KR100340941B1

KR100340941B1 - 항 종양 효과가 있는 화합물 및 그것을 함유하는 항종양제

Info

Publication number: KR100340941B1
Application number: KR19990017919A
Authority: KR
Inventors: 문석식; 조순장; 황의형; 신종헌; 서영환; 이정옥; 최상운; 박종진; 홍승서; 이현수
Original assignee: 김일웅; 주식회사 삼양제넥스
Priority date: 1999-05-14
Filing date: 1999-05-14
Publication date: 2002-06-20
Also published as: KR20000074182A

Abstract

본 발명은 다음식으로 표시되는 항종양 효과가 있는 화합물 및 상기 화합물 또는 그것의 약리학적으로 허용되는 염을 함유하는 항종양제에 관한 것이다

Description

항 종양 효과가 있는 화합물 및 그것을 함유하는 항종양제{A compound effective on tumor and a composition containing the same}

본 발명은 항암제에 관한 것이다.

3β-하이드록시-12-올레아넨-28-오익 애시드 3-0-β-L-람노피라노실(1→2)-[β-D-글루코피라노실(1→4)-α-L-아라비노피라노사이드(3β-hydroxy-12-oleanen-28-oic acid 3-O-β-L-rhamnopyrannosyl(1→2)-[β-D-glucopyranosyl(1→4)-α-L-arabinopyranoside])는 아래와 같은 구조의 화합물이다.

이 물질은 목본류인 브라질의 식물Thinuoia coriacea과 브라질의 또 다른 식물Serjania salzmanniana로부터 분리되었으며 흡충류 및 달팽이를 죽이는 효과가 있는 것으로 보고된 바가 있다. 그러나 항암활성에 관해서는 보고된 바가 없으며, 초본류로부터 분리가 보고된 예가 없다.

한편, 할미꽃은 예로부터 이질, 설사, 출혈 등에 효과가 있고, 또한 혈압을 내리는 효과가 있는 것으로 알려져 있으며, 아네모닌(anemonin), 사포닌(saponin), 탄닌질 등의 성분이 존재한다고 한다. 한 예로, 할미꽃으로 부터 분리하여 보고된 헤데라제닌(hederagenin)은 사포닌 계 화합물로 쥐 실험에서 진정작용을 보이는 것이 보고되었다. 중국 할미꽃인 백두옹(Pulsatilla chinensis)으로 만든 민간약이in vitro와 invivo에서 구충 활성을 나타내고, 여러 가지 균에 대한 살균효과와 이질 및 연주창(scrofula)의 치료에 효과를 보인다고 보고되었다(Bensky,D. 등,Chinese Herbal Medicinepp 612∼613, Eastland Press, Seatle 1986).

본 발명은 항암 효과가 있는 화합물을 제공한다.

본 발명은 항암 효과가 있는 조성물을 제공한다.

본 발명은 3β-하이드록시-12-올레아넨-28-오익 애시드 3-O-β-L-람노피라노실(1→2)-[β-D-글루코피라노실(1→4)-α-L-아라비노피라노사이드]를 제조하는 방법을 제공한다.

도 1은 본 발명에 따른 화합물의, 중수소로 치환된 메탄올에서의 수소핵자기 공명스펙트럼이다.

도 2는 본 발명에 따른 화합물의 탄소핵자기공명스펙트럼이다.

도 3은 본 발명에 따른 화합물의, 중수소로 치환된 피리딘에서의 H,H-COSY이다.

도 4는 본 발명에 따른 화합물의 HMQC 핵자기스펙트럼이다.

도 5는 본 발명에 따른 화합물의 NOESY 스펙트럼이다.

본 발명은 항암 효과가 있는 3β-하이드록시-12-올레아넨-28-오익애시드 3-O-β-L-람노피라노실(1→2)-[β-D-글루코피라노실(1→4)-α-L-아라비노피라노사이드] 및 그것을 함유하는 항암 조성물에 관한 것이다.

3 β-하이드록시-12-올레아넨-28-오익애시드3-O-β-L-람노피라노실(1→2)-[β-D-글루코피라노실(1→4)-α-L-아라비노피라노사이드]는 인체 폐암, 난소암, 흑색종, 중추신경계암 및 대장암 세포주에 강한 치사활성을 보이며, 따라서 항암제로서 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 약학조성물은 3β-하이드록시-12-올레아넨-28-오익애시드 3-O-β-L-람노피라노실(1→2)-[β-D-글루코피라노실(1→4)-α-L-아라비노피라노사이드] 또는 약리학적으로 허용되는 이것의 염을 함유한다. 또 추가로 항암효과가 있는 기타 물질을 함유할 수 있다.

3 β-하이드록시-12-올레아넨-28-오익애시드3-O-β-L-람노피라노실(1→2)-[β-D-글루코피라노실(1→4)-α-L-아라비노피라노사이드]는 천연물로부터 분리하거나 화학적으로 합성하여 얻을 수 있다.

한 예로, 할미꽃(Pulsatilla koreana)으로부터 알코올 추출, 컬럼 크로마토그래피 등을 수행하여 분리할 수 있다.

따라서 본 발명은 할미꽃 추출물을 함유하는 항종양제를 포함한다.

또한 본 발명은 3 β-하이드록시-12-올레아넨-28-오익애시드 3-O-β-L-람노피라노실(1→2)-[β-D-글루코피라노실(1→4)-α-L-아라비노피라노사이드]를 제조하는 방법을 제공한다.

종래에는 목본류로부터 3β-하이드록시-12-올레아넨-28-오익애시드 3-0-β-L-람노피라노실(1→2)-[β-D-글루코피라노실(1→4)-α-L-아라비노피라노사이드]를 분리한 예가 있으나, 목본류는 재배 기간이 길며 분리가 번거로우므로 목본류로부터 분리하는 것은 경제성이 없을 뿐 아니라 자연 환경 파괴의 문제가 있다.

본 발명의 방법은 할미꽃, 예를 들어 할미꽃 뿌리를 메탄올, 에탄올 등의 저가 알코올로 추출한 후 크로마토그래피하는 것으로 이루어진다.

할미꽂은 목본류인Thinuoia coriacea과Serjania salzmanniana등에 비해 재배가 빠르며 용이하므로 3β-하이드록시-12-올레아넨-28-오익애시드 3-O-β-L-람노피라노실(1→2)-[β-D-글루코피라노실(1→4)-α-L-아라비노피라노사이드]의 우수한 제공원이 될 수 있다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 설명하고자 하며, 이 실시예에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

칠갑산에서 채집한 할미꽃의 뿌리 1080 g을 메탄올 4 L로 추출하고 그 추출물을 농축하여 끈적한 액체 120 g을 얻었다. 이 액체 60 mg을 여러 가지 암세포주(human lung carcinoma A549, human ovarian adenocarcinoma Sk-OV-3,melanoma SK-MEL-2, CNS cancer XF498, colon cancer HCT15)에 대하여 활성을 측정하였다. 시료를 2배씩 희석하여 실험하였으며 16배로 묽힌 용액(3.75mg)에서도 암세포주가 모두 죽었다(자료 미제시). 이 액체를 다시 소량의 물에 녹인 다음 역상실리카겔 크로마토그래피 관(C-18, 40-63 ㎛, 100 id x 50 mm, Merck)에 올린 후에 2500 mL의 물, 1000 mL의 물, 1000 mL의 10% 메탄올수용액, 1000 mL의 30% 메탄올수용액, 1000 mL의 50% 메탄올수용액, 1000 mL의 70% 메탄올수용액, 1000 mL의 90% 메탄올수용액, 2000 mL의 메탄올로 용출하였다. 각 분획의 항암 활성을 측정하였으며, 항암 활성이 강한 90% 메탄올로 용출된 부분을 농축하여 1.2 g의 고체를 얻었다. 이부분을 클로로포름과 메탄올 혼합물에 녹여 실리카겔(230-400 메시, 41x350 mm, Merck)로 충진된 관에 올린 후 70:37:3 클로로포름/메탄올/물의 용매로 용출하여 차례로 84 mL, 108 mL, 72 mL, 120 mL, 144 mL, 360 mL, 144 mL, 156 mL을 받았다. 각 분획의 항암 활성을 측정하였으며, 항암 활성이 강한 6번째에 용출된 시료를 농축하여 분말 197mg을 얻었다. 항암활성은 인체 폐암(A-549, nonsmall cell lung cancer), 난소암(SKOV-3, ovarian cancer), 흑색종(SK-Mel-2, melanoma), 중추신경계암(XF-498, central nerve system cancer) 및 대장암(HCT-15, colon cancer) 세포주에 대하여 SRB 방법(Rubinstein, L.V. 등 J. Nat. Cancer Inst. 1990, 82:1113)으로 실험하였다. 얻어진 분말을 고압크로마토그래피(C-18, Phenomenex, 21 x 250 mm, 70% - 100% 메탄올, 60 분)하였다. 항암 활성을 나타내는 보유시간 54.8분의 피크를 받아서 농축한 후에 동일한 조건으로 다시 고압크로마토그래피하여 백색의 순수한 물질 39.7mg을 얻었다. 이 물질을 PK3007로 명명하였다. 이 물질은 분석관(phenomenex C-18, 4.6 x 250 mm, 75% ∼ 100% 메탄올, 60 분)으로 분석하면 보유시간 32.8 분에서 용출된다.

이 물질의 화학구조는 분광기를 이용한 분광학적 방법(핵자기공명, 자외선분광법, 질량분석법)으로 규명하였다. 자외선 흡수 파장은 202 nm에서 끝흡수를 보였으며 , 분자량은 897.1이며 분자식은 C₄₇H₇₆O₁₆이다. 핵자기공명분광법(500 MHz)에서 용매로 메탄올과 피리딘을 사용하였다. 중수소로 치환된 메단올에서의 수소핵자기공명스펙트럼은 도 1과 같다. 또 탄소핵자기공명스펙트럼(도 2)에서 47개의 피크가 관찰되었다. 중수소로 치환된 피리딘에서의 H,H-COSY (도 3)와 HMQC 핵자기스펙트럼(도 4)을 해석하여 글루코피라노오스, 람노피라노오스, 아라비노피라노오스의 부분 구조를 알아 내었다.

물질 PK3007의 스펙트럼에서 당의 탄소들로부터 유래된 피크들을 제외하고 남은 피크들의 탄소핵자기공명 자료를 문헌값(Bensky,D. 등, Chinese Herbal Medicine 612∼613 Eastland Press, Seatle, 1986)과 비교했을 때, 전형적인 3-하이드록시-12-올레아넨-28-오익산(3-hydroxy-12- oleanen-28-oic acid)와 일치하였으므로 올레아넨오익산의 구조가 들어 있다는 것을 알 수 있다.

전체적으로 물질 PK3007은 올레아닌오익산(oleanenoic acid)와 글로코오스, 람노오스 및 아라비노오스로 이루어진 사포닌이다. 이 부분 구조들간의 연결 구조는 NOESY 스펙트럼으로 밝혔다(도 5). 이 스펙트럼을 분석한 결과, 물질 PK3007는 화학구조가 다음과 같은 3β-하이드록시-12-올레아넨-28-오익 애시드 3-0-β-L-람노피라노실(1→2)-[β-D-글루코피라노실(1→4)- α-L-아라비노피라노사이드](3β-hydroxy-12-oleanen-28-oic acid 3-O- β-L-rhamnopyrannosyl(1→2)-[β-D-glucopyranosyl(1→4)-α-L-arabinopyranoside])임을 밝혔다.

PK3007은 다음과 같은 물리화학적 성질을 보였다

mp 274-276℃; UV (MeOH) λmax 205 nm (끝흡수); 당 부분을 제외한 부분의¹³C NMR (피리딘-d₅) δ15.5, 17.0, 17.3, 18.5, 18.7, 23.7, 23.77, 23.80, 26.2, 26.6, 28.1, 28.3, 31.0, 33.17, 33.20, 33.3, 34.2, 37.0, 38.9, 39.5, 39.7, 412.0, 42.2, 46.5, 46.7, 48.0, 56.0, 88,7, 123.1, 144.8, 180.1 ppm; 당 부분의¹H: 4.66 (d,5.9), 4.40 (t, 6.5), 4.16, 4.17, 3.70 (d, 11.7), 4.30 (dd, 11.7, 3.4) (이상 아라비노오스 부분); 6.07 (s), 4.61 (m), 4.49 (dd, 9.3, 2.9), 4.19 (t, 9.7), 4.52 (dt, 9,6, 6,5), 1.53 (d, 6.5) (이상 람노오스 부분); 5.04 (d, 8.8), 3.92 (t, 8.3), 4.10 (t, 8.8), 4.14 (t, 8.3), 3.76-3.81 (m), 4.27 (dd, 11.2, 4.9), 4.38 (dd, 11.2, 0.5). 당 부분의¹³C: 105.0, 76.4, 74.07, 79.7, 64.6 (이상 아라비노오스 부분); 101.8, 72.3, 72.5, 74.12, 69.8, 18.67 (이상 람노오스 부분); 106.4, 75.5, 78.6, 71.3, 78.8, 62.5.

실시예 2.

실시예 1에서 분리한 PK3007를 사용하여, 인체 폐암(A-549, nonsmall cell lung cancer), 난소암(SKOV-3, ovarian cancer), 흑색종(SK-Mel-2, melanoma). 중추신경계암(XF-498, central nerve system cancer) 및 대장암(HCT-15, colon cancer) 세포주에 대한 항암 효과를 SRB 방법(Rubinstein, L.V. 등 J. Nat. Cancer Inst. 1990, 82:1113)으로 실험하였다. 사용한 암세포주는 10% FBS가 포함된 배지에서 37℃, 5% C02 배양기에서 배양하였다. 세포를 부착면으로부터 분리할 때는 0.25% 트립신 및 3 mM CDTA를 PBS용액에 녹인 용액을 사용하였다. 96 웰 플레이트의 각 웰에 세포 수 5x10³- 2x10⁴를 넣고 37℃, 5% C0₂배양기에서 24시간 배양한후 배지를 제거하였다. 이 플레이트의 각 웰에, 준비한 검정 시료 용액 200 μL씩에 가한 후 48시간 배양하였다. 검정 시료 용액은 시료를 DMSO에 녹여서 실험용 배지로 적당한 농도로 희석한 후에 0.22 μm 여과지로 여과하여, 2배씩 희석하여 여러 가지 다른 농도로 준비하였다.

시료를 넣고 배양을 시작하는 시점에서의 광학밀도를 T₀로 잡는다. 시료를 넣지 않은 암세포주 배양액과 시료를 넣은 배양액의 48시간후의 광학밀도를 각각 C, T로 잡는다. 성장억제농도(IC₅₀)값은 (T-T₀)/(C-T₀) x 100 = 50일 때의 시료의 농도이다. 광학밀도는 다음과 같은 방법으로 구하였다. 암세포주 배양액에 TCA를 처리하여 세포를 고정시키고 0.4% SRB 용액으로 염색하였다. 1% 초산으로 씻은 후에 10mM Tris 용액으로 염료를 용출시켜서 520 nm에서 광학밀도를 측정하였다. 위의 방법으로 실험한 결과 물질 PK3007의 암세포주에 대한 IC₅₀은 1.40∼3.77 μg/mL이었다. 대조물질로 카보플라틴, 시스플라틴, 아드리아마이신을 사용하여 동일하게실험하였다. 결과를 표 1에 나타내었다.

본 발명에 의해, 항암 활성이 있는 화합물을 얻을 수 있다.

Claims

(정 정) 다음식으로 표시되는 화합물 또는 이것의 약리학적으로 허용되는 염을 함유하는 항종양제
(삭 제)
(정 정) 제 1 항에 있어서, 상기 화합물이 할미꽃 추출물에서 얻어진 것인 항종양제.