpha-L-ramnopiranosil(1\rightarrow2)-[\beta-D-glucopiranosil(1\rightarrow4)]-\alpha-L-arabinopiranósido aislada de la Pulsatillae radix china (Pulsatilla chinensis) tenía citotoxicidad débil, esto es una ED_{50} de 3,8 \mug/ml, en células HL-60. Sin embargo, la mayor parte de las saponinas y muchos tipos de productos naturales muestran corrientemente dicho nivel de cito toxicidad, y así, no puede decirse que el compuesto anterior tenga actividad antitumoral basado en lo anterior. Por lo tanto, nunca se ha conocido que la hederagenina 3-O-\alpha-L-ramnopiranosil(1\rightarrow2)-[\beta-D-glucopiranosil(1\rightarrow4)]-\alpha-L-arabinopiranósido tenga actividad antitumoral, particularmente contra los tumores sólidos.

Descripción de la invención

Los inventores actuales aislaron desoxipodofilotoxina de hierbas medicinales incluyendo Anthriscus silvestres Hoffman, Pulsatillae radix, etc., y descubrieron que esta sustancia inhibe el crecimiento de las células de los tumores sólidos inhibiendo la angiogénesis, y obtuvieron una patente coreana (documento de Patente Coreana número 315.200) para la misma. Los inventores actuales llevaron a cabo estudios extensivos para desarrollar un agente antitumoral a partir de las hierbas medicinales. Como resultado, obtuvieron una fracción de Pulsatillae radix que se disuelve mal en disolventes orgánicos, pero que es fácilmente soluble en agua, y aislaron un compuesto antitumoral de la fracción, y así completaron la presente invención.

Según esto, el propósito de la presente invención es proporcionar un agente terapéutico para los tumores sólidos que comprende un compuesto antitumoral aislado de Pulsatillae radix o una fracción de Pulsatillae radix que contiene el mismo como ingrediente activo.

Un aspecto de la presente invención proporciona un agente terapéutico para tumores sólidos que comprende un extracto de Pulsatillae radix que contiene hederagenina 3-O-\alpha-L-ramnopiranosil(1\rightarrow2)-[\beta-D-glucopiranosil(1\rightarrow4)]-\alpha-L-arabinopiranósido como un ingrediente activo.

"Tumores sólidos", como se usa aquí, se refiere a cualquier masa tumoral excepto los cánceres de la sangre, un ejemplo representativo de los cuales es el cáncer de pulmón.

En la presente invención, el extracto de Pulsatillae radix que contiene hederagenina 3-O-\alpha-L-ramnopiranosil(1\rightarrow2)-[\beta-D-glucopiranosil(1\rightarrow4)]-\alpha-L-arabinopiranósido puede obtenerse extrayendo Pulsatillae radix con una solución acuosa de etanol, y formando precipitados por la adición de acetona a la misma para obtener una fracción soluble en agua (WT). O, puede obtenerse extrayendo Pulsatillae radix con solución acuosa de etanol, formando precipitados por la adición de acetona a la misma para obtener la fracción soluble en agua, y pasando la fracción a través de una columna de Sefadex LH20 para obtener una fracción (SPX3) que tiene un valor de R_{f} de 0,48\sim0,5, y que desarrolla color rojo, y después, color azul por pulverización con ácido sulfúrico seguido de calentamiento.

Otro aspecto de la presente invención proporciona un agente terapéutico para tumores sólidos que comprende hederagenina 3-O-\alpha-L-ramnopiranosil(1\rightarrow2)-[\beta-D-glucopiranosil(1\rightarrow4)]-\alpha-L-arabinopiranósido como un ingrediente activo.

De aquí en adelante, se explicará la presente invención en detalle.

Según la presente invención, el extracto de Pulsatillae radix se extrae con etanol al 50% para obtener una fracción WT bastante insoluble en acetona, y la fracción es adicionalmente purificada en Sefadex LH20 para obtener una fracción SPX3, y de la fracción SPX3, se obtiene finalmente SB365 puro. Este compuesto es la hederagenina 3-O-\alpha-L-ramnopiranosil(1\rightarrow2)-[\beta-D-glucopiranosil(1\rightarrow4)]-\alpha-L-arabinopiranósido, y muestra actividad antitumoral más alta en tumores sólidos compuestos de células tumorales de pulmón de ratón, células LLC (carcinoma de pulmón de Lewis), o células humanas de tumor de pulmón, células NCI-H23, que un fármaco clínico, la adriamicina.

En particular, el procedimiento actual para preparar una fracción antitumoral a partir de Pulsatillae radix y aislar una sustancia antitumoral de ésta es como sigue.

(1) Preparación de la fracción antitumoral WT de Pulsatillae radix

Se extrajo el polvo de Pulsatillae radix con una solución acuosa de etanol al 50%, y se secó a presión reducida. Al material seco obtenido se le añadió acetona en una cantidad de 5 a 10 veces la cantidad de polvo. Se agitó la mezcla, se centrifugó a 3.000 rpm, y se decantó el sobrenadante de la misma para obtener una parte insoluble. Se repitió el procedimiento anterior dos veces. La parte insoluble remanente fue fácilmente soluble en agua, y por eso se llamó "fracción WT". Esta fracción mostró actividad antitumoral relativamente alta en ratones BDF1 transplantados con células LLC y ratones desnudos transplantados con células NCI-H23.

(2) Preparación de la fracción SPX3 a partir de la fracción WT

Se disuelve una cantidad dada de la fracción WT en una cantidad dada de solución acuosa de metanol a varias concentraciones, y a continuación se fracciona en una columna de Sefadex LH20 estabilizada con el mismo disolvente. En este caso, se consigue el mejor aislamiento empleando una solución acuosa de metanol al 80%, y el tamaño adecuado de la columna empaquetada fue de 60x4 cm para una fracción WT de 500 mg. Como resultado, se obtuvieron la fracción SPX1 (tubos de ensayo números 26-66), SPX2 (tubos de ensayo números 66-91), SPX3 (tubos de ensayo números 91-111), y SPX4 (tubos de ensayo números 111-138). Cuando se pulverizó ácido sulfúrico sobre las fracciones desarrolladas en una placa de gel de sílice y se calentó la placa, la fracción SPX3 desarrolló color rojo al principio, y color azul con el paso del tiempo, y contenía una mancha con un R_{f} de 0,48 a 0,50 como ingrediente mayoritario. Se mostró que tenía actividad antitumoral alta en ratones BDF1 transplantados con células LLC y ratones desnudos transplantados con células NCI-H23.

(3) Aislamiento de SB365 a partir de la fracción SPX3

Para aislar una sustancia antitumoral de la fracción SPX3 que mostraba la actividad antitumoral, se llevó a cabo HPLC para obtener el compuesto puro, SB365. Para identificar la estructura de SB365, se llevaron a cabo una reacción de Lieberman-Burchard, IR, ^{1}H-RMN, ^{13}C-RMN e hidrólisis con etanol/ácido sulfúrico. Como resultado, se confirmó que SB365 era hederagenina 3-O-\alpha-L-ramnopiranosil(1\rightarrow2)-[\beta-D-glucopiranosil(1\rightarrow4)]-\alpha-L-arabinopiranósido, que es un ingrediente tipo saponina que ya se había aislado de la Pulsatillae radix.

Los extractos de Pulsatillae radix según la presente invención o el compuesto SB365 puro aislado de los mismos tienen una citotoxicidad débil para las células de los tumores sólidos, pero inesperadamente mostraron una actividad antitumoral excelente en experimentos animales. De esta forma, pueden mejorar los problemas causados por los agentes antitumorales anteriores de uso clínico, por ejemplo respuestas inmunes reducidas debido a la disminución de células sanguíneas. Se anticipa también que muestren toxicidad baja para las células en división rápida como las células hematopoyéticas, etc.

Las fracciones de Pulsatillae radix y SB365 según la presente invención pueden combinarse con vehículos farmacéuticamente aceptables que se usan convencionalmente, y fabricadas como varias formulaciones que son convencionales en el campo farmacéutico, por ejemplo, formulaciones administradas oralmente como soluciones, suspensiones, etc.; formulaciones inyectables como soluciones o suspensiones inyectables, polvos secos listos para uso como inyectables, etc.; y formulaciones administradas tópicamente como ungüentos, cremas y soluciones. Particularmente, el ingrediente activo de la presente invención es soluble en agua, y puede disolverse en varias soluciones tales como solución salina fisiológica, solución de Ringer, y solución nutritiva, etc. Dichas formulaciones farmacéuticas pueden administrarse por vía intravenosa, subcutánea, intraperitoneal, o tópica.

Una dosis recomendada del ingrediente activo de la presente invención a seres humanos es 3,5\sim8,0 mg/kg de peso corporal en caso de SB365, 20\sim40 mg/kg de peso corporal en caso de la fracción SPX3, o 200\sim300 mg/kg en caso de la fracción WT. La dosis óptima es 6,5 mg/kg de peso corporal en caso de SB365, 25 mg/kg de peso corporal en caso de la fracción SXP3, o 250 mg/kg de peso corporal en caso de la fracción WT. Sin embargo, dicha dosis puede ajustarse apropiadamente dependiendo de la edad, peso corporal, salud, severidad de la enfermedad del paciente.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra el patrón de CCF en gel de sílice de la fracción WT;

la Figura 2 muestra los patrones de CCF en gel de sílice de la fracción SPX3 purificada en una columna de Sefadex LH20;

la Figura 3 es un cromatograma de HPLC de la fracción SPX3; y,

la Figura 4 es un cromatograma de HPLC de SB365.

Mejor forma de realizar la invención

Se entenderá mejor esta invención con los ejemplos siguientes. Una persona versada en la técnica apreciará fácilmente que los materiales específicos y resultados descritos son meramente ilustrativos, y no se intenta que, no se debería intentar que, limiten la invención como se describe más completamente en las reivindicaciones adjuntas.

Ejemplo 1 Preparación de la fracción WT

Se extrajeron 50 g de polvo de Pulsatillae radix tres veces con 500 ml de solución acuosa de etanol al 50%, y se secó el extracto a presión reducida para obtener 22 g de materiales secos. Se añadieron a estos materiales secos 300 ml de acetona, y se agitó la mezcla y se centrifugó a 3.000 rpm. Se separó el sobrenadante de allí para dar un precipitado. Para obtener este precipitado, se repitió dos veces el tratamiento de acetona. Se desechó la capa de acetona, y se secó una parte insoluble para obtener 17,8 g de materiales secos (fracción WT). La fracción WT obtenida se sometió a CCF en gel de sílice (disolvente de desarrollo:butanol:ácido acético:agua en la proporción de 4:1:1, reacción de color:pulverización con ácido sulfúrico seguido de calentamiento). El resultado se muestra en la Figura 1. En la Figura 1, una mancha azul que tiene un R_{f} en el intervalo de 0,48 a 0,50 corresponde al ingrediente activo de la presente invención como se describe a continuación. Como se muestra en el Ejemplo Experimental 1 a continuación, la fracción WT mostró una actividad antitumoral relativamente alta (porcentaje de inhibición de crecimiento tumoral: 57%) en ratones BDF1 transplantados con células LLC.

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Ejemplo 2 Preparación de las fracciones SPX

Se fraccionaron adicionalmente 560 mg de la fracción WT en una columna de Sefadex LH20 (200 g, 60x4 cm) usando una solución en una mezcla de metanol y agua (80:20) con una velocidad de flujo de 1 ml/min, y un volumen de fracción de 0,5 ml/tubo. Se aplicaron estas fracciones a una capa fina de cromatografía en gel de sílice, y se desarrollaron para obtener las fracciones (disolvente de desarrollo:butanol:ácido acético:agua en la proporción de 4:1:1, reacción de color:pulverización con ácido sulfúrico seguido de calentamiento). El resultado se muestra en la Figura 2. En la Figura 2, se obtuvo SPX1 (139 mg, 24,8%) recogiendo los tubos de ensayo números 26 a 66, y consistió en 4 manchas mayoritarias, la más baja desarrolló un color amarillo por reacción con el ácido sulfúrico. Se obtuvo la fracción SPX2 (344 mg, 61,4%) recogiendo los tubos de ensayo números 66 a 91, y consistió en 2 manchas mayoritarias. Se obtuvo la fracción SPX3 (61 mg, 10,9%) recogiendo los tubos de ensayo números 91 a 111, y después de la pulverización con ácido sulfúrico seguido de calentamiento desarrolló color rojo inicialmente que se volvió azul con el tiempo. La fracción SPX3 contenía una mancha con un valor de R_{f} en el intervalo de 0,48 a 0,50 como componente mayoritario. Se obtuvo la fracción SPX4 (15,7 mg, 2,8%) recogiendo los tubos de ensayo números 111 a 138. Las fracciones SPX3 y SPX4 tenían una pureza relativamente alta mostrando una mancha en la cromatografía en capa fina.

Como se muestra en el Ejemplo Experimental 1 a continuación, la fracción SPX3 mostró 60% de inhibición del crecimiento tumoral en 15 días desde su administración. Por el contrario, las fracciones SPX1, SPX2, y SPX4 no mostraron ninguna acción, de manera que podía asumirse que la sustancia que desarrolló el color azul con el ácido sulfúrico era el ingrediente con la actividad antitumoral. Esta fracción SPX3 puede usarse como un agente antitumoral por sí misma.

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Ejemplo 3 Aislamiento de SB365

Para aislar una sustancia pura de la fracción SPX3, se llevó a cabo HPLC como se describe a continuación.

Se usó gel de sílice de fase reversa (RP-C_{18}, 250x10 mm, fabricado por Metachem) como fase fija, y una solución de una mezcla de metanol y agua (80:20) como fase móvil. La longitud de onda de detección fue 210 nm, y la velocidad de flujo fue 1 ml/min. Los resultados se muestran en la Figura 3. Como se muestra en la Figura 3, la fracción SPX3 consistió en 3 sustancias mayoritarias. De las cantidades fraccionadas obtenidas, los picos con un R_{t} de 8,5 minutos y 10,4 minutos contenían pequeñas cantidades de ingredientes, y un pico con un R_{t} de 23,3 minutos contenía el ingrediente principal. Así, se asumió que el último tendría actividad antitumoral. Como se describió anteriormente, la sustancia con un R_{t} de 23,3 minutos que desarrolló color azul con el ácido sulfúrico y sería el ingrediente activo se recogió para obtener 2,8 mg de SB365 a partir de 31 mg de SPX3. La fracción recogida con R_{t} de 23,3 minutos se secó, y se sometió a HPLC en las mismas condiciones que se describieron anteriormente para determinar su pureza. Los resultados se muestran en la Figura 4. Se confirmó con la Figura 4, que SB365 era una sustancia pura. El SB365 obtenido se usó directamente en los ensayos de identificación estructural y de actividad antitumoral siguientes.

Como se muestra en los Ejemplos Experimentales 1 y 2 a continuación, SB365 mostró 81% y 82,1% de inhibición de crecimiento tumoral en ratones BDF1 transplantados con células LLC y ratones desnudos transplantados con células NCI-H23, respectivamente, lo que podría decirse son actividades antitumorales excelentes.

Ejemplo 4 Identificación estructural y confirmación del compuesto activo SB365

El SB365 aislado anteriormente fue la forma blanca amorfa con p.f. 239\sim241ºC y [\alpha]_{D} +23,6º (c, 0,2, MeOH), y fue positivo en la reacción Liebermann-Buchard, y se confirmó así como un glicósido. Además, según el IR (cm^{-1}), se observaron picos a 3400 (ancho, -OH), 2940 (ancho, C-H), 1695 (C=O), 1455, y 1040 (C-O). Se asumió también que era un glicósido por los picos de absorción en los intervalos de 1000-1100 y 3000-3400.

Considerando la ^{1}H-RMN, tenía patrones de RMN típicos de las saponinas. Se observaron seis grupos -CH_{3} a 0,91, 0,92, 0,98, 1,00, 1,07 y 1,21 ppm, y se observó otro grupo -CH_{3} como un doblete a 1,64 ppm. Podría verse por esto que el compuesto poseía un grupo de ramnosa en sus grupos de azúcar. Se observaron protones aloméricos a 6,25 (ancho), 5,11 (1H, J=7,80 Hz), y 4,97 ppm (1H, J=6,66 Hz). Por lo tanto, se confirmó el SB365 como un glicósido con tres grupos de azúcar.

Según la ^{13}C-RMN, se observó un grupo hidroximetilo a 65,4 ppm (C-23), y tres señales de carbonos aloméricos se observaron a 104,2 (C-1'), 106,7 (C-1'''), y 101,7 ppm (C-1'). Se observaron dos carbonos olefínicos a 122,5 ppm (C-12) y 144,8 ppm (C-13), y se observó un carbono carboxi a 180,2 ppm (C-28). En general, se observa un desplazamiento de glicosilación de alrededor de 4 Hz a campos altos cuando el azúcar está unido a la posición 28 (180,2 ppm\rightarrow176,2 ppm). En el compuesto actual, el fenómeno anterior no se observó, y así se confirmó que el compuesto no tiene un grupo azúcar en la posición 28.

A continuación, se hidrolizó el compuesto en etanol/ácido sulfúrico para identificar sus grupos de azúcar y la estructura de la aglicona. SB365 se confirmó como la hederagenina después de comparar los datos fisicoquímicos del producto de la hidrólisis, la aglicona, los datos de la ^{13}C-RMN y de la ^{1}H-RMN. Además, los azúcares hidrolizados se confirmaron como la ramnosa, arabinosa, y glucosa por CCF comparativa.

Basados en los resultados analíticos anteriores y los datos publicados en la bibliografía, se confirmó SB365 como la hederagenina 3-O-\alpha-L-ramnopiranosil(1\rightarrow2)-[\beta-D-glucopiranosil(1\rightarrow4)]-\alpha-L-arabinopiranósido.

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(Tabla pasa a página siguiente)

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Los datos de la ^{1}H-RMN y de la ^{13}C-RMN de SB365 son como se muestran en la Tabla 1 siguiente.

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TABLA 1

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Ejemplo Experimental 1

Actividad antitumoral en ratones BDF1 transplantado con células LLC

La especie de ratón usada en este experimento fue BDF1, y se usaron ratones sanos macho con un peso corporal de 18\sim25 g. A estos animales les fue suministrado agua y comida ad libitum en un lugar de temperatura controlada en el intervalo de 23\sim24ºC, y fueron alimentados con una comida para ratones libre de antibióticos. Las células LLC se cultivaron subcutáneamente en ratones C57BL/6 durante 14 días. Se tomó un tejido que contenía células LLC y se le añadió agua salina fisiológica fría esterilizada (5 ml/g de tejido) para preparar una suspensión de células. La suspensión de células de 0,2 ml se transplantó subcutáneamente a la región de la ingle del ratón BDF1. A las 24 horas del transplante, los ratones anteriores se dividieron en varios grupos de 5 ratones. Después, muestras, fracciones WT y SPX, y SB365, se disolvieron en solución fisiológica salina, y se inyectaron intraperitonealmente a cada concentración de 280 mg/kg (WT), 70 mg/kg (SPX1), 171 mg/kg (SPX2), 30,5 mg/kg (SPX3), 8,1 mg/kg (SPX4), y 6,4 mg/kg (SB365). Al grupo de control negativo se le inyectó solamente solución salina fisiológica, y al grupo de control positivo se le inyectó adriamicina (0,5 mg/kg). La inyección se programó 24 horas después del transplante del tumor para administrar las muestras sucesivamente una vez al día durante 7 días, descanso por un día, y después, se continuó 6 días más consecutivos.

Para evaluar la toxicidad de SB365 en ratones, los ratones experimentales se pesaron dos veces por semana. La actividad antitumoral se calculó después de medir el volumen del tumor del grupo de control y de los grupos de ensayo en los días 14 y 15 después de la administración de la muestra como sigue:

Volumen del tumor (mm^{3}) = longitud (mm) x ancho^{2} (mm^{2})/2

Inhibición del crecimiento tumoral (%) = (C-T) x 100/C

(C: volumen tumoral medio en el grupo control, T: volumen tumoral medio en el grupo de prueba)

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Los resultados se muestran en la Tabla 2 siguiente.

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TABLA 2 Inhibición tumoral (IR, %) de las fracciones de Pulsatillae radix y SB365 en ratones BDF1 transplantados con células LLC

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Como se muestra en la Tabla 2 anterior, las fracciones WT y SPX3 mostraron inhibición del crecimiento tumoral del 55% y 60%, respectivamente, y SB365 mostró inhibición del crecimiento tumoral del 79%, mayor que el de adriamicina del 64% en el día 15 desde el transplante de las células tumorales

Ejemplo Experimental 2

Actividad antitumoral en ratones desnudos transplantados con células NCI-H23

Ratones desnudos hembra de 5 semanas de edad pesando 16-25 g obtenidas de Harlan Co. (Estados Unidos de América) se usaron como animales de experimentación en este experimento. Los ratones se usaron después de la aclimatación de 1 semana en una habitación para animales aséptica. La habitación para animales mantuvo la temperatura de 22\pm2ºC, la humedad de 55\pm5%, y el ciclo de oscuridad y luz de 12 horas, que se controló automáticamente. Comida sólida para animales de experimentación se esterilizó por radiación, y el agua de bebida se esterilizó en autoclave. Los animales se suministraron con comida y agua de beber ad libitum. Se usó una línea celular de tumor humano proporcionada por el Instituto del cáncer nacional (NCI), Estados Unidos de América, y preservada en el Instituto de investigación de Corea de biociencia y biotecnología (KRIBB), Corea. Las células de tumor de pulmón, células NCI-H23, entre las células de pulmón humanas, se transplantaron a ratones desnudos. Las células tumorales de 3x10^{7} células/ml se transplantaron subcutáneamente a los ratones a un volumen de 0,3 ml/20 g de peso corporal. Las muestras se inyectaron intraperitonealmente a los ratones cada día de 13 días, esto es, desde el día 1 al día 14 excepto el día 8 después del transplante de las células tumorales. El tamaño del tumor formado durante la inyección se midió en cada animal, y cualquier cambio en su peso corporal se midió también. En el día 16 después del transplante de células tumorales, los ratones desnudos se sacrificaron, y el tumor se separó y pesó. Al grupo de control positivo se le inyectó intraperitonealmente adriamicina 0,5 mg/kg de peso corporal en los días 1, 5, 9, y 14. Los resultados se muestran en la Tabla 3 siguiente.

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TABLA 3 Inhibición del crecimiento tumoral (IR, %) de SB365 en ratones desnudos transplantados con células NCI-H23

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Como se muestra en la Tabla 3 anterior, SB365 a 6,4 mg/kg mostró una inhibición alta del crecimiento tumoral, 82,1% en el día 16 después del transplante de las células tumorales.

Ejemplo Experimental 3

Ensayo de citotoxicidad

Se obtuvieron las células tumorales A549, SK-MEL-2, y MCF-7 de KRIBB, y se usaron en este experimento. Se preparó un medio de cultivo añadiendo un paquete de L-glutamina que contenía medio RPMI1640, 100 ml de suero bovino fetal (FBS) inactivado calentando en un baño maría de 50ºC durante 30 minutos, 2 g de NaHCO_{3}, 100.000 unidades de penicilina, y 100 mg de estreptomicina, a agua destilada esterilizada para inyección, ajustando el pH de la mezcla con HCl 0,1N a un volumen total de 1 l, y desinfectando la muestra por filtración, y almacenándola a 4ºC antes de su uso. Se mantuvieron las células por propagación una vez cada tres días, y se usó una solución que contenía 0,5% de tripsina y 2% de EDTA en solución salina fisiológica tamponada (PBS) para separar las células de los pocillos.

Se midió la citotoxicidad para las células tumorales según el método de la sulforodamina B (SRB) desarrollado por el NCI en 1989 para medir la actividad antitumoral de los fármacos in vitro.

Específicamente, se separaron las células de los pocillos con la solución 0,5% tripsina-EDTA, y a continuación se preparó una suspensión celular de 3\sim5x10^{4} células/ml. A continuación, se añadió la suspensión celular (180 \mul/pocillo) a una placa de 96 pocillos, y se incubó la placa en un incubador a 37ºC, 5% de CO_{2} durante 24 horas.

Se disolvió la muestra en dimetilsulfóxido (DMSO) y se diluyó con medio de cultivo o agua destilada tres veces para obtener las concentraciones requeridas para el experimento, y se diluyó en serie hasta una concentración final de DMSO de 0,2% o menor. Se añadió a cada pocillo de la placa de 96 pocillos 20 \mul de las soluciones de muestras diluidas en serie, y a continuación, se incubó la placa en un incubador a 37ºC, 5% de CO_{2} durante 48 horas. Se anotó el momento T_{z} (tiempo cero) en el que se añadió la solución de la muestra a la placa. Se eliminó el medio de la placa T_{z} y de cada placa después de completar la incubación, y se añadió a las placas ácido tricloroacético (TCA) al 10% (50 \mul/pocillo). Las placas así tratadas se dejaron reposar durante 1 hora a 4ºC para inmovilizar las células en el fondo de las placas. Después de completar la inmovilización de las células, se lavaron las placas 5-6 veces con agua para eliminar completamente la solución de TCA remanente, y las placas obtenidas se secaron a temperatura ambiente hasta que no tenían humedad.

Se añadió a las placas completamente secas 50 \mul de una solución de teñido con 0,4% SRB en ácido acético al 1% para teñir las células durante 30 minutos. A continuación, se lavaron las placas 5\sim6 veces con una solución de ácido acético al 1% para eliminar totalmente el SRB no unido a las células. Se secaron las placas a temperatura ambiente. Se añadió a éstas 100 \mul de solución de Tris 10 mM para disolver el tinte. A continuación se midió el valor de OD (densidad óptica) con un lector de microplacas a una longitud de onda de 520 nm.

Se calculó el valor ED_{50} de la muestra de células tumorales [50% de la dosis eficaz (ng/ml): una concentración a la que el crecimiento de las células tumorales se inhibe el 50%] como sigue. El valor de T_{z} se definió como el valor de OD en el momento de inicio de la incubación después de añadir la muestra, valor C (control) como el valor de OD del pocillo no tratado con la muestra, y valor de T (prueba) como el valor de OD del pocillo tratado con la muestra. Se midió la citotoxicidad del agente con los valores de T_{z}, C, y T, con la siguiente fórmula:

- en el caso de \hskip0,5cm T_{z} \geq T, (T - T_{z}) / (C-T_{z}) x 100

- en el caso de \hskip0,5cm T_{z} < T, (T - T_{z}) / T_{z} x 100

Se obtuvo el valor ED_{50} de la muestra con los valores como se ha calculado anteriormente usando la función de regresión de datos del programa de Lotus.

Como resultado, los valores ED_{50} de SB365 en células tumorales de pulmón humano, células A549, células
de melanoma humanas, SK-MEL2, y células de tumor de mama humanas, MCF7 fueron >20 \mug/ml, >10 \mug/ml, y >10 \mug/ml, respectivamente. Por lo tanto, SB365 tuvo poca citotoxicidad en las células de tumores sólidos.

Ejemplo de Formulación 1

Preparación de un a solución inyectable que contiene la fracción WT

Se disolvió la fracción WT de 250 mg obtenida en el Ejemplo 1 en 10 ml de solución salina fisiológica para preparar una solución inyectable.

Ejemplo de Formulación 2

Preparación de un polvo seco inyectable que contiene la fracción SPX3

Se disolvieron 25 mg de la fracción SPX3 obtenida en el Ejemplo 2 en 10 ml de solución de Ringer, se esterilizó la solución y después se liofilizó para preparar polvo seco listo para uso como un inyectable. Este polvo se reconstituiría con agua destilada para inyección antes de su uso.

Ejemplo de Formulación 3

Preparación de una solución inyectable que contiene SB365

Se disolvieron 6,5 mg de SB 365 obtenidos en el Ejemplo 3 en 10 ml de solución de Ringer y se esterilizó la solución para preparar una solución inyectable.

Aplicación industrial

Las fracciones WT y SPX3, de Pulsatillae radix y SB365, hederagenina 3-O-\alpha-L-ramnopiranosil(1\rightarrow2)-[\beta-D-glucopiranosil(1\rightarrow4)]-\alpha-L-arabinopiranósido, aislados de las fracciones según la presente invención, no solo tienen una inhibición alta del crecimiento tumoral en las células de los tumores sólidos, sino que también pueden usarse convenientemente disolviéndolos en varias soluciones incluyendo la solución salina fisiológica, solución de Ringer, o solución nutritiva ya que son fácilmente solubles en agua, y tienen una citotoxicidad lo bastante baja para mejorar los efectos secundarios de los agentes antitumorales desarrollados anteriormente. Por lo tanto, se anticipa que serán muy útiles como un agente terapéutico para tumores sólidos.

Claims

1. El uso de un extracto de Pulsatillae radix que contiene hederagenina 3-O-\alpha-L-ramnopiranosil(1\rightarrow2)-[\beta-D-glucopiranosil(1\rightarrow4)]-\alpha-L-arabinopiranósido para la fabricación de un medicamento para tratar tumores sólidos.

2. El uso según la reivindicación 1, en donde el extracto de Pulsatillae radix se prepara extrayendo Pulsatillae radix con una solución acuosa de etanol, y formando precipitados añadiendo acetona a la misma para obtener una fracción soluble en agua.

3. El uso según la reivindicación 2, en donde el extracto de Pulsatillae radix se administra a una dosis diaria de 200 a 300 mg/kg de peso corporal.

4. El uso según la reivindicación 1, en donde el extracto de Pulsatillae radix es una fracción que tiene un R_{f} en el intervalo de 0,48 a 0,50 y que desarrolla un color rojo y después color azul, cuando se la pulveriza con ácido sulfúrico seguido de calentamiento, en donde se prepara la fracción extrayendo Pulsatillae radix con una solución acuosa de etanol, formando precipitados añadiendo acetona a la misma para obtener una fracción soluble en agua, y pasando la fracción a través de una columna de Sefadex LH20.

5. El uso según la reivindicación 4, en donde el extracto de Pulsatillae radix se administra a una dosis diaria de 20 a 40 mg/kg de peso corporal.

6. El uso de la hederagenina 3-O-\alpha-L-ramnopiranosil(1\rightarrow2)-[\beta-D-glucopiranosil(1\rightarrow4)]-\alpha-L-arabinopiranósido para la fabricación de un medicamento para tratar tumores sólidos.

7. El uso según la reivindicación 6, en donde la hederagenina 3-O-\alpha-L-ramnopiranosil(1\rightarrow2)-[\beta-D-glucopiranosil(1\rightarrow4)]-\alpha-L-arabinopiranósido se administra a una dosis diaria de 3,5 a 8 mg/kg de peso corporal.

8. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el extracto de Pulsatillae radix o la hederagenina 3-O-\alpha-L-ramnopiranosil(1\rightarrow2)-[\beta-D-glucopiranosil(1\rightarrow4)]-\alpha-L-arabinopiranósido se disuelve en una solución seleccionada del grupo que consiste en solución salina fisiológica, solución de Ringer, y solución nutritiva.